專利名稱：人參二醇組皂甙及其組合物在血液病治療中的應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及血液病臨床治療，主要是把人參皂甙中的人參二醇組皂甙及其組合物應用于血液病的臨床治療。
目前國內(nèi)外對難治性血液病，因其病因復雜尚無特殊療法，長期用強的松和雄激素的常規(guī)療法有眾所周知的副作用，而重組生長因子療法價格昂貴，無法常規(guī)使用，且對很多難治性血液病無效。人參作為抗衰老強壯劑和補氣血藥物已有千余年歷史，人參提取物即人參總皂甙，對神經(jīng)、心血管、內(nèi)分泌、免疫和抗腫瘤的實驗研究已有不少報道，但對血液方面的實驗研究很少，尤其是人參二醇組皂甙及其組合物，也未見有這方面的臨床報道。
本發(fā)明的目的是提供一種含人參皂甙，尤其是人參二醇組皂甙的組合物，應用于血液病的臨床治療。
本發(fā)明提供的組合物，是由人參皂甙，尤其是人參二醇組皂甙和藥用載體和/或藥用賦形劑組成，應用于血液病的治療。
本發(fā)明將人參皂甙，尤其是人參二醇組皂甙及其組合物，應用于血液病的治療，療效優(yōu)于現(xiàn)有的常規(guī)藥物，且在治療中無毒副反應，本發(fā)明提供的組合物，對造血細胞具有刺激增殖作用，對再生障礙性貧血患者的造血祖細胞具有刺激增殖作用，對白血病祖細胞有增殖的抑制和刺激的雙向作用，有較強的促進化療藥殺傷白血病細胞的作用。
本發(fā)明提供的人參皂甙，尤其是人參二醇組皂甙的組合物，克服了現(xiàn)有治療血液病藥物存在的毒副作用大，價格昂貴等不足之處，為血液病治療提供了新的途徑，拓展了人參皂甙的臨床應用范圍。同時減輕了患者因毒副作用帶來的痛苦，尤其因為該組合物成本較低，也減輕了血液病患者的經(jīng)濟負擔。
本發(fā)明通過以下實施例作進一步說明。
實施例1人參二醇組皂甙組合物的一種配方處方人參二醇粉 30克糊 精 470克制 成 1000粒制備取人參須根粗粉(20目篩)適量，以適當濃度乙醇進行滲漉提取至無色，收集提取液，靜置24小時以上，取上清液回收乙醇至無醇味，將藥液濃縮至適當濃度，上柱，以柱層析分離法進行分離提取，以低度乙醇進行分離，收集分離提取液，經(jīng)真空干燥數(shù)小時后，得結(jié)晶狀，淡黃色人參二醇精品。稱取精品30克，碾成極細粉，過80目篩，與糊精混合均勻，裝入膠囊即可，每粒膠囊0.5克(含人參二醇純品30毫克)。質(zhì)量標準符合衛(wèi)生部藥品衛(wèi)生標準規(guī)定和中國藥典95版。
實施例2人參二醇組皂甙對小鼠骨髓造血祖細胞作用研究人參作為藥用已有幾千年的歷史，其有效成分主要是由20多種單體皂甙組成的人參總皂甙，各成分的藥理作用不盡相同。人參皂甙按單體皂甙元所含羥基量不同分為人參二醇組皂甙(Pananxadiol Saponin；PDS)，人參三醇組皂甙(Panaxtrol Saponin；PTS)兩大類。本研究采用造血祖細胞體外培養(yǎng)技術，比較PDS對小鼠骨髓造血祖細胞(簡稱CFU-E、BFU-E)和粒單系祖細胞(簡稱CEU-GM)的作用。
材料與方法1、動物NIH小鼠，雄性，體重18-22克。
2、PDS按實施例1方法制備。
3、CFU-E、BFU-E、CFU-GM按唐佩弦《造血細胞培養(yǎng)技術》培養(yǎng)。
4、PDS體外刺激試驗將PDS工作液加入小鼠骨髓造血祖細胞CFU-E、BFU-E、CFU-GM培養(yǎng)體系中，終濃度分別為1、5、10、20、50μg/ml，設立對照組，培養(yǎng)7天后觀察結(jié)果。
5、實驗結(jié)果用t檢驗方法，分析PDS組與對照組之間的差異。
