專利名稱：具有生長激素釋放活性的多肽化合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及到新的多肽化合物，給動物使用這種多肽化合物可以促進(jìn)生長激素的釋放。另一方面，本發(fā)明還涉及到通過給動物使用特定的釋放生長激素多肽化合物而促進(jìn)動物體內(nèi)生長激素釋放及使其水平升高的方法。
如果給哺乳動物使用釋放生長激素(GH)化合物而出現(xiàn)GH水平升高，假如達(dá)到足夠高水平，便可以引起體重增加和奶產(chǎn)量增加。而且，已經(jīng)知道通過使用已知的生長激素釋放劑，如自然存在的生長激素釋放激素，可以使哺乳動物體內(nèi)生長激素水平升高。
也可以通過使用生長激素釋放肽使動物體內(nèi)的生長激素水平升高，其中有些肽在以前已有敘述，如在美國專利U.S4，223，019，U.S.4，223，020，U.S.4，223，021，U.S.4，224，316，U.S.4，226，857，U.S.4，228，155，U.S.4，228，156，U.S.4，228，157，U.S.4，228，158，U.S.4，410，512，U.S.4，410，513，U.S.4，411，890和U.S.4，839，344中。
也曾使用內(nèi)源性生長激素釋放抑制因子，即生長抑放素(SRIF)的抗體而使生長激素水平升高。在后例中，通過將這種內(nèi)源性生長激素釋放抑制因子在到達(dá)垂體(在此處它抑制GH釋放)之前去除而使生長激素水平升高。
所有這些促進(jìn)生長激素水平升高的方法都涉及到合成和/或分離這種用于目的動物的足夠高純度物質(zhì)，其價格十分昂貴。因此希望能有短鏈的，相對簡單的多肽能夠促進(jìn)生長激素的釋放，因?yàn)檫@種多肽制備容易且不昂貴，化學(xué)和/或物理改性容易，而且也易于純化和配制;并且還具有良好的運(yùn)輸特性。
人們一直希望能有短鏈的多肽可以促進(jìn)動物血中生長激素的釋放及使其水平升高，能夠運(yùn)用這些多肽促進(jìn)動物血中生長激素的釋放及其水平升高是非常有用的。
我們現(xiàn)在已經(jīng)發(fā)現(xiàn)幾種新的多肽化合物可以促進(jìn)動物體內(nèi)生長激素的釋放。這些多肽具有通式A1-A2-A3-Trp-A5-A6-Z，其中A1是組氨酸，3(NMe)組氨酸，A0-組氨酸，A0-3(NMe)組氨酸，丙氨酸，酪氨酸，或組氨酸-丙氨酸，其中A0是任何自然存在的L-氨基酸，蛋氨酸(O)，多巴(DOPA)，α-氨基丁酸或通式L-A0的多肽，其中L是H，多巴(DOPA)，賴氨酸，苯丙氨酸，酪氨酸，半胱氨酸，Tyr-DAla-Phe-Gly，Tyr-DAla-Gly-Phe，Tyr-Ala-Gly-Thr或者Tyr-DAla-Phe-Sar，優(yōu)選A0是任何自然存在的氨基酸，更為優(yōu)選的是，A0是丙氨酸，賴氨酸，或谷氨酸;A2是DβNal或D(右旋)苯丙氨酸;A3是丙氨酸，甘氨酸，或絲氨酸;A5是D苯丙氨酸，D/Lβ(Me)苯丙氨酸或(NMe)D苯丙氨酸;A6是B-G或G，其中B是任何自然存在的氨基酸，任何自然存在的氨基酸的二肽或H2N-(CH2)n-CO2H(其中n＝2-12)而G是精氨酸，異賴氨酸(iLys)，或鳥氨酸;Z是C末端基團(tuán)-CONR1R2，-COOR1或-CH2OR1(其中R1是H，具有1到大約6個碳原子的烷基，具有3到大約8個碳原子的環(huán)烷基，具有2到大約8個碳原子的鏈烯基或具有6到大約12個碳原子的芳基，而R2定義如R1，并且可以相同或者不同)，-Gly-Z′，-Met-Z′，Lys-Z′，-Cys-Z′，-Gly-Tyr-Z′，或-Ala-Tyr-Z′，其中Z′是-CONR1R2，-COOR1或-CH2OR1(其中R1和R2定義如上)，及其藥劑學(xué)上可接受的有機(jī)或無機(jī)鹽。最好這種肽具有通式His-A2-Ala-Trp-DPhe-Lys-NH2，A0-His-A2-Ala-Trp-DPhe-Lys-NH2(例如Ala-His-A2-Ala-Trp-DPhe-Lys-NH2)或Ala-A2-Ala-Trp-DPhe-Lys-NH2。更為優(yōu)選A2是DβNal。通過給以有效量的肽，可以運(yùn)用這種肽促進(jìn)動物，最好是人，體內(nèi)血中生長激素水平的釋放和升高。
本發(fā)明的依據(jù)是發(fā)現(xiàn)了幾種短鏈多肽可以促進(jìn)動物血中生長激素的釋放及其水平升高。屬于本發(fā)明范圍的多肽由下面的通式定義A1-A2-A3-Trp-A5-A6-Z，其中A1，A2，A3，A5，A6和Z定義如下。A1是組氨酸，3(NMe)組氨酸(也就是，其中的咪唑環(huán)在3位上被甲基化)，組氨酸-丙氨酸，A0-組氨酸，丙氨酸，酪氨酸，或A0-3(NMe)組氨酸，其中A0是任何自然存在的L-氨基酸，蛋氨酸(O)，多巴(DOPA)，α-氨基丁酸或分子式L-A0的肽，其中L是H，多巴(DOPA)，賴氨酸，苯丙氨酸，酪氨酸，半胱氨酸，Tyr-DAla-Phe-Gly，Tyr-DAla-Gly-Phe，Tyr-Ala-Gly-Thr和Tyr-DAla-Phe-Sar。A1優(yōu)選是組氨酸，丙氨酸，組氨酸-丙氨酸，A0-組氨酸，或丙氨酸。更為優(yōu)選的是A1為組氨酸或A0-組氨酸。A0優(yōu)選任何自然存在的L-氨基酸，A0更為優(yōu)選是丙氨酸，賴氨酸，或谷氨酸，再進(jìn)一步優(yōu)選Ao是丙氨酸。
A2是DβNal或右旋苯丙氨酸。A2最好是DβNal。
A3是丙氨酸，甘氨酸或絲氨酸。A3優(yōu)選丙氨酸。
A5是D-苯丙氨酸、D/Lβ(Me)苯丙氨酸或(NMe)D苯丙氨酸。A5優(yōu)選D苯丙氨酸。
A6是B-G或G，其中B是任何自然存在的L-氨基酸，任何自然存在的L-氨基酸的二肽(如Ala-Lys，Ala-Ala，Ala-Leu)或H2N(CH2)nCO2H，其中n＝2-12，而G是精氨酸，異賴氨酸(iLys)，賴氨酸，或鳥氨酸。優(yōu)選B是任何自然存在的L-氨基酸或H2N(CH2)nCO2H，其中n＝4-8，更為優(yōu)選，A6是G，Ala-Lys，或Ala-Ala-Lys。甚至再進(jìn)一步優(yōu)選A6是G。最優(yōu)選A6是賴氨酸。
Z代表多肽的C末端基團(tuán)或C末端氨基酸加上末端基團(tuán)，其中Z是-CONR1R2，-COOR1或-CH2OR1，其中R1是H，具有1到大約6個碳原子的烷基，具有3到大約8個碳原子的環(huán)烷基，具有2到大約8個碳原子的鏈烯基，或具有6到大約12個碳原子的芳基。R2定義如R1，二者可以相同或不同。R1優(yōu)選是H或具有1到大約6個碳原子的烷基。Z也可以是-Gly-Z′，-Met-Z′，-Lys-Z′，-Cys-Z′，-Gly-Tyr-Z′，或-Ala-Tyr-Z′，其中Z′是-CONR1R2，-COOR1或-CH2OR1，其中R1和R2定義同上。Z優(yōu)選是-CONR1R2，-COOR1或-CH2OR1。
和任何所說多肽的藥劑學(xué)上可接受的有機(jī)或無機(jī)加成鹽。
所用氨基酸縮寫與標(biāo)準(zhǔn)肽命名法一致Gly＝甘氨酸Tyr＝L-酪氨酸Ile＝L-異亮氨酸Glu＝L-谷氨酸Thr＝L-蘇氨酸Phe＝L-苯丙氨酸Ala＝L-丙氨酸Lys＝L-賴氨酸Asp＝L-天冬氨酸Cys＝L-半胱氨酸Arg＝L-精氨酸Gln＝L-谷氨酰胺Pro＝L-脯氨酸Leu＝L-亮氨酸Met＝L-蛋氨酸Ser＝L-絲氨酸Asn＝L-天冬酰胺His＝L-組氨酸
Trp＝L-色氨酸val＝L-纈氨酸DOPA＝3，4-二羥基苯丙氨酸Met(O)＝蛋氨酸亞砜Abu＝α-氨基丁酸iLys＝Nε-異丙基-L-賴氨酸4-Abu＝4-氨基丁酸Orn＝L-鳥氨酸DαNal＝α-萘基-D-丙氨酸DβNal＝β-萘基-D-丙氨酸Sar＝肌氨酸所有三字母氨基酸縮寫前面帶“D”則表示該氨基酸的D-構(gòu)型，而前面有“D/L”的縮寫則表示所說氨基酸的D-和L-構(gòu)型的混合物。在本說明書中，甘氨酸被認(rèn)為是屬于術(shù)語“自然存在的L-氨基酸”范圍之內(nèi)。
