專(zhuān)利名稱(chēng)：不穩(wěn)定的dpiv抑制劑的化合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及二肽基肽酶IV(DP IV)的不穩(wěn)定抑制劑的化合物，該化合物的通式為A-B-C，其中A是氨基酸，B是A和C之間的化學(xué)鍵或者是氨基酸，而C是DP IV的不穩(wěn)定抑制劑。
已知氨基?；邕蚧?thiazolidides)、氨基?；量┩榛?pyrrolidides)、N-二肽基化物(dipeptididyl)、O-?；u胺和其他化合物可作為血清酶二肽基肽酶IV(DP IV)及類(lèi)似酶的抑制劑(參見(jiàn)DEMUTH,H.-U.,J.Enzyme Inhibition 3,249(1990)；DEMUTH,H.-U.,HEINS,J.,in Dipeptidyl Peptidase IV(B.Fleischer編輯)R.G.Landes,Biomedical Publishers,Georgetown,1995,1-37)。
已經(jīng)發(fā)現(xiàn)T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答，例如移植時(shí)的免疫應(yīng)答，可通過(guò)二肽基肽酶IV的穩(wěn)定抑制劑來(lái)影響(參見(jiàn)KOROM,S.,DEMEESTER,I.,STADLBAUER,T.H.W.,CHANDRAKER,A.,SCHAUB,M.,SAYEGH,M.H.,BELYAEV,A.,HAEMERS,A.,SCHARPE,S.,KUPIEC-WEGLINSKI,J.W.,抑制CD26/二肽基肽酶IV的體內(nèi)活性延長(zhǎng)接受大鼠的心臟同種異體移植的存活率(Inhibition of CD26/dipeptidyl peptidase IV activity in vivoprolongs cardiac allograft survival in rat recipients),Transplantation 63,1495(1997))。還可抑制風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(參見(jiàn)TANAKA,S.,MURAKAMI,T.,HORIKAWA,H.,SUGIURA,M.,KAWASHIMA,K.,SUGITA,T.,二肽基肽酶IV抑制劑對(duì)關(guān)節(jié)炎的抑制(Suppression of arthritis by the inhibitors ofdipeptidyl peptidase IV),Int.J.Immunopharmacol.19,15(1997))。
還發(fā)現(xiàn)，因?yàn)槊富钚缘南嚓P(guān)的暫時(shí)性下降，給藥哺乳動(dòng)物血液中DP IV或者DP IV類(lèi)似酶活性的穩(wěn)定抑制劑(效應(yīng)物)，可使DP IV和DP IV樣酶導(dǎo)致的內(nèi)源性(或者其他外源性給藥的)促胰島素肽胃抑制劑多肽1-42(GIP1-42)和胰高血糖素樣肽酰胺-17-36(GLP-17-36)(或者GLP-17-37或者其類(lèi)似物)分解的下降，因此減少或延遲了這些肽激素或其類(lèi)似物濃度的下降。(內(nèi)源性存在或者外源性引入的)腸降血糖素或其類(lèi)似物的更高穩(wěn)定性，由于DP IV效應(yīng)物的作用，改變了身體本身的胰島素作用，導(dǎo)致對(duì)治療生物中碳水化合物代謝的刺激作用，而所述DP IV效應(yīng)物可增加胰腺中Langerhans細(xì)胞的腸降血糖素受體的促胰島素性刺激作用的有效性。其結(jié)果是，所治療生物的血清中的血糖濃度下降至高血糖的特征葡萄糖濃度以下。因此，用DP IV抑制劑可防止或者緩解代謝異常，如過(guò)重、葡糖尿、高脂血、以及可能?chē)?yán)重的代謝酸中毒和糖尿病，它們是血糖濃度長(zhǎng)期升高的結(jié)果(參見(jiàn)DE 196 16 486)。
