專利名稱：原位注射具有基因上增進細胞因子表達的抗原呈遞細胞的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明是有關(guān)于免疫學(xué)的領(lǐng)域。特別地，本發(fā)明是有關(guān)于基因修飾的職業(yè)抗原呈遞細胞(professional antigen-presenting cell)的使用，以對抗感染或腫瘤。
背景技術(shù)：
在對于腫瘤以及病毒抗原的細胞免疫反應(yīng)的早期事件的關(guān)鍵分析，已鑒定樹突狀細胞(dendritic cells)是引起有效的T細胞反應(yīng)的主要抗原呈遞細胞(APCs)(Steinman(1991)，Annu.Rev.Immunol.，卷9頁271-296；Macatonia等人(1989)，J.Exp.Med.，卷169頁1255-1264)。適當(dāng)活化的樹突狀細胞(DCs)取食可溶性抗原以及脫噬體(apoptotic bodies)，移動至淋巴結(jié)的皮質(zhì)周邊(paracortical)富含T細胞的區(qū)域，并激活一連串的相互作用，其導(dǎo)致抗原專一性T細胞的選擇，以及DC細胞因子(cytokine)、干擾素-α(interferon-α；IFN-α)和白介素-12(interleukin-12；IL-12)的釋放。
先前已證實，以合成的腫瘤相關(guān)肽而脈沖輸送的DCs的給藥，作為有效醫(yī)療的抗腫瘤疫苗，引起活體外有效的抗腫瘤免疫反應(yīng)，以及在老鼠中接著而來的繼承性轉(zhuǎn)移(Mayordomo等人(1995)，Nature Med.，卷1頁1297-1302；Zitvogel等人(1996)，J.Exp.Med.，卷183頁87-97；Porgador及Gilboa(1995)，J.Exp.Med.，卷182頁255-260；Porgador等人(1996)，J.Immunol.，卷156頁2918-2926)。然而，T細胞所定義的抗原決定部位只對于有限的人類腫瘤類型而定義。許多用以克服這個問題的方法，包括使用以酸洗脫(acid-eluted)的大量腫瘤肽(Zitvogel等人(1996))、腫瘤萃取物及RNA(Flamand等人(1994)，Eur.J.Immunol.，卷24頁605-610；Ashley等人(1997)，J.Exp.Med.，卷186頁1177-1182；Boczkowski等人(1996)，J.Exp.Med.，卷184頁465-472)，或?qū)⒛[瘤與DC融合(Gong等人(1997)，Nature Med.，卷3頁558-561)，這些已使用于以DC為基礎(chǔ)的對抗腫瘤的疫苗策略。即使這些方法將提供腫瘤的治療，而這些腫瘤尚未清楚顯示其腫瘤相關(guān)抗原的特性，但這些方法仍有明顯的問題，特別是來自人類固體癌癥的臨床樣本的制備。
IL-12是由DCs、巨噬細胞、多形核白血球以及角質(zhì)形成細胞(keratinocytes)所制造的異質(zhì)二聚體(heterodimeric)細胞因子(Lamont及Adorini(1996)，Immunol.Today，卷17頁214-217)。IL-12增強天然殺手(NK)細胞以及細胞毒性T淋巴細胞(CTL)的活性，在包括IFN-γ制造的Th1免疫反應(yīng)的誘導(dǎo)上扮演重要的角色，并且具有依賴IFN-γ/干擾素誘導(dǎo)蛋白質(zhì)-10(IP-10)的抗血管生成效果(Lamont及Adorini(1996)，如先前的文章；Voest等人(1995)，J.Natl.CancerInst.，卷87頁581-586；Sgadari等人(1996)，Blood，卷87頁3877-3882)。在與CD40及第二類分子連接之后，推測只有在與T細胞相互作用之后，DCs才具有制造IL-12的能力，并且連同DCs的IL-12傳遞作用，可增強活體外的CTL反應(yīng)(Heufler等人(1996)，Eur.J.Immunol.，卷26頁659-668；Koch等人(1996)，J.Exp.Med.，卷184頁741-746；Bhardwaj等人(1996)，J.Clin.Invest.，卷98頁715-722)。
在以IL-12基因修飾的腫瘤細胞，以及以全身性的IL-12蛋白質(zhì)給藥的疫苗接種模式中，已有IL-12的有效的抗腫瘤效果的報導(dǎo)(Brunda等人(1993)，J.Exp.Med.，卷178頁1223-1230；Nastala等人(1994)，J.Immunol.，卷153頁1697-1706；Tahara等人(1995)，J.Immunol.，卷154頁6466-6474；Martinotti等人(1995)，Eur.J.Immunol.，卷25頁137-146)。直接注射IL-12所轉(zhuǎn)導(dǎo)(transduced)的成纖維細胞，也可有效地減少已建立的腫瘤，并伴隨著隨之而來的有效的全身性免疫的誘導(dǎo)(Zitvogel等人(1995)，J.Immunol.，卷155頁1393-1403)?；谶@些結(jié)果，IL-12基因療法的初期臨床試驗，已在第一期研究的背景中，藉由使用自體移植的成纖維細胞而完成(Tahara等人(1997)，Proc.Am.Soc.Clin.Oncol.，卷16頁439a)。在具有黑色素瘤、乳癌、以及頭頸部腫瘤持續(xù)存在多達二年的病患中，觀察到部份的反應(yīng)。
發(fā)明摘述本發(fā)明部份取決于此發(fā)現(xiàn)，也就是已被基因修飾而增強免疫刺激性細胞因子表達的職業(yè)抗原呈遞細胞，在沒有以抗原使APCs預(yù)裝載(pre-loading)或興奮的情況下，可直接注射進入感染或腫瘤的位置或其附近，以誘導(dǎo)對抗與感染或腫瘤相關(guān)的抗原的專一性免疫反應(yīng)。特別地，已發(fā)現(xiàn)樹突狀細胞(DCs)，及較佳的是骨髓衍生的樹突狀細胞(BM-DCs)或CD34+衍生的樹突狀細胞(CD34+-DCs)，其已被基因修飾以增強免疫刺激性細胞因子的表達，較佳地是白介素-12(IL-12)，可注射進入感染或腫瘤的位置或其附近，以誘導(dǎo)對抗與注射位置相關(guān)的抗原的專一性免疫反應(yīng)。
因此，本發(fā)明的一個觀點是提供用以治療具有感染或腫瘤的個體的方法，包括以一有效量的職業(yè)抗原呈遞細胞(PAPCs)注射個體的感染或腫瘤的位置或其附近，而此職業(yè)抗原呈遞細胞已被基因修飾，以增強免疫刺激性細胞因子的表達。
在較佳具體實施例中，基因修飾的APCs是職業(yè)抗原呈遞細胞，最佳地，PAPCs是選擇自CD34+衍生的樹突狀細胞、骨髓衍生的樹突狀細胞、單核細胞衍生的樹突狀細胞、脾臟細胞衍生的樹突狀細胞、皮膚衍生的樹突狀細胞、濾泡衍生的樹突狀細胞、以及胚種中心(germinal center)衍生的樹突狀細胞所組成的族群中的樹突狀細胞。在特別較佳的具體實施例中，樹突狀細胞是CD34+衍生的樹突狀細胞，其在至少一個因子的存在下培養(yǎng)，此因子是選擇自G-CSF、GM-CSF、TNF-α、IL-4、Flt-3配體(ligand)以及kit配體所組成的族群中。