可用于氨基酸A1，A3，A5和A6的堿性，中性或酸性氨基酸殘基可以使人們在很大程度上控制所需肽的生理化學(xué)特性，這種靈活性對配制所需肽并將其用于任何所給種類動物中具有重要優(yōu)越性。通過選擇R和Z基團(tuán)還可以得到其他的可變性，從而對所需化合物的生理化學(xué)特性進(jìn)一步地控制。
實(shí)施本發(fā)明的優(yōu)選生長激素釋放化合物是A1-A2-Ala-Trp-DPhe-A6-Z，如A0-His-A2-Ala-Trp-DPhe-A6-Z，His-Ala-A2-Ala-Trp-DPhe-A6-Z，
Ala-A2-Ala-Trp-DPhe-A6-Z和His-A2-Ala-Trp-DPhe-A6-Z和它們的有機(jī)或無機(jī)加成鹽。A2優(yōu)選是DβNal，進(jìn)一步優(yōu)選是A0-His-DβNal-Ala-Trp-DPhe-Lys-NH2(尤其是，Ala-His-DβNal-Ala-Trp-DPhe-Lys-NH2)，和His-DβNal-Ala-Trp-Dphe-Lys-NH2，和任何所說多肽的有機(jī)或無機(jī)加成鹽。
這些化合物一般易于合成，具有促進(jìn)血清生長激素水平增加的效應(yīng)，并且能滿足商業(yè)化水平的生產(chǎn)和利用。另外，由于可通過在這些多肽化合物的多個位點(diǎn)進(jìn)行取代，選擇這些多肽化合物N-末端、C-末端和中心位點(diǎn)的極性，中性或非極性特性使之與所需傳遞方法相適應(yīng)，從而帶來多變性，使這些化合物具有將其有效地傳遞給各種動物種類所需要的生理化學(xué)特性。
這些肽比大部分在A2位點(diǎn)帶有不同氨基酸殘基的等同肽在促進(jìn)血清生長激素水平升高方面典型地表現(xiàn)出較高水平的促進(jìn)能力。由于高水平的促進(jìn)效能，一般DβNal肽是最優(yōu)選的肽。
目前最優(yōu)選的是His-DβNal-Ala-Trp-DPhe-Lys-NH2和A0-His-DβNal-Ala-Trp-DPhe-Lys-NH2肽(如Ala-His-DβNal-Ala-Trp-DPhe-Lys-NH2)，A0-His-DPhe-Ala-Trp-DPhe-Lys-NH2肽如Ala-His-DPhe-Ala-Trp-DPhe-Lys-NH2和它們的有機(jī)或無機(jī)加成鹽。
這些化合物表現(xiàn)出了高水平的促進(jìn)血清生長激素水平增加的能力。
本發(fā)明的化合物可以用來升高動物血中生長激素的水平，增加牛奶產(chǎn)量，增加動物體重如哺乳動物(如，人，羊，牛和豬)，以及魚，家禽，其他脊椎動物和甲殼綱動物;并且增加哺乳動物的毛和/或皮毛的產(chǎn)量。體重增加量取決于動物品種的性別和年齡，生長激素釋放化合物的給藥量和特性，給藥途徑，等。
本發(fā)明的新型多肽化合物可以按照普通的液固相肽化學(xué)方法，或者通過本技術(shù)領(lǐng)域中已知的經(jīng)典方法進(jìn)行合成。固相合成是從肽的C-末端開始。例如，可以通過將所需的保護(hù)的α-氨基酸連接到氯甲基化樹脂，羥甲基樹脂，二苯甲基胺(BHA)樹脂，或?qū)?甲基-二苯甲基胺(P-Me-BHA)樹脂上制備一種合適的起始物質(zhì)。其中一種氯甲基樹脂由Bio Rad Laboratories，Richmond，California以商品名BIOBEADS SX-1出售。Bodansky等人，在Chem，Ind.(Lon-don)38，1597(1966)對羥甲基樹脂的制備進(jìn)行了描述。Pietta和Marshall，在Chem.Comm，650(1970)曾對BHA樹脂進(jìn)行過描述，并且可以從Peninsula Laboratories，Inc.，Belmont，California購買到這種樹脂。
起始連接之后，可以在室溫下選擇酸性試劑，包括溶于有機(jī)溶劑中的三氟乙酸(TFA)或鹽酸(HCl)溶液去除掉α-氨基保護(hù)基團(tuán)。去掉α-氨基保護(hù)基團(tuán)之后，則可以按照所需順序分段使剩余的保護(hù)氨基酸偶聯(lián)。一般用，例如，二氯甲烷(CH2Cl2)或二甲基甲酰胺(DMF)和其混合物中的一種合適的羧基活化劑如二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)或二異丙基碳二亞胺(DIC)溶液在大約3倍過量的條件下可以使每一種保護(hù)的氨基酸發(fā)生反應(yīng)。
在完成所需要的氨基酸順序之后，用一種試劑如氟化氫(HF)處理可以將所需肽從樹脂上切下，它不僅從樹脂上切下肽，而且還可以切下最普遍使用的側(cè)鏈保護(hù)基因。如果使用氯甲基樹脂或羥甲基樹脂，HF處理可以形成游離肽酸。如果使用BHA或P-Me-BHA，HF處理可以直接產(chǎn)生游離的肽酰胺。
上述的固相方法在本技術(shù)領(lǐng)域中是公知的，并且Stewart和Young曾對此進(jìn)行過描述，見Solid Phase Peptide Synthesis;Second Edn.(Pierce Chemical Co.，Rockford，IL 1984)。
Bodansky等人曾提供了可用來合成本發(fā)明肽基團(tuán)的某些溶液法，見Peptide Synthesis，2nd Edition，John Wiley.&Sons，New York，N.Y.1976。
公認(rèn)肽的合成最好采用溶液方法，它涉及到至少兩個肽片段的縮合反應(yīng)。
這種方法包括使一種肽片段X-A1-y與肽片段U-V-W進(jìn)行縮合，其中除A1外所有氨基酸側(cè)鏈?zhǔn)侵行曰虮槐Ｗo(hù)的，而X是Prot，或Prot-A0，這里Prot，是一個N-末端保護(hù)基團(tuán);y是A2-Q，Ala-A2-Q，A2-A3-Q，Ala-A2-A3-Q，A2-A3-A4-Q，Ala-A2-A3-A4-Q，Ala-Q或-Q，其中當(dāng)y是Q時，U是J-A2-A3-A4，或J-Ala-A2-A3-A4，如果y是Ala-Q，U是J-A2-A3-A4，如果y是A2-O或Ala-A2-Q，U是J-A3-A4，當(dāng)y是A2-A3-Q或Ala-A2-A3-Q時，U是J-A4。當(dāng)y是A2-A3-A4-Q或Ala-A2-A3-A4-Q時，U是J，V是A5或Z，如果V是A5，W是A6-Z或Z，當(dāng)V是Z時，W則不存在。A1，A5，A6和Z如本文定義。在目前情況下A2是DβNal或DPhe而A4是Trp。
Q是肽片段的羧基端，是-OR3或-M，這里M是一種能夠被含氮親核物質(zhì)取代的基團(tuán)，而R3是H，含有1到大約10個碳原子的烷基，6到約12個碳原子的芳基，具有7到大約12個碳原子的芳烷基;J代表所指片段的胺末端，是H或一種保護(hù)基團(tuán)，這種基團(tuán)不影響偶聯(lián)反應(yīng)，例如苯甲基。
然后，可以去掉該保護(hù)基團(tuán)。也可以使用該保護(hù)肽進(jìn)一步縮合制備一種較大的肽。
這種優(yōu)選方法更為詳細(xì)的敘述見由John C.Hubbs和S.W.Parker于1990年7月24日申請的題為“合成肽的方法”的美國專利申請?zhí)?，該申請列入本發(fā)明作為參考。
根據(jù)本發(fā)明的另一個實(shí)施方案，提供了一種促進(jìn)動物血中生長激素釋放和水平升高的方法。所說的方法包括給動物使用一定有效量的至少一種上述多肽。
本發(fā)明化合物可以通過口服、非腸道(肌肉(i.m.)、腹膜內(nèi)(i.p.)、靜脈(i.v.)或皮下(s.c.)注射)、鼻腔、陰道、直腸或舌下途徑給藥，并且可以配制成適合于各種給藥途徑的劑型。優(yōu)選非腸道給藥。
用于口服的固體劑型包括膠囊、片劑、丸劑、粉劑和顆粒劑。在這些固體劑型中，活性化合物與至少一種惰性載體如蔗糖、乳糖、或淀粉混合。正如一般實(shí)際應(yīng)用中這些劑型也可以包括除惰性稀釋劑外的其他物質(zhì)，例如，潤滑劑如硬脂酸鎂。在膠囊，片劑和丸劑中，該劑型也可以包括緩沖劑。片劑和丸劑還可以制備成腸衣片。