用DP IV抑制劑還可經(jīng)驗(yàn)性地防止HIV對(duì)CD 26(DP IV)陽(yáng)性細(xì)胞的滲透(參見(jiàn)WAKSELMAN,M.,NGUYEN,C.,MAZALEYRAT,J.-P.,CALLEBAUT,C.,KRUST,B.,HOVANESSIAN,A.G.用CD 26的DPP IV活性的強(qiáng)效環(huán)肽抑制劑抑制HIV-1對(duì)CD 26陽(yáng)性而不是CD26細(xì)胞的感染(Inhibition of HIV-1 infection of CD 26+but not CD 26-cells by a potentcyclopeptidic inhibitor of the DPP IV activity of CD 26).Abstract P 44 of the24thEuropean Peptide Symposium 1996)。
還發(fā)現(xiàn)DP IV可調(diào)節(jié)神經(jīng)活性肽的活性，如神經(jīng)肽Y和CLIP(參見(jiàn)MENTLEIN,R.,DAHMS,P.,GRANDT,D.,KRUGER,R.,用二肽基肽酶IV對(duì)神經(jīng)肽Y和肽YY的蛋白酶解加工(Proteolytic processing of neuropeptideY and peptide YY by dipeptidyl peptidase IV).Regul.Pept.49,133(1993)；WETZL,W.,WAGNER,T.,VOGEL,D.,DEMUTH,H.-U.,BALSCHUN,D.,CLIP片段ACTH 20-24對(duì)REM睡眠期持續(xù)時(shí)間的作用(Effects of theCLIP fragment ACTH 20-24 on the duration of REM sleep episodes).Neuropeptides,31,41(1997))。
DP IV抑制劑的這些不同作用表明，當(dāng)在組織的具體病理生理?xiàng)l件下使用時(shí)，它們的作用可對(duì)其他正常的生理狀態(tài)產(chǎn)生作用，例如在其他器官中。這些作用對(duì)于目標(biāo)生物既有正面又有負(fù)面的后果。
因此，本發(fā)明的目的是提供DP IV的效應(yīng)物，其具有DP IV抑制劑的高生物利用度，而且在具體的目標(biāo)組織或者目標(biāo)生物中具有精確限定的作用時(shí)間。
特別是，本發(fā)明的目的是提供DP IV抑制劑，其具有精確限定的短作用時(shí)間和高生物利用度。
這些目的是通過(guò)二肽基肽酶IV(DP IV)的不穩(wěn)定抑制劑的化合物來(lái)解決的，該化合物具有通式A-B-C，其中A是氨基酸，B是A和C之間的化學(xué)鍵或者是氨基酸，而C是DP IV的不穩(wěn)定抑制劑。
當(dāng)B代表一個(gè)鍵時(shí)，其特別是肽鍵；當(dāng)B是氨基酸時(shí)，其優(yōu)選通過(guò)肽鍵連接在A和C上。
根據(jù)本發(fā)明，這些化合物可用作DP IV的抑制劑，它們的作用部位、作用的起始時(shí)間、以及作用的持續(xù)時(shí)間都可精確地限定。
在給藥時(shí)，該化合物例如由于合適酶的作用而斷裂，由此不穩(wěn)定的“C”抑制劑通過(guò)除去A-B基團(tuán)而被釋放。該抑制劑可通過(guò)化學(xué)和酶機(jī)理釋放。例如，酯酶、蛋白酶和肽酶都可用于從根據(jù)本發(fā)明的化合物中釋放活性成分。所述酯酶、蛋白酶等例如公開(kāi)在WO 97/45117、US5433955、US 5614379和US 5624894中。
所釋放的不穩(wěn)定抑制劑然后可與已經(jīng)存在的DP IV相互作用并對(duì)其進(jìn)行抑制。其直接結(jié)果是，例如上述促胰島素肽被分解成更小的程度，并由此增加胰島素的作用。