除此之外，在較佳具體實施例中，免疫刺激性細胞因子是選擇自白介素(例如，IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-3、IL-4、IL-6、IL-8、IL-9、IL-10、IL-12、IL-18、IL-19、IL-20)、干擾素(例如，IFN-α、IFN-β、、IFN-γ)、腫瘤壞死因子(TNF)、轉(zhuǎn)形生長因子-β(TGF-β)、粒細胞群叢形成促進因子(G-CSF)、巨噬細胞群叢形成促進因子(M-CSF)、粒細胞-巨噬細胞群叢形成促進因子(GM-CSF)、Flt-3配體以及kit配體所組成的族群中。
此外，在較佳具體實施例中，APCs已藉由轉(zhuǎn)導(dǎo)編碼免疫刺激的該細胞因子的病毒載體而基因修飾，最佳的是，以反轉(zhuǎn)錄病毒載體而基因修飾。然而，在其它的具體實施例中，APCs可藉由腺病毒載體或腺病毒相關(guān)的病毒載體而基因修飾，或藉由脂質(zhì)感染(lipofection)、彈道注射(ballistic injection)，或在此領(lǐng)域中所熟知的其它基因修飾的方法而修飾。
此外，在上述任何的具體實施例中，所治療的個體可以是罹患下列所組成的族群中的癌癥，黑色素瘤、肝癌、腺癌、基細胞癌、口腔癌、鼻咽癌、喉癌、膀胱癌、頭頸部癌、腎細胞癌、胰臟癌、肺癌、子宮頸癌、卵巢癌、食道癌、胃癌、前列腺癌、睪丸癌、乳癌、或其它固體癌癥。另外，個體可以是罹患難以治療的感染。
附圖
的簡單說明第1圖顯示藉由IL-12基因修飾的BM-DCs，制造IL-12的時間-產(chǎn)量關(guān)系圖。(A)在轉(zhuǎn)導(dǎo)的第四天之后，每天收集具有GM-CSF以及IL-4的DC培養(yǎng)的上清液，并在IL-12 ELISA中分析。(B)采集以IL-12基因轉(zhuǎn)導(dǎo)第六天的BM-DCs，清洗二次，并以106個細胞/毫升重新培養(yǎng)，以評估IL-12的制造?？招膱A圈表示無轉(zhuǎn)導(dǎo)的細胞，空三角形表示DFG-hCD80-neo所轉(zhuǎn)導(dǎo)的細胞，并且實心圓圈表示DFG-mIL-12所轉(zhuǎn)導(dǎo)的細胞。
第2圖顯示在注射HBSS(空心圓圈)、106個Zeo轉(zhuǎn)導(dǎo)的(三角形)以及IL-12轉(zhuǎn)導(dǎo)的(實心圓圈)BM-DCs進入腫瘤之后，所建立的(A)MCA205、(B)B16以及(C)D122腫瘤面積的改變。數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。
第3圖顯示由基因修飾的DCs所生產(chǎn)的IL-12，與腫瘤內(nèi)注射這些DCs，在MCA205腫瘤的面積上的效果之間的相關(guān)性。
第4圖顯示注射HBSS(空心圓圈)、106個Zeo轉(zhuǎn)導(dǎo)的(三角形)、IL-12轉(zhuǎn)導(dǎo)的(方塊)BM-DCs，或IL-12轉(zhuǎn)導(dǎo)的同基因的成纖維細胞(實心圓圈)，在所建立的MCA205腫瘤的生長上的效果。數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。
第5圖顯示重復(fù)注射HBSS(空心圓圈)、106個IL-12轉(zhuǎn)導(dǎo)的BM-DCs(實心圓圈)，或IL-12轉(zhuǎn)導(dǎo)的同基因的成纖維細胞(三角形)，在所建立的MCA205腫瘤的生長上的效果。數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。
第6圖顯示，(A)來自以HBSS(空心圓圈)、Zeo轉(zhuǎn)導(dǎo)的(三角形)以及IL-12轉(zhuǎn)導(dǎo)的(方塊)BM-DCs和IL-12轉(zhuǎn)導(dǎo)的成纖維細胞(實心圓圈)所處理的老鼠，其脾臟細胞對抗MCA205的腫瘤專一性的CTL活性；以及(B)來自以IL-12轉(zhuǎn)導(dǎo)的BM-DCs所注射的老鼠，其脾臟細胞對抗MCA205(空心圓圈)、YAC-1(三角形)以及同基因的成纖維細胞(方塊)的CTL活性。
第7圖顯示腫瘤內(nèi)注射HBSS(空心圓圈)、Zeo轉(zhuǎn)導(dǎo)的(三角形)以及IL-12轉(zhuǎn)導(dǎo)的(實心圓圈)BM-DCs，在(A)注射的以及(B)未注射的對側(cè)的MCA205或B16腫瘤面積上的效果。數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。
發(fā)明詳述定義為了更清楚地以及更簡潔地指出并說明申請人所考慮成為本發(fā)明的主題，提供以下的定義，以用于所撰寫的說明以及附隨的申請專利范圍所使用的特定的名詞。
如同此處所使用的，名詞“抗原呈遞細胞”或縮寫“APC”意指可處理蛋白質(zhì)抗原、將其破壞成肽、并連同MHC分子在細胞表面上呈遞的細胞，它可在細胞表面上與適當(dāng)?shù)腡細胞受體相互作用。名詞，抗原呈遞細胞，如同此處所使用的，是意指包含職業(yè)以及非職業(yè)的抗原呈遞細胞兩者。
如同此處所使用的，名詞“職業(yè)的抗原呈遞細胞”或縮寫“PAPC”意指具有高效率的免疫刺激能力的抗原呈遞細胞。PAPCs顯現(xiàn)與適當(dāng)種類的MHC分子連結(jié)的抗原性肽片段，并且具備共同刺激的表面分子。不同種類的PAPCs包括，藍蓋罕士氏細胞(Langherhans’cells)、指間細胞(interdigitating cells；IDCs)、濾泡樹突狀細胞(FDCs)、胚種中心樹突狀細胞(GCDCs)、B細胞以及巨噬細胞。
如同此處所使用的，關(guān)于本發(fā)明的APCs，“基因修飾的”APC意指已引導(dǎo)外源性核酸進入的APC或APC的祖細胞或前驅(qū)物，此外源性核酸轉(zhuǎn)錄并轉(zhuǎn)譯以生產(chǎn)編碼所引導(dǎo)的核酸分子，或合并進入APC的基因組，并且增強編碼免疫刺激性細胞因子的內(nèi)源性核酸序列的轉(zhuǎn)錄及/或轉(zhuǎn)譯。名詞“基因修飾的”可在此處使用，以包括任何引導(dǎo)外源性核酸的方法，包括，但并不限于，轉(zhuǎn)形作用(transformation)、轉(zhuǎn)導(dǎo)作用(transduction)、轉(zhuǎn)染作用(transfection)以及其類似的方法。
