快速培育牛黃的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種名貴中藥原料的制備方法，特別涉及一種天然牛黃的體外替代 品一培育牛黃的制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 天然牛黃是干燥的牛色素性膽結(jié)石。自古以來，天然牛黃就是一種名貴的中藥材 和原料藥。其有清熱解毒、涼肝息風(fēng)和清心開竅之效。主用于治療高熱神昏、癲癇抽搐、中 風(fēng)迷痰、口舌生瘡等癥。其既可直接施用于患者，也能以之為原料，使用于超過600種的中 成藥。其中最重要的包括安宮牛黃丸，安神丸，片仔癀等名貴藥品。但是天然牛黃因其稀缺 性和品質(zhì)不一致性，在使用范圍上受到嚴重限制。另外，加上國家政策對天然牛黃進口的限 制，天然牛黃數(shù)量嚴重供不應(yīng)求，價格節(jié)節(jié)攀升。目前，天然牛黃價格已超過等量黃金。尋 找體外形成牛黃的方法已成為醫(yī)學(xué)工作者長期的工作目標(biāo)。
[0003] 天然牛黃的體外替代品包括如下的人工牛黃、培植牛黃和培育牛黃：
[0004] 1)人工牛黃是價格最低廉的牛黃替代品。其制作方法是把牛黃中的部分成分（膽 酸，脫氧膽酸，少量膽紅素）和淀粉混合而成。無論其成分、含量、理化性質(zhì)和醫(yī)學(xué)效果都與 天然牛黃相去甚遠，因而其使用受到嚴格限制。根據(jù)國家中藥局相關(guān)規(guī)定，人工牛黃嚴禁使 用于各類急救藥物。
[0005] 2)培植牛黃是我國醫(yī)學(xué)工作者根據(jù)膽結(jié)石形成的機制，改造活牛膽囊的解剖結(jié) 構(gòu)，人工植入能加速促成膽結(jié)石的細菌和其他成分，形成有利于膽結(jié)石形成的微觀條件，從 而誘導(dǎo)生成膽結(jié)石。該方法的不足之處在于生成周期長達2-3年，產(chǎn)石率低，產(chǎn)品質(zhì)量不一 致，且需殺牛取石。因此，培植牛黃無法規(guī)?；a(chǎn)而不具備經(jīng)濟可行性。此外，該法也因 長期使用活體動物而受到動物保護人士的非議。
[0006] 3)培育牛黃是世界上唯一經(jīng)濟上可行，技術(shù)上成熟的制造牛黃的方法。如：申請 號為：201110430982. 4,名稱為："一種制備牛膽結(jié)石的方法"的發(fā)明專利，其公開了如下技 術(shù)方案（流程如圖1所示）：
[0007] "一種制備牛膽結(jié)石的方法，其特征在于，包括如下步驟：
[0008] 一、制備發(fā)酵牛膽汁
[0009] (1)調(diào)節(jié)天然牛膽汁中的?；撬岷恐? - 7% (g/ml);
[0010] ⑵牛膽汁入罐后利用蒸汽進行滅菌處理，然后按每10000ml牛膽汁接種100 - 500ml菌液的比例，將大腸桿菌、變形桿菌或腸球菌的單一菌液或其組合菌液接種到牛膽汁 中，進行發(fā)酵處理；
[0011] (3)發(fā)酵完成后利用蒸汽對發(fā)酵液進行滅活處理；
[0012] 二、利用發(fā)酵牛膽汁制備復(fù)合膽紅素鈣
[0013] (1)取1000 - 4000ml純化水加入20 - 40g氧化鈣，攪拌，即得飽和氧化鈣溶液；
[0014] (2)取出定量的發(fā)酵牛膽汁，每1000 ml加入1000 - 4000ml飽和氧化鈣溶液以及 5 - 15g焦亞硫酸鈉，對其進行攪拌、加熱至沸騰，濾取棕紅色沉淀物；
[0015] (3)在棕紅色沉淀物中，加入適量的水進行攪拌、洗滌，靜置后濾去上清液，以除去 水溶性雜質(zhì)，再向沉淀中加入總重量35 - 55%的膽紅素、5 - 15%的膽酸、2. 5 - 7. 5%的 去氧膽酸、〇. 3 - 0. 6%的硫酸鋅、0. 3 - 0. 6%的硫酸鎂后，攪拌混勻；
