專利名稱：：百白破、A+C群腦膜炎球菌-b型流感嗜血桿菌結(jié)合疫苗的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明提供一種百白破、A+C群腦膜炎球菌-b型流感嗜血桿菌結(jié)合疫苗，用吸附無細(xì)胞百白破聯(lián)合疫苗、AC群腦膜炎球菌-b型流感嗜血桿菌結(jié)合疫苗，預(yù)防腦脊髓膜炎、肺炎、百日咳、白喉及破傷風(fēng)等重要疫病，屬于疫苗生產(chǎn)制備
技術(shù)領(lǐng)域：
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背景技術(shù)：
：流行性腦脊髓膜炎(流腦)主要發(fā)病人群是嬰幼兒，A、C群腦膜炎球菌多糖結(jié)合疫苗主要用于嬰幼兒預(yù)防使用。二十世紀(jì)八十年代，隨著流腦多糖疫苗開發(fā)成功和納入計(jì)劃免疫，全球范圍內(nèi)接種人數(shù)逐年上升，發(fā)病率逐年下降。我國的流腦發(fā)病以A群為主，因此開發(fā)的疫苗均為A群多糖或A+C群雙價(jià)多糖疫苗，但是2000年在貴州、2004年在河北分別爆發(fā)了流腦，造成當(dāng)?shù)氐目只?，?jīng)流行病學(xué)調(diào)査證明，引起流行的是C群菌株，這就引起了疾病控制部門的重視?，F(xiàn)行A+C群腦膜炎球菌多糖疫苗安全，有效，保護(hù)率可達(dá)80-90%。但該疫苗對2歲以下嬰幼兒免疫效果差，接種一劑不能達(dá)到抗體保護(hù)水平，且抗體很快消失。因該疫苗與其它多糖疫苗一樣，屬T細(xì)胞非依賴性抗原，2歲以下嬰幼兒免疫系統(tǒng)尚未發(fā)育成熟.，對大多數(shù)莢膜多糖的抗體應(yīng)答反應(yīng)較弱，僅產(chǎn)生低水平的特異性抗體，多糖結(jié)合物可刺激嬰幼兒的T細(xì)胞依賴性抗體的合成，并可加強(qiáng)應(yīng)答，與非結(jié)合物疫苗相比還提高了免疫球蛋白(IgG)的抗體比例。b型流感嗜血桿菌(Hib)通過飛沫傳播感染，引起五歲以下兒童鼻咽炎、會咽炎等原發(fā)性疾?。患?xì)菌從局部進(jìn)入血液或通過血腦屏障，引起肺炎、化膿性腦膜炎、關(guān)節(jié)炎、骨髓炎、心包炎和敗血癥等嚴(yán)重的侵襲性疾病。WHO指出全世界每年有300萬例的Hib感染，其中死亡6萬例(2%)，在發(fā)達(dá)國家以腦膜炎為主，在發(fā)展中國家以肺炎為主。鑒于A、C群腦膜炎球菌和b型流感嗜血桿菌引起疾病的嚴(yán)重性和疫苗的有效性，研發(fā)該疫苗具有極其重要的意義。在目前已使用Hib疫苗的38個(gè)國家中，其免疫程序遵照的原則是l)在出生后2-6月齡之間完成基礎(chǔ)免疫程序，每劑注射間隔至少l個(gè)月；2)出生后12-24個(gè)月之間可以進(jìn)行一次加強(qiáng)免疫。遵照這一原則，用吸附無細(xì)胞百白破聯(lián)合疫苗、AC群腦膜炎球菌-b型流感嗜血桿菌結(jié)合疫苗，于出生后2-6月齡之間完成基礎(chǔ)免疫，12-24個(gè)月之間完成加強(qiáng)免疫。按該免疫程序可同時(shí)預(yù)防A、C群的疾病、百日咳、白喉和破傷風(fēng)，同時(shí)減少兒童免疫次數(shù)。