用于口服的液體劑型包括乳劑，溶液，懸浮液，糖漿，含有本領(lǐng)域中常用的惰性稀釋劑(如水)的酏劑。除了這些惰性稀釋劑外，該組合物中還可以包括佐劑，如濕潤劑，乳化劑，和懸浮劑，以及甜味劑，調(diào)味劑和香料。
用于本發(fā)明非腸道給藥的配制品包括無菌水溶液或非水溶液，懸浮液，或乳劑。非水性溶劑或載體的例子包括丙二醇，聚乙二醇，植物油，如椰欖油和玉米油，明膠和可注射的有機(jī)酯如油酸乙酯。這種劑型也可以含有佐劑如防腐劑，濕潤劑，乳化劑，和分散劑。這些劑型的滅菌可以通過，例如，細(xì)菌非透過濾紙過濾，向組合物中加入消毒劑，對組合物進(jìn)行輻射照射，或加熱該組合物等方式進(jìn)行。也可以用一種無菌水介質(zhì)或其他可注射的無菌介質(zhì)在使用之前臨時配制。
本發(fā)明的新型化合物也可以和生長激素釋放激素(即自然存在的生長激素釋放激素，及其類似物和功能等同物)以其他可促進(jìn)釋放生長激素的化合物，如釋放生長激素肽結(jié)合使用(見美國專利No.4，880，778引入本發(fā)明作為參考)。這種聯(lián)合用藥代表了一種特別優(yōu)選的本發(fā)明釋放生長激素肽的給藥方式，因?yàn)檫@種聯(lián)合用藥比各個成份單獨(dú)用藥產(chǎn)生效應(yīng)的總和比預(yù)期引起的生長激素的釋放增加更為強(qiáng)烈。也就是說，聯(lián)合用藥可以帶來各個單獨(dú)成份藥效的協(xié)同作用。上面所引用的專利對于釋放生長激素肽的聯(lián)合給藥進(jìn)行了更為詳細(xì)的描述。這些協(xié)同作用的化合物優(yōu)選那些作為生長激素釋放激素受體的激活劑或抑制生長激素釋放抑制因子之效應(yīng)的化合物。這種協(xié)同作用可以是二元的，即本發(fā)明化合物和協(xié)同作用的化合物的一種，或者包括不只一種協(xié)同作用的化合物。
本發(fā)明多肽或多肽聯(lián)合給藥的量因多方面因素而有所不同，例如，可取決于所用藥的特定動物，其年齡和性別，所要達(dá)到的治療效果，給藥途徑，以及使用的是哪種多肽或多肽配制品。在所有情況下，都要使用達(dá)到促進(jìn)受體動物血中生長激素釋放和水平升高的有效劑量。一般情況下，這種劑量水平為每公斤體重大約0.1μg至10mg總肽量的范圍之內(nèi)。熟練的技術(shù)人員根據(jù)本發(fā)明公開書明書憑經(jīng)驗(yàn)可以容易地確定優(yōu)選劑量。
例如，在人體中如果靜脈給藥，優(yōu)選的劑量水平在每公斤體重大約0.1μg至10μg總肽量范圍內(nèi)，更為優(yōu)選是每公斤體重大約0.5μg至5μg的總肽量，再進(jìn)一步優(yōu)選是每公斤體重大約0.7μg至3.0μg。如果使用生長激素釋放肽的聯(lián)合給藥，則可以給以較低量的本發(fā)明多肽。例如，將本發(fā)明的肽與美國專利No.4，880，778中第1組中的協(xié)同作用化合物如GHRH聯(lián)合使用時，優(yōu)選給藥范圍是本發(fā)明化合物(如Ala-His-DβNal-Ala-Trp-DPhe-A6-Z，Ala-His-DPhe-Ala-Trp-DPhe-A6-Z，或His-DβNal-Ala-Trp-DPhe-A6-Z)每公斤體重給藥大約0.1μg至大約5μg和大約0.5μg至大約15.0μg的協(xié)同化合物(如GHRH)，更為優(yōu)選是每公斤體重給以大約0.1μg至大約3μg的本發(fā)明化合物和大約1.0μg至大約3.0μg的協(xié)同化合物。
如果口服給藥，一般需要較大的劑量。例如，人口服約藥，劑量水平一般是每公斤體重大約30μg至大約600μg的多肽，優(yōu)選為每公斤體重大約70μg至大約500μg的多肽，更為優(yōu)選是每公斤體重大約100μg至大約350μg的總多肽，甚至再進(jìn)一步優(yōu)選是，每公斤體重大約200μg至大約300μg的總多肽。牛的給藥劑量與人相同，而鼠一般需要較多的劑量水平。根據(jù)本發(fā)明公開說明書憑經(jīng)驗(yàn)可以容易地確定精確給藥水平。
一般情況下，如前所述，釋放生長激素肽聯(lián)合約藥時，由于其協(xié)同效應(yīng)，達(dá)到同樣效果所用各釋放生長激素化合物的劑量，比其單獨(dú)用藥所需的劑量要小。
本發(fā)明還包括以上述多肽的有機(jī)和無機(jī)加成鹽和其結(jié)合物為活性成份的組合物;也可以任意與載體、稀釋劑、緩慢釋放基質(zhì)，或包衣聯(lián)合使用。
被認(rèn)為屬于本發(fā)明范圍之內(nèi)的生長激素釋放化合物及其結(jié)合物的有機(jī)無機(jī)加成鹽包括如下有機(jī)鹽，如乙酸鹽，三氟乙酸鹽，草酸鹽，戊酸鹽，油酸鹽，十二酸鹽，苯甲酸鹽，乳酸鹽，甲苯磺酸鹽，檸檬酸鹽，馬來酸鹽，反丁烯二酸鹽，丁二酸鹽，酒石酸鹽，萘甲酸鹽(naphthalate)等;和無機(jī)部分如周期表第一族(即堿金屬鹽)，第二族(即堿土金屬鹽)、銨和魚精蛋白鹽，鋅、鐵等的氯化物、溴化物、硫酸鹽、磷酸鹽等，以及上述的有機(jī)鹽。
如果給人體用藥則優(yōu)選醫(yī)藥上可接受的鹽。這些鹽包括制藥工業(yè)中常用的非毒性堿金屬，堿土金屬和銨鹽，這包括通過本技術(shù)領(lǐng)域中熟知的方法制備的鈉、鉀、鋰、鈣、鎂、鋇、銨和魚精蛋白鹽。該術(shù)語也包括通常將本發(fā)明的化合物與合適的有機(jī)或無機(jī)酸反應(yīng)而產(chǎn)生的非毒性酸加成鹽。有代表性的鹽包括鹽酸鹽、氫溴酸鹽、硫酸鹽、硫酸氫鹽、乙酸鹽、草酸鹽、戊酸鹽、油酸鹽、十二酸鹽、硼酸鹽、苯甲酸鹽、乳酸鹽、磷酸鹽、甲苯磺酸鹽、檸檬酸鹽、馬來酸鹽、反丁烯二酸鹽、丁二酸鹽、酒石酸鹽、萘甲酸鹽(naphthylate)等。
下面的非限制性實(shí)施例將對本發(fā)明作進(jìn)一步的說明。
實(shí)施例1釋放生長激素肽的合成將鹽酸對甲基二苯甲基胺(PMe-BHA·HCl)樹脂裝入市面上可買到的自動肽合成儀的反應(yīng)容器中。以每克5m moles的負(fù)載量用游離胺取代樹脂。運(yùn)用合適的活化劑，如N，N′-二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)從肽順序的羧基末端開始，將單個的氨基酸偶連在一起來制備該化合物。各個單一氨基酸的α氨基要進(jìn)行保護(hù)，例如，表1中所述如對t-丁基氧代羰基衍生物(t-BOC)和反應(yīng)性側(cè)鏈官能團(tuán)進(jìn)行保護(hù)。
表1適用于固相肽合成的側(cè)鏈保護(hù)基團(tuán)精氨酸 Ng-甲苯磺?；於彼? O-芐基半胱氨酸 S-對-甲基芐基谷氨酸 O-芐基組氨酸 Nfm-甲苯磺酰基賴氨酸 Nε-2，4-二氯芐基氧代羰基蛋氨酸 S-亞砜基絲氨酸 O-芐基蘇氨酸 O-芐基色氨酸 Nln-甲酰基酪氨酸 O-2，6-二氯芐基在加入起始氨基酸之前，加入二氯甲烷(CH2Cl2大約10ml/gm樹脂)攪動樹脂三次(每次約一分鐘)，再用含有N，N-二異丙基乙胺(DIEA)的二氯甲烷(10∶90);大約10ml/gm樹脂)三次攪拌(大約每次2分鐘)進(jìn)行中和，并加二氯甲烷(大約10ml/gm樹脂)攪動三次(每次大約1分鐘)。運(yùn)用一種預(yù)制的對稱酐，用含有大約3倍于結(jié)合能力總量的適合于保護(hù)氨基酸的樹脂和大約1.5倍于結(jié)合能力總量的DCC樹脂的適量二氯甲烷，將起始和隨后每一個氨基酸偶連到樹脂上。對于在二氯甲烷中的溶解度較低的氨基酸來說，加入N，N-二甲基甲酰胺(DMF)可形成均相溶液。一般情況下，要在加入反應(yīng)器中之前30分鐘于室溫或更低溫度下制備好對稱性酐。通過重力過濾使溶液入反應(yīng)器將在對稱酐制備過程中形成的二環(huán)己基脲去除。一般用試劑如水合茚三酮(它可與伯胺和腫胺反應(yīng))通過顯色試驗(yàn)來檢測氨基酸于樹脂上偶連的程度。在被保護(hù)氨基酸完全連接到樹脂上(＞99%)后，通過用酸性試劑(一種或多種)處理去掉α氨基保護(hù)基團(tuán)。常用試劑由一種三氟乙酸(TPA)和含有苯甲醚的二氯甲烷(45∶2∶53)溶液組成。將每個氨基酸連接到樹脂上的全過程如表2所述。