如同此處所使用的，當(dāng)它們是以這樣的方式共價地連結(jié)，以便將此編碼序列的表達或轉(zhuǎn)錄，放置在此調(diào)控區(qū)域的影響或控制之下的時候，編碼的序列以及調(diào)控的區(qū)域被稱為是“可操作地連接”。如果編碼序列轉(zhuǎn)譯成為有功能的蛋白質(zhì)是需要的，兩個DNA序列被稱為是可操作地連接，如果激活子功能的誘導(dǎo)會導(dǎo)致編碼序列的轉(zhuǎn)錄，以及如果在此兩個DNA序列之間的連結(jié)性質(zhì)并不會(1)導(dǎo)致移碼(frame-shift)突變的引導(dǎo)，(2)干擾調(diào)控區(qū)域管理編碼序列轉(zhuǎn)錄的能力，或(3)干擾對應(yīng)的RNA轉(zhuǎn)錄物轉(zhuǎn)譯成為蛋白質(zhì)的能力。因此，調(diào)控區(qū)域?qū)⒖刹僮鞯剡B接至編碼序列，如果調(diào)控區(qū)域有能力影響該DNA序列的轉(zhuǎn)錄，使得結(jié)果產(chǎn)生的轉(zhuǎn)錄物可轉(zhuǎn)譯成為所需要的蛋白質(zhì)或多肽。
如同此處所使用的，關(guān)于本發(fā)明的基因修飾的APCs，名詞“增強免疫刺激性細胞因子的表達”意指增加編碼細胞因子的核酸序列的轉(zhuǎn)錄及/或轉(zhuǎn)譯的程度。
如同此處所使用的，名詞“免疫刺激性細胞因子”意指可溶解的分子，其調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)細胞之間的相互作用，以及，特別地，引起對抗APC所呈遞的抗原性肽的免疫反應(yīng)的活化或增加。特別所指的是選擇自白介素(例如，IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-3、IL-4、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-12、IL-18、IL-19、IL-20)、干擾素(例如，IFN-α、IFN-β、IFN-γ)、腫瘤壞死因子(例如，TNF-α)、轉(zhuǎn)形生長因子-β(TGF-β)、粒細胞群叢形成促進因子(G-CSF)、巨噬細胞群叢形成促進因子(M-CSF)、粒細胞-巨噬細胞群叢形成促進因子(GM-CSF)、Flt-3配體以及kit配體所組成的族群中的免疫刺激性細胞因子。如同此處使用的，提到任何這些細胞因子是意指包括人類的同源物，以及任何其它哺乳動物的同源物，其在人類中具有本質(zhì)上相似于人類蛋白質(zhì)的活性。
I.處理方法本發(fā)明部份衍生自此發(fā)現(xiàn)，也就是已被基因修飾而增強免疫刺激性細胞因子表達的抗原呈遞細胞，在沒有以抗原使APCs興奮或預(yù)裝載的情況下，可直接注射進入感染或腫瘤的位置或其附近，以誘導(dǎo)對抗與感染或腫瘤相關(guān)的抗原的專一性免疫反應(yīng)。特別地，已發(fā)現(xiàn)職業(yè)抗原呈遞細胞，例如，樹突狀細胞(DCs)，以及更佳地是骨髓衍生的樹突狀細胞(BM-DCs)或CD34+衍生的樹突狀細胞(CD34+-DCs)，其已被基因修飾以增強免疫刺激性細胞因子的表達，較佳地是白介素-12(IL-12)，可注射進入感染或腫瘤的位置或其附近，以誘導(dǎo)對抗與注射位置相關(guān)的抗原的專一的免疫反應(yīng)。顯著的是，在牽涉到注射進入腫瘤的實驗中，已發(fā)現(xiàn)職業(yè)抗原呈遞細胞，例如，工程化而原構(gòu)性地(constitutively)表達IL-12的DCs，在注射的位置以及在遠離的位置皆可引起腫瘤的退化，并且在區(qū)域性淋巴結(jié)以及脾臟皆可誘導(dǎo)腫瘤相關(guān)的抗原(TAA)專一性Th1細胞的反應(yīng)。
因此，一般而言，本發(fā)明提供對于患者的治療的方法，特別是對于具有感染或腫瘤的人類患者，其中，將基因修飾以增強表達免疫刺激性細胞因子的APCs，較佳地是職業(yè)抗原呈遞細胞，注射進入感染或腫瘤的位置或其附近。因此，此方法包括下列步驟獲得APCs的樣本；基因修飾APCs以增強表達免疫刺激性細胞因子；以及將基因修飾的APCs，較佳地是職業(yè)抗原呈遞細胞，注射進入感染或腫瘤的位置或其附近。在基因修飾APCs之前或之后，以及在將它們注射之前，藉由在此領(lǐng)域中所熟知的細胞培養(yǎng)的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，可將它們選殖地擴增。如果APC是自體的，則獲得及修飾細胞的步驟，以及可視需要地，選殖地擴增細胞的步驟，較佳地是在盡可能接近注射的時間執(zhí)行。然而，如果是使用異質(zhì)(heterologous)但同基因的APCs，則細胞可在早于注射之前而獲得并基因修飾，并且可在使用之前無限期地維持。
以本發(fā)明的方法治療的患者，包括癌癥病患以及具有難以治療的感染的患者。因為較佳的是基因修飾的APCs，較佳的是職業(yè)抗原呈遞細胞，是直接注射于腫瘤或感染的位置，所以預(yù)期本發(fā)明的方法將更有助益于患者，其具有至少一種身體上充分定義的腫瘤，或一種身體上充分定義的感染位置，而非一種擴散的、高度轉(zhuǎn)移的癌癥，或擴散的感染。另一方面，如同在以下實施例中所顯示的，注射進入腫瘤(或感染)存在的位置，可導(dǎo)致全身性免疫反應(yīng)的發(fā)展。因此，本發(fā)明的方法，在治療擴散的、高度轉(zhuǎn)移的癌癥，或擴散的感染上是有效的，如果可鑒定至少一個腫瘤或感染的位置，而在這個位置可注射APCs，較佳地是職業(yè)抗原呈遞細胞，并且可有效地裝載腫瘤相關(guān)或感染相關(guān)的抗原。
在目前較佳的具體實施例中，使用本發(fā)明的方法以治療具有固體腫瘤的病患，將本發(fā)明的基因修飾的APCs，較佳的是職業(yè)抗原呈遞細胞，直接注射進入腫瘤。適當(dāng)?shù)墓腆w腫瘤可包括，黑色素瘤、肝癌、腺癌、基細胞癌、口腔癌、鼻咽癌、喉癌、膀胱癌、頭頸部癌、腎細胞癌、胰臟癌、肺癌、子宮頸癌、卵巢癌、食道癌、胃癌、前列腺癌、睪丸癌以及乳癌。對于許多的這些癌癥，已建立DC浸潤(infiltration)以及預(yù)后之間的相關(guān)性。
使用對于皮下、皮內(nèi)、經(jīng)皮、肌肉內(nèi)、腹膜內(nèi)、或其它的注射形式的標(biāo)準(zhǔn)滅菌技術(shù)，注射本發(fā)明的基因修飾的APCs。細胞可以生理上可接受的溶液或緩沖液而給藥，并且可與其它試劑結(jié)合而給藥，特別是細胞因子，其可促進APCs存活、裝載抗原、通行至引流淋巴結(jié)(draining lymph node)或脾臟以及呈遞抗原以活化免疫反應(yīng)的能力。打算引導(dǎo)的細胞數(shù)目取決于許多因素，包括打算注射的位置的數(shù)目、在期間內(nèi)打算執(zhí)行注射的次數(shù)、腫瘤或感染損害的大小、以及腫瘤或感染的性質(zhì)。雖然打算使用的細胞數(shù)目隨著這樣的因素而將有所不同，目前預(yù)期將在每個位置、每次治療，注射104-108個，較佳地105-107個細胞。
有關(guān)APCs的選擇及分離、免疫刺激細胞因子的選擇、以及APCs的基因修飾的細節(jié)以及目前較佳的具體實施例，分別說明如下。
II.APCs的選擇以及分離本發(fā)明使用抗原呈遞細胞APCs，較佳地是職業(yè)抗原呈遞細胞，最佳地是樹突狀細胞，其已被基因修飾以增強免疫刺激細胞因子的表達。
