專利名稱：含有鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶b亞基的藥物組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及含有鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶B亞基(CaNB)的藥物組合物。
鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶(Calcineurin，CaN)是目前所知唯一依賴鈣，鈣調(diào)素(calmodulin，CaM)的蛋白磷酸酶。70年代末，80年代初首先在哺乳動(dòng)物腦內(nèi)發(fā)現(xiàn)并得到純化。后來在人，兔的非神經(jīng)組織乃至某些腫瘤細(xì)胞中均有發(fā)現(xiàn)。CaN的分子量是80KD，由催化亞基A(61KD)和調(diào)節(jié)亞基B(19KD)按1∶1組成。(Klee，C B et al.，The calmodulin regulated proteinphosphatase molecular aspects of cellular regulation，1988，Vol 5，p225)。
CaNA亞基是全酶催化和調(diào)節(jié)的核心。生物化學(xué)研究表明，它至少包含了4個(gè)結(jié)構(gòu)域與金屬離子的結(jié)合區(qū)(或催化區(qū))，與調(diào)節(jié)亞基B(CaNB)的結(jié)合區(qū)，與調(diào)節(jié)劑CaM的結(jié)合區(qū)及自抑制區(qū)。催化部位在A亞基上的最有力證據(jù)是將A，B二亞基分離后，A亞基仍表現(xiàn)出蛋白磷酸酶的活性。CaN在蛋白磷酸酶分類中屬絲氨酸/蘇氨酸蛋白磷酸酶。命名為蛋白磷酸酶2B，其催化亞基A和此家族的其他成員特別是蛋白磷酸酶1，2A等有很高的同源性。這主要發(fā)生在它們的催化區(qū)域，因此它們的催化機(jī)制極其相似。但每種磷酸酶有著不同的調(diào)節(jié)區(qū)域和亞基，因而產(chǎn)生出結(jié)構(gòu)和功能的差異。CaNA亞基與其他磷酸酶不同的是它的C末端多出170個(gè)氨基酸序列，此序列為B亞基結(jié)合區(qū)，CaM結(jié)合區(qū)和自抑制區(qū)，它們都與調(diào)節(jié)CaN磷酸酶的活性有關(guān)。
人的CaNB亞基由169個(gè)氨基酸組成，它是鈣結(jié)合蛋白家族中的一員，其一級(jí)結(jié)構(gòu)與CaM，肌鈣蛋白C等非常相似，與CaM的序列有31％-35％的同源性。并也有4個(gè)EF手的鈣結(jié)合區(qū)域。鈣離子結(jié)合區(qū)的氨基酸序列有更為高度的保守性。CaNB亞基與CaM的空間結(jié)構(gòu)也極其相似，都包括了兩個(gè)球型的，分別含有2個(gè)結(jié)合鈣的結(jié)構(gòu)域和連接兩個(gè)結(jié)構(gòu)域的中心α螺旋。與CaM不同的是CaM的兩個(gè)球型鈣結(jié)構(gòu)域位于中心α螺旋的兩側(cè)，而CaNB亞基的兩個(gè)球型鈣結(jié)構(gòu)域通過中心螺旋在85位甘氨酸處發(fā)生急劇轉(zhuǎn)變，連同C末端的β鏈形成了一個(gè)疏水凹槽。使這兩個(gè)球型鈣結(jié)構(gòu)域覆蓋在其上側(cè)，而CaNA亞基的B亞基結(jié)合中心螺旋(BBH)中的疏水氨基酸就結(jié)合在這個(gè)疏水凹槽中，成為CaNA，B二亞基結(jié)合的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。(Kissinger，CR et al.，Nature，1995，378；641；Griffith，JPet al.，Cell，1995，82507)。另一個(gè)與CaM不同的是CaNB亞基N末端的甘氨酸上連接有一個(gè)十四碳的脂肪?；鶊F(tuán)。B亞基不具有蛋白磷酸酶的活力，但對(duì)于維持CaN酶活性是高度專一的。雖然CaNB亞基和CaM對(duì)CaNA亞基的活性具有協(xié)同調(diào)節(jié)作用，但二者對(duì)酶活力的調(diào)節(jié)是不可互相代替的。目前所知最主要的一點(diǎn)是B亞基通過降低催化亞基A對(duì)底物的Km來調(diào)節(jié)CaN的活性。(Perrino，BA et al.，J.Biol.Chem.，1996，270340)。