表2單個氨基酸向樹脂上的結(jié)合步驟試劑攪動次數(shù) 攪動時間1.二氯甲烷 3 1分鐘2.三氟乙酸、苯甲醚、二氯甲烷1 2分鐘(45253)3.三氟乙酸、苯甲醚、二氯甲烷1 20分鐘
(45253)4.二氯甲烷3 1分鐘5.二異丙基乙胺、二氯甲烷 3 2分鐘(1090)6.二氯甲烷3 1分鐘7.預(yù)制對稱酐(preformed symmetrical anhydride)1 15－120分鐘＊8.二氯甲烷3 1分鐘9.異丙醇 3 1分鐘10.二氯甲烷 3 1分鐘11.檢測偶連反應(yīng)程度＊＊12.對于每一個氨基酸重復(fù)步驟1－12＊偶連時間取決于各個氨基酸＊＊一般可通過顯色試驗(yàn)檢測偶連水平。如果連接不完全，可以重復(fù)7-11的步驟再偶連相同的氨基酸。如果偶連完全，則可以偶連下一個氨基酸。
使用這種肽合成方法，可以得到新的樹脂結(jié)合多肽如A1-DβNal-A3-Trp-A5-A6- 和A1-DPhe-A3-Trp-A5-A6- (其中A1，A3，A5和A6定義同上，而 是一種聚合樹脂，并且如果需要，可用合適的保護(hù)基團(tuán)對組成氨基酸之官能團(tuán)進(jìn)行保護(hù))。已經(jīng)制備的特定順序(以合適的保護(hù)形式存在)包括His-DβNal-Ala-Trp-DPhe-Lys- ，Ala-His-DβNal-Ala-Trp-DPhe-Lys- ，Ala-His-DTrp-Ala-Trp-DPhe-Lys- ，
His-Ala-DTrp-Ala-Trp-DPhe-Lys-
，His-DαNal-Ala-Trp-DPhe-Lys-
，His-DAsp-Ala-Trp-DPhe-Lys-
，His-DCys(SMe)-Ala-Trp-DPhe-Lys-
，His-DTrp-Ala-Trp-DPhe-Ala-Lys-
，His-DβNal-Ala-Trp-DPhe-Ala-Lys-
，Ala-His-DβNal-Ala-Trp-DPhe-Ala-Lys-
，Try-DArg-Phe-Gly-R，Ala-His-Dphe-Ala-Trp-DPhe-Lys-
，Ala-His-DHis-Ala-Trp-DPhe-Lys-
，和Ala-His-DPro-Ala-Trp-DPhe-Lys-
.
實(shí)施例2鼠體內(nèi)GH釋放未成熟雌性Sprague-Dawley鼠來源于Charles River實(shí)驗(yàn)室(Wilmington，MA)。取來鼠后將其在20℃下，以14∶10小時的光暗循環(huán)條件進(jìn)行室內(nèi)喂養(yǎng)。水和Purina鼠食可以任意喂給。幼鼠要和母親一起長至21天。
將26天齡的鼠分為每個治療組6只，在靜脈注射肽之前20分鐘以50mg/Kg的戊巴比妥腹膜內(nèi)給藥進(jìn)行麻醉。以含有0.1%明膠的普通鹽水作為靜脈注射這種肽的載體。以表3，4和5中所示的用量給體重為55-65克，且已經(jīng)麻醉的鼠靜脈注射釋放生長激素化合物。每次向頸靜脈內(nèi)注射0.2ml的溶液。
在最后的試驗(yàn)注射之后10分鐘用鍘刀將所有的動物殺死(見表3和4)。斷頭之后收集動脈血以測定血中GH水平。血液凝集之后，離心分離血清。將血清冷凍保存至進(jìn)行放射免疫(RIA)測試那天，以確定其生長激素水平，按照由國家關(guān)節(jié)炎、糖尿病、消化和腎病研究所(NIADDK)建立的下列程序進(jìn)行。
一般以下列順序在冰箱溫度(大約4℃)下逐一向RIA分析試管中加入試劑(a)緩沖液，(b)“冷”(也即非放射活性)標(biāo)準(zhǔn)液或所要分析的未知血清樣本，(c)放射碘化的生長激素抗原，和(d)生長激素抗血清。
一般情況下試劑的加入要達(dá)到最終RIA試管稀釋濃度為大約1∶30，000(抗血清比總液體量;體積∶體積)。
在向混合液中加入第二種可以與生長激素抗血清結(jié)合并引起生長激素抗血清復(fù)合物沉淀的抗體(如，山羊或兔抗-猴，γ球蛋白血清)之前，一般要將該混合試劑在室溫下保溫(大約25℃)大約24小時。然后在γ閃爍計數(shù)器上分析特定時間內(nèi)RIA試管內(nèi)沉淀物的計數(shù)。用放射活性計數(shù)與生長激素(GH)水平為坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。通過查閱標(biāo)準(zhǔn)曲線則可以確定未知的GH含量。
用由國家激素與垂體研究項(xiàng)目(National Hormone and Pituitary Program)提供的試劑通過RIA測定血清GH。
表3，4，5，和6中的血清水平以ng/ml為單位記錄，相當(dāng)于0.61鼠GH標(biāo)準(zhǔn)國際單位/mg(IU/mg)。數(shù)據(jù)為平均值+/-平均值標(biāo)準(zhǔn)誤差(SEM)。用Student′s t-試驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。NS是指差沒有統(tǒng)計學(xué)顯著意義。表3，4，5和6中所示結(jié)果都是6只鼠的研究結(jié)果平均值。
表3釋放生長激素化合物在戊巴比妥麻醉鼠體內(nèi)對GH釋放(ng/ml)的促進(jìn)作用(最后注射之后10分鐘處死動物)A欄 總劑量對照組 由A欄中化合物釋放釋放生長激素化合物(μg)GH ng/ml的GH ng/ml+SEMP值His-DTrp-Ala-Trp- .1151±16246±39 -DPhe-Lys-NH2.3 151±16 670±75 -1.0151±16 1000±276 -3.0151±16 2106±216 -
His-DβNal-Ala- .1 151±16 938±255 ＜.02Trp-DPhe-Lys-NH2.3 151±16 1716±258 ＜.021.0151±16 3728±691 ＜.013.0151±16 3238±237 ＜.01
His-DTrp-Ala-Trp- .1138±12226±31-Dphe-Lys-NH2.3 138±12 613±73 -1.0138±12 1581±228 -3.0138±12 2875±393 -
Ala-His-DTrp-Ala-.1138±12254±78 NS -Trp-DPhe-Lys-NH2.3 138±12 809±59 NS -
1.0 138±12 1516±215 NS -3.0 138±12 3095±473 NS -
Ala-His-DβNal- .1 138±12 1128±309 ＜.02＜.02Ala-Trp-DPhe-Lys-NH2.3 138±12 2479±389 ＜.001＜.0011.0 138±12 3899±514 .001 .0013.0 138±12 4202±369 ＜.05 NS
Ala-His-DTrp-Ala-Trp- 0.1 111±25 360±35 -DPhe-Lys-NH20.3 111±25 903±217 -1.0 111±25 2957±427 -3.0 111±25 3956±485 -
Ala-His-DβNal- 0.1 111±25 970±169 ＜.01Ala-Trp-DPhe-Lys-NH20.3 111±25 2898±248 ＜.0011.0 111±25 3908±327NS