較佳地，APCs的原始來源是打算被治療的患者，使得APCs是自體移植的。從其它個體獲得的同種異基因的(allogenic)APCs，也可使用于本發(fā)明中，但較佳地，此APCs是衍生自組織兼容的(histocompatible)或同基因的個體，以便提供對于患者的同源的、抗原專一性的T細胞受體的適當(dāng)?shù)腗HC呈遞。此外，可創(chuàng)造基因工程化的動物，例如，老鼠或豬，其呈遞人類或人類化的MHC蛋白質(zhì)，以及可視需要地，共同刺激的分子，并且可使用這些動物，以作為對于患者同源的、抗原專一性的T細胞受體，可以有適當(dāng)?shù)腗HC呈遞的可更新的APCs來源。
較佳的PAPCs是樹突狀細胞，特別地是從流通的周圍血液采集的CD34+衍生的DCs(CD34+-DCs)，以及從骨髓采集的骨髓衍生的樹突狀細胞(BM-DCs)。其它有助益于本發(fā)明的DCs，包括從血液采集的單核細胞衍生的樹突狀細胞、從骨髓采集的CD34+-DCs、從脾臟采集的脾臟細胞衍生的DCs、皮膚衍生的DCs、濾泡的樹突狀細胞(FDCs)、以及胚種中心衍生的樹突狀細胞(GCDCs)。從它們產(chǎn)生及/或局部化的組織中分離這些樹突狀細胞的方法，是在此領(lǐng)域中所熟知的。
例如，分離BM-DCs的方法是說明于Inaba等人(1992)，J.Exp.Med.，卷176頁1693-1702。另外，CD34+祖細胞可從人類臍帶或成人血液中獲得，并可以細胞因子刺激而分化進入樹突狀細胞(參見，例如，Caux等人(1996)J.Exp.Med.，卷184頁695-706；Romani等人(1994)J.Exp.Med.，卷180頁83-93)。Flt-3配體在產(chǎn)生樹突狀細胞的有效度是說明于，例如，Shurin等人(1997)，CellImmunol.，卷179頁174-184)。特別較佳的是，與GM-CSF以及IL-4一起培養(yǎng)數(shù)天(例如，5天)的BM-DCs或CD34+-DCs。TNF-α以及kit配體，對于增加生長于培養(yǎng)中的DCs的產(chǎn)量，也已顯示是有效的(參見，例如，Mayordomo等人(1997)，Stem Cells，卷15頁94-103，以及在那里所引用的參考文獻)，并且可使用TNF-α以及kit配體，以得到本發(fā)明的DCs。根據(jù)先前的報導(dǎo)(Pierre等人，(1997)，Nature，卷388頁787-792；Inaba等人(1993)，J.Exp.Med.，卷178頁479-488)，如同藉由流動細胞計數(shù)法(flow cytometry)以及MLR分析所測定的，大多數(shù)這樣的DCs可顯現(xiàn)未成熟的表現(xiàn)型。DCs只在它們未成熟階段的期間，具有抓取抗原和加工，以及通行的能力(Pierre等人，(1997)，Nature，卷388頁787-792；Inaba等人(1993)，J.Exp.Med.，卷178頁479-488；Cella等人(1997)，Nature，卷388頁782-787)。
III.細胞因子的選擇本發(fā)明的APCs是基因修飾的APCs，以增強免疫刺激性細胞因子的表達。較佳地，細胞因子是白介素(例如，IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-3、IL-4、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-12、IL-18、IL-19、IL-20)、干擾素(例如，IFN-α、IFN-β、IFN-γ)、腫瘤壞死因子(TNF)、轉(zhuǎn)形生長因子-β(TGF-β)、粒細胞群叢形成促進因子(G-CSF)、巨噬細胞群叢形成促進因子(M-CSF)、粒細胞-巨噬細胞群叢形成促進因子(GM-CSF)、Flt-3配體或kit配體的其中之一。這些細胞因子的氨基酸序列是在此領(lǐng)域中所熟知的。因此，白介素-4的氨基酸序列可發(fā)現(xiàn)于，例如，Arai等人，(1989)，J.Immunol.，卷142(1)頁274-282；白介素-6的氨基酸序列可發(fā)現(xiàn)于，例如，Yasukawa等人，(1987)，EMBO J.，卷6(10)頁2939-2945；白介素-12的p35以及p40次單元體的氨基酸序列可發(fā)現(xiàn)于，例如，Wolf等人，(1991)，J.Immunol.，卷146(9)頁3074-3081；各種TNF-α亞型的氨基酸序列可發(fā)現(xiàn)于，例如，Gren等人，(1984)，J.InterferonRes.，卷4(4)頁609-617，以及Weismann等人，(1982)，Princess TakamatsuSymp.，卷12頁1-22；TNF的氨基酸序列可發(fā)現(xiàn)于，例如，Pennica等人，(1984)，Nature，卷312頁724-729；以及G-CSF的氨基酸序列可發(fā)現(xiàn)于，例如，Hirano等人，(1986)，Nature，卷324頁73-76；GM-CSF的氨基酸序列可發(fā)現(xiàn)于，例如，Cantrell等人，(1985)，Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)，卷82(18)頁6250-6254。為了基因地修飾APCs，以增強這些細胞因子之一的表達，可選擇此技藝中之一般技術(shù)的一種，使用包含編碼細胞因子的自然發(fā)生的核酸序列的載體(例如，基因組序列或互補DNA(cDNA)的序列)，或者可使用遺傳密碼的退化性(degeneracy)，設(shè)計并制造，包括非自然發(fā)生卻仍編碼一具有功能的細胞因子的序列的載體。在異質(zhì)二聚體的免疫刺激細胞因子(例如，IL-12)的例子中，本發(fā)明的APCs必須基因地修飾，以表達此細胞因子分子的兩個次單元體。
本發(fā)明的APCs也可基因地修飾，以表達這些細胞因子的變異體(variant)。例如，對于那些具有前形式(pro-forms)以及成熟形式的細胞因子(例如，在訊息肽的切割之前以及之后，或在有限的蛋白質(zhì)分解而產(chǎn)生一活性的片段之前及之后)，本發(fā)明的APCs可基因地修飾以表達前形式或成熟形式。其它的變異體，例如，也可使用在細胞因子的活性片段以及異質(zhì)序列(例如，異質(zhì)的訊息肽)之間的融合蛋白質(zhì)。物種的變異體，也可以用它們在人類患者中保有活性的程度而使用。因此，例如，人類APCs可基因地修飾以表達鼠、牛、馬、綿羊、貓、狗、非人類靈長動物或人類細胞因子的其它哺乳動物變異體，如果這些物種變異體保有本質(zhì)上相似于它們的人類同源物的活性。