[0016] (4)冷凍后低溫真空干燥；
[0017] 三、在15°C - 37°C條件下，利用發(fā)酵牛膽汁和復(fù)合膽紅素鈣在牛體外培育牛膽結(jié) 石
[0018] (1)制備成石膽汁
[0019] 在15 - 37°C下，每千克干燥的復(fù)合膽紅素鈣中添加500 - 1500ml發(fā)酵牛膽汁、 0. 4g - I. 2g焦亞硫酸鈉、亞硫酸氫鈉或硫代硫酸鈉的單一組份或其混合物作為抗氧劑，再 按發(fā)酵牛膽汁：純化水=(1 一 3) :1的體積比例加入適量的純化水，充分攪拌后，靜置，制 成成石膽汁；
[0020] (2)培育牛膽結(jié)石
[0021 ] 對成石膽汁用酸液進行pH調(diào)節(jié)，使其pH值在6. 8以下，然后對成石膽汁進行偏心 定向旋轉(zhuǎn)，待其類球形結(jié)石形成后，停止旋轉(zhuǎn)，靜置培育，取出結(jié)石；
[0022] (3)牛膽結(jié)石的整形
[0023] (4)牛膽結(jié)石的低溫真空干燥"。
[0024] 按照該技術(shù)方案制備的產(chǎn)品的理化結(jié)構(gòu)、成分、含量和藥效均與天然牛黃一致，完 全滿足最新版《中國藥典》的要求。國家中藥局授予其可完全等量于天然牛黃使用的資質(zhì)。
[0025] 但是，該技術(shù)方案仍存有如下不足：
[0026] 1)生產(chǎn)周期長。通常，該技術(shù)從膽汁發(fā)酵到成品出爐需要7天左右。
[0027] 2)在制備過程中所加入的發(fā)酵菌（例如大腸桿菌）會不可避免地消耗掉新鮮牛膽 汁中一些有益藥效的成分，產(chǎn)生作用不明的物質(zhì)，所產(chǎn)生的不明物質(zhì)包括細菌毒素、致敏物 質(zhì)和發(fā)熱源。
[0028] 3)細菌（即上述大腸桿菌）的引入是潛在的生物危險因素。
[0029] 4)在制備過程中所加入的復(fù)合膽紅素鈣是一種弱酸強堿鹽，在pH < 6. 8的條件 下，很容易與H+反應(yīng)生成游離膽紅素，過高的游離膽紅素被空氣中的02氧化生成膽綠素，其 在牛黃中的含量需嚴格控制，若其濃度過高則會對人體產(chǎn)生不良作用，如對機體細胞產(chǎn)生 毒性作用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0030] 本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種成本低、制備周期短、性能穩(wěn)定且副作用小 的快速培育牛黃的方法。
[0031] 為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為：
[0032] 本發(fā)明的快速培育牛黃的方法，包括獲取天然牛膽汁的步驟，還包括以下步驟：
[0033] 1)制備含纖維蛋白原和其它凝血因子的基本原液；
[0034] 2)依據(jù)藥用要求，按重量百分比配制如下混合物備用：
[0035] 脫氧膽酸： 5 - 15%; 膽酸： 5 - 21%; 膽紅素鈣： >55%; 膽固醇： 5- 磷脂： 1-2%； 氯化鈣： 0.1 - 1%;
[0036] 3)依據(jù)藥用要求，配制如下混合液備用：
[0037] ?；撬幔? - 10%;
[0038] 按需加入微量 FeS04、MgSO4和 ZnSO 4;
[0039] 4)按常規(guī)方法取得與所述混合物用量成比例的新鮮牛膽汁備用；
[0040] 5)按以下四種流程中的任意一種流程制備牛膽結(jié)石沉淀物：