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明提供一種百白破、A+C群腦膜炎球菌-b型流感嗜血桿菌結(jié)合疫苗，采用A、C群腦膜炎奈瑟氏雙球菌、b型流感嗜血桿菌培養(yǎng)液，分別提取莢膜多糖，經(jīng)過純化、活化后，與破傷風(fēng)類毒素結(jié)合，然后將A、C群腦膜炎多糖結(jié)合疫苗原液、b型流感嗜血桿菌結(jié)合疫苗原液與無細(xì)胞百白破原液按一定比例混合，獲得一針多種免疫的效果。本發(fā)明聯(lián)合疫苗含以下組分及含量A群腦膜炎球菌多糖10ygC群腦膜炎球菌多糖10ugb型流感嗜血桿菌多糖乳糖2.53.0mg無細(xì)胞百日咳原液18ygPN/ml白喉類毒素-25Lf/ml破傷風(fēng)類毒素7Lf/ml氫氧化鋁含量1.01.5mg/ml本發(fā)明聯(lián)合疫苗的制備工藝，包括以下步驟1.菌種的的選用選用A、C群腦膜炎奈瑟氏球菌，b型流感嗜血桿菌菌種，用于A、C群腦膜炎球菌-b型流感嗜血桿菌結(jié)合疫苗的制備。2.生產(chǎn)用種子啟開工作種子批菌種，經(jīng)適當(dāng)傳代，經(jīng)檢定合格后，接種改良半綜合培養(yǎng)基或其他適宜培養(yǎng)基，制備數(shù)量適宜的生產(chǎn)用種子。3.生產(chǎn)用培養(yǎng)基采用改良半綜合培養(yǎng)基或經(jīng)批準(zhǔn)的其他適宜培養(yǎng)基。培養(yǎng)基不應(yīng)含有與十六烷基三甲基溴化銨形成沉淀的成分。4.培養(yǎng)采用培養(yǎng)罐液體培養(yǎng)。在培養(yǎng)過程中取樣進(jìn)行純菌檢査，涂片做革蘭氏染色鏡檢，如發(fā)現(xiàn)污染雜菌，應(yīng)廢棄。5.收獲和殺菌于對數(shù)生長期的后期或靜止期的前期終止培養(yǎng)。取樣進(jìn)行菌液濃度測定及純菌檢查，合格后在收獲的培養(yǎng)液中加入甲醒溶液殺菌，或采用加熱方法殺菌。以確保殺菌安全又不損傷其多糖抗原為宜。6.去核酸將已殺菌的培養(yǎng)液(單批或多批混合)離心后收集上清液，加入十六烷基三甲基溴化銨，充分混勻，形成沉淀；離心后的沉淀物加入適量氯化鈣溶液，其最終濃度為lmol/L，使多糖十六垸基三甲基溴化銨解離，加入乙醇至最終濃度為25%，2—8。C靜置1一3小時(shí)或過夜，離心收集澄清的上清液。7.沉淀多糖于上述上清液中加入冷卻乙醇至最終濃度為80%,充分振搖，離心收集沉淀，用無水乙醇及丙酮各洗2次以上，將沉淀物即為多糖粗制品，應(yīng)保存在一20。C以下，待純化。8.多糖純化將粗制品溶解于1/10飽和中性醋酸鈉溶液中，使其濃度達(dá)10—20mg/ml;按1:2容量用冷酚(100g結(jié)晶酚溶于40ml的1/10飽和醋酸鈉溶液)提取數(shù)次，離心收集上清液，并用0.lmol/L氯化鈣溶液或其他適宜溶液透析，加入乙醇至終濃度為75%80%;離心收集的沉淀物用無水乙醇及丙酮各洗2次以上，干燥后用滅菌注射用水溶解沉淀物，即為純化多糖原液。提取過程應(yīng)在15'C以下進(jìn)行9.多糖活化、衍化與破傷風(fēng)類毒素結(jié)合將理化檢定合格的多糖經(jīng)溴化氰活化，加入適宜比例的ADH(1、6—己二酰肼)反應(yīng)過夜，然后用超慮或其他適宜方法除去溴化氰及未衍化的ADH,過濾除菌，-2(TC保存。