達(dá)沙替尼抗肺纖維化應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于肺纖維化的防治技術(shù)領(lǐng)域，涉及達(dá)沙替尼抗肺纖維化的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]各型肺纖維化(pulmonary fibrosis, PF)皆以成纖維細(xì)胞(fibroblast, FB)增殖及大量細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)聚集為特征。多種因素均可引起肺纖維化，如職業(yè)性粉塵(Si02等)、放射性損傷及某些藥物(博萊霉素)等，此外還有一類不明病因的肺纖維化一特發(fā)性肺纖維化(id1pathic pulmonary fibrosis, IPF)。雖然起因不同，但纖維化的發(fā)展與結(jié)局基本相似，即由下呼吸道炎癥細(xì)胞浸潤起始，逐步引起肺泡上皮細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷，并伴有肌成纖維細(xì)胞(myofibroblast, MF)和II型肺泡上皮細(xì)胞增殖的細(xì)胞因子等的釋放，致細(xì)胞外基質(zhì)蛋白和膠原沉積，最終引起肺結(jié)構(gòu)的損害。肺纖維化晚期多引起心、肺功能衰竭而死亡，對人類危害極大。目前肺纖維化發(fā)生的確切機制尚不清楚，早期防治亦未獲得突破性進(jìn)展。
[0003]達(dá)沙替尼Clasatinibjv^SC22H26ClN7O2S.H20，為白色或類白色、雙凸橢圓型薄膜衣片。達(dá)沙替尼屬多酪氨酸激酶抑制劑，已經(jīng)用于治療包括甲磺酸伊馬替尼(Imatinibmesylate/Gleevec)耐藥或不能耐受的慢性骨髓性白血病所有病期(慢性期、加速期、淋巴系細(xì)胞急變期和髓細(xì)胞急變期)的成人患者。同時，F(xiàn)DA也經(jīng)正常程序批準(zhǔn)達(dá)沙替尼治療對其他療法耐藥或不能耐受的費城染色體陽性的急性淋巴細(xì)胞性白血病成人患者。目前尚無達(dá)沙替尼dasatinib在肺纖維化中的應(yīng)用報道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的在于提供達(dá)沙替尼抗肺纖維化的應(yīng)用，達(dá)沙替尼dasatinib可應(yīng)用于防治肺纖維化的藥物的制備。
[0005]本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案來實現(xiàn):
[0006]達(dá)沙替尼在制備抗肺纖維化藥物和或/保健品中的應(yīng)用。
[0007]所述的藥物和或/保健品為抑制新生血管生成的藥物和或/保健品。
[0008]所述的藥物和或/保健品為抑制博萊霉素誘導(dǎo)的新生血管生成的藥物和或/保健品O
[0009]所述的藥物和或/保健品為降低肺纖維化組織間質(zhì)中膠原堆積量的藥物和或/保健品。
[0010]所述的藥物和或/保健品為降低肺纖維化組織內(nèi)羥脯氨酸含量的藥物和或/保健品O
[0011]達(dá)沙替尼的動物給藥量為10?20mg/kg。
[0012]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益的技術(shù)效果:
[0013]本發(fā)明公開了達(dá)沙替尼(dasatinib)在抗肺纖維化中的應(yīng)用。在經(jīng)博來霉素誘導(dǎo)的小鼠肺纖維化模型中，博來霉素處理14天后灌胃給予達(dá)沙替尼dasatinib的情況下，達(dá)沙替尼(dasatinib)可以顯著改善肺纖維化狀況，羥脯氨酸含量也顯著下降。同時，達(dá)沙替尼(dasatinib)顯著抑制博來霉素誘導(dǎo)的新生血管生成。因此，本發(fā)明的實驗結(jié)果充分支持達(dá)沙替尼(dasatinib)在制備抗肺纖維化藥物和/或保健品的制備中應(yīng)用。
【附圖說明】
[0014]圖1為博來霉素誘導(dǎo)14天后給予達(dá)沙替尼dasatinib改善野生鼠中博來霉素誘導(dǎo)的肺纖維化(HE和Masson染色)結(jié)果圖；