結(jié)果(1)PDS對小鼠骨髓CFU-E的作用表1顯示將不同PDS加入8份小鼠骨髓培養(yǎng)CFU-E的情況，結(jié)果表明當PDS濃度為1、5、10和20ug/ml時CFU-E集落產(chǎn)率明顯高于對照組(p＜0.05)，提高率分別為26.1％、58.5％、29.0％和25.8％。
表1 PDS對小鼠骨髓CFU-E的作用
(2)PDS對小鼠骨髓BFU-E的作用表2顯示將不同濃度的PDS加入8份小鼠骨髓培養(yǎng)BFU-E情況，結(jié)果表明當PDS濃度為1、5、10和20 ug/ml時BFU-E集落產(chǎn)率明顯高于對照組(p＜0.05)，提高率分別為27.0％、64.7％、36.7％和29.4％，高濃度不抑制。
表2 PDS 對小鼠骨髓BFU-E的作用
(3)PDS對小鼠骨髓CFU-GM的作用表3顯示將不同濃度的PDS加入8份小鼠骨髓培養(yǎng)CFU-GM情況，結(jié)果表明PDS濃度為1、5、10、20和50 ug/ml時，CFU-GM集落產(chǎn)率明顯高于對照組(p＜0.05)，提高率分別為32.3％、54.0％、38.2％、36.5％和28.6％。
表3 PDS對小鼠骨髓CFU-GM的作用
本實驗結(jié)果表明PDS體外對小鼠骨髓CFU-E、BFU-E、CFU-GM均有明顯的刺激增殖作用，與對照組相比分別提高58.5％、64.7％和54.0％，且高濃度不抑制。
實施例3人參二醇對正常人骨髓造血祖細胞的作用材料與方法1、標本取非血液病患者正常肋骨骨髓，骨髓涂片為正常髓象。
2、紅系祖細胞(CFU-E、BFU-E)，粒單祖細胞(CFU-GM)培養(yǎng)方法與實施例1相同。
3、多向祖細胞(CFU-Mix)培養(yǎng)取IMDM混合培養(yǎng)體系中含4×105/ml骨髓單個核細胞、0.3％瓊脂、25％人AB型血清、10-5mol/L 2-ME和L-谷氨酰胺，每ml培養(yǎng)體系含重組的造血生長因子如下紅細胞生成素(EPO)2U、粒/單-集落刺激因子(GM-CSF)20ng，以0.25 ml/孔(四個復孔)接種至培養(yǎng)板上，置于37℃，含5％CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱孵育，于14天后計數(shù)CFU-Mix集落。
4、PDS對CFU-E、BFU-E、CFU-GM和CFU-Mix刺激試驗將PDS工作液加入培養(yǎng)體系中，終濃度分別為2.5、10、20、50、100和200ug/ml時，并設立無PDS的對照組，于培養(yǎng)7、14天后觀察結(jié)果。
5、數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析處理用t檢驗。
結(jié)果(1)PDS對正常人骨髓CFU-E的作用表1顯示將不同濃度的PDS加入10份正常人骨髓標本培養(yǎng)CFU-E的結(jié)果。當PDS濃度為2.5、10、20、50、100和200 ug/ml時，CFU-E集落產(chǎn)率明顯高于對照組，具有顯著性差異。提高率分別為24.8％、25.3％、33.9％、54.9％、44.0％、32.4％。
表1 PDS對正常人骨髓CFU-E的增殖作用(n=10)
(2)PDS對正常人骨髓BFU-E的增殖作用表2顯示將不同濃度的PDS、加入10份正常人骨髓標本培養(yǎng)BFU-E結(jié)果。當PDS濃度為2.5、10、20、50、100和200 ug/ml時，BFU-E集落產(chǎn)率均明顯高于對照組，具有顯著差異。提高率分別為26.5％、28.1％、30.4％、48.7％、42.3％、和35.6％。表2 PDS對正常人骨髓BFU-E的增殖作用(n=10)
(3)PDS對正常人骨髓CFUGM的增殖作用(n=10)表3顯示將不同濃度的PDS加入10份正常人骨髓標本培養(yǎng)CFU-GM結(jié)果。當PDS濃度為10、20、50、100、和200 ug/ml時，CFU-GM集落產(chǎn)率均明顯高于對照組，具有顯著差異。提高率分別為15.2％、25.9％、27.6％、27.3％和27.1％。