表4釋放生長激素化合物在戊巴比妥麻醉鼠體內(nèi)對GH釋放(ng/ml)的促進(jìn)作用(最后注射10分鐘處死動物)A欄 由A欄的化釋放生長激素化合物 對照組 總劑量 合物釋放的GHGH ng/mL (μg) ng/mlAlaHisDTrpAlaTrpDpheLysNH2111±25 .3 901±21AlaHisDPheAlaTrpDPheLysNH2181±69 .3 616±74AlaHisDHisAlaTrpDPheLysNH2117±19 .3 268±54AlaHisDProAlaTrpDPheLysNH2117±19 .3 262±51表5肽 總劑量 對照組 釋放的GH(μg) GH ng/ml ng/mlHis-DAsp-Ala-Trp- 1.0 150±20 154±63DPhe-Lys-NH23.0 150±20 155±3410.0 150±20 163±4430.0 150±20 224±62100.0 150±20 178±83His-DCys(SMe)-Ala- .3 181±69 178±28Trp-DPhe-Lys-NH21.0 181±69 193±28
3.0 181±69 180±34His-DαNal-Ala- .1 151±16 280±70Trp-DPhe-Lys-NH2.3 151±16 439±1221.0 151±16 1130±1793.0 151±16 2319±139His-DTrp-Ala-Trp- .1 181±69 512±43Dphe-Lys-NH2.3 181±69 566±1141.0 181±69 1531±3033.0 181±69 2349±267His-DTrp-Ala-Trp- .1 220±29 420±105DPhe-Ala-Lys-NH2.3 220±29 900±1631.0 220±29 1965±3663.0 220±29 4553±670His-DβNal-Ala- .1 111±25 484±89Trp-DPhe-Ala-Lys-NH2.3 107±16 971±2411.0 107±16 1593±3593.0 107±16 3337±583
His-Ala-DTrp-Ala-Trp- .1 111±25 -DPhe-Lys-NH2.3 151±16 261±321.0 151±16 830±1033.0 151±16 2588±341表3，4，5，和6表明本發(fā)明的化合物對給以這種化合物的鼠血中生長激素的釋放及水平升高有促進(jìn)作用。本發(fā)明的肽表現(xiàn)出可在A2位點(diǎn)被取代的等同化合物(如，用DAsp，Dcys(Sme)，DHis，和DPro取代)所不能表現(xiàn)的活性。這些表格也說明，His-DβNal-Ala-Trp-DPhe-Lys-NH2比在A2位點(diǎn)帶有DTrp，DαNal，DAsp和DCys(Sme)的化合物活性更強(qiáng)。同樣，Ala-His-DβNal-Ala-Trp-DPhe-Lys-NH2比等同DTrp化合物活性更強(qiáng)。
實(shí)施例3釋放生長激素化合物的聯(lián)合用藥重復(fù)實(shí)施例2的方法，不同之處是不對鼠進(jìn)行麻醉，也不用戊巴比妥對鼠進(jìn)行予處理，并且用多種肽給鼠聯(lián)合用藥。所給化合物，劑量以及結(jié)果如表6所示。
表6釋放生長激素化合物在戊巴比妥麻醉的鼠體內(nèi)對GH釋放的促進(jìn)作用(在最后注射之后10分鐘處死動物)A欄釋放GH 總劑量 對照血清 GH被釋放肽 (μg) GH ng/ml 的血清GH ng/ml±SEM(N＝6)+SEM(N＝6)Als-His-DβNal- 0.1 337±51 610±90DPhe-Lys-NH20.3 337±51 1140±1871.0 337±51 2909±2573.0 337±51 3686±436Ala-DβNal-Ala- 0.3 167±46 363±73Trp-DPhe-Lys-NH21.0 167±46 1450±2943.0 167±46 2072±20810.0 167±46 2698±369Ala-His-DβNal-Ala-Trp-DPhe-Lys-NH20.3 160±51 1418±3021.0 160±51 2201±269
Ala-His-DβNal-Ala-Trp-DPhe-Lys-NH20.3 228±23 1746±3181.0 228±23 2610±176Ala-HIs-DβNal-Ala-Trp-DPhe-Lys-NH20.1 160±36 822±2430.3 160±36 1549±2921.0 160±36 2180±284表7本發(fā)明化合物與第1類和/或第3類化合物在未麻醉鼠體內(nèi)的協(xié)同作用所使用的化合物 劑量(μg) 釋放的GH(ng/mL)±SEM對照 - - - 12±3175-1a- - 1 58±13175-1 - - 3 240±32Cb- - 10 204±50GHRHc- - 3 131±50TPd- - 10 79±29
175-1 GHRH - 1+3 2014±224175-1 TP - 1+10 987±204175-1 GHRH TP 1+3+10 4150±555175-1 GHRH - 3+3 1994±249175-1 TP - 3+10 2149±451175-1 GHRH TP 3+3+10 2922±384C GHRH - 10+3 2525±453C TP - 10+10 1597±387C GHRH TP 10+3+10 4344±374＊第1類和第3類化合物在美國專利No.4，880，778中進(jìn)行了詳細(xì)描述。
a-175-1＝His-DβNal-Ala-Trp-DPhe-Lys-NH2，(本發(fā)明的化合物)b-C＝His-DTrp-Ala-Trp-DPhe-Lys-NH2(對比化合物)c-GHRH＝Tyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Nle-Ser-Arg-NH2
(第1類化合物)d-TP＝Tyr-DArg-Phe-Gly-NH2(第3類化合物)表7表明本發(fā)明化合物如果與例舉的第1類和/或第3類化合物一起使用時可以產(chǎn)生協(xié)同作用。表7中的結(jié)果還表明本發(fā)明化合物與以往曾表現(xiàn)有協(xié)同反應(yīng)的對比化合物(C)一起可以產(chǎn)生更大的協(xié)同作用。
實(shí)施例4肽片段形成肽的縮合反應(yīng)一般方法用Thomas Hoover毛細(xì)管熔點(diǎn)儀測定熔點(diǎn)。在Perkin-Elmer Model137或Nicolet Model 5 DX分光光度計上記錄紅外(IR)光譜，并記下波數(shù)(cm-1)。使用VG Analytical Ltd，Model ZAB-1F質(zhì)譜儀以EI(電沖擊)、FD(場吸收)或FAB(快速原子轟擊)方式獲得質(zhì)譜(MS)。使用配備有一個30mDB5毛細(xì)柱(J & W Scientific)的Finnigan 4023 GCMS用氦載體氣體獲得GCMS。用Rudolph Research生產(chǎn)的Autopol Ⅲ偏振計測量旋光度。
在J.EOL GX-400 NMR儀器上以400MHz操作或用JEOL-270NMR儀器以270MHz操作可以獲得1HNMR光譜。這些儀器能夠進(jìn)行小于0.7Hz的常規(guī)數(shù)字分辨。相對于內(nèi)標(biāo)物3-(三甲硅烷基)-四氚丙酸鈉(TSP)的化學(xué)位移以百萬分率表示。
使用由L-5000梯度控制器和連接到Vydac 201TP1010或218TP1010半制備柱子上的655A泵組成的Hitachi系統(tǒng)可以進(jìn)行高效液相色譜分析(HPLC)。可以使用含有0.2%三氟乙酸和甲醇的混合水溶液作為洗脫劑。一般情況下，用以大約每分鐘1-2%的速度增加有機(jī)成份的梯度以每分鐘6ml的流速可以洗脫出有用的化合物，然后用LKB2140二極管陣U.V.檢測儀在合適的波長下檢測這些化合物。然后用Nelson分析軟件(Version3.6)完成積分計算。
未特別指出時，則在一種惰性氣體氮或氬存在下進(jìn)行反應(yīng)。無水四氫呋喃(THF，U.V.級)和二甲基甲酰胺(DMF)從Burdick and Jackson購買到，并可從瓶中直接使用。
A.制備三肽片段-2HN-Trp-DPhe-Lys(Boc)-NH2Nα-芐氧基羰基-(Nε-t-丁氧基羰基)賴氨酸酰胺.4.