[0015]圖2為博來霉素誘導(dǎo)14天后給予達(dá)沙替尼dasatinib改善野生鼠中博來霉素誘導(dǎo)的肺纖維化(羥脯氨酸含量)結(jié)果圖；
[0016]圖3為達(dá)沙替尼抑制博來霉素誘導(dǎo)的肺組織的血管生成結(jié)果圖；
[0017]圖4為達(dá)沙替尼抑制博來霉素誘導(dǎo)的肺組織的血管生成結(jié)果統(tǒng)計結(jié)果圖。
【具體實施方式】
[0018]下面結(jié)合具體的實施例對本發(fā)明做進(jìn)一步的詳細(xì)說明，所述是對本發(fā)明的解釋而不是限定。
[0019]用博萊霉素制作的肺纖維化模型，其病理組織學(xué)和生理學(xué)改變與人類肺纖維化近似，因此成為肺纖維化造模的常用藥物。博萊霉素經(jīng)鼻腔滴注給藥可誘導(dǎo)C57小鼠發(fā)生肺纖維化。在博來霉素滴鼻給藥14天后，灌胃給予藥物達(dá)沙替尼dasatinib，劑量為10mg/kg，對照組為等劑量的水。
[0020]達(dá)沙替尼dasatinib的配制:
[0021]首先配制達(dá)沙替尼dasatinib儲存濃度，稱取dasatinib溶于80mmol/LpH2.1的檸檬酸中，終濃度為10mg/ml ;然后配制達(dá)沙替尼dasatinib的工作濃度:用檸檬酸鈉(80mmol/L, pH3.1)稀釋10倍成lmg/mL。小鼠灌胃劑量為10mg/kg體重。
[0022]小鼠博來霉素誘導(dǎo)的肺纖維化模型的建立:取6-8周成年小鼠，腹腔注射I %戊巴比妥鈉100 μ L左右，將其放于籠中，讓其自然暈倒，左手揪住小鼠頸部皮膚，使其仰臥在手心上，小指夾住尾巴固定住小鼠，采用加樣槍通過鼻腔給藥的方式給予博來霉素(5mg/kg體重)或者PBS，給藥的過程中不時觀察小鼠的呼吸頻率，以免小鼠窒息死亡導(dǎo)致實驗失敗。將它們置于實驗室條件下4周(即通氣良好的20°C恒溫環(huán)境中，每12小時光照與黑暗交替，水糧足量，自由取用)，2周后每天給予達(dá)沙替尼dasatinib (10mg/kg體重)灌胃，4周后取小鼠肺臟組織，石蠟包埋固定。
[0023]1.1取6-8周成年C57小鼠20只，采用隨機分組的辦法，將小鼠隨機分為四組，即PBS-水、PBS-達(dá)沙替尼、博來霉素-水、博來霉素-達(dá)沙替尼，按照如上所述的方法建模，在開始建模后第14天開始灌胃10mg/kg劑量的達(dá)沙替尼dasatinib，對照組則灌胃水，至第28天停止灌胃。處死小鼠后，收集小鼠肺組織，用PBS沖洗2次，去除表面殘余的血液。用數(shù)碼相機留下全肺的照片，右肺行10%中性甲醛固定，用以后續(xù)的形態(tài)學(xué)染色，如HE染色、Masson染色等；左肺則直接放置液氮里，用于后續(xù)的蛋白檢測和羥脯氨酸含量的測定。
[0024]結(jié)果如圖1所示，10mg/kg達(dá)沙替尼dasatinib的處理，肺組織損傷部位已經(jīng)明顯降低(右/上)，Masson染色顯示膠原堆積也顯著減少(右/下)。因此，達(dá)沙替尼dasatinib的處理可以顯著緩解肺纖維化的形成。
[0025]1.2人體標(biāo)本實驗顯示，肺纖維化晚期間質(zhì)中堆積大量的膠原，膠原含量的多少反映了肺纖維化的水平。而羥脯氨酸在膠原蛋白中占13.4%，因此羥脯氨酸的含量能反映肺纖維化過程中膠原堆積的情況，進(jìn)而反應(yīng)肺纖維化程度。
[0026]羥脯氨酸含量的測定:采用南京建成羥脯氨酸(HYP)測定試劑盒(堿水解法)可以準(zhǔn)確測定肺組織中羥脯氨酸的含量，步驟如下:準(zhǔn)確稱取肺組織的重量；調(diào)PH至中性，定容至10mL，加活性碳離心；取上清ImL加Rl靜置10分鐘，加R2靜置5分鐘，加R3，60°C水浴15分鐘；3500轉(zhuǎn)/分離心10分鐘，取上清550nm波長測定吸光度值。
[0027]結(jié)果如圖2所示，由圖可見，博來霉素誘導(dǎo)的肺纖維化組織內(nèi)羥脯氨酸含量較PBS對照組明顯升高，而達(dá)沙替尼dasatinib處理后，羥脯氨酸的含量降至幾乎與對照組持平，且兩組之間有顯著性差異，說明達(dá)沙替尼dasatinib顯著緩解了博來霉素誘導(dǎo)的肺纖維化狀況。