表3 PDS對正常人骨髓CFU-GM的增殖作用(n=10)
(4)PDS對正常人骨髓CFU-Mix的增殖作用表4顯示將不同濃度的PDS加入8份正常人骨髓標本培養(yǎng)CFU-Mix結(jié)果。PDS濃度為10、20、50 ug/ml時，CFU-Mix集落產(chǎn)率明顯高于對照組，具有顯著差異。提高率分別為22.4％、48.9％和31.6％。
表4 PDS對正常人骨髓CFU-Mix的增殖作用(n=8)
本研究結(jié)果表明1、PDS對正常人骨髓紅系、粒系、巨核系三種系列的造血祖細胞均有明顯的刺激增殖作用，這種增殖效應類似于造血生長因子。2、根據(jù)以前的研究結(jié)果應用高濃度的造血生長因子培養(yǎng)造血祖細胞時即使再增加該生長因子濃度也不能提高集落產(chǎn)率，PDS則能與生長因子起協(xié)同作用而顯著地提高集落產(chǎn)率。這種協(xié)同作用在臨床上可能更有意義，因為絕大多數(shù)血液病患者體內(nèi)并不缺乏造血生長因子，有的患者還高于正常人。3、10-50ug/ml濃度的PDS是體外刺激造血祖細胞增殖的恰當濃度，同時也可為臨床試驗用藥劑量提供參考。
實施例4人參二醇組皂甙對再生障礙性貧血患者造血祖細胞的體外增殖作用病例30例診斷為再生障礙性貧血(AA)患者，診斷標準按中華血液學雜志，19878(8)封四和463《再生障礙性貧血診斷與療效標準》。其中男17例，女13例，中位年齡32歲(7-66)，急性再障(AAA)8例，慢性再障(CAA)22例。又按祖細胞集落數(shù)，患者外圍血單個核細胞(PBMNC)對正常CFU-GM的抑制試驗及紅系祖細胞對甲睪的敏感性分為雄激素反應型(AA1)15例，免疫介導型(AA2)8例及干細胞缺少型(AA3)7例三種類型。
藥物PDS按常規(guī)提取，用培養(yǎng)基配成1 mg/ml工作液，正壓過濾，4℃保存?zhèn)溆谩?br> 造血祖細胞培養(yǎng)法PDS以25μg/ml為終濃度加入再障患者骨髓體外培養(yǎng)體系中，并設立不加PDS的對照組。
結(jié)果(1)PDS對雄激素反應型再障(AA1)15例骨髓CFU-E、BFU-E和CFU-GM的作用，結(jié)果表明PDS組CFU-E、BFU-E和CFU-GM集落產(chǎn)率均明顯高于對照組(p＜0.05)，提高率分別為38.1％、47.6％和23.8％(見表1)。
表1
(2)PDS對免疫介導型再障(AA2)8例骨髓CFU-E、BFU-E和CFU-GM的作用，結(jié)果表明PDS組CFU-E、BFU-E和CFU-GM集落產(chǎn)率與對照組相比無明顯差異(p＞0.05)，提高率分別為13.3％、11.1％和12.9％(見表2)。
表2
(3)PDS對干細胞缺少型再障(AA3)7例骨髓CFU-E、BFU-E和CFU-GM的作用，結(jié)果表明PDS組CFU-E、BFU-E和CFU-GM集落產(chǎn)率與對照組相比無明顯差異(p＞0.05)，提高率分別為3.8％、0％和6.0％(見表3)。
表3
本實驗結(jié)果表明PDS對再障患者的造血祖細胞也有刺激增殖作用。而免疫介導型因存在抑制系統(tǒng)，干細胞缺少型因祖細胞太少，均使PDS的作用不能表達。當其病情好轉(zhuǎn)時，PDS體外試驗亦趨向敏感。
實施例5人參二醇組皂甙及其組合物對難治性血液病的療效觀察病例慢性再障性貧血(CAA)23例，其中男11例，女12例，年齡11-72歲，中數(shù)患病時間6(1-13)年。過去治療藥物包括中藥、雄性激素、腎上腺糖皮質(zhì)類激素、HGF、環(huán)胞菌素A以及輸血和抗生素等支持治療。17例經(jīng)以上治療無效，另6例血紅蛋白和白細胞有上升，但血小板仍處于低水平。