IV.APCs的基因修飾本發(fā)明的APCs可藉由在此領(lǐng)域中所熟知的任何標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)而基因地修飾，以導(dǎo)引編碼所需的細胞因子的核酸。例如，人類樹突狀細胞藉由反轉(zhuǎn)錄病毒的轉(zhuǎn)導(dǎo)作用而基因修飾的方法，說明于Reeves等人(1996)，Cancer Res.，卷56頁5672-5677，以及Specht等人(1997)，J.Exp.Med.，卷186頁1213-1221。相似地，骨髓細胞藉由反轉(zhuǎn)錄病毒調(diào)節(jié)的IL-4基因轉(zhuǎn)移而基因修飾的方法，說明于Chambers等人(1992)，J.Immunol.，卷149(9)頁2899-2905。此外，人類CD34+祖細胞的反轉(zhuǎn)錄病毒的轉(zhuǎn)導(dǎo)作用，伴隨后續(xù)的細胞因子刺激而促進分化并成熟，以離心或不以離心而進入樹突狀細胞的方法，已說明于Henderson等人(1996)，Cancer Res.，卷563763-3770，以及Reeves等人(1996)，Cancer Res.，卷56頁5672-5677。使用反轉(zhuǎn)錄病毒的上清液，代替與反轉(zhuǎn)錄病毒的制造者細胞共同培養(yǎng)(Specht等人(1997))，具有許多勝過其它策略的優(yōu)點，包括(1)對于細胞沒有直接的毒性；(2)獲得穩(wěn)定的基因表達；(3)具有最小的病毒專一性CTL反應(yīng)，不像以腺病毒載體的方法(參見，例如，Smith等人(1996)，J.Virol.，卷70頁6733-6740)；以及(4)有較大規(guī)模的使用反轉(zhuǎn)錄病毒上清液的臨床經(jīng)驗。
本發(fā)明的APCs的基因修飾可以是短暫的或穩(wěn)定的。也就是，導(dǎo)引進入APCs的編碼細胞因子的核酸序列，可與細胞的基因組DNA分開地存在，并且只短暫地表達，或它們可合并進入細胞的基因組內(nèi)，并在細胞的生命中持續(xù)地表達。例如，使用腺病毒載體的IL-6的短暫表達，說明于Richards等人(1995)，Ann.NY.Acad.Sci.，卷762頁282-292。對于短暫地表達的序列，較佳的是，免疫刺激細胞因子的表達至少持續(xù)1天，較佳的是數(shù)天，以提供足夠的時間，使APCs在感染或腫瘤的位置獲得抗原、遷移至區(qū)域性淋巴結(jié)，并且藉由抗原的呈遞而活化同源T細胞。
較佳地，用以增強免疫刺激細胞因子表達的基因構(gòu)筑，包括，可操作地連接至編碼細胞因子的序列的原構(gòu)性激活子，以使基因修飾的APCs原構(gòu)性地表達細胞因子。然而，另外，如果用于誘導(dǎo)的條件，可與具有或不具有額外的患者的治療的生理狀況下相符合，則可使用可誘導(dǎo)的激活子(例如，給藥一誘導(dǎo)物(inducer))。
除了以上所說明的以及在以下實施例中，基因修飾APCs的反轉(zhuǎn)錄病毒方法之外，許多制造適當(dāng)?shù)妮d體、以那些載體基因修飾細胞、以及鑒定轉(zhuǎn)形株的其它方法，是在此領(lǐng)域中所熟知的，并且只簡短地在此回顧(參見，例如，Sambrook等人，(1989)，分子選殖實驗室操作手冊，第二版，冷泉港實驗室印制，冷泉港，紐約)。有許多各種不同的載體已被發(fā)展出，并且是商業(yè)上可獲得的，其在人造激活子元素的調(diào)控之下，提供核酸的可誘導(dǎo)的表達(例如，LacSwitch表達載體，Stratagene，La Jolla，加州)或原構(gòu)性的表達(例如，pcDNA3載體，Invitrogen，Chatsworth，加州)。雖然也可使用在真核細胞中有活性的其它強大的激活子元素以誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄，但是這樣的激活子元素常常是衍生自CMV或SV40病毒基因。典型地，這些載體也包含人造的聚腺苷酸化(polyadenylation)序列以及3＇UTR，其也可衍生自外源性的病毒基因序列或衍生自其它真核基因。此外，在一些構(gòu)筑中，人造的、非編碼的插入序列(intron)以及表達序列(extron)也可包括于載體中，用以增強有興趣的細胞因子序列的表達。這些表達系統(tǒng)一般是從商業(yè)上的來源獲得，并且，以例如pcDNA3以及pZeoSV(Invitrogen，圣地亞哥，加州)的載體為典型。無數(shù)商業(yè)上可獲得的、以及客戶訂作的表達載體，可從商業(yè)上的來源獲得，以在更多或更少的任何所需的細胞類型中，提供任何所需的轉(zhuǎn)錄物的原構(gòu)地表達，或在暴露于外源性刺激物之后的表達(例如，撤除四環(huán)素或暴露于異丙基硫代半乳糖苷(IPTG))。
藉由各種在此領(lǐng)域中所熟知的方法，可將載體引導(dǎo)進入APCs，包括，但并不限于，磷酸鈣轉(zhuǎn)染作用、磷酸鍶轉(zhuǎn)染作用、乙二胺乙基(DEAE)葡萄糖轉(zhuǎn)染作用、電轉(zhuǎn)殖(electroporation)、脂質(zhì)感染作用(lipofection)(例如，Dosper脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染作用試劑，Boehringer Mannheim，德國)、微量注射(microinjection)、使用“基因槍”在微量小珠(micro-bead)上的彈道注射、或?qū)τ诓《据d體而言，藉由重組病毒的感染作用等方法。
實施例反轉(zhuǎn)錄病毒載體反轉(zhuǎn)錄病毒DFG-mIL-12、TFG-mIL-12以及DFG-hCD80-neo的構(gòu)筑，已說明于先前的研究中(Tahara等人，(1995)；Zitvogel等人(1996)，Eur.J.Immunol.，卷26頁1335-1341)。藉由次選殖從pEGFP-N1(Clontech，Palo Alto，加州)以及pcDNA3.1/Zeo(-)(Invitrogen，Carlsbad，加州)所獲得的各別片段，產(chǎn)生MFG-EGFP以及MFG-Zeo(Cormack等人，(1996)，Gene，卷173頁33-38)。藉由將這些前病毒的(proviral)構(gòu)筑轉(zhuǎn)染進入BOSC23或BING包裝細胞系(packing cell lines)中，而產(chǎn)生反轉(zhuǎn)錄病毒的上清液(Tahara等人，(1995))。藉由將BING或BOSC23所制造的反轉(zhuǎn)錄病毒感染這些包裝細胞，而產(chǎn)生制造DFG-hCD80-neo反轉(zhuǎn)錄病毒的CRE以及CRIP細胞，分別伴隨著以G418(Geneticin；Life Technologies公司，Grand Island，紐約)的后續(xù)篩選。在轉(zhuǎn)導(dǎo)進入NIH3T3細胞之后，從存活于G418細胞群體中，計算反轉(zhuǎn)錄病毒的上清液的效價。