CaN是保守蛋白，廣泛分布在真核生物中。從人，大鼠，小鼠，豬，蛙，魚，雞等的腦勻漿中以及人，兔等的非神經(jīng)組織中均檢出了CaN。從果蠅胚囊粗提物中檢出了B亞基，但沒有檢出A亞基。在海膽卵中發(fā)現(xiàn)了一種受CaM調(diào)節(jié)的蛋白磷酸酶，它與CaN有著相同的亞基組成，它的小亞基與CaN的B亞基有著相似的肽圖譜，但它的大亞基肽圖譜與CaNA亞基的肽圖譜不同(Klee，CB et al.，Adv.Enzymol.，1987，61149)。表明B亞基比A亞基更具保守性。
我們?cè)眯∈驝aN抗體檢測人腦及其他腫瘤中的CaN，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在我們檢測的一些腫瘤如人腦膠質(zhì)瘤，腦膜瘤等中均有B亞基的存在，含量還相當(dāng)可觀。但A亞基很不明顯。小鼠H22肝癌腹水中CaNA，B二亞基均能檢測到，但B亞基量大于A亞基。(魏群等，生物化學(xué)雜志，1993，9240)。CaN在腫瘤組織中的存在和作用還值得進(jìn)一步研究和探討。
從分子生物學(xué)研究來看，已經(jīng)從人，大鼠，小鼠，兔腦等組織的基因文庫中分離到幾個(gè)CaN cDNA克隆，真核組織中CaNA有3種基因編碼，分別命名為CaNAα，β，γ。其中Aα，Aβ分別定位在人類4號(hào)和10號(hào)(10q21-q22)染色體上，CaNB亞基高度保守，目前只發(fā)現(xiàn)一種CaNB基因，定位于人的2號(hào)染色體(2p16-p15)上。(Wang，MG et al.，Cytogenet.CellGenet.，1996，72236)。
CaNA，B兩亞基哺乳動(dòng)物的cDNA雖早在80年代末，90年代初就已經(jīng)問世，但在大腸桿菌中如何表達(dá)出高含量，有活性的酶卻遲遲不能解決，有在昆蟲細(xì)胞或其他細(xì)胞中表達(dá)的，有表達(dá)出來以包涵體形式存在的，純化步驟繁雜，得率很少?；駻，B兩亞基共同表達(dá)。而我們進(jìn)行了CaNA，B兩亞基在大腸桿菌中的分別表達(dá)，尤其是CaNB亞基的表達(dá)量極大，純化步驟極其簡單。人CaNB亞基和大鼠，牛等哺乳動(dòng)物均同源，這些均為CaNB亞基的藥用奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。
CaN有許多重要的生物學(xué)功能。由于它是唯一依賴鈣，鈣調(diào)素的蛋白磷酸酶，所以在鈣離子信號(hào)傳遞涉及其底物可逆磷酸化的生理，病理過程中都起著重要的作用。又因CaN在腦內(nèi)的極高含量，許多腦內(nèi)功能都與之有關(guān)。目前最引人注目的是它和學(xué)習(xí)記憶，老年性癡呆等的關(guān)系。最近發(fā)現(xiàn)CaN又是T細(xì)胞活化中的關(guān)鍵酶。
CaN是T細(xì)胞活化中關(guān)鍵酶的證據(jù)是證明了它是不同免疫抑制藥物如FK506，環(huán)胞霉素A等的體內(nèi)共同靶酶，而且已研究了它在T細(xì)胞活化中的作用。研究表明轉(zhuǎn)錄因子NF-AT是CaN的底物，而且證明了CaN和NF-AT是結(jié)合成復(fù)合物從胞漿轉(zhuǎn)移到核內(nèi)的(Shibasaki，F(xiàn) et al.，Nature，1996，382370)。NF-AT在核內(nèi)的作用已很清楚，它結(jié)合于白介素2(IL-2)基因啟動(dòng)子區(qū)，促使IL-2的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，IL-2再從細(xì)胞中分泌出來，結(jié)合于T細(xì)胞表面的IL-2受體，從而刺激T細(xì)胞的增殖。