血小板減少性紫癜(ITP)33例，病程2.5(1-8)年。成人組男9例，女19例，中數(shù)年齡43(22-71)歲。兒童組5例均為男性，年齡8(6-13)歲。多數(shù)患者均經(jīng)糖皮質(zhì)激素治療初期有反應，以后無效。兒童病例均經(jīng)強的松、長春新堿及硫唑嘌呤等單獨或聯(lián)合治療均無效。
治療結(jié)果(1)再生障礙性貧血期17例，治療有效率70.6％(12/17)。治療前平均血小板31.6×109/L，血紅蛋白51.3g/L和白細胞2.8×109/L；人參二醇組皂甙治療后提高到64.7×109/L,90.3g/L和4.06×109/L，具有顯著差異(p＜0.01)，血小板、血紅蛋白和白細胞的提高率分別為144.0％、20.1％和36.3％。其中基本治愈5例、緩解4例、進步3例、無效5例(5例中2例治療前靠輸血維持，治療后已經(jīng)一年未再輸血，血象已有上升，但是未到“進步”標準)。
(2)再障性貧血恢復期(再障治療后血紅蛋白和白細胞有上升，但血小板仍低下者)6例，本組有效率為100％(6/6)。其中基本治愈4例、緩解1例、進步1例。4例經(jīng)人參二醇組皂甙治療后血小板達到正常，而血紅蛋白和白細胞也較原水平升高，1例血小板由治療前15.0×109/L升至96.0×109/L。
(3)血小板減少性紫癜33例，治療有效率為84.8％(28/33)。
成人組28例，治療前平均血小板為36.2×109/L，人參二醇組皂甙治療后提高到82.4×109/L，提高率為127％，經(jīng)統(tǒng)計學分析具有顯著差異(p＜0.01)。其中基本治愈和顯效10例、良效9例、進步7例、無效2例，有效率為92.8％(26/28)，顯效中1例同時伴有HbsAg陽性，經(jīng)人參二醇組皂甙治療8個月后，乙肝三系轉(zhuǎn)陰、血小板達到正常，隨訪二年10個月未復發(fā)，符合治愈標準。
兒童組5例，治愈有效率為40％(2/5)，其中顯效和良效各1例、無效3例。
(4)56例中由乙型肝炎誘發(fā)的再生障礙性貧血和血小板減少性紫癜17例，治愈有效率為88.2％(15/17)。均有HbsAg陽性或其他抗體陽性，其中再生障礙性貧血7例，經(jīng)人參二醇組皂甙治療其中基本治愈2例、進步3例、無效2例，有效率71.4％(5/7)；血小板減少性紫癜10例，經(jīng)人參二醇組皂甙治療其中基本治愈和顯效6例、良效3例、進步1例，有效率達100％。17例中有2例經(jīng)人參二醇組皂甙治療后，HbsAg從陽性轉(zhuǎn)為陰性。
本研究結(jié)果表明人參二醇組皂甙具有刺激造血祖細胞增殖的類生長因子作用。臨床應用獲得令人滿意的療效，總有效率為82.1％(46/56)。體內(nèi)療效與體外實驗結(jié)果相符合。CAA和成人ITP在血液病中均為多發(fā)病和難治性疾病，病因復雜。人參二醇組皂甙能使CAA和ITP外周血明顯上升，尤以血小板升高明顯。28例成人ITP經(jīng)人參二醇組皂甙治療，有效率為98.2％。ITP系自身免疫性疾病，人參二醇皂甙可能增加正常免疫力或抑制自身抗體。17例乙型肝炎引起的CAA和ITP有HbsAg陽性或其他抗體陽性，15例獲得良好療效，其中2例HbsAg由陽性轉(zhuǎn)陰性。提示人參二醇對免疫系統(tǒng)有良好的作用。
實施例6人參二醇組皂甙對人CD34+造血干/祖細胞的作用材料和方法1．取外科手術無血液病患者的肋骨，用常規(guī)方法分離，獲得骨髓單個核細胞。
2．取單個核細胞用免疫磁珠單克隆抗體標記法獲得CD34+細胞，經(jīng)流式細胞儀分析純度高達90％以上。
3．PDS的提取方法與實施例1相同。
