專利名稱：生長激素釋放肽及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生長激素釋放肽及其在抗衰老、促進(jìn)機體生長、促進(jìn)創(chuàng)傷愈合和治療垂體功能低下方面中的應(yīng)用。
生長激素(Growth hormone,GH)是由垂體前葉分泌的一種單鏈多肽，具有重要的生理學(xué)功能。由于動物體內(nèi)的生長激素對人類無活性，臨床上曾微量使用的生長激素均是從人尸體中提取得到的，材料來源極其困難。后來，人們通過體內(nèi)給予生長激素釋放激素(Growth hormone releasing hormone,GHRP)促進(jìn)生長激素釋放來代替直接給予生長激素，但生長激素釋放激素是一個具有44個氨基酸的大分子，也不宜長期使用。自1992年以來，國外，主要是美歐國家科學(xué)家采用基因工程方法生產(chǎn)重組的GH。我國也將基因工程方法生產(chǎn)GH作為國家“863”計劃重點項目加以資助。目前，國內(nèi)外用基因工程方法生產(chǎn)的GH均已進(jìn)入臨床研究階段，但基因工程方法生產(chǎn)的GH存在如下不足首先是GH氨基酸的結(jié)構(gòu)改變后，易于引起機體產(chǎn)生免疫識別；其次是產(chǎn)品價格太高，患者難以承受；第三是需注射給藥，長期使用，患者不易接受。1984年，Bowers等對Dynorphin進(jìn)行了改造，偶然發(fā)現(xiàn)這種改造后的物質(zhì)能使血中生長激素濃度增加(BowersCY.Momany FA.Reynolds G.Hong A 1984,On the in vitro and in vivo activity of a new synthetic hexapeptidethat acts on the pituitary to specifically releasing growth hormone.Endocriniligy,114:1537-1545)，但當(dāng)時Bowers等并未給予應(yīng)有的重視。在此基礎(chǔ)上，近幾年相繼發(fā)現(xiàn)數(shù)種能促進(jìn)生長激素釋放的結(jié)構(gòu)，但這些結(jié)構(gòu)對促進(jìn)生長激素的釋放作用均沒能超過Bowers等報道的結(jié)果(P.M.Conn and Bowers CY.Science,273,923-924)。1992-1995年間，Patchett等發(fā)現(xiàn)兩種椐稱具有潛力的生長激素釋放肽(Patchett et al Design and biological activities of L-163,191(MK-0677):apotent,orall active growth hormone secretagogues.Proc.Natl Sci USA.92:7001-7005,1995,Barry J et al Growth hormone response in man to L-692,429,a novelnonpeptide mimic of growth hormone-releasing peptide-6,J Clinical Endocrinol.And Metablim.77:1393-1397,1993)。并將他們試用于促進(jìn)機體生長的應(yīng)用研究。1996年，GHRP特異性受體也相繼被發(fā)現(xiàn)，該受體是完全不同于垂體前葉somatotropes上的GH受體，亦不是生長抑素受體。這種新受體不但存在于somatotropes上，也存在于下丘腦GHRH能神經(jīng)元上。GHRP不但能直接刺激垂體前葉生長激素細(xì)胞來促進(jìn)GH的合成與釋放，亦可通過刺激下丘腦GHRH神經(jīng)元來促進(jìn)GHRH的合成與釋放，從而間接作用于垂體前葉，促進(jìn)GH的合成與釋放(P.M.Conn and Bowers CY.Science,273,923-924)。
本發(fā)明的一個目的是提供一類新的生長激素釋放肽。