目前進(jìn)行的CaN生物功能研究都是基于CaN具有蛋白磷酸酶活性這一特性，進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)大部分是在CaNA，B二亞基共同參與下完成的，少數(shù)實(shí)驗(yàn)是在CaNA亞基或CaNA亞基的突變體單獨(dú)存在時(shí)完成的。有論文對(duì)CaNB亞基在完成生物功能中的作用有所論述，特別是免疫抑制劑FK506和FKBP-12及環(huán)胞霉素A和其結(jié)合蛋白與CaN結(jié)合時(shí)有人認(rèn)為B亞基起了重要作用(Li，W et al.，J.Biol.Chem.，1993，26814040；Milan D，et al.，Cell，1994，79437；Kawamura A et al.，J.Biol.Chem.，1995，27015463；Griffith，JP et al.，Cell，1995，82507)，但認(rèn)為在此作用中仍需要CaNA的參與。目前為止沒有看到用CaNB亞基單獨(dú)注入體內(nèi)產(chǎn)生生理效應(yīng)的報(bào)導(dǎo)，更沒有看到CaNB亞基能作為抗癌藥及生物反應(yīng)調(diào)節(jié)劑的報(bào)導(dǎo)。
機(jī)體免疫狀態(tài)與腫瘤發(fā)生發(fā)展有著密切的關(guān)系，Burnet于1970年提出免疫監(jiān)視的概念。其主要論點(diǎn)是“免疫功能部分是作為阻止體細(xì)胞突變產(chǎn)生癌細(xì)胞的機(jī)制而進(jìn)化的。”即哺乳動(dòng)物主要是通過T淋巴細(xì)胞來識(shí)別和消滅體內(nèi)癌變的。近年來關(guān)于人及動(dòng)物腫瘤的抗原性，抗腫瘤效應(yīng)細(xì)胞以及腫瘤細(xì)胞逃避機(jī)體免疫監(jiān)視等研究有了進(jìn)一步的進(jìn)展，表明機(jī)體對(duì)發(fā)揮免疫監(jiān)視作用的效應(yīng)細(xì)胞除T細(xì)胞外，還有其他細(xì)胞的參與，抗腫瘤的免疫功能除針對(duì)腫瘤相關(guān)抗原外，也可對(duì)癌細(xì)胞的其他異常表現(xiàn)產(chǎn)生反應(yīng)，并認(rèn)為，機(jī)體免疫功能受損則易患腫瘤。而且目前研究表明，免疫功能的受損主要是由于免疫調(diào)節(jié)失常引起的。
近代免疫學(xué)進(jìn)展告訴我們，包括人類在內(nèi)的一切動(dòng)物，它們的免疫功能是由一個(gè)極其復(fù)雜而又十分精確的調(diào)節(jié)系統(tǒng)來調(diào)節(jié)的，稱為免疫調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)。在這個(gè)免疫調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)中，除神經(jīng)系統(tǒng)和內(nèi)分泌系統(tǒng)的調(diào)節(jié)因素外，就免疫系統(tǒng)本身，按其功能可分為兩類一類調(diào)節(jié)細(xì)胞及其產(chǎn)物能增強(qiáng)免疫反應(yīng)，稱向上調(diào)節(jié)，另一類調(diào)節(jié)細(xì)胞及其產(chǎn)物是降低免疫反應(yīng)的稱為向下調(diào)節(jié)。正常機(jī)體的免疫系統(tǒng)就依賴于向上和向下調(diào)節(jié)的機(jī)制對(duì)來自體內(nèi)外的各種刺激作出精確的反應(yīng)，并維持機(jī)體的免疫功能處于動(dòng)態(tài)平衡之中。如果由于某種原因如腫瘤生長，或衰老，病毒，慢性感染，化療等因素的影響，干擾或破壞調(diào)節(jié)的平衡，使免疫功能低下。如我們能使他們的免疫功能向上調(diào)節(jié)，就必然有利于這些疾病的控制和改善。免疫調(diào)節(jié)藥物就是從不同的側(cè)面通過調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫功能而發(fā)揮治療作用的。其中我們把來自生物體本身的一類免疫調(diào)節(jié)物質(zhì)叫生物反應(yīng)調(diào)節(jié)劑。
基礎(chǔ)研究表明，CaN是T細(xì)胞活化中的關(guān)鍵酶，也是現(xiàn)知免疫抑制藥物FK506，環(huán)胞霉素A的體內(nèi)靶酶，CaNB亞基在免疫抑制劑和其結(jié)合蛋白與CaN結(jié)合時(shí)起了重要作用。CaNB亞基的保守性很強(qiáng)，人，牛，大鼠等哺乳動(dòng)物CaNB亞基的氨基酸序列均相同。
本發(fā)明的目的是提供一種通過調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)治療哺乳動(dòng)物疾病的藥物組合物，它含有有效量的CaNB亞基。
所述藥物組合物可含有藥學(xué)上可接受的載體和/或賦形劑。