4．造血祖細胞培養(yǎng)CD34+細胞1×104/ml，培養(yǎng)體系含白介素-3(IL-3)、GM-CSF、EPO。37℃ 5％CO2培養(yǎng)14天。觀察BFU-E、CFU-E、CFU-E、CFU-E和CFU-Mix集落數(shù)。以不加PDS組為對照。結(jié)果見表7表7PDS對CD34+造血干/祖細胞的增殖作用(X+SD,n=5)
以前的研究僅能針對較晚期的造血祖細胞。而隨著造血干細胞的分離純化方法進展，CD34+造血干/祖細胞是目前所能研究的最早期的造血細胞，已顯示出巨大的臨床應用價值，CD34+造血干/祖細胞移植已成為根治惡性血液病及某些實體瘤的方法，可重建造血功能，還可用于遺傳病和腫瘤的基因治療。本研究觀察PDS對造血干/祖細胞的增殖作用。結(jié)果顯示PDS不但刺激較晚期的造血祖細胞增殖，而且對CD34+細胞形成各類定向造血祖細胞集落具有明顯的作用。PDS促進CD34+細胞形成BFU-E、CFU-E、CFU-GM和CFU-Mix集落數(shù)分別增加186.0±10.1％、123.1±11.4％、151.0±11.2％和127.0±1.8％，提高率顯著高于PDS對較晚期的造血祖細胞。提示PDS不但具有促進CD34+細胞增殖，而且能夠誘導其定向分化的雙向作用，并且對越早期的造血細胞，作用越明顯。這些結(jié)果提示對于骨髓移植和化療后的病人應用PDS治療可與造血生長因子起協(xié)同作用，對提高療效和恢復造血將是很有效的，對于難治性血液病，病變在干/祖細胞階段者則能通過促進早期CD34+造血干/祖細胞增殖和分化而恢復造血功能。
5-50μg/ml的PDS濃度是刺激CD34+細胞集落形成的最佳濃度，當濃度高達100μg/ml時不但沒有出現(xiàn)抑制現(xiàn)象，而且仍能提高集落數(shù)，也說明PDS質(zhì)量和純度良好。
實施例7人參二醇刺激造血祖細胞增殖的作用機理研究PDS如何促使造血祖細胞增殖的作用機理尚未明了。轉(zhuǎn)錄因子c-Fos、c-Jun和GATA-2在血細胞生成中起重要作用，它們的主要功能是介導造血細胞對生長因子的反應，參與細胞增殖及分化有關基因的調(diào)控。由于PDS刺激造血的作用類似于生長因子，故借鑒研究生長因子的方法，探討PDS在造血細胞內(nèi)的信號傳遞途徑。
材料和方法1、人細胞株培養(yǎng)和PDS刺激處理 選用人粒系細胞株HL-60、紅系細胞株K562、巨核系細胞株CHRF-288和Meg-01作靶細胞。常規(guī)培養(yǎng)在含10％小牛血清的IMDM培養(yǎng)基中，分為2組實驗組分別加PDS 5ug/ml，對照組不加PDS，培養(yǎng)1個月，細胞作饑餓處理，去血清孵育24小時，然后分別加入PDS 25 ug/ml，細胞與藥物作用2小時后，提取核蛋白。
2、提取核蛋白 核蛋白提取方法按Dinam報道的加以改良，細胞經(jīng)冷PBS洗滌后，懸浮在緩沖液A中，含蛋白酶抑制劑抑蛋白酶肽(Leupeptin)、木瓜蛋白酶抑制肽(antipain)、亮抑制肽(aprotinin)和胃蛋白酶抑制劑(pepstatin)(Sigma)，均為10ug/ml濃度，經(jīng)振蕩后破碎細胞膜，收集細胞核，懸浮在緩沖液C中，超聲粉碎器破碎細胞核，離心沉淀12000 rpm，20分鐘，取上清，測定蛋白濃度。