本發(fā)明的另一個目的是提供本發(fā)明的新的生長激素釋放肽在抗衰老、促進(jìn)機體生長、促進(jìn)創(chuàng)傷愈合及治療垂體功能低下中的應(yīng)用。
為實現(xiàn)上述目的，幾乎與國外研究同步，我們對現(xiàn)有技術(shù)GHRP的結(jié)構(gòu)進(jìn)行了大規(guī)模的改造，合成了一系列新的生長激素釋放肽，并以文獻(xiàn)報告的結(jié)構(gòu)作對照，對這些生長激素釋放肽進(jìn)行了系統(tǒng)的藥效學(xué)研究，發(fā)現(xiàn)一些結(jié)構(gòu)不但具有文獻(xiàn)報告的促進(jìn)機體生長的作用，還具有肯定的抗衰老和促進(jìn)創(chuàng)傷愈合等作用。
本發(fā)明的生長激素釋放肽具有下式的結(jié)構(gòu)，aa1-D-Trp-aa3-aa4-D-Phe-aa6-NH2其中，aa1代表His或Trp,aa3代表Ala或Gly,aa4代表His或Trp,aa6代表Lys或Arg。
優(yōu)選aa1為D-His或D-Trp,aa3為D-Ala或D-Gly,aa4為D-His或D-Trp,aa6為D-Lys或D-Arg。
本發(fā)明的生長激素釋放肽可用合成儀自動合成、手工固相或液相方法合成。本發(fā)明采用手工方法合成，用Fmoc保護(hù)氨基酸，連接在Rink酰胺化樹脂上。合成方法參照文獻(xiàn)Cai et al,Proc Natl Acad Sci USA 1986；83:1890-1990。進(jìn)行。
除多肽本身外，本發(fā)明的生長激素釋放肽可以其與本領(lǐng)域中常用的有機酸或無機酸，如鹽酸、枸櫞酸形成鹽加以使用。
研究結(jié)果表明，本發(fā)明的生長激素釋放肽具有抗衰老、促進(jìn)機體生長、促進(jìn)創(chuàng)傷愈合和治療垂體功能低下的作用，可用于制備抗衰老、促進(jìn)機體生長、促進(jìn)創(chuàng)傷愈合和治療垂體功能低下的藥物。
下面的實施例將對本發(fā)明作進(jìn)一步的闡述，但并不限制本發(fā)明。


圖1為本發(fā)明的GHRP高效液相色譜分析結(jié)果。
圖2為本發(fā)明的GHRP質(zhì)譜分析結(jié)果。
圖3為本發(fā)明的GHRP對同窩大鼠生長的影響。
圖4為本發(fā)明的同窩不同大小大鼠自然生長情況，作為圖3對照。
圖5為本發(fā)明的GHRP對正常群的大鼠生長的影響。
圖6為本發(fā)明的GHRP對動物游泳耐力的影響。
圖7為本發(fā)明的GHRP對大鼠軟組織創(chuàng)傷修復(fù)的影響。
圖8為本發(fā)明的GHRP對24月齡老年皮毛外觀的影響。
圖8.1為24個月齡GHRP處理組小鼠(上下兩張照片為不同放大倍數(shù))。
圖8.1為24個月齡的對照組小鼠(上下兩張照片為不同放大倍數(shù))。
圖9為本發(fā)明的GHRP對24個月老年小鼠生育能力的影響。
圖9.1為24個月齡GHRP處理組雌性小鼠與青年雄性小鼠共育后代。
圖9.2為24個月齡GHRP處理組雌性小鼠與24個月GHRP處理組雄性小鼠共育后代。
實施例1．生長激素釋放肽的篩選實驗組成年大鼠48只，體重180g分為8組。實驗組皮下分別注射上述類似物10ug/只。對照組動物6只，皮下注射同容積的生理鹽水。測得注射后30分鐘時動物血中GH濃度如表1。經(jīng)篩選，確定His-D-Trp-Ala-Trp-D-Phe-Arg-NH2、His-D-Trp-Ala-Trp-D-Phe-Lys-NH2和His-D-Trp-Ala-His-D-Phe-Arg-NH2為最有效結(jié)構(gòu)。
表1．不同類似物對動物血中GH濃度組別例數(shù) 平均值g/kg 標(biāo)準(zhǔn)差A(yù) 6 31.6 2.46874B 6 42.6 3.46784C 6 40.5 2.28954D 6 26.4 3.46213E 6 22.1 2.16784F 6 14.6 3.45224G 6 36.4 4.27894H 6 12.4 2.45785表中，A:Trp-D-Trp-Ala-His-D-Phe-Lys-NH2,B:His-D-Trp-Ala-Trp-D-Phe-Lys-NH2,C:His-D-Trp-Ala-Trp-D-Phe-Arg-NH2,D: His-D-Trp-Gly-Trp-D-Phe-Lys-NH2,E:His-D-Trp-Gly-His-D-Phe-Lys-NH2,F:His-D-Lys-Gly-His-D-Phe-Lys-NH2,G:His-D-Trp-Ala-His-D-Phe-Arg-NH2,H:His-D-Trp-Ala-Trp-D-Phe-Lys-NH2。
