0038) 中培養(yǎng)，每隔一天更換培養(yǎng)基，直到達到70%的飽和度。該細胞在包含2%馬血清（HS)的 培養(yǎng)基中誘導(dǎo)分化成肌細胞。在包含2%馬血清（HS)的培養(yǎng)基中培養(yǎng)4天后，用魁蒿提取 物，絞股藍葉提取物，黃芪提取物，或它們的混合物（200 μ g/mL)處理。使用相對于培養(yǎng)基 1/1000體積的DMSO作為陰性對照組。用每個樣品處理過的細胞在37°C下培養(yǎng)24小時后， 用涼的生理鹽水清洗2次，用TRIzoI試劑（Invitrogen)提取RNA。cDNA用提取和測定數(shù) 量的RNA (1 μ g/μ L)在反轉(zhuǎn)錄試劑盒（Promega)中合成。
[0082] CPTl β，PDK4, PGCl α和GAPDH基因的表達模式用合成cDNA和引物 和探針（Applied Biosystems ;CPTiP，Mm00487200_ml;PDK4，Mm00447181_ml; PGCl-a Mm〇〇447181_ml ;GAPDH，Mm99999915_ql)來測定。使用 Rotor-Gene 3000 系統(tǒng) (Corbett Research, Sydney, Australia)來進行 PCR 和分析。結(jié)果展不在圖 4 中。
[0083] 從圖4可以看出，與使用陰性對照物質(zhì)或單獨使用物質(zhì)的相比，經(jīng)過這三種物質(zhì) 的混合物的處理，增加了 2倍或更多的CPTl β，TOK4和PGCl- α的表達。因此，服用了分別 活化PPAR- δ，AMPK和PGCl- α的混合物物質(zhì)可以促進肌肉的脂肪和糖類代謝。
[0084] 測試實施例5 :運動持續(xù)時間評價
[0085] (1)實驗鼠的準備
[0086] 5歲的雄性C57BL/6鼠分成正常飲食組，高脂肪飲食組和有氧運動組，每組10只 鼠。在8周內(nèi)，正常飲食組喂D12450B(10%脂肪，Research Diets, Inc.，NJ，USA)，高脂肪 飲食組喂D12492(60%脂肪）。有氧運動組喂養(yǎng)高脂肪飲食，并進行每周5次，以15m/mim 的速度在跑步機上跑步40分鐘。測試組喂養(yǎng)高脂肪飲食，并每天口服絞股藍葉提取物，魁 蒿提取物，黃芪提取物，EPA，以及魁蒿提取物，絞股藍葉提取物和黃芪提取物的混合物，或 EPA，絞股藍葉提取物和黃芪提取物（200mg/kg)的混合物。每周測量一次體重和采食量。
[0087] (2)運動持續(xù)時間的測量
[0088] 服用測試物質(zhì)后的8周，實驗鼠被迫在跑步機上以15m/min的速度跑步，并測量運 動持續(xù)時間。結(jié)果展示在圖5中。如圖5所示，服用了絞股藍葉提取物，魁蒿提取物和黃芪 提取物的混合物的組，相比于沒有經(jīng)過處理或只服用測試物質(zhì)的組，展示了提高約70%的 運動時間。
[0089] 因此，可見服用分別激活PPAR- δ、AMPK和PGCl- α混合物的物質(zhì)可以在較長時間 內(nèi)進行運動。
[0090] 測試實施例6 :體重和組織重量的測量
[0091] 將5歲的雄性C57BL/6老鼠與10個老鼠組成一組。實驗鼠在8周內(nèi)，每天一次口 服作為測試物質(zhì)的絞股藍葉提取物，魁蒿提取物，黃芪提取物或單獨的ΕΡΑ，魁蒿提取物，絞 股藍葉提取物和黃芪提取物的混合物，或ΕΡΑ，絞股藍葉提取物和黃芪提取物（200mg/kg) 的混合物。實驗鼠在解剖前禁食12小時。
[0092] 圖6展示了 8周體重的變化。圖6中，服用了絞股藍葉提取物，魁蒿提取物，黃芪 提取物的混合物的組和服用絞股藍葉提取物，EPA和黃芪提取物的混合物的組，相比于未經(jīng) 過處理或只服用測試物質(zhì)的組，分別展示了下降26%和28%的體重。
[0093] 圖7展示了附睪的脂肪重量，在圖7中，服用了絞股藍葉提取物，魁蒿提取物，黃芪 提取物的混合物的組和服用了絞股藍葉提取物，EPA和黃芪提取物的混合物的組，相比于未 經(jīng)過處理的陰性控制組或只服用測試物質(zhì)的組，分別展示了 34%和36%的體重下降值。
[0094] 圖8展示了鼠拓肌的分離和重量結(jié)果。在圖8中，服用了絞股藍葉提取物，魁蒿提 取物和黃芪提取物的混合物的組，和服用了絞股藍葉提取物，EPA和黃芪提取物的混合物的 組，相比于沒有經(jīng)過處理的陰性對照組或只服用測試物質(zhì)的組，鼠拓肌增加了約55%。
