專利名稱：傳染性粘液囊炎疫苗的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及能保護(hù)家禽免受傳染性粘液囊炎感染的疫苗，并涉及可用于制備所述疫苗的新病毒。
傳染性粘液囊炎是折磨家禽的傳染病，是由傳染性粘液囊炎病毒(IBDV)引起的。傳染性粘液囊炎的病原體屬于雙RNA病毒科，雙RNA病毒屬，主要影響Fabricius的粘液囊，可導(dǎo)致粘液囊萎縮。野外發(fā)現(xiàn)的高毒力病毒的感染一般會(huì)導(dǎo)致粘液囊的重量降低至正常重量的約1/3，這一般被表示為粘液囊/體重比(BBR)。疾病使粘液囊的B淋巴細(xì)胞群體退化和壞死，這可能會(huì)導(dǎo)致免疫抑制。粘液囊萎縮(和隨后的退化)的程度取決于有關(guān)毒株的毒力。
在血清學(xué)上，IBDV可被區(qū)分為兩種不同的類型1型發(fā)現(xiàn)于雞中，而2型發(fā)現(xiàn)于火雞中。
傳染性粘液囊炎的預(yù)防基于免疫接種。目前使用的疫苗毒株分為高毒力(中度+；例子Bursine Plus，Bursine 3)，中度毒力(如Bursine2，D78，LZ228TC)和高度減毒溫和(＝無(wú)毒性；如Bursine 1)毒株。
家禽養(yǎng)殖人員面臨的難題是在有規(guī)律地免疫家禽群的制度中，新孵出的雞一出生即帶有來(lái)自母體的高抗體滴度。已知母體的抗體滴度會(huì)干擾疫苗病毒，高毒力，中度毒力和無(wú)毒力病毒株分別可突破母體病毒-中和抗體水平1∶500，1∶250或1∶100以下(“家禽疾病”，第9版，Calnek等編；衣阿華州立大學(xué)出版社，1991，p659)。使用ELISA系統(tǒng)監(jiān)測(cè)母體抗體，得到差不多的結(jié)果。高毒力(中度+)疫苗突破約為500的IDDEX-ELISA滴度。發(fā)現(xiàn)中度和溫和毒株突破低得多的滴度以誘導(dǎo)血清反應(yīng)。
通過(guò)前述對(duì)粘液囊重量(BBR)的影響或通過(guò)微觀的改變監(jiān)測(cè)毒株的毒力。下表(表1)顯示出中度+疫苗(Poulvac Bursa Plus，Delvax LZ228E)和高毒力野生型病毒(D6948E分離株)的毒力水平對(duì)粘液囊重量的影響(表示為與正常值相比的BBR％)。
表1
比較結(jié)果顯示出中度+疫苗與高毒力野生型病毒對(duì)粘液囊重量的影響一樣大，結(jié)果，希望免疫具有高母體抗體滴度的雛雞的操作人員不得不接受更“猛烈”毒株的消極結(jié)果(如嚴(yán)重的氣管損害和高死亡率)。因此，當(dāng)使用中度毒力的疫苗時(shí)，養(yǎng)殖人員會(huì)損失具有＞1∶500抗體滴度的雞，因?yàn)樗鲆呙绮荒芡黄拼说味?，而?dāng)使用高毒力疫苗時(shí)，因?yàn)椴《镜淖饔枚桂B(yǎng)殖人員損失雞。
因此，需要一種毒性較低并同時(shí)能突破高的母體抗體滴度的疫苗。
令人驚奇地是，已發(fā)現(xiàn)具有這一系列特征IBDV，因此，根據(jù)本發(fā)明，提供了能保護(hù)家禽免受傳染性粘液囊炎感染的疫苗，其特征在于含有傳染性粘液囊炎病毒，該病毒具有中度毒力和保護(hù)具有至少約為500 ELISA抗體滴度的家禽的能力的聯(lián)合特性。
已分離出特別的一例此類新病毒，新的IBDV毒株本質(zhì)上以毒株9793表示，該毒株的樣品已于1997年1月22日保藏于法國(guó)巴黎巴斯德研究所的國(guó)立微生物保藏中心，保藏號(hào)為1-1810，保藏材料1-1810的形式為主種子病毒。