已證明給藥DP IV的不穩(wěn)定抑制劑本身對(duì)于抑制DP IV不是有利的，這是因?yàn)樗鼈冊(cè)隗w內(nèi)快速分解，抑制劑的均勻分布、特別是在人體中的均勻分布由此是不可能的。具體而言，在口服給藥時(shí)，此等抑制劑非常不穩(wěn)定，使得它們實(shí)際上根本沒(méi)有活性。因此，穩(wěn)定的抑制劑目前特別是用于糖尿病的治療。
令人驚奇的是，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)不穩(wěn)定的“C”抑制劑可通過(guò)將其掩蔽為式A-B-C的化合物來(lái)充分地穩(wěn)定。
該穩(wěn)定作用目前也是令人驚奇的，因?yàn)榫哂恤始谆拎の袒鶊F(tuán)的式A-B-C化合物在吡啶翁氮原子處是正電荷的。其結(jié)果是，亞甲基對(duì)在除去A-B基團(tuán)后構(gòu)成抑制劑的活性親核反應(yīng)中心的基團(tuán)產(chǎn)生吸電子作用。在所形成的反應(yīng)中心活化的基礎(chǔ)上，預(yù)期其親核性將增加至親核基團(tuán)非特異性地“停留”在化合物A-B-C處的程度，而且抑制劑失活。但令人驚奇地發(fā)現(xiàn)，抑制劑的此等失活沒(méi)有發(fā)生。
為通過(guò)DP IV抑制劑干擾僅需要對(duì)目標(biāo)酶DP IV產(chǎn)生短期作用的生理控制循環(huán)，根據(jù)本發(fā)明提供例如作為組分C的抑制劑，其僅具有短的作用持續(xù)時(shí)間，而且在限定的半衰期后變成沒(méi)有抑制劑活性的化合物。
例如，為增強(qiáng)腸降血糖素在糖尿病中的作用，抑制劑幾分鐘的持續(xù)作用時(shí)間就已經(jīng)足夠，而例如抑制移植時(shí)的DP IV介導(dǎo)的免疫應(yīng)答則需要抑制劑的長(zhǎng)期作用。
在釋放后，根據(jù)本發(fā)明的不穩(wěn)定抑制劑環(huán)化成例如吡嗪衍生物，并因此失活。該反應(yīng)同時(shí)發(fā)生，而且有助于N端氨基氮對(duì)二肽衍生物的C端羰基官能團(tuán)的親核作用，并可通過(guò)氨基酸/酰亞胺鍵處的cis/trans異構(gòu)化來(lái)促進(jìn)，該異構(gòu)化在包含脯氨酸的肽中可特別有利地進(jìn)行。
而且，在化合物到達(dá)所希望的目標(biāo)腔室例如血液循環(huán)并開(kāi)始所希望的活性前，不會(huì)開(kāi)始分解過(guò)程。
本發(fā)明化合物的這些性質(zhì)可根據(jù)本發(fā)明用于設(shè)計(jì)不同的DP IV抑制劑，以通過(guò)釋放后的分子內(nèi)環(huán)化來(lái)引發(fā)DP IV抑制劑的所希望的暫時(shí)性失活。
具體而言，根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的化合物是其中C為在C端具有活性羰基的二肽衍生物。C優(yōu)選為二肽基氯烷基酮、二肽基硼酸或者二肽基氰化物或者二肽基吡啶翁甲基酮化合物。已證明此等抑制劑是特別有效的不穩(wěn)定DP IV抑制劑。二肽基例如是Ile-Thia、Ile-Pyr、Val-Thia和Val-Pyr。
根據(jù)本發(fā)明抑制劑(組分C)也可以是鹽形式，優(yōu)選為有機(jī)鹽，如乙酸鹽、琥珀酸鹽、酒石酸鹽、或富馬酸鹽，或者優(yōu)選是無(wú)機(jī)酸鹽如硫酸鹽或者磷酸鹽。特別優(yōu)選的是富馬酸鹽。
根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案，化合物中B是脯氨酸、羥基脯氨酸、噻唑烷羧酸、脫氫脯氨酸、2-哌啶酸、氮雜環(huán)丁烷羧酸或者氮丙啶羧酸，其中特別優(yōu)選脯氨酸和羥基脯氨酸。
具體而言，根據(jù)本發(fā)明的化合物還具有根據(jù)個(gè)體患者的需要釋放DPIV抑制劑的優(yōu)點(diǎn)。
