術(shù)語"膽固醇的衍生物"是指類固醇家族的分子，其通常從膽固醇前 體分子開始來獲得并且具有親脂性質(zhì)。
[0036] 在本發(fā)明的一個實施方案中，所述包含EGF的囊泡的特征為：其具有單層結(jié)構(gòu)，和 大約在25和500nm之間，優(yōu)選地在50和300nm之間的平均大小。在一個特別的實施方案 中，本發(fā)明涉及其中EGF被摻入到囊泡雙層中的囊泡。通過Cryo-TEM來評價囊泡的近似大 小和形態(tài)學，和通過DLS來表征囊泡的大小分布。
[0037] 令人驚訝地，本發(fā)明的囊泡相比于游離的EGF和在"膽固醇：DPPC"脂質(zhì)體中的EGF 而言顯示出EGF的生物學效能的顯著增加（體外測量的）。此外，這些囊泡能夠保護EGF 對抗蛋白酶的攻擊（這是對于在作用位點處得到足夠的EGF生物利用率來說非常重要的特 征），并因此提高了其治療效力。
[0038] 在本發(fā)明中，首次合成了這樣的EGF囊泡，其改善了該生長因子的一些藥學和藥 理學特性，例如其效能和穩(wěn)定性。已證明了，EGF摻入到囊泡結(jié)構(gòu)中的程度在至少一年期間 保持穩(wěn)定。另外，它們使得能夠增加穿過生物膜的滲透性。
[0039] 作為額外的優(yōu)點，本發(fā)明的囊泡具有抗微生物和抗真菌效應，這在用于治療復雜 傷口和其他能夠用EGF進行治療的損傷的組合物中是所希望的。
[0040] 在本發(fā)明的一個實施方案中，所述包含EGF的囊泡通過CF技術(shù)來獲得。在一個特 別的實施方案中，用于獲得所述囊泡的CF技術(shù)包括這樣的工藝過程，其包括：a)制備EGF 和陽離子型表面活性劑的水溶液；b)將膽固醇或其衍生物溶解在用CF使之膨脹的有機溶 劑中；和c)通過在得自步驟a)的溶液上將得自步驟b)的溶液減壓來合成囊泡。在一個優(yōu) 選的實施方案中，在步驟a)中所使用的陽離子型表面活性劑為季銨類型的陽離子型表面 活性劑。
[0041] 本發(fā)明還提供了用于制備包含EGF、陽離子型表面活性劑和膽固醇或其衍生物的 囊泡的方法，其特征在于，所述方法包括：a)制備EGF和陽離子型表面活性劑的水溶液；b) 將膽固醇或其衍生物溶解在用CF使之膨脹的有機溶劑中；和c)通過在得自步驟a)的溶液 上將得自步驟b)的溶液減壓來合成囊泡。在本發(fā)明的一個實施方案中，上面所描述的方法 包括季銨類型的陽離子型表面活性劑。
[0042] 在本發(fā)明的一個實施方案中，上面所描述的方法的步驟b)的有機溶劑為選自下 列的溶劑：一元醇，例如乙醇、甲醇、1-丙醇、2-丙醇、1-丁醇、1-己醇、1-辛醇和三氟乙醇； 多元醇，例如丙二醇、PEG400和1,3-丙二醇；酮類，例如丙酮、甲基?乙基酮和甲基?異丁 基酮；乙二胺；乙腈；乙酸乙酯；和其混合物。在任何情況下，不論有機溶劑的性質(zhì)如何，脂 質(zhì)組分必須是在其中可溶的，并且此外所述溶劑必須是一定與CF和水可混溶的。此外，所 選擇的有機溶劑應當具有相對低的毒性。
[0043] 在初始緩沖液中EGF和表面活性劑的相對濃度和在有機溶劑中膽固醇的濃度將 由在最終囊泡中所希望的"膽固醇：陽離子型表面活性劑：EGF"比值來確定。通常，"膽固 醇：陽離子型表面活性劑：EGF"比率可以影響所獲得的各種不同囊泡的物理化學和生物學 特征。
[0044] 在本發(fā)明的另一個實施方案中，在上面所描述的方法中所使用的CF為選自下列 的化合物：CO 2、乙烷、丙烷、氟氯烴（例如，CFC-22)和含氟烴（例如，HFC-134A)。優(yōu)選地， 在步驟b)中的CF為CO 2，其被認為是生態(tài)型溶劑，因為它是無毒的，不易燃的，非腐蝕性的， 對周圍環(huán)境無害的，并且此外它在自然界中是非常豐富的。