通過(guò)在適當(dāng)培養(yǎng)基上進(jìn)行一次或多次傳代由種子病毒制備疫苗病毒，優(yōu)選所有疫苗病毒得自單個(gè)原種病毒庫(kù)-主種子病毒。任選通過(guò)一次或多次傳代由此主種子制備工作種子病毒庫(kù)，并通過(guò)一次或多次傳代由此工作種子制備實(shí)際的疫苗病毒。疫苗一般含有穩(wěn)定劑，如肌醇(inisitol)或甘露醇(manitol)，所述穩(wěn)定劑用于制備過(guò)程中。必要時(shí)，疫苗的稀釋劑可以是任何生理溶液。
在由主種子至疫苗病毒的各個(gè)增殖步驟中用于傳代的適當(dāng)培養(yǎng)基是例如無(wú)特定病原體(SPF)的雞蛋，特定抗體為陰性(SAN)的雞蛋，原代雞細(xì)胞或禽細(xì)胞系。
優(yōu)選本發(fā)明的疫苗含有上述新IBDV類活病毒。每只雞的有效劑量范圍約為102至106EID50，優(yōu)選約為103至105EID50，可以給剛出生1天的雞安全地在卵內(nèi)施用疫苗。
基于活I(lǐng)BDV的本發(fā)明疫苗優(yōu)選以凍干形式運(yùn)輸，并在使用前溶于水。
優(yōu)選通過(guò)如口服(在飲用水中或各自通過(guò)滴管)的腸途徑，眼鼻途徑或噴灑施用本發(fā)明的疫苗。
IBDV毒株9793的特征在于能在母體抗體水平≥500(通過(guò)IDDEXELISA測(cè)定)的鳥(niǎo)中誘導(dǎo)抗體，因?yàn)橄鄬?duì)于高毒力疫苗而言，它對(duì)粘液囊的損害較小。通常，只有所謂的“高毒力”疫苗和/或烈性野生型毒株才能在母體抗體水平≥500的鳥(niǎo)中誘導(dǎo)抗體。這些高毒力疫苗和野生型毒株會(huì)嚴(yán)重?fù)p害Fabricius的粘液囊，導(dǎo)致B淋巴細(xì)胞缺失。感染后通過(guò)測(cè)定粘液囊的大小發(fā)現(xiàn)IBDV毒株9793對(duì)粘液囊的損害較小。
因此，本發(fā)明另一方面提供了含有病毒株9793的疫苗，該毒株具有保藏毒株1-1810的一般性或特異性的特征，本發(fā)明還提供了含有衍生或形成自毒株9793，即衍生或形成自實(shí)際的保藏毒株或得自天然病毒的病毒的疫苗，本發(fā)明還提供了具有保藏毒株1-1810的一般性或特異性的特征的IBD病毒，或含有衍生或形成自毒株9793，即衍生或形成自實(shí)際的保藏毒株或得自天然病毒的病毒的疫苗。
下列實(shí)施例將闡明而不是限定本發(fā)明。
實(shí)施例1制備主種子病毒將2管毒株9793的種子材料重新懸浮于2.0ml蒸餾水中，將1ml該懸浮液轉(zhuǎn)移至9ml鹽水中以1/10稀釋該病毒懸浮液?；旌虾螅瑢?ml懸浮液轉(zhuǎn)移至58ml鹽水中以1/30稀釋此病毒懸浮液，得到約含有500EID50/0.1ml的懸浮液。使用裝有23G×1”針頭的1ml注射器經(jīng)由卵黃囊途徑各用0.1ml上述病毒懸浮液接種400個(gè)SAN雞蛋的胚。將雞蛋置于37℃保溫，24小時(shí)后對(duì)光檢查，49個(gè)胚死亡并被丟棄，接種48和72小時(shí)后，從雞蛋中挑除死胚(共340個(gè)雞蛋)并去頭。將它們集中并分成約50個(gè)胚一組，使用裝有小的可高壓滅菌的軸的Ystral攪拌器分開(kāi)勻漿各組的胚。將各個(gè)勻漿物倒在小水桶上的兩層紗布上，將每個(gè)過(guò)濾物轉(zhuǎn)移至分開(kāi)的Duran瓶中。在每瓶中加入約等于過(guò)濾物體積1/3的含有肌醇和甘露醇的穩(wěn)定劑，從每瓶中取出2或3ml樣品分別用于滴定或無(wú)菌試驗(yàn)。將瓶和樣品冷凍于-70℃中直至下一步處理過(guò)程。融化無(wú)菌瓶，集中并使用磁力攪拌器混合均勻。將總體積為496ml的主種子懸浮液分裝至管中，每管0.5ml，置于Edwards Lyomaster 4000中并凍干。真空下用橡皮塞將小管封口并用鋁盒密封。