[0028]1.3病理性的血管生成是肺纖維化等疾病的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，這種持續(xù)、無控性、無規(guī)則的新血管生成推動了疾病的發(fā)展。達(dá)沙替尼為多酪氨酸激酶抑制劑，主要靶點有BCR/Abl，Src, c-Kit, ephrin受體以及其他酪氨酸激酶受體等，而這些靶點多與血管生成有關(guān)，因此明確達(dá)沙替尼dasatinib在肺纖維化過程中血管生成中的作用尤為重要。⑶31抗原廣泛表達(dá)于血管的各種細(xì)胞上，免疫熒光檢測指標(biāo)可作為機體血管生成的標(biāo)志。
[0029]經(jīng)灌胃達(dá)沙替尼dasatinib處理的肺組織切片進(jìn)行抗⑶31抗體免疫熒光染色，具體步驟如下:切片二甲苯脫錯入梯度酒精，PBS漂洗5min，0.5% Triton穿孔15min ；PBS漂洗2次，每次5min ;1 % BSA封閉30min ;加入PBS稀釋的一抗(1:200)，放置于濕盒4°C過夜；PBS漂洗2次，每次5min ;加入PBS稀釋的二抗，于室溫雜交Ih ；PBS漂洗2次，每次5min ；5 μ g/mL DAPI染色1min ;抗淬滅封片劑封片；Nikon共聚焦顯微鏡采集。
[0030]結(jié)果如圖3所示，由圖可見，博來霉素誘導(dǎo)的模型組經(jīng)灌胃水處理可見新生小血管增多，排列紊亂，形態(tài)不規(guī)則；而達(dá)沙替尼dasatinib處理組可見新生小血管明顯減少，可見達(dá)沙替尼dasatinib顯著抑制博來霉素誘導(dǎo)的新生血管生成。
[0031]1.4為1.3數(shù)據(jù)的統(tǒng)計結(jié)果，如圖4所示，由圖可見，達(dá)沙替尼dasatinib處理組，相對熒光強度顯著降低，兩者有統(tǒng)計學(xué)差異，可見達(dá)沙替尼dasatinib顯著抑制博來霉素誘導(dǎo)的新生血管生成。
【主權(quán)項】
1.達(dá)沙替尼在制備抗肺纖維化藥物和或/保健品中的應(yīng)用。
2.如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的藥物和或/保健品為抑制新生血管生成的藥物和或/保健品。
3.如權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的藥物和或/保健品為抑制博萊霉素誘導(dǎo)的新生血管生成的藥物和或/保健品。
4.如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的藥物和或/保健品為降低肺纖維化組織間質(zhì)中膠原堆積量的藥物和或/保健品。
5.如權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的藥物和或/保健品為降低肺纖維化組織內(nèi)羥脯氨酸含量的藥物和或/保健品。
6.如權(quán)利要求1?5中任意一項所述的應(yīng)用，其特征在于，達(dá)沙替尼的動物給藥量為.10 ?20mg/kg。
【專利摘要】本發(fā)明公開了達(dá)沙替尼抗肺纖維化應(yīng)用，屬于肺纖維化的防治技術(shù)領(lǐng)域。在博來霉素誘導(dǎo)的小鼠肺纖維化模型中，博來霉素處理14天后灌胃給予達(dá)沙替尼dasatinib的情況下，達(dá)沙替尼dasatinib可以顯著改善肺纖維化狀況，羥脯氨酸含量也顯著下降。同時，達(dá)沙替尼dasatinib顯著抑制博來霉素誘導(dǎo)的新生血管生成。因此，本發(fā)明的實驗結(jié)果充分支持達(dá)沙替尼dasatinib在制備抗肺纖維化藥物和/或保健品的制備中應(yīng)用。
【IPC分類】A61P11-00, A23L1-30, A61K31-506
【公開號】CN104546855
【申請?zhí)枴緾N201510014106
【發(fā)明人】蘇金, 趙虎, 藥立波, 卜歆, 于江天
【申請人】中國人民解放軍第四軍醫(yī)大學(xué)
【公開日】2015年4月29日
【申請日】2015年1月12日