[0045] 在本發(fā)明的一個實施方案中，以如在圖1中所呈現(xiàn)的那樣的組合體中實施所述用 于制備EGF囊泡的方法。所述組合體由高壓反應器（R)組成，在大氣壓和工作溫度（T = Tw) 下向所述高壓反應器中添加濃度為Cl的膽固醇在乙醇中的溶液。在第二步中，添加經(jīng)壓縮 的CO 2直至工作壓力（P = Pw)，從而導致溶液發(fā)生體積膨脹至摩爾分數(shù)Χω2。所述添加通過 使用泵Pl經(jīng)由閥門V-I (同時保持其余閥門關(guān)閉）來進行。將該系統(tǒng)在壓力Pw和溫度T w 下保持確定的時間以保證完全均質(zhì)化和熱平衡。在該時間過后，打開V-4,目的是接通反應 器R與過濾器FL (其事先已用N2加壓至P w)，同時保持其余閥門關(guān)閉。V-6的打開允許體積 經(jīng)膨脹的溶液在通過P2泵送的濃度為C2的EGF和濃度為C3的表面活性劑的水溶液上減 壓。在該最后一步中，將在Pw下通過V-2添加的N 2流用作活塞以用于推動經(jīng)膨脹的溶液， 和用于在減壓步驟期間保持反應器內(nèi)的壓力恒定。過濾器FL的存在使得能夠收集在該工 藝過程期間可能形成的任何沉淀物。將所形成的囊泡收集在容器C中，并隨后在4°C下貯 存在玻璃瓶中。一旦減壓結(jié)束，就關(guān)閉V-6和V-2,并且通過重新打開V-6來進行設(shè)備的減 壓。
[0046] 在本發(fā)明的一個實施方案中，CF的量與有機溶劑的量之間的比率相應于大約0. 3 至0. 95,優(yōu)選地0. 5至0. 8的CF摩爾分數(shù)。在一個特別的實施方案中，在反應器中，在大約 1至30MPa的壓力Pw和大約10至70°C的溫度T w下進行膽固醇（或其衍生物）在CF中的 溶解。優(yōu)選地，反應器的大致溫度在10和50°C之間。
[0047] 在作為本發(fā)明目標的方法中，將EGF溶解在包含陽離子型表面活性劑的水溶液 中，所述陽離子型表面活性劑的濃度在其臨界膠束濃度之上。
[0048] 令人驚訝地，通過使用上面所描述的方法而合成的"膽固醇：QUAT:EGF"囊泡具有 非常接近100%的EGF摻入到囊泡中的產(chǎn)率，這比對于任何水溶性分子的摻入所預期的產(chǎn) 率顯著地更高，考慮到以前對于慶大霉素所報道的結(jié)果。在"膽固醇-QUAT-EGF"囊泡中的 這些產(chǎn)率也比在具有與EGF相似的結(jié)構(gòu)特性的其他蛋白質(zhì)（例如，牛血清白蛋白（BSA)這 種水溶性蛋白質(zhì)）的摻入中所獲得的產(chǎn)率明顯更高。這甚至在當為了所述BSA摻入而使用 上面所描述的DELOS-SUSP程序時也出現(xiàn)，因為僅獲得42%的摻入產(chǎn)率。
[0049] 另一方面和也令人驚訝地，EGF摻入到"膽固醇：QUAT"囊泡中的這些產(chǎn)率明顯高 于在"膽固醇：DPPC:EGF"囊泡中所獲得的產(chǎn)率，甚至在使用DELOS-SUSP方法來制備其的情 況下。
[0050] 本發(fā)明的另一個方面為藥物組合物，其包含EGF囊泡、陽離子型表面活性劑和膽 固醇或其衍生物，和至少一種藥學上可接受的賦形劑。在藥學上可接受的賦形劑（其是本 發(fā)明的藥物組合物的一部分）可以改善囊泡的活性。備選地，它們可以有助于本發(fā)明的組 合物的操作和加工。本發(fā)明的EGF囊泡可以配制成各種藥學形式，例如：注射劑、霧化液體 或"噴霧劑"、凝膠、粘性溶液、霜劑、軟膏劑、透皮貼劑、貯庫制劑、吸入制劑和其他本領(lǐng)域技 術(shù)人員已知的形式。