腫瘤細胞系以及老鼠品系將各種可移植的老鼠腫瘤細胞系注射進入老鼠以發(fā)起腫瘤，此腫瘤接著以本發(fā)明的基因修飾的APCs治療。MCA205甲基膽蒽(methylcholanthrene)誘導(dǎo)的纖維肉瘤，由S.A.Rosenberg(國家癌癥研究所，Bethesda，馬里蘭)慷慨地提供。B16-F10老鼠黑色素瘤細胞系，由E.Gorelik(匹茲堡大學(xué)，匹茲堡，賓州)好心地提供。3LL腫瘤細胞的D122高度轉(zhuǎn)移性變異體，由L.Aisenbach(Weizmann科學(xué)研究院，Rehovot，以色列)好心地提供。YAC-1是由W.Chambers(匹茲堡大學(xué)，匹茲堡，賓州)慷慨贈與。這些細胞系維持在補充10％熱失活性的胎牛血清、2毫摩爾濃度的谷氨酰胺、100微克/毫升的鏈霉素、100國際單位/毫升的青霉素以及5×10-5的M2-ME的RPMI 1640(全部來自Life Technologies公司，Grand Island，紐約)，即為此后所提及的完全的培養(yǎng)液(CM)。
6至8周大的母鼠C57BL/6(B6)從Taconic農(nóng)場(Germantown，紐約)購買，并且在8至10周大的年齡時用于所有的實驗。
APCs的培養(yǎng)以及基因修飾使用先前說明的方法(Mayordomo等人，(1995)，Zitvogel等人，(1996)；Inaba等人(1992)，J.Exp.Med.，卷176頁1693-1702)而得到BM-DC培養(yǎng)物。簡言之，從犧牲的老鼠的股骨以及脛骨采集老鼠骨髓細胞。在第0天，以0.83摩爾濃度的氯化銨緩沖液，將污染的紅血球溶解，以抗體混合物(RA3-3A1/6.1、抗B220；2.43、抗-Lyt 2；GK1.5、抗L3T4；全部來自美國標(biāo)準(zhǔn)菌種中心(ATCC)，Rockville，馬里蘭)以及兔子補體(AccurateChemical and Science Corp.，Westbury，紐約)，而將淋巴細胞耗盡。這些細胞在CM中培養(yǎng)隔夜，以移除附著的巨噬細胞，并接著在第1天，將無附著的細胞放置在含有rmGM-CSF(1000單位/毫升)以及rmIL-4(1000單位/毫升)(DC培養(yǎng)液)的新鮮CM中。一般而言，在第6天采集細胞。藉由形態(tài)學(xué)、表現(xiàn)型以及強烈混合的淋巴細胞反應(yīng)刺激的活性，以鑒定BM-DCs。藉由流動細胞計數(shù)儀的表現(xiàn)型分析顯示，在多數(shù)的培養(yǎng)細胞中(60-95％)，CD11b、CD11c、CD80、CD86以及MHC第I型和第II型的高度的表達。
對于反轉(zhuǎn)錄病毒的轉(zhuǎn)導(dǎo)作用，將DC培養(yǎng)液中培養(yǎng)24小時的1×106個BM細胞分裝至14毫升的圓底試管，并且懸浮在具有8微克/毫升的聚凝胺(polybrene)、1000單位/毫升的rmGM-CSF以及1000單位/毫升的rmIL-4的1毫升反轉(zhuǎn)錄病毒上清液中。將這些細胞在30-32℃、以2500xg的轉(zhuǎn)速，離心2小時(Kotani等人，(1994)，Hum.Gene Ther.，卷5頁19-28；Bahnson等人(1995)，J.Virol.Methods，卷54頁131-143)。在離心之后，將細胞培養(yǎng)于DC培養(yǎng)液中。在第3天和第4天，重復(fù)轉(zhuǎn)導(dǎo)作用的過程。當(dāng)在可比較的效價的時候，與兩性病毒(amphotropic viruses)比較，來自外生性(ectropic)制造者細胞(BOSC23以及CRE)的反轉(zhuǎn)錄病毒上清液，可更有效地轉(zhuǎn)導(dǎo)老鼠BM-DCs。因為它們制造最高效價的病毒(2-8×106菌落形成單位(cfu)/毫升)，所以使用來自BOSC23細胞的反轉(zhuǎn)錄病毒上清液。為了檢查老鼠BOS-DCs的轉(zhuǎn)導(dǎo)作用效率，我們做出具有插入的人類CD80(B7.1)或EGFP基因，作為轉(zhuǎn)導(dǎo)作用的標(biāo)記的反轉(zhuǎn)錄病毒載體，并且藉由流動細胞計數(shù)儀測定轉(zhuǎn)導(dǎo)作用的效率。在高的轉(zhuǎn)導(dǎo)作用效率時(22-75％)，反轉(zhuǎn)錄病毒修飾的DCs，可在最后一次轉(zhuǎn)導(dǎo)作用(在第4天)后至少12天，在培養(yǎng)物中表達轉(zhuǎn)殖基因。轉(zhuǎn)導(dǎo)作用的效率與所使用的反轉(zhuǎn)錄病毒上清液的效價適切地相關(guān)。二種有顏色的免疫螢光染色顯示，顯著數(shù)量的標(biāo)記(hCD80)-陽性細胞也表達高程度的mCD80以及CD86、MHC第II型以及DEC-205。
以EGFP反轉(zhuǎn)錄病毒載體的轉(zhuǎn)導(dǎo)作用顯示，可以高效率反轉(zhuǎn)錄病毒地轉(zhuǎn)導(dǎo)老鼠BM-DCs。此外，也可用修飾而表達兩個IL-12基因(DFG-mIL-12)的反轉(zhuǎn)錄病毒載體，而轉(zhuǎn)導(dǎo)BM-DCs。在第4天，完成轉(zhuǎn)導(dǎo)作用的步驟之后，在培養(yǎng)液中的mIL-12p70異質(zhì)二聚體的濃度，可藉由酶連結(jié)免疫吸附分析(ELISA)而測定。如同在第1A圖中所顯示，在DFG-mIL-12所轉(zhuǎn)導(dǎo)的BM-DC的培養(yǎng)物中，觀察到異質(zhì)二聚體IL-12(p70)的累積，但是在未轉(zhuǎn)導(dǎo)的培養(yǎng)物或是以標(biāo)記基因轉(zhuǎn)導(dǎo)的細胞中，是沒有觀察到的。在第6天，采集DCs，清洗兩次并轉(zhuǎn)移至一個新的培養(yǎng)盤。在這個時候，IL-12所轉(zhuǎn)導(dǎo)的DCs產(chǎn)生大約80納克(ng)/106個細胞/48小時的異質(zhì)二聚體IL-12(第1B圖)。來自IL-12所轉(zhuǎn)導(dǎo)的DCs的IL-12制造范圍是8-80ng/106個細胞/48小時，并且與每次實驗所使用的反轉(zhuǎn)錄病毒上清液的效價有關(guān)。由基因修飾的DCs所制造的IL-12蛋白質(zhì)，證實具有生物活性，并且有能力刺激來自Con A處理的脾臟細胞的IFN-γ制造。為了檢查IL-12轉(zhuǎn)導(dǎo)作用在DC表現(xiàn)型上的作用，使用流動細胞計數(shù)法檢查各種細胞表面分子。除了它們表達較多程度的MHC第I型以及第II型分子之外，IL-12所轉(zhuǎn)導(dǎo)的DCs與不轉(zhuǎn)導(dǎo)的或Zeo轉(zhuǎn)導(dǎo)的DCs并無不同成纖維細胞的培養(yǎng)以及基因修飾為了比較本發(fā)明的基因修飾的APCs的治療有效度，制備相似修飾的成纖維細胞。簡言之，從B6老鼠的肺臟獲得同基因的成纖維細胞的初代培養(yǎng)。用剪刀將肺臟的小片塊切碎，并且在膠原酶IV、玻尿酸酶V以及去氧核糖核酸酶IV(Sigma，St Louis，密蘇里)的三種酶溶液中，在室溫下攪拌3小時。以HBSS清洗二次之后，將細胞懸浮液培養(yǎng)于CM中，以獲得成纖維細胞的初代培養(yǎng)。藉由感染以G418篩選之后的CRIP-TFG-mIL-12-neo的上清液，而產(chǎn)生IL-12所轉(zhuǎn)導(dǎo)的成纖維細胞。