實施例2．生長激素釋放肽的確認(rèn)根據(jù)上述篩選結(jié)果，用Fmoc保護(hù)氨基酸，連接在Rink酰胺化樹脂上(參照文獻(xiàn)Cai et al,Proc Natl Acad Sci USA 1986；83:1890-1990。進(jìn)行)用手工方法較大量地合成了多肽B和C，兩種多肽經(jīng)脫鹽純化后，用質(zhì)譜生物重構(gòu)和高效液相色譜(HPLC)分析確認(rèn)，冰凍干燥法脫去水分(詳細(xì)可參照文獻(xiàn)Cai et al,Proc Natl Acad Sci USA 1986；83:1890-1990。進(jìn)行)。
實施例3．藥理作用研究藥理學(xué)研究用上述序列的C，同時將B作為參照。發(fā)現(xiàn)兩種結(jié)構(gòu)在藥理學(xué)作用上幾乎完全相同。
1促進(jìn)機體生長作用方法一將同窩幼年大鼠(雌雄不拘)按體重分為兩組體重輕的一組經(jīng)皮下注射GHRP，體重重的一組給生理鹽水。
結(jié)果三周后，注射GHRP的體重輕的大鼠體重明顯全面高于同窩體重較重的一組(P＜0.05)。而未經(jīng)處理的同窩大鼠，兩組大鼠間體重差距明顯加大(p.＜0.01)，見附圖3、4。
方法三將同窩幼年大鼠(雌雄不拘)按體重大小分為兩組，讓兩組動物自然生長。
結(jié)果三周后，同窩幼年大鼠體重大的一組與小的一組體重差距加大，差別非常明顯。
方法二體重相似的雄性大鼠40只，給藥組注射GHRP(20ug/d/rat)，另一組注射生理鹽水對照。同時，每天稱重并記錄。結(jié)果用藥一周后，給藥組大鼠體重明顯高于給鹽水的對照組。停止給藥后，處理組動物體重在一周內(nèi)仍保持繼續(xù)加大趨勢，但這種加大趨勢漸緩和。兩周后兩組動物體重增加比相同。兩組大鼠絕對體重，GHRP組明顯高于對照組(P＜0.001)，見附圖5。
測量治療和未治療兩組動物的脂肪/肌肉比例，治療組明顯低于對照組。
2增進(jìn)耐力研究方法動物分為治療組(12只)和正常對照組(12只)。治療組動物連續(xù)每天給GHRP，一次(20ug/day)，共14天。對照組動物注射生理鹽水。注射時間同治療組。兩組動物配對，采用游泳耐力實驗，記錄每只大鼠死亡時間，GHRP可明顯提高游泳生存時間，方差分析結(jié)果P＜0.01，見附圖6。
3促進(jìn)創(chuàng)傷愈合方法動物分為GHRP組(24只)和對照組(24只)，雌雄各半。動物分別在戊巴比妥麻醉下，左下肢手術(shù)創(chuàng)傷，深至骨。GHRP組每天注射GHRP20μg/200μl/只，對照組注射生理鹽水200μl/只。每組動物又分為三組，分別在第五天，七天，九天深麻醉下處死，取下手術(shù)部位，浸泡固定。石蠟切片，H.E.呈色。結(jié)論研究了軟組織損傷后，GHRP對傷口愈合情況的影響。結(jié)果GHRP組動物傷口愈合明顯增快，治療組5天傷口與對照組7天傷口一致(見附圖7)。說明具有明顯的促進(jìn)創(chuàng)傷愈合作用。
4抗衰老研究動物使用18個月和23個月齡的老年小鼠各120只。其中各80只注射GHRP,40只注射鹽水對照。青年對照組用雌性青年小鼠44只，其中24只用于生育研究，20只用于行為學(xué)觀察；雄性青年小鼠32只，其中12只用于生育研究，20只用于行為學(xué)觀察。處理注射GHRP組老年動物注射GHRP10ug/次/天，連續(xù)30天；用于對照組的老年動物和行為學(xué)觀察組的青年動物注射生理鹽水，連續(xù)30天。然后觀察記錄其行為特征。
4.1使老年動物活動明顯增加，攻擊性增強，使老年動物皮毛光滑。GHRP治療組老齡大鼠與對老年照組老齡大鼠外觀照片明顯不同。