[0051] 在合成本發(fā)明的囊泡期間或之后，可以混合各種不同的賦形劑，目的是形成適合 于上面所提及的劑型的材料。通常，可以為了慣常的目的和以典型的量使用賦形劑例如 增溶劑或溶劑、表面活性劑、PH調(diào)節(jié)劑、抗氧化劑、稀釋劑、基質(zhì)系統(tǒng)、絡(luò)合劑、增粘劑、分 散劑、潤濕劑、著色劑、香料、防腐劑、滲透增強劑等，而不影響本發(fā)明的組合物的特征，如 本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的那樣（Remington' s Pharmaceutical Sciences (1995))。其他待 在EGF囊泡的藥物制劑中使用的賦形劑的另外例子可以在Handbook of Pharmaceutical Excipients(第6版）中找到。
[0052] 在本發(fā)明的一個實施方案中，所述藥物組合物為受控釋放或持續(xù)釋放形式。所述 受控釋放或持續(xù)釋放形式通常包括基質(zhì)系統(tǒng)、離子交換樹脂或控制EGF囊泡擴散的特定屏 障。
[0053] 在本發(fā)明的一個實施方案中，為了制備所述藥物組合物，使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已 知的設(shè)備，通過濃縮-滲濾方法來對EGF囊泡進行調(diào)適。本發(fā)明的藥物組合物可以通過不 同的途徑來進行施用，尤其是通過全身途徑、損傷內(nèi)途徑、粘膜途徑、局部途徑、透皮途徑、 眼途徑，或者作為吸入制劑。
[0054] 在另一個方面，本發(fā)明包括EGF、陽離子型表面活性劑和膽固醇或其衍生物的囊泡 在制備藥物中的用途。在本發(fā)明的一個實施方案中，所述藥物旨在用于在任何哺乳動物物 種中治療其中需要輔助愈合和組織再生過程的疾??；其中組成所述囊泡的陽離子型表面活 性劑、膽固醇和EGF是在藥學上可接受的。在一個優(yōu)選的實施方案中，所述哺乳動物為人。
[0055] 上述的作為藥物的用途包括施用有效量的所述囊泡以用于治療需要外源施用EGF 的疾病，以便調(diào)節(jié)上皮細胞的增殖、生長和迀移過程或者誘導血管發(fā)生。
[0056] 通常，設(shè)想了，在施用本發(fā)明的EGF囊泡（或包含其的組合物）中的有效濃度將會 為I. 0至200 μ g/mL的EGF等價物/施用，優(yōu)選地5. 0至100 μ g/mL的EGF等價物/施用。 施用的體積和頻次取決于損傷類型、其大小和所使用的施用裝置，如本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟 知的那樣。在一天期間以合適的間隔按照兩個、三個、四個或更多個亞劑量施用所需要的劑 量也可以是合適的。
[0057] 施用的確切用量和頻次取決于待治療的具體病況及其嚴重度、年齡、體重、性別、 疾病的范圍和患者的總體身體狀況，以及向個體施用的任何其他伴隨藥劑，正如本領(lǐng)域技 術(shù)人員所熟知的那樣。此外，明顯的是，上述的日有效量可以減少或增加，這取決于患者對 于所述藥劑如何反應，和/或取決于由開出本發(fā)明的藥物的醫(yī)生所做的評價。因此，上面所 提及的日有效量應當被視為指導或建議。
[0058] 在本發(fā)明的一個實施方案中，用本發(fā)明的囊泡制備的藥物用于治療任何外周軟組 織部位的復雜傷口。在一個特別的實施方