取樣進(jìn)行檢定，檢定合格后，將適宜濃度的多糖-AH衍生物與破傷風(fēng)類毒素等量混合，然后加入EDAC(碳二亞胺)，混合物2-8。C保持一定時(shí)間，用0.2MNaCl溶液透析過夜，將反應(yīng)物用S印haroseCL-4B柱層析純化，收集V。部分洗脫液，用NaOH調(diào)pH至中性，除菌過濾，既為結(jié)合物原液，2-8t:保存。10.半成品配制及分裝將檢定合格的A、C群腦膜炎球菌多糖結(jié)合苗原液、b型流感嗜血桿菌結(jié)合疫苗原液與無細(xì)胞百日咳原液按比例混合均勻后，按要求進(jìn)行分裝，分裝量0.5mL/瓶，放2-8。C庫待檢。11.成品檢定根據(jù)擬訂的《AC群腦膜炎球菌-b型流感嗜血桿菌結(jié)合疫苗制檢暫行規(guī)程》及現(xiàn)行的《吸附無細(xì)胞百白破聯(lián)合疫苗制造及檢定規(guī)程》的相關(guān)要求進(jìn)行全面檢定。本發(fā)明優(yōu)點(diǎn)在于1.無細(xì)胞百白破聯(lián)合疫苗中含有氫氧化鋁，作為佐劑成分，有如下特點(diǎn)1)吸附率高，第一針注射后即可達(dá)到快、高和持續(xù)久的免疫效果；2)適量的鋁佐劑可逐步釋放抗原，較長時(shí)間刺激免疫細(xì)胞；3)刺激體液免疫，產(chǎn)生更高滴度的IgG、IgE，激活Th2細(xì)胞。本發(fā)明巧妙利用佐劑氫氧化鋁，制成百白破+八(:群腦膜炎球菌-b型流感嗜血桿菌結(jié)合疫苗，接種人體后，不僅增強(qiáng)百白破免疫效果，還能增強(qiáng)A、C群腦膜炎球菌-Hib結(jié)合疫苗免疫效果。2.接種一針就可以預(yù)防流行性腦脊髓膜炎、Hib導(dǎo)致的疾病、百日咳、白喉和破傷風(fēng)；3.提高疫苗覆蓋率和接種率，減少兒童多次注射疫苗所帶來的的痛苦，降低接種和管理上的費(fèi)用，減少家長、兒童和醫(yī)生的不便和工作量。具體實(shí)施例方式實(shí)施例1:200901批百白破、A+C群腦膜炎球菌-b型流感嗜血桿菌結(jié)合疫苗制備1、取A群腦膜炎球菌29201菌株、C群腦膜炎球菌29205菌株、b型流感嗜血桿菌58534菌株，接種于適宜瓊脂培養(yǎng)基，于35—37'C二氧化碳的環(huán)境中培養(yǎng)16—20小時(shí)，涂片做革蘭氏染色鏡檢，接種發(fā)酵罐培養(yǎng)。2、采用培養(yǎng)罐液體培養(yǎng)。在培養(yǎng)過程中取樣進(jìn)行純菌檢查，涂片做革蘭氏染色鏡檢，如發(fā)現(xiàn)污染雜菌，應(yīng)廢棄。于對數(shù)生長期的后期或靜止期的前期終止培養(yǎng)。取樣進(jìn)行菌液濃度測定及純菌檢查，合格后在收獲的培養(yǎng)液中加入甲醛溶液殺菌，或采用加熱方法殺菌。以確保殺菌安全又不損傷其多糖抗原為宜。3、將巳殺菌的培養(yǎng)液(單批或多批混合)離心后收集上清液，加入十六烷基三甲基溴化銨，充分混勻，形成沉淀；離心后的沉淀物加入適量氯化鈣溶液，其最終濃度為lmol/L，使多糖十六烷基三甲基溴化銨解離，加入乙醇至最終濃度為25%,2_8°C靜置1一3小時(shí)或過夜，離心收集澄清的上清液。于上述上清液中加入冷卻乙醇至最終濃度為80%，充分振搖，離心收集沉淀，用無水乙醇及丙酮各洗2次以上，將沉淀物即為多糖粗制品，應(yīng)保存在一20。