向10℃的羰基二咪唑(CD1，2，88，24g，0.544mol)和無水四氫呋喃(THF，1500ml)溶液中緩慢加入Nα-芐氧基羰基-(Nε-t-丁氧基羰基)賴氨酸(I，180g，0.474mol)，在加入過程中放出氣體。在Nε-芐氧基羰基-(Nε-t-丁氧基羰基)賴氨酰咪唑(Lysine imidazolide)(中間體3)形成同時，制備氨和THF(2000ml)的飽和溶液(無水，NH3氣于5-10℃下通過THF)。當(dāng)判斷已完全形成了中間體3時(放氣停止時，大約2小時)，向氨溶液中加入含有3的THF溶液的一半，30分鐘之后再加入含有3的剩余溶液。在加入過程中保持連續(xù)通入氨氣，并且之后還要再通入45分鐘。在加入兩次含有3的溶液時，形成白色沉淀。將反應(yīng)液回升到室溫并攪拌15小時。在真空中去除漿液中的溶劑。把剩余物再于水中形成漿液，通過真空過濾收集所產(chǎn)生的固體物。
Nε-t-丁氧基羰基-賴氨酸-酰胺，5.
在氬氣存在下向5%Pd/c(5g)甲醇催化劑漿液(250ml)中加入賴氨酸酰胺4(181.48g，0.479mol)甲醇(1000ml)溶液。使氫氣通入反應(yīng)混合液中冒泡(約15分鐘)，然后在氫氣存在下攪拌反應(yīng)液直至HPLC分析表明反應(yīng)已完成(36小時)。用氬取代氫氣。反應(yīng)液通過Celite 墊澄清，并在真空中去除溶劑得到固體物。
Nα-芐氧基羰基-D-苯丙氨?；?(Nε-t-丁氧基羰基)賴氨酸-酰胺.8將Nα-芐氧基羰基-D-苯丙氨酸(6，126，39g，0.423mol)緩慢加入到10℃的CDI(2，66.03g，0.409mol)的THF溶液中(500ml)。在加入過程中可以發(fā)現(xiàn)放出氣體，當(dāng)停止放氣時，再加入賴氨酸酰胺5(110.75g，0.452mol)的THF溶液(500ml)。大約48小時之后，使混合液過濾去掉固體物。在真空中濃縮濾液。
將所得到的殘留物溶于乙酸乙酯(EtOAc，500ml)中，然后在分液漏斗中按照下列步驟洗滌1.HCl水溶液(1N，3×500 ml)洗1次pH約為8，接著洗到pH1，2.水(500ml)3.Na2CO3水溶液(1/2飽和，2×500ml)，過濾收集形成的結(jié)晶固體(8)，4.水(3×500ml)。
將有機(jī)層用MgSO4干燥。澄清之后，真空去除溶劑。使得到的殘留物從熱EtOAc中重結(jié)晶得到第二種樣品8。
D-苯丙氨?；?(Nε-t-丁氧基羰基)賴氨酸酰胺9.
將酰胺8(120.53g，0.229mol)的甲醇溶液加入到含有5%Pd/c(50g)的甲醇(200ml)催化劑漿液中。用氫氣取代氬氣。當(dāng)HPLC分析表明反應(yīng)完全完成時(大約4小時)，用氬氣取代氫氣。然后使反應(yīng)液通過Celite 墊澄清，并在真空中使濾液形成殘渣。這種二肽產(chǎn)物可以直接用來制備三肽12。
Nα-芐氧基羰基-色氨酰-D-苯丙氨酰-(Nε-t-丁氧基羰基)賴氨酸-酰胺，12。
將10℃的Nα-芐氧基羰基-色氨酸(10，67.60g，0.200mol)，THF(500ml)和CDI(2，33.05g，0.204mol)溶液進(jìn)行攪拌直至沒有氣體放出。然后再向反應(yīng)混合液中加入含有9(40.8g，0.103mol)的THF(大約200ml)溶液。使所得的溶液在室溫下反應(yīng)15小時。通過真空過濾收集形成的固體物。通過真空濃縮使濾液形成殘渣。將所得到的殘渣和固體物再混合并溶于EtOAc(4000ml)中，輕微加熱。溶液冷卻至室溫時，即形成固體物。通過真空過濾收集固體物。使固體從熱的MeOH中重結(jié)晶得到純化的三肽12。將EtOAc濾液(來自第一次結(jié)晶)按照下列步驟在分液漏斗中洗滌1.HCl水溶液(1N，2×500ml)，2.水(1×500ml)，3.Na2CO3水溶液(1/2飽和，2×500ml)，4.NaCl水溶液(1×500ml)。
有機(jī)層用MgSO4干燥，然后真空過濾澄清。在真空中去除濾液的溶劑。將所得到的殘留物再溶于EtOAc中以得到干燥的固體物?？梢詫⒃摴腆w物從熱MeOH重結(jié)晶，形成第二種白色固體物12。色氨酰-D-苯丙氨?；?(Nε-t-丁氧基羰基)賴氨酸-酰胺13。
在氬氣存在下將三肽12(64.59g，0.091mol)的甲醇溶液(1500ml)加入到含有5%Pd/c(5g)和甲醇(250ml)的催化劑漿液中。再加入額外量的甲醇(2250ml)。用氫氣取代氬氣，使之反應(yīng)(大約24小時)。在反應(yīng)完成后，用氬氣代替氫氣。使溶液通過Celite
墊進(jìn)行澄清，并在真空中濃縮濾液得到白色固體物三肽13。
B.制備三肽片段-K-His-DβNal-Ala-OMeNα-芐氧基羰基-組氨?；?D-β-萘基丙氨酸甲酯，25.
用飽和碳酸鈉(400ml)和0.8N氫氧化鈉水溶液(大約500ml)洗滌EtOAc(400ml)和D-β-萘基丙氨酸甲酯鹽酸鹽(22，0.62mol)溶液。去除掉所產(chǎn)生的水相(pH8.5)，并且接著用半飽和的Na2CO3水溶液(150ml)洗有機(jī)相，然后再用水(50ml)洗。在真空中濃縮乙酸乙酯離析出游離堿形式的22。
-5℃(冰-乙醇浴)的含有Nα-芐氧基羰基-組氨酸(19，143.5g，0.50mol)，N-羥基丁二酰胺(HONSu，23，0.62mol)和新制備的游離堿性22(大約0.52mol)的DMF(大約3L)溶液中加入二環(huán)己基碳二亞胺(DCC，大約95g，0.46mol)。對所得到的反應(yīng)液在室溫下攪拌24小時。應(yīng)進(jìn)行HPLC分析以觀察反應(yīng)是否完全。如果反應(yīng)不完全則將反應(yīng)液冷卻至大約-5℃，并向反應(yīng)液中整批再加入二環(huán)己基碳二亞胺(大約0.17mol)。然后使反應(yīng)混合液加熱至室溫并再攪拌24小時。過濾混合液去除二環(huán)己基脲(DCU)。向?yàn)V液中加水(1L)，并在真空中濃縮該溶液。把所得到的殘留物溶于1NHCl水溶液中(大約1L，直至液相pH達(dá)到1)。用乙酸乙酯(每次1L)提取該水相兩次，去除掉乙酸乙酯層。加入冷卻的2N氫氧化鈉(500ml)和氫氧化鈉片調(diào)節(jié)該水相的pH。在中和過程中，加入冷卻的乙酸乙酯(1L)以保持該溶液冷卻。當(dāng)水相的pH達(dá)到大約7時，一般會產(chǎn)生大量的白色固體沉淀或油狀物。通過真空過濾或傾析收集沉淀物，并接著用飽和的碳酸鈉(2×1500ml)，水(6×1500ml)和乙酸乙酯(3×1500ml)洗滌。在高真空下使所產(chǎn)生的物質(zhì)干燥使達(dá)恒重。這種物質(zhì)可以直接被水溶解而無需進(jìn)一步純化。
可用D-苯丙氨酸甲酯鹽酸鹽做為化合物22來代替D-β-萘基丙氨酸甲酯鹽酸鹽制備出DPhe肽。
Nα-芐氧基羰基-組氨酰-β-萘基-D-丙氨酯.26.