當(dāng)根據(jù)本發(fā)明的化合物與DP IV分子相互作用時(shí)，其被酶斷裂為A-B基團(tuán)和抑制劑C。抑制劑C將抑制DP IV分子，使其不能進(jìn)一步斷裂該化合物。如果還存在DP IV分子，化合物將繼續(xù)被斷裂(如果已給藥足夠量的相應(yīng)化合物)，直至抑制最后的DP IV分子。剩余的化合物不再被分解，并由此構(gòu)成抑制劑儲(chǔ)存，直至DP IV分子的濃度又一次升高或者抑制劑分子被DP IV置換或者抑制劑分子被消除或失活，根據(jù)本發(fā)明的化合物再被斷裂并由此釋放抑制劑。
本發(fā)明的再一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是，每種生物將釋放抑制已有DP IV所需要的精確量的抑制劑，其在每個(gè)情況下都是不同的。例如如果患者具有高濃度的DP IV，則就釋放大量的抑制劑；而如果僅有略高濃度的DP IV，則釋放少量的抑制劑。
具體而言，特別優(yōu)選的化合物是其中A-B是式Ile-Pro或者Gly-Pro的二肽。
本發(fā)明因此涉及絲氨酸肽酶二肽基肽酶IV的不穩(wěn)定抑制劑的新型化合物，該化合物可用于治療各種疾病，特別是治療與糖尿病有關(guān)的代謝紊亂。
令人驚奇的是，此等掩蔽抑制劑比未經(jīng)掩蔽的抑制更為有效如果使用相同量的未經(jīng)掩蔽的DP IV抑制劑和根據(jù)本發(fā)明的化合物，則根據(jù)本發(fā)明的化合物在Wistar大鼠中產(chǎn)生顯著提高的葡糖耐量。
本發(fā)明化合物的再一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是，合適地選擇基團(tuán)A-B可以暫時(shí)性控制DP IV抑制劑的作用起始和作用持續(xù)時(shí)間。具體而言，從根據(jù)本發(fā)明的化合物中釋放基團(tuán)A-B取決于基團(tuán)A氨基酸的性質(zhì)對(duì)于基團(tuán)A,DPIV從化合物中釋放基團(tuán)A-B的速率具體順序如下Ile＜Val＜Phe＜Pro＜Ala＜Gly。相應(yīng)的DP IV催化釋放速率常數(shù)為1-100s-1。因此就有了以精確暫時(shí)性的限定方式釋放DP IV抑制劑如果例如在攝入富葡萄糖的營(yíng)養(yǎng)物時(shí)酶立即作用，所選擇的化合物A-B-C中例如具有氨基酸Gly作為A基團(tuán)；如果延遲抑制劑的作用，則例如選擇氨基酸Ile作為基團(tuán)A。
因此，通過(guò)根據(jù)本發(fā)明的化合物，可特別是實(shí)際上沒(méi)有任何延遲、例如實(shí)際上與營(yíng)養(yǎng)物攝入同時(shí)地經(jīng)由小腸粘膜轉(zhuǎn)運(yùn)DP IV抑制劑。
而且，DP IV抑制劑釋放的部位和它們作用的部位也可以通過(guò)基團(tuán)A-B的性質(zhì)來(lái)控制。
除二肽基肽酶IV以外，各種其他氨基肽酶，如焦谷氨?；被拿负透滨；被拿?，也存在于哺乳動(dòng)物的血液中。合適地選擇基團(tuán)A-B，可根據(jù)本發(fā)明測(cè)定釋放DP IV抑制劑的氨基肽酶，并因此確定抑制劑的作用發(fā)生在何處。根據(jù)本發(fā)明的化合物或者相應(yīng)的藥物組合物還因此可用于細(xì)胞、組織或者器官特異性DP IV抑制中?；鶊F(tuán)A-B也可進(jìn)行選擇，使得針對(duì)僅在血管中存在并以足夠快的速率釋放抑制劑的酶。
總之，通過(guò)本發(fā)明的不穩(wěn)定DP IV抑制劑的化合物，可完全令人驚奇地實(shí)現(xiàn)以下方面
1、增加抑制劑的作用；2、根據(jù)患者的需要釋放抑制劑；3、以暫時(shí)受控的方式從化合物中釋放抑制劑；4、控制從化合物中釋放抑制劑的部位；5、提高DP IV抑制劑的儲(chǔ)存；以及6．從其未掩蔽的時(shí)間起精確地限定作用的持續(xù)時(shí)間或者引發(fā)劑作用的結(jié)束。