C以下，待純化。4.將粗制品溶解于1/10飽和中性醋酸鈉溶液中，使其濃度達(dá)10—20mg/ml;按1:2容量用冷酚(100g結(jié)晶酚溶于40ml的1/10飽和醋酸鈉溶液)提取數(shù)次，離心收集上清液，并用0.lraol/L氯化鈣溶液或其他適宜溶液透析，加入乙醇至終濃度為75%80%;離心收集的沉淀物用無水乙醇及丙酮各洗2次以上，干燥后用滅菌注射用水溶解沉淀物，即為純化多糖原液。提取過程應(yīng)在15'C以下進(jìn)行。5.將理化檢定合格的多糖經(jīng)溴化氰活化，加入適宜比例的ADH(1、6—己二酰肼)反應(yīng)過夜，然后用超慮或其他適宜方法除去溴化氰及未衍化的ADH，過濾除菌，凍干(或-2(TC)保存。取樣進(jìn)行檢定，檢定合格后，將適宜濃度的多糖-AH衍生物與破傷風(fēng)類毒素等量混合，然后加入EDAC(碳二亞胺)，混合物2-8'C保持一定時(shí)間，用0.2MNaCl溶液透析過夜，將反應(yīng)物用S印haroseCL-4B柱層析純化，收集V。部分洗脫液，用NaOH調(diào)pH至中性，除菌過濾，既為結(jié)合物原液，2-8'C保存。6.半成品配制及分裝將檢定合格的AC群腦膜炎球菌多糖結(jié)合苗原液、b型流感嗜血桿菌結(jié)合疫苗原液與無細(xì)胞百日咳原液按比例混合均勻后，按要求進(jìn)行分裝，分裝量O.5mL/瓶，放2-8°C庫待檢。7.成品檢定根據(jù)擬訂的《AC群腦膜炎球菌-b型流感嗜血桿菌結(jié)合疫苗制檢暫行規(guī)程》及現(xiàn)行的《吸附無細(xì)胞百白破聯(lián)合疫苗制造及檢定規(guī)程》的相關(guān)要求進(jìn)行全面檢定。實(shí)施例2:200902批百白破、A+C群腦膜炎球菌-b型流感嗜血桿菌結(jié)合疫苗制備1、取A群腦膜炎球菌29201菌株、C群腦膜炎球菌29205菌株、b型流感嗜血桿菌58534菌株，接種于適宜瓊脂培養(yǎng)基，于35—37。C二氧化碳的環(huán)境中培養(yǎng)16—20小時(shí)，涂片做革蘭氏染色鏡檢，接種發(fā)酵罐培養(yǎng)。2、采用培養(yǎng)罐液體培養(yǎng)。在培養(yǎng)過程中取樣進(jìn)行純菌檢査，涂片做革蘭氏染色鏡檢，如發(fā)現(xiàn)污染雜菌，應(yīng)廢棄。于對數(shù)生長期的后期或靜止期的前期終止培養(yǎng)。取樣進(jìn)行菌液濃度測定及純菌檢查，合格后在收獲的培養(yǎng)液中加入甲醛溶液殺菌，或采用加熱方法殺菌。以確保殺菌安全又不損傷其多糖抗原為宜。3、將己殺菌的培養(yǎng)液(單批或多批混合)離心后收集上清液，加入十六烷基三甲基溴化銨，充分混勻，形成沉淀；離心后的沉淀物加入適量氯化鈣溶液，其最終濃度為lmol/L，使多糖十六烷基三甲基溴化銨解離，加入乙醇至最終濃度為25%，2—8'C靜置1一3小時(shí)或過夜，離心收集澄清的上清液。于上述上清液中加入冷卻乙醇至最終濃度為80%，充分振搖，離心收集沉淀，用無水乙醇及丙酮各洗2次以上，將沉淀物即為多糖粗制品，應(yīng)保存在一20。C以下，待純化。4.將粗制品溶解于1/IO飽和中性醋酸鈉溶液中，使其濃度達(dá)10—20mg/ml;按1:2容量用冷酚(100g結(jié)晶酚溶于40ml的1/10飽和醋酸鈉溶液)提取數(shù)次，離心收集上清液，并用0.lmol/L氯化鈣溶液或其他適宜溶液透析，加入乙醇至終濃度為75%80%;離心收集的沉淀物用無水乙醇及丙酮各洗2次以上，干燥后用滅菌注射用水溶解沉淀物，即為純化多糖原液。