4.2對性行為的影響使18個月雄性大鼠爬背次數(shù)明顯增加；22個月大鼠不同程度仍有爬背能力，而對照組動物幾乎完全喪失了爬背能力。雌性動物(18,22個月)發(fā)情次數(shù)增加，而22個月對照組雌性動物幾乎完全喪失發(fā)情能力。
4.3對生育能力的影響為進(jìn)一步證明GHRP對動物生育能力的影響，我們觀察了老齡大鼠的生育能力。將給藥組、對照組23個月齡大鼠分別與正常青年雌雄大鼠，或相同處理的同齡大鼠共同喂養(yǎng)一周，然后再次分開喂養(yǎng)。分組及20天后動物生育情況如下第一組老齡給藥組雄性大鼠6只與青年雌鼠12只第二組老齡對照組雄性大鼠6只與青年雌鼠12只第三組老齡雌性給藥組大鼠12只與青年雄大鼠6只第四組老齡雌性對照組大鼠12只與青年雄大鼠6只第五組老齡給藥組雌雄大鼠各12只第六組老齡對照組雌雄大鼠各12只
20天后，1.3.5.組大鼠分別生下正常幼鼠，而2.4.6.組則未生育，各組動物產(chǎn)子情況統(tǒng)計如下。
表2、各組小鼠妊娠及產(chǎn)子情況統(tǒng)計表組別 妊娠大鼠數(shù)量妊娠大鼠比率 平均每胎產(chǎn)子數(shù)1 1010/12=83％92 00 03 8 8/12=67％ 74 00 05 7 7/12=60％ 86 00 04.4、對血清過氧化物岐化酶(SOD)活力的影響方法給藥組(16只)與對照組(11只)23個月雄性大鼠摘除眼球采血。血液分為兩份。一份用肝素抗凝，另一份自然凝固。雙盲法送301醫(yī)院老年病中心做血液學(xué)檢查。血清SOD檢查采用生物發(fā)光法測定SOD活力(請參照李益新等報告文獻(xiàn)超氧化物歧化酶活力測定的新方法—化學(xué)發(fā)光法。生物化學(xué)與生物物理學(xué)進(jìn)展，1983,2:59-62)表3、老年小鼠血清SOD活力
方差分析差別明顯(P＜0.0040)4.5、對全血谷光甘肽過氧化物酶活力的影響方法測定全血GSH-PX活力采用DTNB顯色法測定，具體方法見OhkawaHet al Annal Biochem 1979,95:351。
結(jié)果檢查結(jié)果如表4表4老年小鼠全血谷光甘肽過氧化物酶活力組別 例數(shù) 平均值標(biāo)準(zhǔn)差Control14 22.7172727 5.32159768GHRP 16 31.0992857***3.03958364方差分析治療組明顯高于對照組(p＜0.0001)4.6、對血清中過氧化物酶含量的影響方法用鉬酸銨顯色法測定血清。具體方法參見董泗建等報告文獻(xiàn)一種測定過氧化輕酶活性的新方法。軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院院刊，1995,19:130-132結(jié)果檢查結(jié)果如表5表5老年小鼠血清中過氧化物酶含量組別 例數(shù) 平均值 標(biāo)準(zhǔn)差Control14 87.6500000 13.6424983GHRP 16 99.4653846*15.3184271方差分析，差別顯著(P＜0.05)。
4.7、對血清中酯褐素(LPO)含量的影響方法用磷鎢酸沉淀，TBN顯色測定LPO。具體參見文獻(xiàn)Balge JTMicrosomal lipid peroxidation methods.Enzymology,1987,52:302，周翔等血清過氧化脂質(zhì)的測定和意義。白求恩醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，1985,11:358-361結(jié)果檢查結(jié)果如表6表6老年小鼠血清中LPO含量組別 例數(shù) 平均值標(biāo)準(zhǔn)差Control 13 136.85090929.2700412GHRP 15 91.660667***26.9361071方差分析，差別非常明顯(P＜0.0004)結(jié)論從上述行為學(xué)、生育能力和4項血清學(xué)檢查看，GHRP具有非常明確而強大的抗衰老作用。
4.8、對老年小鼠死亡率的影響方法老年(23個月)小鼠共90只，其中30只注射GHRP,30只注射鹽水對照，30只不作任何處理。觀察用藥一個月時生存和死亡動物數(shù)量。