根據(jù)本發(fā)明還提供特別適用于口服給藥的藥物組合物，其特征在于包含至少一種根據(jù)本發(fā)明的化合物，并任選與常規(guī)載體或賦形劑組合。
根據(jù)本發(fā)明的化合物或者包含該化合物的藥物組合物可用于治療或預(yù)防哺乳動(dòng)物中可通過(guò)調(diào)節(jié)哺乳動(dòng)物的DP IV活性來(lái)治療的疾病，例如人的代謝紊亂。
具體而言，所述化合物可用于治療哺乳動(dòng)物中的受損葡糖耐量、葡糖尿、高脂血、代謝酸中毒、糖尿病、糖尿病性神經(jīng)病和腎病、以及糖尿病的后遺癥。因?yàn)楦鶕?jù)本發(fā)明的不穩(wěn)定抑制優(yōu)選具有短的作用持續(xù)時(shí)間，特別有可能最小化或者防止對(duì)人或動(dòng)物體內(nèi)需要長(zhǎng)期DP IV抑制作用的過(guò)程的影響。
反應(yīng)時(shí)間為5分鐘。在1.0mmol的Z-保護(hù)肽中添加2ml的HBr/冰乙酸(33％)，混合物在23℃下攪拌約10分鐘。然后進(jìn)行真空濃縮。用乙醚使氫溴酸鹽的肽從甲醇中沉淀，抽濾，然后真空干燥。經(jīng)驗(yàn)式C16H24N3O2Cl分子量325.84Da產(chǎn)率理論值的97.7％HPLC保留時(shí)間7.4分鐘，LiChrosper 100 RP-18(125-4),λ=220nm，流速0.5ml/min，非梯度50％乙腈水溶液(0.1％TFA)MALDI-TOF-MS m/z:291.2 Da(M+H+，無(wú)氯離子)1.2合成H-Phe-Pro-CH2-(N+C5H5)/Cl-a)Z-Phe-Pro-CH2-(N+C5H5)/Cl-結(jié)構(gòu)式 制備將2ml吡啶添加在10mmol的Z-Phe-Pro-氯甲基酮中。該混合物在23℃下攪拌4天。在2mbar的真空下蒸餾掉過(guò)量的吡啶。粗產(chǎn)物在60g硅膠上進(jìn)行純制。在氯仿/甲醇洗脫液(9∶1體積比)中首先收集產(chǎn)物，然后隨著洗脫液的極性增加，收集氯甲基酮。Z-Phe-Pro-吡啶翁甲基酮最后進(jìn)行HPLC純制。經(jīng)驗(yàn)式C28H30N3O4Cl分子量508.01Da產(chǎn)率理論值的69.6％HPLC保留時(shí)間17分鐘，LiChrosper RP-8(Hibar),λ=220nm,流速8.0ml/min，非梯度50％乙腈水溶液(0.1％TFA)保留時(shí)間3.4分鐘，LiChrosper RP 8(125*4),λ=220nm,流速1.5ml/min，梯度30-80％乙腈水溶液(0.1％TFA)25分鐘保留時(shí)間10.2分鐘，Nucleosil 7 C8,λ=220nm，流速8ml/min，非梯度50％乙腈水溶液(0.1％TFA)1H NMR(DMSO-d6)δH:1.7-2.1(4H,m,H20和H21),2.7-3.0(2H,m,H11),3.4-3.9(2H,m,H19),4.4-4.6(1H,m,H9),4.6-4.8(2H,m,H24,H25),5.0-5.1(2H,dd,H7),5.7-5.8(1H,d,H18),5.9-6.1(2H,dd,H23),7.2-7.4(10H,m,H2-H6,H13-H17),8.6-8.8(1H,dd,H28),8.2-8.3(2H,d,H26和H27),8.8-8.9(1H,d,6Hz,NH)13C NMR(DMSO-d6)δC:136.8(C1),127.9(C2,C3),127.6(C4,C5),128.4(C6),65.5(C7),156.3(C8),54.1(C9),170.9(C10),36.4(C11),137.6(C12),126.6(C13,C14),128.4(C15,C16),129.3(C17),63.1(C18),46.9(C19),25.1(C20),27.6(C21),200.7(C22),66.3(C23),146.2(C24,C25),128.2(C26,C27),146.4(C28)MALDI-TOF-MS m/z:472.8 Da(M+H+，無(wú)氯離子)b)H-Phe-Pro-CH2-(N+C5H5)/Cl-結(jié)構(gòu) 制備從Z-Phe-Pro-CH2-(N+C5H5)/Cl-中脫除Z保護(hù)基，反應(yīng)時(shí)間為5分鐘。在1.0mmol的Z-保護(hù)肽中添加2ml的HBr/冰乙酸(33％)，混合物在23℃下攪拌約10分鐘。然后進(jìn)行真空濃縮。