提取過程應(yīng)在15。C以下進(jìn)行。5.將理化檢定合格的多糖經(jīng)溴化氰活化，加入適宜比例的ADH(1、6—己二酰肼)反應(yīng)過夜，然后用超慮或其他適宜方法除去溴化氰及未衍化的ADH，過濾除菌，凍干(或-20'C)保存。取樣進(jìn)行檢定，檢定合格后，將適宜濃度的多糖-AH衍生物與破傷風(fēng)類毒素等量混合，然后加入EDAC(碳二亞胺)，混合物2-8r保持一定時(shí)間，用0.2MNaCl溶液透析過夜，將反應(yīng)物用S印haroseCL-4B柱層析純化，收集V。部分洗脫液，用NaOH調(diào)pH至中性，除菌過濾,既為結(jié)合物原液，2-8'C保存。6.半成品配制及分裝將檢定合格的AC群腦膜炎球菌多糖結(jié)合苗原液、b型流感嗜血桿菌結(jié)合疫苗原液與無細(xì)胞百日咳原液按比例混合均勻后，按要求進(jìn)行分裝，分裝量0.5mL/瓶，放2-8'C庫待檢。7.成品檢定根據(jù)擬訂的《AC群腦膜炎球菌-b型流感嗜血桿菌結(jié)合疫苗制檢暫行規(guī)程》及現(xiàn)行的《吸附無細(xì)胞百白破聯(lián)合疫苗制造及檢定規(guī)程》的相關(guān)要求進(jìn)行全面檢定。實(shí)施例3:200903批百白破、A+C群腦膜炎球菌-b型流感嗜血桿菌結(jié)合疫苗制備1.取A群腦膜炎球菌29201菌株、C群腦膜炎球菌29205菌株、b型流感嗜血桿菌58534菌株，接種于適宜瓊脂培養(yǎng)基，于35—37'C二氧化碳的環(huán)境中培養(yǎng)16—20小時(shí)，涂片做革蘭氏染色鏡檢，接種發(fā)酵罐培養(yǎng)。2.采用培養(yǎng)罐液體培養(yǎng)。在培養(yǎng)過程中取樣進(jìn)行純菌檢査，涂片做革蘭氏染色鏡檢，如發(fā)現(xiàn)污染雜菌，應(yīng)廢棄。于對數(shù)生長期的后期或靜止期的前期終止培養(yǎng)。取樣進(jìn)行菌液濃度測定及純菌檢查，合格后在收獲的培養(yǎng)液中加入甲醛溶液殺菌，或采用加熱方法殺菌。以確保殺菌安全又不損傷其多糖抗原為宜。3.將已殺菌的培養(yǎng)液(單批或多批混合)離心后收集上清液，加入十六烷基三甲基溴化銨，充分混勻，形成沉淀；離心后的沉淀物加入適量氯化鈣溶液，其最終濃度為lmol/L，使多糖十六烷基三甲基溴化銨解離，加入乙醇至最終濃度為25%，2—8。C靜置1一3小時(shí)或過夜，離心收集澄清的上清液。于上述上清液中加入冷卻乙醇至最終濃度為80%，充分振搖，離心收集沉淀，用無水乙醇及丙酮各洗2次以上，將沉淀物即為多糖粗制品，應(yīng)保存在一20。C以下，待純化。4.將粗制品溶解于1/10飽和中性醋酸鈉溶液中，使其濃度達(dá)10—20mg/ml;按1:2容量用冷酚(100g結(jié)晶酚溶于40ml的1/10飽和醋酸鈉溶液)提取敎次，離心收集上清液，并用0.lmol/L氯化鈣溶液或其他適宜溶液透析，加入乙醇至終濃度為75%80%;離心收集的沉淀物用無水乙醇及丙酮各洗2次以上，干燥后用滅菌注射用水溶解沉淀物，即為純化多糖原液。提取過程應(yīng)在15'C以下進(jìn)行。5.