[0041] 流程一：
[0042] a.將備用的基本原液、新鮮牛膽汁和混合物加入反應(yīng)器皿中；
[0043] b.再將緩沖液加入所述反應(yīng)器皿中，調(diào)節(jié)pH至7. 3 ±0. 3 ;
[0044] c.然后向所述反應(yīng)器皿中加入凝血酶，所述凝血酶與纖維蛋白原的比例為 0.05 - 10IU/mg ；
[0045] d.采用水浴或氣浴對反應(yīng)器皿進行升溫，在30±10°C的環(huán)境中溫育，溫育期間， 持續(xù)混勻時間不低于10秒鐘；
[0046] 流程二：
[0047] a.將按凝血酶與所述基本原液中的纖維蛋白原的比值為0. 05 - lOIU/mg的比例 獲取的凝血酶、所述備用的新鮮牛膽汁和混合物加入反應(yīng)器皿中；
[0048] b.將緩沖液加入所述反應(yīng)器皿中，調(diào)節(jié)pH至7. 3±0. 3 ;
[0049] c.再將備用的基本原液加入所述的反應(yīng)器皿中；
[0050] d.采用水浴或氣浴對反應(yīng)器皿進行升溫，在30±10°C的環(huán)境中溫育，溫育期間， 持續(xù)混勻時間不低于10秒鐘；
[0051] 流程二：
[0052] a.將所述備用的基本原液和混合物加入反應(yīng)器皿中；
[0053] b.將緩沖液加入所述反應(yīng)器皿中，調(diào)節(jié)pH至7. 3±0. 3 ;
[0054] c.再按凝血酶與所述基本原液中的纖維蛋白原的比值為0. 05 - lOIU/mg的比例 向所述反應(yīng)器皿中加入凝血酶；
[0055] d.再將備用的新鮮牛膽汁加入該反應(yīng)器皿中；
[0056] e.最后，采用水浴或氣浴對反應(yīng)器皿進行升溫，在30±10°C的環(huán)境中溫育，溫育 期間，持續(xù)混勻時間不低于10秒鐘；
[0057] 流程四：
[0058] a.按凝血酶與所述基本原液中的纖維蛋白原的比值為0. 05 - 10IU/mg的比例獲 取的凝血酶和所述備用的混合物加入反應(yīng)器皿中；
[0059] b.將緩沖液加入所述反應(yīng)器皿中，調(diào)節(jié)pH至7. 3 ±0. 3 ;
[0060] c.再將備用的基本原液加入所述的反應(yīng)器皿中；
[0061] d.再將備用的新鮮牛膽汁加入該反應(yīng)器皿中；
[0062] e.采用水浴或氣浴對反應(yīng)器皿進行升溫，在30±10°C的環(huán)境中溫育，溫育期間， 持續(xù)混勻時間不低于10秒鐘；
[0063] 6)將獲得的牛膽結(jié)石沉淀物分離之后去掉上清液，再加入備用的混合液，靜置；
[0064] 7)之后，再對上述牛膽結(jié)石沉淀物偏心旋轉(zhuǎn)形成球狀牛膽結(jié)石沉淀物；
[0065] 8)球狀牛膽結(jié)石沉淀物的整形；
[0066] 9)冷凍后低溫真空干燥形成牛膽結(jié)石。
[0067] 所述基本原液按以下方法獲取：
[0068] 1)在動物全血中加入抗凝劑；
[0069] 2)從含有抗凝劑的動物全血中分離出動物血漿；
[0070] 3)將動物血漿置于0°C以下保存；
[0071] 4)將冷凍后的動物血漿置于0 - KTC的環(huán)境中解凍；
[0072] 5)從解凍后的血漿中分離出含有纖維蛋白原和其它凝血因子的血漿解凍沉淀物。
[0073] 所述血漿解凍沉淀物按以下步驟獲?。?br>[0074] 1)取濃度為3. 2 %的檸檬酸鈉作為抗凝劑，抗凝劑與動物血液的體積比值為1 : 9 ；
[0075] 2)以1500g的離心力，離心15 - 20分鐘制成血漿；
[0076] 3)將上述血漿置于一