3、蛋白免疫印跡分析(Western Blot)10ug核蛋白加入SDS凝膠加樣緩沖液25ul煮沸后，經(jīng)SDS-PAGE膠電泳分離后。將蛋白條樣用電轉(zhuǎn)移到硝酸纖維濾膜上，加特異性抗人c-Fos、c-Jun和GATA-2抗體(Santa Cruz)0.5ug/ml，室溫結(jié)合反應1小時，加辣根過氧化物酶標記的二抗(1∶2000稀釋)，ECL發(fā)光劑(Amersham)作用1分鐘，曝光1-10分鐘，顯影后用光密度掃描儀分析結(jié)果，同樣實驗重復三遍。結(jié)果 PDS處理細胞后核內(nèi)c-Fos、c-Jun和GATA-2轉(zhuǎn)錄因子含量1．c-FosHL-60、K562、CHRF-288和Meg-01四株細胞經(jīng)PDS刺激處理后，Western Bolt顯示核蛋白與c-Fos抗體結(jié)合反應帶，經(jīng)光密度掃描分析處理后，四株細胞的C-FOS轉(zhuǎn)錄蛋白含量高于未經(jīng)處理的細胞為1.5-2.0倍。
2．c-JunHL-60、K562、CHRF-288和Meg-01四株，HL-60細胞表達c-Jun，且PDS刺激處理前后無變化。而K562、CHRF-288和Meg-01三株細胞表達很低，PDS處理后明顯增加，經(jīng)光密度掃描分析處理后，三株細胞的c-Jun轉(zhuǎn)錄蛋白含量高于未經(jīng)處理的細胞，為2.0-3.0倍。
3．GATA-2HL-60、K562、CHRF-288和Meg-01四株細胞經(jīng)PDS刺激處理后，Western Bolt顯示核蛋白與GATA-2抗體結(jié)合反應帶，CHRF-288和Meg-01二株細胞的GATA-2轉(zhuǎn)錄蛋白含量是未經(jīng)處理的細胞1.4-1.8倍。
生長因子、細胞因子和其他細胞外信號分子可誘導細胞增殖、分化以及功能和行為的改變。這種細胞對外環(huán)境的反應具有重要的生物學意義，需要經(jīng)過一系列復雜的信號傳遞和基因調(diào)控程序，包括信號分子與表面受體和配體的結(jié)合，進而觸發(fā)特定的細胞內(nèi)信號傳遞途徑，并啟動基因轉(zhuǎn)錄和表達。因此，細胞內(nèi)信號傳遞途徑作為連結(jié)細胞表面和細胞核內(nèi)目的基因的橋梁。
經(jīng)PDS刺激處理后，HL-60、K562、CHRF-288和Meg-01細胞的c-Fos蛋白含量高于未經(jīng)處理細胞。K562、CHRF-288和Meg-01細胞的c-Jun表達明顯增加。而GATA-2僅在PDS處理的巨核細胞CHRF-288和Meg-01蛋白含量高于未經(jīng)處理細胞。這些結(jié)果提示PDS分別通過誘導c-Fos、c-Jun和GATA-2轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白而刺激造血細胞增殖，從分子水平證明PDS的類生長因子效應。紅系、粒系和巨核系三種系列細胞核內(nèi)轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白本身表達高低的不同，以及對PDS的敏感性程度不同，這是由于系列的特異性所致。
權利要求
1.人參二醇組皂甙與藥用載體和/或藥用賦形劑組成的組合物在血液病治療中的應用。
2.如權利要求1所述的組合物，尤其在難治性血液病治療中的應用。
全文摘要
一種組合物,是由人參二醇組皂甙與藥用載體和/或藥用賦形劑組成,本發(fā)明是將該組合物應用與血液病的治療,尤其是應用于難治性血液病的治療。本發(fā)明提供的組合物,對造血細胞具有刺激增殖作用,對再障性貧血患者的造血祖細胞具有刺激增殖作用,對白血病祖細胞有增殖的抑制和刺激作用,有較強的促進化療藥殺傷白細胞的作用。該組合物應用于血液病的治療,療效優(yōu)于現(xiàn)有治血液病的藥物,且無毒副作用,價格較低,為血液病的治療提供了新途徑,并拓展了人參皂甙尤其是人參二醇組皂甙的臨床應用范圍。
文檔編號A61K31/7028GK1300594SQ9912683
公開日2001年6月27日 申請日期1999年12月17日 優(yōu)先權日1999年12月17日
發(fā)明者高瑞蘭, 馬逢順, 金錦梅, 許家鸞, 牛泱平, 苗青 申請人:浙江省中醫(yī)院