實(shí)施例2制備工作種子將1管毒株9793的主種子病毒重新懸浮于1.0ml蒸餾水中，將0.2ml該懸浮液轉(zhuǎn)移至1.8ml鹽水中以1/10稀釋該病毒懸浮液?；旌虾螅瑢?ml懸浮液轉(zhuǎn)移至199ml鹽水中以1/200稀釋此病毒懸浮液，得到約含有104EID50/0.1ml的懸浮液。使用裝有23G×1”針頭的1ml注射器經(jīng)由卵黃囊途徑各用0.1ml上述病毒懸浮液接種650個(gè)SAN雞蛋的胚。將雞蛋置于37℃保溫，24和48小時(shí)后對(duì)光檢查，24小時(shí)后12個(gè)胚死亡，48小時(shí)后11個(gè)胚死亡，死亡的胚皆被丟棄，接種72小時(shí)后，從剩下的雞蛋中挑除胚胎并去頭。將它們集中并分成約60個(gè)胚一組，共分了10組。使用裝有小的可高壓滅菌的軸的Ystral攪拌器分開(kāi)勻漿各組的胚。將各個(gè)勻漿物倒在小水桶上的兩層紗布上，將每個(gè)過(guò)濾物轉(zhuǎn)移至分開(kāi)的Duran瓶中。在每瓶中加入約等于過(guò)濾物體積1/3的含有肌醇和甘露醇的穩(wěn)定劑，每瓶的終體積為50至60ml，從每個(gè)Duran瓶中取出1ml樣品，并集中在一起，混合后分成1ml等分試樣置于Nunc Cryotube中，儲(chǔ)存于-70℃用于隨后的滴定。從每個(gè)Duran瓶中再取出1ml等分試樣，各涂布于5％血瓊脂平板上以檢查是否無(wú)菌。將Duran瓶都儲(chǔ)存于-70℃中待用。14天后，每一個(gè)平板上都無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)，因此，所有10個(gè)等分試樣都可作為工作種子。
凍干并檢測(cè)工作種子融化各個(gè)工作種子等分試樣，集中之并在使用跟隨器(follower)的磁力攪拌器中混合均勻。在420個(gè)小管中各裝入1ml病毒懸浮液，將小管置于Modulyo凍干器中，凍干14小時(shí)，然后密封小管并從清潔室中取出小管。將各個(gè)小管的頂端卷曲，使用Edwards放電檢測(cè)器檢測(cè)所有小管的真空狀況。
制備疫苗根據(jù)上述方法由工作種子制備疫苗材料本身，在疫苗材料中加入穩(wěn)定劑(肌醇，甘露醇)。
實(shí)施例3疫苗的安全性根據(jù)下文所解釋的兩種方法免疫1天齡小雞后，檢測(cè)根據(jù)實(shí)施例1制備的疫苗的安全性。
粘液囊/體重比根據(jù)下式，粘液囊大小被表示為粘液囊/體重比(BBR)BBR＝粘液囊重量(g)×1000/體重(g)粘液囊損害評(píng)分由顯微鏡檢查所見(jiàn)的損害被判斷如下稱重后，將取下的粘液囊固定于4％福爾馬林中以在荷蘭Doorn的PHC進(jìn)行顯微鏡檢，評(píng)分結(jié)果概述于表2。
表2
通過(guò)噴灑用9793疫苗免疫各為30只鳥(niǎo)的組，對(duì)照除外。免疫后3周，將每組中一半的鳥(niǎo)殺死，測(cè)定BBR。免疫后3周免疫攻擊每組剩下的一半鳥(niǎo)，使用高毒力的野生型毒株(D6948E，得自荷蘭，Deventer動(dòng)物衛(wèi)生研究所)進(jìn)行免疫攻擊，免疫攻擊后10-12天，殺死這些鳥(niǎo)并測(cè)定BBR。用顯微鏡檢查免疫免疫攻擊前和免疫攻擊后選定數(shù)目的組中的粘液囊，測(cè)定損害分?jǐn)?shù)。