[0095] 因此，可以看到服用分別激活PPAR- δ，AMPK和PGCl- α的混合物質(zhì)在減少體重和 附睪脂肪重量的同時增加了肌肉量。
[0096] 測試實施例7 :血液分析
[0097] 將5歲的雄性C57BL/6老鼠與10個老鼠組成一組。實驗鼠在8周內(nèi)，每天一次口 服作為測試物質(zhì)的絞股藍葉提取物，魁蒿提取物，黃芪提取物或單獨的ΕΡΑ，魁蒿提取物，絞 股藍葉提取物和黃芪提取物的混合物，或ΕΡΑ，絞股藍葉提取物和黃芪提取物（200mg/kg) 的混合物。因此，進行血液分析來評定血糖水平，血清甘油三酯和膽固醇水平。
[0098] 用 accu-check 活性試劑盒（Roche Diagnostics, Seoul, Korea)檢測血糖。
[0099] 血液樣品在3000rpm速度下離心分離10分鐘來分離血清。用Vitalab Selectra E分析儀（Vital Scientific, Dieren, The Netherlands)分析分離的血清中的甘油三酯和 膽固醇的水平。結(jié)果展示在表1中。
[0100] 表 1
【主權(quán)項】
1. PPAR- δ激活物質(zhì)、AMPK激活物質(zhì)和PGCl- α激活物質(zhì)在制備用于加速肌肉類型轉(zhuǎn) 變的組合物中的用途， 其中，所述PPAR-δ激活物質(zhì)包括十二碳五烯酸； 所述AMPK激活物質(zhì)包括絞股藍葉提取物；及 所述PGCl- α激活物質(zhì)包括黃芪提取物。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于，所述肌肉類型轉(zhuǎn)變包括從快肌型到慢肌 型的轉(zhuǎn)變，或慢肌型的增加。 3. PPAR-δ激活物質(zhì)、AMPK激活物質(zhì)和PGCl-α激活物質(zhì)在制備用于增加肌肉量、強化 肌肉或增加運動能力的組合物中的用途， 其中，所述PPAR-δ激活物質(zhì)包括十二碳五烯酸； 所述AMPK激活物質(zhì)包括絞股藍葉提取物；及 所述PGCl- α激活物質(zhì)包括黃芪提取物。 4. PPAR-δ激活物質(zhì)、AMPK激活物質(zhì)和PGCl-α激活物質(zhì)在制備用于減少脂肪、抑制脂 肪堆積或降低血糖的組合物中的用途， 其中，所述PPAR-δ激活物質(zhì)包括十二碳五烯酸； 所述AMPK激活物質(zhì)包括絞股藍葉提取物；及 所述PGCl- α激活物質(zhì)包括黃芪提取物。 5. PPAR- δ激活物質(zhì)、AMPK激活物質(zhì)和PGCl- α激活物質(zhì)在制備用于控制體重或減少 體重的組合物中的用途， 其中，所述PPAR-δ激活物質(zhì)包括十二碳五烯酸； 所述AMPK激活物質(zhì)包括絞股藍葉提取物；及 所述PGCl- α激活物質(zhì)包括黃芪提取物。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1-5中任一項所述的用途，其特征在于，所述PPAR- δ激活物質(zhì)、AMPK 激活物質(zhì)和PGCl-α激活物質(zhì)以1-10:1-10:1-10的比例混合。
【專利摘要】本發(fā)明提供一種加速肌肉類型改變、增加肌肉量、強化肌肉、增強運動能力、減少脂肪、抑制脂肪堆積、降低血糖、控制體重或減少體重的組合物，該組合物包括作為活性成分的PPAR-δ啟動子、AMPK啟動子和PGC1-α啟動子。
【IPC分類】A61P3-04, A61P3-10, A61K36-481, A61K31-202
【公開號】CN104644727
【申請?zhí)枴緾N201510007435
【發(fā)明人】曺始永, 李知海, 裴日弘, 宋旼庭, 呂炫周, 徐大方, 金完起, 李尚駿
【申請人】株式會社愛茉莉太平洋
【公開日】2015年5月27日
【申請日】2011年4月6日
【公告號】CN102933222A, CN102933222B, US8652538, US9084785, US20130017280, US20140120187, WO2011126301A2, WO2011126301A3