用乙醚使氫溴酸鹽形式的肽從甲醇中沉淀，抽濾，然后真空干燥。經(jīng)驗(yàn)式C20H24N3O2Cl分子量373.88Da產(chǎn)率理論值的98％HPLC保留時(shí)間6.9分鐘，LiChrosper 100 RP-18(125-4),λ=220nm，流速0.5ml/min，非梯度50％乙腈水溶液(0.1％TFA)MALDI-TOF-MS m/z:337.2 Da(M+H+，無(wú)氯離子)1.3合成H-Gly-Pro-Val-Pro-CH2-(N+C5H5)/Cl-a)Z-Gly-Pro-Val-Pro-CH2-(N+C5H5)/Cl-結(jié)構(gòu)式 制備將2ml吡啶添加在10mmol的Z-Gly-Pro-Val-Pro-氯甲基酮中。
該混合物在23℃下攪拌4天。在2mbar的真空下蒸餾掉過(guò)量的吡啶。Z-Gly-Pro-Val-Pro-吡啶翁甲基酮用HPLC進(jìn)行純制。經(jīng)驗(yàn)式C31H40N5O6Cl分子量614.14Da產(chǎn)率理論值的69.6％HPLC保留時(shí)間17.4分鐘，LiChrosper RP 8 Hibar,λ=220nm,流速8.0ml/min，非梯度50％乙腈水溶液(0.1％TFA)保留時(shí)間5.4分鐘，LiChroCART 100 RP-18(125-4),λ=220nm，流速0.5ml/min，非梯度50％乙腈水溶液(0.1％TFA)保留時(shí)間17.7分鐘，Nucleosil 100 7 C8,λ=220nm，流速8ml/min，非梯度50％乙腈水溶液(0.1％TFA)13C NMR(DMSO-d6)δC:134.4(C1),128.9(C2,C3),128.2(C4,C5),129.8(C6),65.3(C7),157.2(C8),39.0(C9),165.7(C10),56.0(C11),41.6(C12),24.6(C13),29.0(C14),170.5(C15),52.1(C16),171.9(C17),30.3(C18),18.6,19.3(C19,C20),58.9(C21),47.2(C22),25.0(C23),29.4(C24),196.5(C25),65.8(C26),137.9(C27,C28),129.1(C29,C30),146.5(C31)MALDI-TOF-MS m/z:579.7 Da(M+H+，無(wú)氯離子)b)H-Gly-Pro-Val-Pro-CH2-(N+C5H5)/Cl-結(jié)構(gòu) 制備從Z-Phe-Pro-CH2-(N+C5H5)/Cl-中脫除Z保護(hù)基，反應(yīng)時(shí)間為5分鐘。在1.0mmol的Z-保護(hù)肽中添加2ml的HBr/冰乙酸(33％)，混合物在23℃下攪拌約10分鐘。然后進(jìn)行真空濃縮。
用乙醚使氫溴酸鹽形式的肽從甲醇中沉淀，抽濾，然后真空干燥。經(jīng)驗(yàn)式C23H34N5O4Cl分子量480.0Da產(chǎn)率理論值的95％MALDI-TOF-MS m/z:443.9 Da(M+H+，無(wú)氯離子)1、不穩(wěn)定DP IV抑制劑以及它們掩蔽的形式在水溶液中的分解為分析在1.1和1.2中制各的抑制劑的穩(wěn)定性，在緩沖水溶液中溫育這些抑制劑，并用MALDI-TOF質(zhì)譜監(jiān)測(cè)它們的分子內(nèi)環(huán)化(圖2和3)。反應(yīng)產(chǎn)物為相應(yīng)的吡嗪衍生物(

圖1)。