結(jié)果BBRBBR測(cè)定的結(jié)果概述于表3，這些結(jié)果表明免疫后相對(duì)于對(duì)照的％BBR平均值約為60，因此，可以得出結(jié)論疫苗病毒對(duì)粘液囊的損害非常溫和。另外，免疫攻擊病毒對(duì)經(jīng)免疫鳥(niǎo)的粘液囊顯然沒(méi)有影響，而對(duì)照鳥(niǎo)中，對(duì)粘液囊顯然有相當(dāng)大的損害。得自對(duì)照鳥(niǎo)的后一數(shù)據(jù)實(shí)際上進(jìn)一步證實(shí)了野生型病毒和烈性疫苗毒株所提供的前一數(shù)據(jù)。
表3
*未經(jīng)免疫的對(duì)照實(shí)施例4免疫后的血清反應(yīng)用實(shí)施例3所用的鳥(niǎo)進(jìn)行這些研究，對(duì)5或6天齡的鳥(niǎo)取血樣，2-5天后根據(jù)Kouwenhoven式(B.Kouwenhoven和J.van den Bosch；第19屆國(guó)際家禽會(huì)議記錄匯編，1992，p465-468)計(jì)算各個(gè)滴度，然后將鳥(niǎo)分成不同的滴度組并進(jìn)行免疫，過(guò)3或4周，取血樣檢查血清轉(zhuǎn)變。
結(jié)果這些研究的結(jié)果概述于表5，這些數(shù)據(jù)進(jìn)一步證實(shí)了本發(fā)明疫苗的高效性，高水平的母體抗體不會(huì)干擾免疫。Kouwenhoven(文獻(xiàn)同上)給出了中度+毒株能突破的ELISA滴度約為500，本發(fā)明的疫苗輕易地突破了高水平的母體抗體，從而誘導(dǎo)了血清轉(zhuǎn)變。
表5
*未免疫的對(duì)照；“ND”表示未測(cè)定。
實(shí)施例5取1天齡雞的血樣以使用上述Kouwenhoven式計(jì)算免疫時(shí)間。
建立兩個(gè)試驗(yàn)A和B以確定毒株9793對(duì)死亡率的影響。試驗(yàn)A中，取1天齡，14天(用毒株9793免疫的那天)，21，28和35天齡雞的血樣，試驗(yàn)B中，取1天齡，11天(用毒株9793免疫的那天)，21， 28和35天齡雞的血樣。
在兩個(gè)實(shí)驗(yàn)中，一組針對(duì)IBD免疫，另一組用作對(duì)照，每組由1500個(gè)雞組成。
免疫當(dāng)天，針對(duì)新城疫(ND)和傳染性粘液囊炎(IB)免疫所有的雞，所用疫苗是Poulvac NDW(新城疫疫苗)和Poulvac IB Primer(含有毒株H120和D274的傳染性粘液囊炎疫苗)，通過(guò)粗糙的噴灑進(jìn)行免疫。對(duì)ND和IB通過(guò)HI試驗(yàn)進(jìn)行血清學(xué)研究，對(duì)IBD通過(guò)IDEXX ELISA進(jìn)行血清學(xué)研究，監(jiān)測(cè)最終的死亡率。有關(guān)血清學(xué)的數(shù)據(jù)示于表6A和6B(試驗(yàn)97-62A和97-62B)。
死亡率如下試驗(yàn)A針對(duì)IBD免疫(組1)＝7％未經(jīng)免疫的對(duì)照(組2)＝6.4％試驗(yàn)B針對(duì)IBD免疫(組2)＝2.8％未經(jīng)免疫的對(duì)照(組1)＝5.1％試驗(yàn)B表明IBD9793可突破母體抗體＞500，在試驗(yàn)A中，免疫當(dāng)天的母體抗體低于500。IB和ND的血清學(xué)數(shù)據(jù)未顯示出IBD9793可免疫抑制對(duì)IB或ND的體液抗體應(yīng)答，死亡率數(shù)據(jù)也闡明疫苗是安全的。表6A.對(duì)NDV，IBV M41和IBV D274的平均HI抗體滴度和對(duì)IBDV的平均ELISA抗體滴