一種含有二肽25(大約，0.38mol)，水(360ml)和MeOH(大約6L)的溶液中加入氫氧化鈉水溶液(192ml，0.08g/ml溶液，0.38mol)。在室溫下攪拌該溶液直至完全水解(大約24小時)。通過HPLC分析證實(shí)起始肽已消失。在真空中將該溶液濃縮得到殘留物，并將其溶于水中(大約1L)。用EtOAc(2×500ml)在分液漏斗中對水溶液層(pH大約10)萃取。去掉乙酸乙酯層。用濃鹽酸調(diào)節(jié)所得到的水相pH至大約5，在此pH點(diǎn)一般產(chǎn)生白色固體或油狀物。收集產(chǎn)物并在真空中干燥。
Nα-芐氧基羰基-組氨酰-D-β-萘基丙氨酰-丙氨酸甲酯.20.
在氬氣存在下HONSu(23，0.505mol)的DMF(800ml)溶液中加入二肽Nα-芐氧基羰基-組氨酰-D-β-萘基丙氨酸(26，0.253mol)。再向該溶液中加入含有丙氨酸甲酯鹽酸鹽(15，0.303mol)，N-甲基嗎啉(16，0.303mol)和DMF(200ml)的混合液。將所得到的溶液冷卻至10℃，此時加入含有二環(huán)己基碳二亞胺(24，0.265mol)的二氯甲烷(273ml)。用HPLC檢測該反應(yīng)，使反應(yīng)溫度保持在10℃直至反應(yīng)完全。幾天(大約4天)之后，如果反應(yīng)尚未完全，再加入24(0.080mol)，并且將反應(yīng)混合液在10℃下再攪拌1天。用HPLC分析再檢測反應(yīng)直至完全反應(yīng)(一般大約5天)。通過真空過濾收集反應(yīng)形成的固體。把濾液在真空中濃縮成殘渣。將所得到的殘渣溶于乙酸乙酯中，并用半飽和的Na2CO3水溶液(2×500ml)提取。乙酸乙酯相用MgSO4干燥。澄清所得到的溶液并在真空中濃縮得到殘渣。
C.制備四肽片段Ala-His-DβNal-Ala-OH組氨酰-D-B-萘基-丙氨酰-丙氨酸甲酯.30.
在氬氣存在下，Nα-芐氧基羰基-組氨酰-D-β-萘基丙氨酰-丙氨酸甲酯20(71mmol)的甲醇溶液(500ml)中小心地加入在碳(3g)上的5%鈀。向反應(yīng)混合物中通入氬氣鼓泡15分鐘，并加入乙酸(15ml，0.26mol)。再向這種混合物中通入鼓泡(液面下)氫氣15分鐘，然后在穩(wěn)定通入氫氣(1atm)下于室溫攪拌反應(yīng)液。用HPLC分析檢測起始物質(zhì)剩余量。如果剩余一部分，則要小心地向反應(yīng)混合物中通入氬氣(液面下通入30分鐘)，并再加入一份碳(2.5g)上的5%鈀。然后再通入氫氣，再向反應(yīng)混合物中通入氬氣，并通過硅藻土墊過濾澄清所得到的溶液。在真空中濃縮該溶液得到產(chǎn)物。將一份這種產(chǎn)物溶于水或于水中成漿狀(500ml)。向這些物質(zhì)中加入乙酸乙酯和飽和的碳酸鈉水溶液。分離乙酸乙酯層或產(chǎn)生的固體，可得到一種不含乙酸酯的物質(zhì)(30)。Boc-丙氨酸N-羥基丁二酰亞胺酯。31.
Boc-丙氨酸(43mmol)和N-羥基丁二酰胺(48mmol)的二氯甲烷(250ml)的室溫溶液中加入二環(huán)己基碳二亞胺(43mmol)。將所得溶液攪拌過夜。然后過濾反應(yīng)混合物以去除二環(huán)己基脲，并在真空中濃縮澄清的濾液以得到產(chǎn)物，在使用之前將該產(chǎn)物存放于-20℃氬氣中。
Boc-Ala-His-DβNal-Ala-OMe.32.
將上述的丙氨酸酯(23.9mmol)加入到His-D-βNal-Ala-OMe(30)(20.1mmol)無水二甲基甲酰胺(DMF，200ml)溶液中。在室溫下攪拌所得到的均相溶液過周末并進(jìn)行檢測。當(dāng)HPLC分析表明反應(yīng)混合液中基本上沒有三肽存在時(例如，大約3天)，向反應(yīng)液中加水(50ml)，并且攪拌所得到的混合液一天。然后在真空中濃縮該溶液。將所得到的殘留物溶于乙酸乙酯中，然后在半飽和的碳酸鈉溶液(2×300ml)提取。有機(jī)相用MgSO4和Na2SO4進(jìn)行干燥，并在真空中濃縮得到四肽?？梢允褂眠@種物質(zhì)無需進(jìn)一步純化來制備Boc-Ala-His-D-βNal-Ala-OH.
Boc-Ala-His-D-βNal-Ala-OH.33.
含有Boc-Ala-His-D-βNal-Ala-OMe(13.7mmol)的甲醇(500ml)和水溶液(200ml)中加入2N氫氧化鈉水溶液(7.5ml，15mmol)。在室溫下攪拌該反應(yīng)液過夜后，HPLC分析確定所剩余的起始物質(zhì)的量。當(dāng)反應(yīng)基本完全時(大約過夜)，在真空中將所得溶液濃縮至大約200ml的體積。加水(100ml)，并且加入2N氫氧化鈉(1ml)調(diào)節(jié)pH至大約12。用乙酸乙酯(2×500ml)提取該溶液。去掉乙酸乙酯層。加入HCl水溶液調(diào)節(jié)水相的pH至大約5，此時一般會得到產(chǎn)物的沉淀。重要的是要將水相的體積減少到最小以促進(jìn)沉淀。將水相從產(chǎn)物中傾析掉，然后用水(2×50ml)漂洗該產(chǎn)物。在真空中將分離的產(chǎn)物干燥至恒重。
D.肽片段縮合反應(yīng)產(chǎn)生七肽Boc-Ala-His-Dβ-Nal-Ala-Trp-D-Phe-Lys(Boc)-NH2.34.
將兩種肽Boc-Ala-His-D-βNal-Ala-OH(3.3，2.6mmol)和Trp-D-Phe-Lys(Boc)-NH2(13，2.8mmol)溶于無水DMF中，并在真空中濃縮所得到的溶液。這種初步濃縮目的是企圖去除任何可能存在的甲醇。將所得到的肽混合物再溶于DMF中，然后加入N-羥基丁二酰亞胺(5.1mmol)。將所得溶液溫度冷卻至-2℃，然后加入二環(huán)己基碳二亞胺(3.4mmol)的二氯甲烷(3，5ml)溶液。在-2℃的溶液溫度下攪拌所得到的反應(yīng)混合物三天。用HPLC分析確定該反應(yīng)是否基本完全。這段時間之后，如果反應(yīng)不完全，再加入二環(huán)己基碳二亞胺，并在-2℃下再攪拌所得到的反應(yīng)混合液一天。如果在第二天(總共4天)HPLC分析再表明反應(yīng)尚不完全，必須終止對反應(yīng)混合物的冷卻?？梢栽趲讉€小時(大約8)的時間內(nèi)使反應(yīng)液的溫度緩慢上升至室溫(25℃)。在室溫下攪拌該反應(yīng)混合物過夜。重復(fù)該程序直至反應(yīng)完全。然后，加水(50ml)，并再攪拌該混合液一天。過濾該反應(yīng)液去除二環(huán)己基脲，并在真空中將所得到的濾液濃縮成粘性油。所得到的殘留物中加入乙酸乙酯和半飽和的碳酸鈉水溶液(200ml)。將兩相混合物在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上高速旋轉(zhuǎn)大約1小時。在燒結(jié)玻璃漏斗上過濾收集形成的任何固體，得到產(chǎn)物。用水洗滌有機(jī)相，然后在真空中干燥至恒重得到產(chǎn)物。
Ala-His-DβNal-Ala-Trp-D-Phe-Lys-NH2.35.