腫瘤內(nèi)注射基因修飾的APCs為了制造癌癥病患的動物模式，在第0天，以1×105個細胞的MCA205、B16以及D122腫瘤細胞系，注射到老鼠(每群四或五只)的右腰窩。在第7天，當(dāng)腫瘤的大小變成10-20平方毫米的時候，腫瘤內(nèi)注射106個無轉(zhuǎn)導(dǎo)的或轉(zhuǎn)導(dǎo)的BM-DCs。如同先前所說明的，在輻射(5000拉德(rad))之后，使用IL-12所轉(zhuǎn)導(dǎo)的同基因的成纖維細胞以用于腫瘤內(nèi)注射(Zitvogel等人，(1995))。當(dāng)老鼠排斥所建立的腫瘤時，在對面的腰窩上，再以較大量的細胞(2×105)激發(fā)，以評估對抗腫瘤的保護性的全身免疫的誘導(dǎo)。
所建立的腫瘤的抑制及/或排斥為了檢查腫瘤內(nèi)注射APCs的抗腫瘤效果(APCs是被基因地修飾以增強免疫刺激細胞因子的表達)，將106個無轉(zhuǎn)導(dǎo)或IL-12轉(zhuǎn)導(dǎo)的BM-DCs注射進入所建立的第7天的腫瘤(MCA205、B6以及D122)(腫瘤直徑3-5毫米)。如同第2圖所顯示的，IL-12轉(zhuǎn)導(dǎo)的DCs顯著地抑制這些所建立的腫瘤的生長，導(dǎo)致在5只注射MCA205的老鼠中的2只有最終的排斥。無轉(zhuǎn)導(dǎo)的或Zeo所轉(zhuǎn)導(dǎo)的DCs都不具有抗腫瘤的效果。在這些實驗中，基因修飾的DCs的IL-12的制造是29ng/106個細胞/48小時?？傆嫞訧L-12所轉(zhuǎn)導(dǎo)的DCs的單一治療，導(dǎo)致在14只老鼠中的5只(36％)，排斥所建立的MCA205腫瘤。這些沒有腫瘤的老鼠排斥后續(xù)兩次相同量的MCA205的激發(fā)，暗示獲得對于所注射的腫瘤的免疫記憶。如同在第3圖中所顯示的，使用皮耳森氏(Pearson’s)線性回歸，IL-12所轉(zhuǎn)導(dǎo)的DCs的抗腫瘤效果，與在第28天IL-12的產(chǎn)量相關(guān)連(r＝-0.80，p＜0.05)。在另一個實驗中，老鼠一開始以1×105個MCA205細胞皮內(nèi)注射，接著，在第7天，將HBSS(空心圓圈)、106個Zeo所轉(zhuǎn)導(dǎo)的BM-DCs(三角形)、IL-12所轉(zhuǎn)導(dǎo)的BM-DCs(方塊)或IL-12所轉(zhuǎn)導(dǎo)的同基因成纖維細胞(實心圓圈)注射進入所建立的腫瘤。如同在第4圖中所顯示的，IL-12所轉(zhuǎn)導(dǎo)的DCs的抗腫瘤效果也與IL-12所轉(zhuǎn)導(dǎo)的成纖維細胞的抗腫瘤效果比較。如同先前報導(dǎo)的(Zitvogel等人(1995))，IL-12所轉(zhuǎn)導(dǎo)的成纖維細胞抑制MCA205的生長，然而，它們的單一注射并沒有顯示任何的腫瘤排斥。然而，當(dāng)與IL-12所轉(zhuǎn)導(dǎo)的成纖維細胞比較時，IL-12所轉(zhuǎn)導(dǎo)的DCs更有效率地抑制腫瘤生長，而IL-12所轉(zhuǎn)導(dǎo)的成纖維細胞以相似的，但稍微較高的程度表達IL-12(基因修飾的DCs以及成纖維細胞的IL-12產(chǎn)量，分別是13以及22ng/106個細胞/48小時)。也檢查每周腫瘤內(nèi)注射IL-12所轉(zhuǎn)導(dǎo)的DCs的連續(xù)治療。簡言之，老鼠一開始以1×105個MCA205細胞皮內(nèi)注射。在第7天以及第14天，將HBSS(空心圓圈)、106個IL-12所轉(zhuǎn)導(dǎo)的BM-DCs(實心圓圈)、或IL-12所轉(zhuǎn)導(dǎo)的同基因成纖維細胞(三角形)，注射進入所建立的腫瘤。如同在第5圖中所顯示的，當(dāng)與單一注射比較時，重復(fù)注射IL-12所轉(zhuǎn)導(dǎo)的DCs，導(dǎo)致腫瘤的更顯著以及延長的抑制(超過60天)。
全身性腫瘤專一的免疫反應(yīng)如同以上所提及的，IL-12所轉(zhuǎn)導(dǎo)的DCs的局部抗腫瘤效果，比以IL-12所轉(zhuǎn)導(dǎo)的成纖維細胞所觀察到的抗腫瘤效果更為深刻。為了測定是否IL-12所轉(zhuǎn)導(dǎo)的DCs的腫瘤內(nèi)注射，可誘導(dǎo)對于腫瘤專一的顯著的全身性免疫反應(yīng)，在注射DCs后7天(在腫瘤接種后14天)，從具有腫瘤的老鼠中，采集在接種的腫瘤的同一側(cè)鼠蹊部區(qū)域中的皮下淋巴結(jié)(引流淋巴結(jié))以及脾臟。將這些淋巴細胞與輻射的腫瘤細胞(MCA205)在活體外共同培養(yǎng)，并檢查在培養(yǎng)上清液中的IFN-γ以及IL-4的產(chǎn)量。有趣地，當(dāng)與IL-12所轉(zhuǎn)導(dǎo)的成纖維細胞比較時，注射無轉(zhuǎn)導(dǎo)的或Zeo所轉(zhuǎn)導(dǎo)的DCs，增強從引流淋巴結(jié)以及脾臟采集而來的淋巴細胞的腫瘤專一的IFN-γ產(chǎn)量。此外，腫瘤內(nèi)注射IL-12所轉(zhuǎn)導(dǎo)的DCs，對于腫瘤的再刺激的反應(yīng)，導(dǎo)致這些淋巴細胞的IFN-γ產(chǎn)量的更大的增強。有趣地，注射DC也增強較少程度的IL-4產(chǎn)量。IFN-γ的產(chǎn)量在MCA205刺激之后專一地釋放，但不包含B16或MCA207腫瘤。這些結(jié)果暗示，腫瘤內(nèi)注射的IL-12所轉(zhuǎn)導(dǎo)的DCs流通至引流淋巴結(jié)，并且在原位有效地刺激淋巴細胞，以產(chǎn)生IFN-γ。為了證實這個假設(shè)，以螢光染劑(RKH-26)將IL-12所轉(zhuǎn)導(dǎo)的DCs染色，并且腫瘤內(nèi)地注射，并在注射后24小時檢查引流淋巴結(jié)。在注射后24小時，在引流淋巴結(jié)偵測到顯著數(shù)量的DCs。
此外，也評估來自治療的老鼠的脾臟細胞的CTL活性。在腫瘤內(nèi)注射BM-DCs后7天，從每一群的二只老鼠中，采集脾臟細胞并放在一起。在25國際單位/毫升的rhIL-2的存在下，這些細胞(2×106)在活體外以2×105個輻射的(5000拉德)MCA205再刺激。5天后，在標(biāo)準(zhǔn)的51Cr釋放分析中，測試再刺激的細胞。CTL的對抗MCA205的活性，藉由來自以HBSS、Zeo所轉(zhuǎn)導(dǎo)的以及IL-12所轉(zhuǎn)導(dǎo)的BM-DCs、以及IL-12所轉(zhuǎn)導(dǎo)的成纖維細胞而處理的族群中的脾臟細胞而測試(第6A圖)。在誘導(dǎo)CTL的活性上，Zeo所轉(zhuǎn)導(dǎo)的DCs比IL-12所轉(zhuǎn)導(dǎo)的成纖維細胞更為有效。與使用任何其它策略所觀察到的CTL活性比較，IL-12所轉(zhuǎn)導(dǎo)的DCs顯著地誘導(dǎo)更高的CTL活性。CTL的對抗MCA205、YAC-1以及同基因成纖維細胞的活性，藉由注射IL-12所轉(zhuǎn)導(dǎo)的BM-DCs的老鼠脾臟細胞而測試(第6B圖)。這個活性顯露對于MCA205腫瘤是專一性的，并且可用抗CD8的抗體，阻斷40-50％，以及可用抗H-2Kb的抗體，阻斷24-35％。