1使用單向ANOVA的組與因子組之間的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性差異(P≤0.05)表6B針對(duì)ND，IB M41，IB D274和IBD的平均抗體滴度
1使用單向ANOVA的組與因子組之間的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性差異(P≤0.05)
權(quán)利要求
1.能保護(hù)家禽免受傳染性粘液囊炎感染的疫苗，其特征在于含有傳染性粘液囊炎病毒，該病毒具有通過(guò)施用于雞可導(dǎo)致表示為粘液囊/體重比的粘液囊大小降低55％以下和能保護(hù)具有至少約為500 ELISA抗體滴度的家禽的聯(lián)合特性。
2.含有具有病毒株9793的特征的傳染性粘液囊炎病毒的疫苗，所述毒株的樣品已保藏于巴斯德研究所的國(guó)立微生物保藏中心，保藏號(hào)為1-1810。
3.權(quán)利要求1的疫苗，其特征在于傳染性粘液囊炎病毒具有保藏物1-1810的特征。
4.權(quán)利要求1或2的疫苗，其特征在于傳染性粘液囊炎病毒是病毒株9793，所述毒株的樣品已保藏于巴斯德研究所的國(guó)立微生物保藏中心，保藏號(hào)為1-1810。
5.權(quán)利要求1至3任一項(xiàng)的疫苗，其特征在于傳染性粘液囊炎病毒是衍生或形成自病毒株9793的病毒，所述毒株的樣品已保藏于巴斯德研究所的國(guó)立微生物保藏中心，保藏號(hào)為1-1810。
6.上述權(quán)利要求任一項(xiàng)的疫苗，其特征在于每劑該疫苗含有病毒的量為102至106EID50。
7.權(quán)利要求6的疫苗，其特征在于每劑該疫苗含有病毒的量為103至105EID50。
8.傳染性粘液囊炎病毒，其特征在于具有通過(guò)施用于雞可導(dǎo)致表示為粘液囊/體重比的粘液囊大小降低55％以下和能保護(hù)具有至少約為500 ELISA抗體滴度的家禽的聯(lián)合特性。
9.具有病毒株9793的特征的傳染性粘液囊炎病毒，所述毒株的樣品已保藏于巴斯德研究所的國(guó)立微生物保藏中心，保藏號(hào)為1-1810。
10.權(quán)利要求8的傳染性粘液囊炎病毒，其特征在于傳染性粘液囊炎病毒具有保藏物1-1810的特征。
11.權(quán)利要求8或9的傳染性粘液囊炎病毒，其特征在于傳染性粘液囊炎病毒是病毒株9793，所述毒株的樣品已保藏于巴斯德研究所的國(guó)立微生物保藏中心，保藏號(hào)為1-1810。
12.權(quán)利要求8至10任一項(xiàng)的傳染性粘液囊炎病毒，其特征在于傳染性粘液囊炎病毒是衍生或形成自病毒株9793的病毒，所述毒株的樣品已保藏于巴斯德研究所的國(guó)立微生物保藏中心，保藏號(hào)為1-1810。
全文摘要
本發(fā)明涉及能保護(hù)家禽免受傳染性粘液囊炎感染的疫苗,其特征在于含有傳染性粘液囊炎病毒,該病毒具有通過(guò)施用于雞可導(dǎo)致表示為粘液囊/體重比的粘液囊大小降低55%以下和能保護(hù)具有至少約為500ELISA抗體滴度的家禽的聯(lián)合特性,本發(fā)明還涉及具有上述特征的病毒。
文檔編號(hào)A61P37/04GK1246800SQ98802234
公開(kāi)日2000年3月8日 申請(qǐng)日期1998年1月29日 優(yōu)先權(quán)日1997年2月3日
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