分子量為337.2Da的H-Phe-Pro-吡啶翁甲基酮分解為分子量是319.2Da的環(huán)狀吡嗪衍生物，其中除去水，該反應(yīng)在30分鐘的時(shí)間內(nèi)完全是定量的(圖2)。
分子量為291.2Da的H-Val-Pro-吡啶翁甲基酮分解為分子量是273.2Da的環(huán)狀吡嗪衍生物，其中除去水，該反應(yīng)在60分鐘的時(shí)間內(nèi)完全是定量的(圖3)。
在分子內(nèi)反應(yīng)期間形成吡嗪的雙鍵系統(tǒng)，使得能夠通過(guò)UV光譜計(jì)定量分析環(huán)化過(guò)程(圖4)。在0.1M HEPES緩沖液pH=7.6和25℃下由其中測(cè)定的不穩(wěn)定DP IV抑制劑的分子內(nèi)環(huán)化反應(yīng)速率常數(shù)見(jiàn)以下表1所示。
表1不穩(wěn)定DP IV抑制劑的環(huán)化反應(yīng)參數(shù)
與此相反的是，證明根據(jù)本發(fā)明的H-Val-Pro-CH2-(N+C5H5)和H-Gly-Pro-Val-Pro-CH2-(N+C5H5)化合物在相同條件下于24小時(shí)的時(shí)間中是完全穩(wěn)定的。2、不穩(wěn)定DP IV抑制劑或者根據(jù)本發(fā)明的包含二肽基肽酶IV的化合物在水溶液中的相互作用在存在底物時(shí)DP IV目標(biāo)酶與不穩(wěn)定抑制劑溫育，首先觀察酶的抑制；由于平行地發(fā)生抑制劑的分子內(nèi)環(huán)化，抑制作用隨實(shí)驗(yàn)時(shí)間的發(fā)展開(kāi)始下降，這是因?yàn)榉磻?yīng)溶液中的抑制劑濃度由于同時(shí)發(fā)生的化學(xué)反應(yīng)而降低。該作用見(jiàn)圖5和6所示。因?yàn)橐种苿舛鹊臅r(shí)間依賴(lài)性降低，底物的酶催化水解的速率隨時(shí)間增加。
與未掩蔽的DP IV抑制劑相反，已證明在沒(méi)有酶存在時(shí)根據(jù)本發(fā)明的化合物H-Gly-Pro-Val-Pro-CH2-(N+C5H5)在緩沖水溶液中于24小時(shí)的時(shí)間內(nèi)都是穩(wěn)定的。僅在添加DP IV酶時(shí)釋放活性DP IV抑制劑H-Val-Pro-CH2-(N+C5H5)(在此也稱(chēng)為釋放DP IV抑制劑)，其中除去N端二肽H-Gly-Pro-OH。因此，在質(zhì)譜(圖7)中，即使在溫育60分鐘后，根據(jù)本發(fā)明的溫育化合物中仍有50％以上可以被檢測(cè)出來(lái)。由于延遲釋放，還令人驚奇地發(fā)現(xiàn)除所希望地有效抑制目標(biāo)酶外，與不穩(wěn)定DP IV抑制劑相比，明顯地延長(zhǎng)了活性而且顯著降低根據(jù)本發(fā)明的化合物的濃度(圖8)。 圖1H-Phe-Pro-吡啶翁甲基酮的分子內(nèi)環(huán)化產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)式。對(duì)相應(yīng)的原子給出用13C NMR和1H NMR測(cè)定的特征化學(xué)位移(ppm)。 圖2H-Phe-Pro-吡啶翁甲基酮在pH=7.6的緩沖水溶液中的分子內(nèi)環(huán)化反應(yīng)的MALDI-TOF質(zhì)譜，其是根據(jù)溫育時(shí)間來(lái)記錄的。 圖3H-Val-Pro-吡啶翁甲基酮在pH=7.6的緩沖水溶液中的分子內(nèi)環(huán)化反應(yīng)的MALDI-TOF質(zhì)譜，其是根據(jù)溫育時(shí)間來(lái)記錄的。 圖4在0.1 MHEPES緩沖液pH=7.6中于30℃下溫育的H-Phe-Pro-吡啶翁甲基酮水溶液的UV光譜。環(huán)化反應(yīng)的監(jiān)測(cè)時(shí)間為40分鐘。 圖5在0.1M HEPES緩沖液pH=7.6、30℃中有2.8×10-3M的H-Val-Pro-吡啶翁甲基酮、0.06μg/ml的DP IV、4×10-4M的H-Gly-Pro-pNA存在時(shí)DP IV對(duì)底物H-Gly-Pro-pNA的催化水解反應(yīng)曲線。 