將理化檢定合格的多糖經(jīng)溴化氰活化，加入適宜比例的ADH(l、6—己二酰肼)反應(yīng)過夜，然后用超慮或其他適宜方法除去溴化氰及未衍化的ADH，過濾除菌，凍干(或-20°C)保存。取樣進(jìn)行檢定，檢定合格后，將適宜濃度的多糖-AH衍生物與破傷風(fēng)類毒素等量混合，然后加入EDAC(碳二亞胺)，混合物2-8。C保持一定時(shí)間，用0.2MNaCl溶液透析過夜，將反應(yīng)物用S印haroseCL-4B柱層析純化，收集V。部分洗脫液，用Na0H調(diào)pH至中性，除菌過濾，既為結(jié)合物原液，2-8'C保存。6.半成品配制及分裝將檢定合格的A、C群腦膜炎球菌多糖結(jié)合苗原液、b型流感嗜血桿菌結(jié)合疫苗原液與無細(xì)胞百日咳原液按比例混合均勻后，按要求進(jìn)行分裝，分裝量0.5mL/瓶，放2-8°C庫待檢。7.成品檢定根據(jù)擬訂的《AC群腦膜炎球菌-b型流感嗜血桿菌結(jié)合疫苗制檢暫行規(guī)程》及現(xiàn)行的《吸附無細(xì)胞百白破聯(lián)合疫苗制造及檢定規(guī)程》的相關(guān)要求進(jìn)行全面檢定。試驗(yàn)例1:根據(jù)擬訂的《AC群腦膜炎球菌-b型流感嗜血桿菌結(jié)合疫苗制檢暫行規(guī)程》和現(xiàn)行的《吸附無細(xì)胞百白破聯(lián)合疫苗制造及檢定規(guī)程》的要求對百白破、A+C群腦膜炎球菌-b型流感嗜血桿菌結(jié)合疫苗進(jìn)行全面檢定，結(jié)果表一百白破、A+C群腦膜炎球菌-b型流感嗜血桿菌結(jié)合疫苗效力試驗(yàn)<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>表二百白破+AC群腦膜炎球菌-b型流感嗜血桿菌結(jié)合疫苗效力試驗(yàn)<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>試驗(yàn)結(jié)果表明，百白破、A+C群腦膜炎球菌-b型流感嗜血桿菌結(jié)合疫苗是安全的、有效的，完全符合擬訂的《AC群腦膜炎球菌-b型流感嗜血桿菌結(jié)合疫苗制檢暫行規(guī)程》和現(xiàn)行的《吸附無細(xì)胞百白破聯(lián)合疫苗制造及檢定規(guī)程》的要求。權(quán)利要求1、一種百白破、A+C群腦膜炎球菌-b型流感嗜血桿菌結(jié)合疫苗，每支成品含以下組分及含量A群腦膜炎球菌多糖10μgC群腦膜炎球菌多糖10μgb型流感嗜血桿菌多糖10μg乳糖2.5～3.0mg無細(xì)胞百日咳原液18μgPN/ml白喉類毒素25Lf/ml破傷風(fēng)類毒素7Lf/ml氫氧化鋁含量1.0～1.5mg/ml。2、權(quán)利要求1所述聯(lián)合疫苗的制備工藝，包括以下步驟1)菌種的的選用選用A、C群腦膜炎奈瑟氏球菌，b型流感嗜血桿菌菌種，用于A、C群腦膜炎球菌-b型流感嗜血桿菌結(jié)合疫苗的制備；2)生產(chǎn)用種子啟開工作種子批菌種，經(jīng)適當(dāng)傳代，經(jīng)檢定合格后，接種改良半綜合培養(yǎng)基或其他適宜培養(yǎng)基，制備數(shù)量適宜的生產(chǎn)用種子；3)生產(chǎn)用培養(yǎng)基采用改良半綜合培養(yǎng)基或經(jīng)批準(zhǔn)的其他適宜培養(yǎng)基。