將七肽Boc-Ala-His-D-βNal-Ala-Trp-D-Phe-Lys-(Boc)-NH2(34，1.02mmol)加入到含有三氟乙酸(30ml)，甲硫醚(14ml)，1.2乙二硫酚(ethanedithiol)(7ml)和苯甲醚(2.2ml)的二氯甲烷(15ml)室溫溶液中。將均相反應(yīng)混合液攪拌15分鐘。這段時間之后，加入無水乙醚(450ml)以引起粗制生物活性肽產(chǎn)物35的沉淀。通過在燒結(jié)玻璃漏斗上過濾或傾析分離這種產(chǎn)物。把所得產(chǎn)物溶于水并凍干?？梢酝ㄟ^中壓色譜法在含有LichroprepTMRP-18柱填充材料(C-18，25-40nm，不規(guī)則篩孔)的26×460nm玻璃柱子上進(jìn)一步純化凍干的產(chǎn)物。注射入肽的水溶液之后，以每分鐘9ml的流速，用0到25%甲醇的淺梯度洗脫該柱子5-20小時，然后以25至55%甲醇梯度洗脫大約48小時。甲醇濃度梯度以每小時2%的速度增加。洗脫過程中，保留的溶劑成份由含有0.2%三氟乙酸乙酯的水溶液組成。通過HPLC鑒定該產(chǎn)物(35)，并通過濃縮相應(yīng)的洗脫體積分離出該產(chǎn)物。
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權(quán)利要求
1.一種具有通式A1-A2-A3-Trp-A5-A6-Z的肽，其中A1是His，3(NMe)His，His-Ala，Ala，Tyr，Ao-His或Ao-3(NMe)Hie，其中Ao是任何自然存在的L-氨基酸，蛋氨酸(Met(O))，Dopa(3，4-二羥基苯基丙氨酸)，α-氨基丁酸或分子式L-Ao的肽，其中L是H，3，4-二羥基苯基丙氨酸、賴氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、Tyr-DAla-phe-Gly，Tyr-DAla-Gly-phe，Tyr-Ala-Gly-Thr或Tyr-DAla-phe-SarA2是β-萘基-D丙氨酸或D苯丙氨酸A3是丙氨酸，甘氨酸或絲氨酸；A5是D苯丙氨酸，D/Lβ(Me)苯丙氨酸或(NMe)D-苯丙氨酸；A6是B-G或G，其中B是任何自然存在的L-氨基酸，任何自然存在氨基酸的二肽或者H2N(CH2)nCO2H，其中n=2-12，而G是精氨酸、異賴氨酸(iLys)、賴氨酸或鳥氨酸；Z是多肽的C末端基團(tuán)或C末端氨基酸加末端基團(tuán)，且Z是-CONR1R2，-COOR1，-CH2OR1，-Gly-Z′，-Met-Z′，-Ly·s-Z′，-Cys-Z′，-Gly-Tyr-Z′，或者-ALa-Tyr-Z′，其中Z′是-CONR1R2，-COOR1或-CH2OR1，其中R1是H，具有1到約6個碳原子的烷基，是3到約8個碳原子的環(huán)烷基，是2到約8個碳原子的鏈烯基、或是6到約12個碳原子的芳基；R2的定義同R1，二者可相同或不同；以及該肽醫(yī)藥上可接受的有機(jī)或無機(jī)鹽。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的肽，其中A1是組氨酸、丙氨酸、組氨酸-丙氨酸或A0-組氨酸。
3.根據(jù)權(quán)利要求2的肽，其中A3是丙氨酸。
4.根據(jù)權(quán)利要求2的肽，其中A0是丙氨酸、賴氨酸或谷氨酸;A3是丙氨酸;A6是賴氨酸、異賴氨酸(iLys)，丙氨酸-賴氨酸、丙氨酸-丙氨酸-賴氨酸或H2N(CH2)n′CO-賴氨酸，其中n′是4-8。
5.根據(jù)權(quán)利要求1的肽，其中A2是DβNal。
6.根據(jù)權(quán)利要求1的肽，具有分子式His-DβNal-Ala-Trp-Dphe-A6-Z。
7.根據(jù)權(quán)利要求1的肽，其中A2是DPhe。
8.根據(jù)權(quán)利要求6的肽，具有分子式His-DβNal-Ala-Trp-DPhe-Lys-NH2。
9.根據(jù)權(quán)利要求1的肽，具有分子式A0-His-DβNal-Ala-Trp-DPhe-A6-Z或Ao-His-DPhe-Ala-Trp-DPhe-A6-Z。
10.根據(jù)權(quán)利要求9的肽，其中A0是丙氨酸。
11.根據(jù)權(quán)利要求6，9，18或20的肽，其中Z是-CONH2
12.根據(jù)權(quán)利要求12的肽，具有分子式Ala-His-DPhe-Ala-Trp-DPhe-Lys-NH2Ala-His-DβNal-Ala-Trp-DPhe-Lys-NH2Ala-His-DβNal-Ala-Trp-DPhe-Ala-Lys-NH2，Ala-His-DβNal-Ala-Trp-DPhe-Ala-Ala-Lys-NH2，Lys-His-DβNal-Ala-Trp-DPhe-A6-NH2，或Glu-His-DβNal-Ala-Trp-DPhe-A6-NH2.
13.根據(jù)權(quán)利要求2，6，9，18，或20的肽，其中A6是G。
14.根據(jù)權(quán)利要求8的肽，具有分子式Ala-His-DPhe-Ala-Trp-DPhe-Ala-Lys-NH2Ala-His-DPhe-Ala-Trp-DPhe-Ala-Ala-Lys-NH2Lys-His-DPhe-Ala-Trp-DPhe-A6-NH2或Glu-His-DPhe-Ala-Trp-DPhe-A6-NH2.
15.根據(jù)權(quán)利要求1的肽，具有分子式His-Ala-DβNal-Ala-Trp-DPhe-A6-Z。
16.根據(jù)權(quán)利要求15的肽，其中Z是-CONH2。
17.根據(jù)權(quán)利要求16的肽，具有分子式His-Ala-DβNal-Ala-Trp-DPhe-Lys-NH2。
18.根據(jù)權(quán)利要求1的肽，具有分子式His-DPhe-Ala-Trp-DPhe-A6-Z。
19.根據(jù)權(quán)利要求18的肽，具有分子式His-DPhe-Ala-Trp-DPhe-Lys-NH2。
20.根據(jù)權(quán)利要求1的肽，具有分子式Ala-DβNal-Ala-Trp-DPhe-A6-Z或Ala-DPhe-Ala-Trp-DPhe-A6-Z。
21.根據(jù)權(quán)利要求20的肽，具有分子式Ala-DβNal-Ala-Trp-DPhe-Lys-NH2或Ala-DPhe-Ala-Trp-DPhe-Lys-NH2。
22.一種用于促進(jìn)動物體內(nèi)生長激素含量釋放的藥物組合物，包括權(quán)利要求1、4、5、7、9、12、14或15中的至少一種肽和其醫(yī)藥上可接受的載體或稀釋劑。
23.根據(jù)權(quán)利要求2的肽，其中A0是任何自然存在的氨基酸。
24.如權(quán)利要求22的藥物組合物，還包括可以作為釋放生長激素激素受體興奮劑或可以抑制生長激素釋放抑制因子活性的第二種化合物。
25.制備分子式為A1-A2-A3-Trp-A5-A6-Z的化合物的方法，其中A1是His，3(NMe)His，His-Ala.Ala，Tyr，A0-His或A0-3(NMe)His，其中A0是自然存在的L-氨基酸，Met(O)，DOPA，Abu或分子式為L-A0的肽，其中L是H，DOPA，Lys，Phe，Tyr，Cys，Tyr-DAla-Phe-Gly，Tyr-DAla-Gly-Phe，Thr-Ala-Gly-Tyr或Tyr-DAla-Phe-SarA2是DβNal或DPhe;A3是Ala，Gly或Ser;A5是DPhe，D/Lβ(Me)Phe或(NMe)DPhe;A6是B-G或G，它包括偶連氨基酸或氨基酸衍生物以形成該化合物。
26.制備權(quán)利要求1的肽的方法，它包括肽片段的縮合反應(yīng)以形成肽。
全文摘要
本發(fā)明描述了新型多肽，給動物使用這種多肽，可以促進(jìn)生長激素的釋放。這些多肽具有分子式A
文檔編號C07K14/60GK1061606SQ91105938
公開日1992年6月3日 申請日期1991年7月24日 優(yōu)先權(quán)日1990年7月24日
發(fā)明者J·C·哈布斯, C·H·福斯特, C·Y·包瓦斯, F·A·莫門尼, W·L·科迪 申請人:多價控股公司