圖6在0.1M HEPES緩沖液pH=7.6、30℃中有2.1×10-4M的H-Phe-Pro-吡啶翁甲基酮、0.0(6μg/ml的DP IV、1.0×10-3mol/l的H-Gly-Pro-pNA存在時(shí)DP IV對(duì)底物H-Gly-Pro-pNA的催化水解反應(yīng)曲線。 圖7在有2.6×10-5mol/l的H-Gly-Pro-Val-Pro-吡啶翁甲基酮、0.06μg/ml的DP IV、2.0×10-4M的H-Gly-Pro-pNA、0.1M HEPES緩沖液pH=7.6存在時(shí)在30℃下DP IV對(duì)H-Gly-Pro-pNA的催化水解的溫育浴的MALDI-TOF質(zhì)譜。 圖8在0.1M HEPES緩沖液pH=7.6、30℃中有2.6×10-5mol/l的H-Gly-Pro-Val-Pro-吡啶翁甲基酮、0.06μg/ml的DP IV、2.0×10-4M的H-Gly-Pro-pNA存在時(shí)DP IV對(duì)H-Gly-Pro-pNA的催化水解的反應(yīng)曲線。
權(quán)利要求
1.二肽基肽酶IV(DP IV)的抑制劑的化合物，該化合物具有通式A-B-C，其中A是氨基酸，B是A和C之間的化學(xué)鍵或者是氨基酸，而C是DP IV的不穩(wěn)定抑制劑。
2.如權(quán)利要求1所述的化合物，其特征在于，B是脯氨酸、羥基脯氨酸、噻唑烷羧酸、脫氫脯氨酸、2-哌啶酸、氮雜環(huán)丁烷羧酸或者氮丙啶羧酸。
3.如權(quán)利要求1或2所述的化合物，其特征在于，B是脯氨酸和羥基脯酸。
4.如任一前述權(quán)利要求所述的化合物，其特征在于，C為在C端具有活性羰基的二肽衍生物，如二肽基烷基酮衍生物。
5.如任一前述權(quán)利要求所述的化合物，其特征在于，C是二肽基氯烷基酮、二肽基硼酸或者二肽基氰化物或者二肽基吡啶翁甲基酮基團(tuán)。
6.如任一前述權(quán)利要求所述的化合物，其特征在于，所述抑制劑為鹽的形式。
7.如任一前述權(quán)利要求所述的化合物，其特征在于，A-B是式Ile-Pro或Gly-Pro的二肽。
8.特別是用于口服給藥的藥物組合物，其特征在于包括至少一種如任一前述權(quán)利要求所述的化合物以及任選的常規(guī)載體或賦形劑。
9.如任一前述權(quán)利要求所述的化合物或者藥物組合物在制備用于暫時(shí)性受控體內(nèi)抑制DP IV的藥物中的應(yīng)用。
10.如權(quán)利要求1-7之一所述的化合物或藥物組合物在細(xì)胞、組織或器官特異性抑制DP IV中的應(yīng)用。
11.如權(quán)利要求1-7之一所述的化合物或藥物組合物在治療哺乳動(dòng)物中可通過(guò)調(diào)節(jié)哺乳動(dòng)物的DP IV活性來(lái)治療的疾病中的應(yīng)用。
12.如權(quán)利要求10所述的應(yīng)用，其是用于治療人的代謝紊亂。
13.如權(quán)利要求10所述的應(yīng)用，其是用于治療哺乳動(dòng)物中受損葡糖耐量、葡糖尿、高脂血、代謝酸中毒、糖尿病、糖尿病性神經(jīng)病和腎病、以及糖尿病的后遺癥。
全文摘要
本發(fā)明涉及二肽基肽酶Ⅳ(DPⅣ)的不穩(wěn)定抑制劑的化合物,該化合物具有通式A－B－C,其中A是氨基酸,B是A和C之間的化學(xué)鍵或者是氨基酸,而C是DPⅣ的不穩(wěn)定抑制劑。該化合物可用于治療哺乳動(dòng)物中受損葡糖耐量、葡糖尿、高脂血、代謝酸中毒、糖尿病、糖尿病性神經(jīng)病和腎病、以及糖尿病的后遺癥。
文檔編號(hào)A61P3/10GK1306541SQ99807628
公開(kāi)日2001年8月1日 申請(qǐng)日期1999年6月24日 優(yōu)先權(quán)日1998年6月24日
發(fā)明者漢斯-烏爾里?！さ履绿? 約恩·施米特, 托爾斯滕·霍夫曼, 康拉德·格隆德 申請(qǐng)人:前體生物藥物開(kāi)發(fā)有限公司