結(jié)果發(fā)現(xiàn)GHRP小鼠死亡數(shù)量明顯低于其他兩組。(見表7)表7、23-24個月齡小鼠在1個月間死亡情況表<
4.9對老年小鼠學(xué)習(xí)記憶的影響方法將23個月齡的給藥組和對照組小鼠進(jìn)行學(xué)習(xí)記憶研究。方法主動回避實驗—穿梭箱(Shuttle box)實驗對動物條件回避反應(yīng)能力進(jìn)行評價。實驗由8個箱體構(gòu)成。實驗箱通過一個主控器與計算機相連。由微機發(fā)出指令控制實驗進(jìn)程。記錄60次試行周期內(nèi)動物條件刺激期避免電擊次數(shù)(條件性回避反應(yīng))和逃避電擊的反應(yīng)時間(條件回避反應(yīng)潛伏期)。
結(jié)果條件性回避次數(shù)和條件回避反應(yīng)潛伏期時間見表8:GHRP可使動物條件回避反應(yīng)潛伏期縮短，方差分析結(jié)果差別明顯(P＜0.05)(見表9)，而對條件性回避反應(yīng)能力無明顯(P＞0.05,P=0.064)改善作用。結(jié)果說明GHRP對老年動物的主動回避反應(yīng)有一定的促進(jìn)作用。以上研究說明，GHRP能縮短動物條件回避時間。對于條件回避即學(xué)習(xí)能力差異并不顯著。
表8、條件性回避反應(yīng)組別 例數(shù) 平均值 標(biāo)準(zhǔn)差Control12 7.000000 7.89706505GHRP 17 8.76470588 4.71075116表9、條件回避反應(yīng)潛伏期AN Mean SDControl12 51.91666677.83301095GHRP 16 42.8125000**9.82662200
權(quán)利要求
1．具有下式序列的多肽或其與酸形成的鹽，aa1-D-Trp-aa3-aa4-D-Phe-aa6-NH2其中，aa1代表His或Trp,aa3代表Ala或Gly,aa4代表His或Trp,aa6代表Lys或Arg。
2．按照權(quán)利要求1所述的多肽或其與酸形成的鹽，其特征在于aa1代表D-His或D-Trp,aa3代表D-Ala或D-Gly,aa4代表D-His或D-Trp,aa6代表D-Lys或D-Arg。
3．按照權(quán)利要求1所述的多肽或其與酸形成的鹽，其序列為His-D-Trp-Gly-Trp-D-Phe-Lys-NH2。
4．按照權(quán)利要求1所述的多肽或其與酸形成的鹽，其序列為His-D-Trp-Gly-His-D-Phe-Lys-NH2。
5．按照權(quán)利要求1所述的多肽或其與酸形成的鹽，其序列為His-D-Lys-Gly-His-D-Phe-Lys-NH2。
6．按照權(quán)利要求1所述的多肽或其與酸形成的鹽，其序列為His-D-Trp-Ala-His-D-Phe-Arg-NH2。
7．按照權(quán)利要求1所述的多肽或其與酸形成的鹽，其序列為His-D-Trp-Ala-Trp-D-Phe-Arg-NH2。
8．按照權(quán)利要求1所述的多肽或其與酸形成的鹽，其序列為His-D-Trp-Ala-Trp-D-Phe-Lys-NH2。
9．按照權(quán)利要求1所述的多肽或其與酸形成的鹽，其序列為Trp-D-Trp-Ala-His-D-Phe-Lys-NH2。
10．權(quán)利要求1所述的多肽在制備抗衰老、促機體生長、促進(jìn)創(chuàng)傷或骨折愈合、治療垂體功能低下藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及生長激素釋放肽及其在抗衰老、促進(jìn)機體生長、促進(jìn)創(chuàng)傷愈合和治療垂體功能低下方面的應(yīng)用。它們的結(jié)構(gòu)為aal－D－Trp－aa3－aa4－D－Phe－aa6－NH
文檔編號A61P5/02GK1224725SQ9910074
公開日1999年8月4日 申請日期1999年2月13日 優(yōu)先權(quán)日1999年2月13日
發(fā)明者劉少君 申請人:中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所