為了進一步證實全身性免疫的誘導(dǎo)，檢查未處理的腫瘤的相反側(cè)的生長。將1×105個MCA205以及B16腫瘤細胞皮內(nèi)注射至老鼠的兩側(cè)，并且在第7天，當(dāng)腫瘤面積到達13-20平方毫米時，將IL-12所轉(zhuǎn)導(dǎo)的DCs注射于右側(cè)的腫瘤中。監(jiān)測兩側(cè)的腫瘤生長。第7圖顯示，腫瘤內(nèi)注射IL-12所轉(zhuǎn)導(dǎo)的DCs，不只顯著地抑制注射的腫瘤的生長(第7A圖)，也抑制相反側(cè)的未注射的腫瘤的生長(第7B圖)。在這些實驗中，注射IL-12所轉(zhuǎn)導(dǎo)的DCs后2天，在老鼠血清中并沒有偵測到IL-12。
流動細胞計數(shù)法對于BM-DCs的表現(xiàn)型分析，使用連結(jié)PE或FITC的對抗老鼠細胞表面分子(CD11b、CD11c、CD80、CD86、Gr-1、H-2Kb、I-Ab以及適當(dāng)?shù)耐臀?isotype)控制組，全部來自PharMingen，圣地亞哥，加州)的單克隆抗體。藉由以NLDC-145抗體的染色，而偵測DEC-205(Serotec公司，牛津，英國)。轉(zhuǎn)導(dǎo)作用的標(biāo)記hCD80以FITC連結(jié)的抗hCD80抗體(PharMingen，圣地亞哥，加州)染色，其并未與老鼠的CD80交叉反應(yīng)。
活體外細胞因子釋放分析從二只老鼠的一只所采集的輸納(鼠蹊)淋巴結(jié)以及脾臟細胞獲得淋巴細胞，這些老鼠7天前已接受BM-DCs的腫瘤內(nèi)注射。如同先前所描述的(Zitvogel等人(1996))，在25國際單位/毫升的rhIL-2(Chiron，Emeryville，加州)的存在下，這些細胞(2×106)與2×105個輻射的(5000拉德)MCA205，在24槽孔的培養(yǎng)盤中共同培養(yǎng)36小時。收集上清液，并在ELISA中估算mIFN-γ以及mIL-4的表達(PharMingen，圣地亞哥，加州)。對于每個分析的敏感度的下限(lower limit)分別是18以及36皮克(pg)/毫升。
細胞毒性T淋巴細胞分析在腫瘤內(nèi)注射BM-DCs后7天，從每一群的二只老鼠中，采集脾臟細胞并放在一起。在25國際單位/毫升的rhIL-2的存在下，這些細胞(2×106)在活體外以2×105個輻射的(5000拉德)MCA205再刺激。5天后，使用再刺激的細胞作為效應(yīng)物(effectors)，以用作對抗MCA205、YAC-1以及同基因成纖維細胞的標(biāo)準(zhǔn)4小時-51Cr釋放分析。簡言之，以100微居里(μCi)的Na251CrO4將106的每個標(biāo)的細胞標(biāo)示1小時。清洗兩次之后，以適當(dāng)?shù)腅/T比例，將這些效應(yīng)物以及標(biāo)的細胞放置于96槽孔的圓底培養(yǎng)盤中。在4小時的培養(yǎng)之后，收集上清液(100微升)，并用伽碼計數(shù)器計數(shù)放射活性。專一性溶解的百分比以下面的公式計算％專一性溶解＝100×(實驗上的釋放-自發(fā)性的釋放)/(最大釋放-自發(fā)性的釋放)。
統(tǒng)計分析使用非成對的雙尾學(xué)生氏(Student’s)t-試驗，執(zhí)行統(tǒng)計分析。應(yīng)用皮耳森氏線性回歸以檢查相關(guān)性。當(dāng)p值小于0.05時，差異被認為是顯著的。
權(quán)利要求
1.一種治療具有感染或腫瘤的個體的方法，其包括在該個體接近感染或腫瘤的位置注射有效量的基因修飾職業(yè)抗原呈遞細胞(PAPCs)，其中該職業(yè)抗原呈遞細胞已被基因修飾以增進免疫刺激性細胞因子的表達。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中該PAPCs是樹突狀細胞。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中該樹突狀細胞是選擇自CD34+衍生的樹突狀細胞、骨髓衍生的樹突狀細胞、單核細胞衍生的樹突狀細胞、脾臟細胞衍生的樹突狀細胞、皮膚衍生的樹突狀細胞、濾泡衍生的樹突狀細胞，以及胚種中心衍生的樹突狀細胞所組成的族群。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其中該樹突狀細胞是CD34+衍生的樹突狀細胞，其在至少一個因子的存在下培養(yǎng)，該因子是選擇自G-CSF、GM-CSF、TNF-α、IL-4、Flt-3配體以及kit配體所組成的族群。
5.根據(jù)權(quán)利要求1至4中任一項所述的方法，其中該細胞因子是選擇自白介素(例如，IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-3、IL-4、IL-6、IL-8、IL-9、IL-10、IL-12、IL-18、IL-19、IL-20)、干擾素(例如，IFN-α、IFN-β、IFN-γ)、腫瘤壞死因子(TNF)、轉(zhuǎn)形生長因子-β(TGF-β)、粒細胞群叢形成促進因子(G-CSF)、巨噬細胞群叢形成促進因子(M-CSF)、粒細胞-巨噬細胞群叢形成促進因子(GM-CSF)、Flt-3配體以及kit配體所組成的族群。
6.根據(jù)權(quán)利要求1至5中任一項所述的方法，其中該樹突狀細胞已藉由編碼該細胞因子的病毒載體的轉(zhuǎn)導(dǎo)作用而基因修飾。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其中該病毒載體是反轉(zhuǎn)錄病毒載體。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其中該病毒載體是選擇自腺病毒載體以及腺病毒相關(guān)的載體所組成的族群。
9.根據(jù)權(quán)利要求1至5中任一項所述的方法，其中該樹突狀細胞已藉由選擇自脂質(zhì)感染(lipofection)以及彈道注射(ballistic injection)所組成的族群中的方法而基因修飾。
10.根據(jù)權(quán)利要求1至9中任一項所述的方法，其中該個體具有選擇自黑色素瘤、肝癌、腺癌、基細胞癌、口腔癌、鼻咽癌、喉癌、膀胱癌、頭項部癌、腎細胞癌、胰臟癌、肺癌、子宮頸癌、卵巢癌、食道癌、胃癌、前列腺癌、睪丸癌、以及乳癌所組成的族群中的癌癥。
全文摘要
本發(fā)明揭露基因修飾以增強免疫刺激性細胞因子表達的職業(yè)抗原呈遞細胞,以用于具有腫瘤或感染的個體的治療。將基因修飾的職業(yè)抗原呈遞細胞直接注射在腫瘤或感染的位置或其附近。較佳的職業(yè)抗原呈遞細胞包括樹突狀細胞,并且,較佳的免疫刺激性細胞因子包括白介素,例如,IL－12。
文檔編號A61P35/00GK1330557SQ99812841
公開日2002年1月9日 申請日期1999年9月14日 優(yōu)先權(quán)日1998年9月15日
發(fā)明者田原秀明, 麥克T·洛茲, 西岡安彥 申請人:匹茲堡大學(xué)聯(lián)邦系統(tǒng)高等教育