培養(yǎng)基不應(yīng)含有與十六垸基三甲基溴化銨形成沉淀的成分；4)培養(yǎng)采用培養(yǎng)罐液體培養(yǎng)。在培養(yǎng)過程中取樣進(jìn)行純菌檢查，涂片做革蘭氏染色鏡檢，如發(fā)現(xiàn)污染雜菌，應(yīng)廢棄；5)收獲和殺菌于對數(shù)生長期的后期或靜止期的前期終止培養(yǎng)。取樣進(jìn)行菌液濃度測定及純菌檢查，合格后在收獲的培養(yǎng)液中加入甲醛溶液殺菌，或采用加熱方法殺菌，以確保殺菌安全又不損傷其多糖抗原為宜；6)去核酸將已殺菌的培養(yǎng)液(單批或多批混合)離心后收集上清液，加入十六烷基三甲基溴化銨，充分混勻，形成沉淀；離心后的沉淀物加入適量氯化鈣溶液，其最終濃度為lmol/L，使多糖十六烷基三甲基溴化銨解離，加入乙醇至最終濃度為25%，2—8t:靜置l一3小時(shí)或過夜，離心收集澄清的上清液；7)沉淀多糖于上述上清液中加入冷卻乙醇至最終濃度為80%，充分振搖，離心收集沉淀，用無水乙醇及丙酮各洗2次以上，將沉淀物即為多糖粗制品，應(yīng)保存在一20。C以下，待純化；8)多糖純化將粗制品溶解于1/10飽和中性醋酸鈉溶液中，使其濃度達(dá)10—20呢/ml;按1:2容量用冷酚(100g結(jié)晶酚溶于40ml的1/10飽和醋酸鈉溶液)提取數(shù)次，離心收集上清液，并用0.lmol/L氯化鈣溶液或其他適宜溶液透析，加入乙醇至終濃度為75%80%;離心收集的沉淀物用無水乙醇及丙酮各洗2次以上，干燥后用滅菌注射用水溶解沉淀物，即為純化多糖原液；提取過程應(yīng)在15"C以下進(jìn)行；9)多糖活化、衍化與破傷風(fēng)類毒素結(jié)合將理化檢定合格的多糖經(jīng)溴化氰活化，加入適宜比例的ADH(1、6—己二酰肼)反應(yīng)過夜，然后用超慮或其他適宜方法除去溴化氰及未衍化的ADH，過濾除菌，-20。C保存；取樣進(jìn)行檢定，檢定合格后，將適宜濃度的多糖-AH衍生物與破傷風(fēng)類毒素等量混合，然后加入EDAC(碳二亞胺)，混合物2-8r;保持一定時(shí)間，用0.2MNaCl溶液透析過夜，將反應(yīng)物用S印haroseCL-4B柱層析純化，收集V0部分洗脫液，用NaOH調(diào)pH至中性，除菌過濾，既為結(jié)合物原液，2-8。C保存；10)半成品配制及分裝將檢定合格的A、C群腦膜炎球菌多糖結(jié)合苗原液、b型流感嗜血桿菌結(jié)合疫苗原液與無細(xì)胞百日咳原液按比例混合均勻后，按要求進(jìn)行分裝，分裝量0.5mL/瓶，放2-8'C庫待檢。全文摘要本發(fā)明提供一種百白破、A+C群腦膜炎球菌-b型流感嗜血桿菌結(jié)合疫苗，采用A、C群腦膜炎奈瑟氏雙球菌、b型流感嗜血桿菌培養(yǎng)液，分別提取莢膜多糖，經(jīng)過純化、活化后，與破傷風(fēng)類毒素結(jié)合，然后將A、C群腦膜炎多糖結(jié)合疫苗原液、b型流感嗜血桿菌結(jié)合疫苗原液與無細(xì)胞百白破原液按一定比例混合，獲得一針多種免疫的效果。文檔編號A61K39/095GK101590225SQ20091006715公開日2009年12月2日申請日期2009年6月19日優(yōu)先權(quán)日2009年6月19日發(fā)明者孫惠軍,爽巨,沖李,楊宗輝,梁艷婷,牟盈盈申請人:長春長生生物科技股份有限公司