所述的哺乳動(dòng)物疾病是指可通過調(diào)節(jié)哺乳動(dòng)物的免疫反應(yīng)得到治療的疾病，例如，腫瘤，病毒慢性感染，衰老，放療等使免疫功能低下，及其它一些由于免疫功能紊亂造成的疾病。
所說的哺乳動(dòng)物可以是人，小鼠等。治療小鼠體內(nèi)腫瘤的有效量為每只小鼠10-200μg/天(或人的臨床劑量為100-2000μg/kg體重/天)，施用一次或多次。對(duì)施用途徑?jīng)]有特別限制，可以是靜脈內(nèi)，腹膜內(nèi)等，并且最好是連續(xù)多天施用。
本文所述的CaNB亞基具有如下的氨基酸序列1GNEASYPLEM CSHFDADEIK RLGKRFKKLD LDNSGSLSVE EFMSLPELQQ51 NPLVQRVIDI FDTDGNGEVD FKEFIEGVSQ FSVKGDKEQK LRFAFRIYDM101 DKDGYISNGE LFQVLKMMVG NNLKDTQLQQ IVDKTIINAD KDGDGRISFE151 EFCAVVGGLD IHKKMVVDV上述序列中一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基的加入，缺失或替換，或者一個(gè)或多個(gè)氨基酸側(cè)鏈的化學(xué)修飾后的功能衍生物，只要它基本上保留了CaNB亞基生物學(xué)活性也可以用于本發(fā)明的藥物組合物中。
我們的體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，CaNB亞基直接作用于大鼠脾淋巴細(xì)胞，能使之增殖4-7倍，并與有絲分裂原Con.A對(duì)淋巴細(xì)胞的刺激有明顯的協(xié)同作用，62.5mg CaNB亞基能使可的松的免疫抑制效應(yīng)逆轉(zhuǎn)88％。小鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)也表明CaNB亞基能刺激重要免疫器官脾的增生，顯示了CaNB亞基是一種較好的向上調(diào)節(jié)免疫功能的免疫調(diào)節(jié)藥物或生物反應(yīng)調(diào)節(jié)劑。
CaNB亞基的體內(nèi)抗腫瘤作用表現(xiàn)尤為明顯，能明顯減少H22腹水肝癌小鼠的腹水生長，并使荷瘤小鼠生命延長50-83％，同樣劑量的CaNB亞基能使S180實(shí)體瘤抑制57％以上，與對(duì)照組相比，結(jié)果均具有顯著差異。
CaNB亞基的小鼠急性毒性實(shí)驗(yàn)表明，其毒性較小。用有效劑量的4-50倍進(jìn)行小鼠急性毒性實(shí)驗(yàn)，被試小鼠24小時(shí)內(nèi)均無一只死亡。
本發(fā)明是建立在我們已完成了有活性的人CaNB亞基在大腸桿菌中大量表達(dá)和純化的基礎(chǔ)上將其單獨(dú)直接藥用的結(jié)果，并進(jìn)行了CaNB亞基及功能衍生物的應(yīng)用工作。
實(shí)施例實(shí)施例1 CaNB亞基質(zhì)粒的構(gòu)建和表達(dá)CaNB亞基的cDNA來自大鼠腦cDNA文庫(Perrino B et al.，J.Biol.Chem.，1996，270340)，通過5’引物5’-CCGCCATATGGGAAATGAGGCGAGTT-3’和3’引物5’-CGCGGGATCCTCACACATCTACCACCA-3’經(jīng)PCR擴(kuò)增，在瓊脂糖凝膠電泳上分離PCR產(chǎn)物，于NdeI和BamHI酶切后，經(jīng)T4DNA連接酶裝入pet21a表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化到感受態(tài)E.coli菌株BL21(DE3)plysS中，保存于含氨芐青霉素50μg/ml的LB瓊脂培養(yǎng)板，挑取單菌落預(yù)培養(yǎng)，將預(yù)培養(yǎng)液加入含50μg/ml含氨芐青霉素的TM培養(yǎng)基中，37℃搖床以250rpm保溫培養(yǎng)5-6小時(shí)，4500rpm，20分鐘離心，棄上清，收獲菌體。實(shí)施例2CaNB亞基剪切體及突變體的構(gòu)建和表達(dá)。
CaNB亞基剪切體及近N，C末端突變體的構(gòu)建采用對(duì)所需改變基因特定引物設(shè)計(jì)后的PCR擴(kuò)增及在瓊脂糖凝膠電泳中產(chǎn)物的分離。CaNB亞基遠(yuǎn)離N，C末端的基因的定點(diǎn)突變，采用promega公司的pAlter突變質(zhì)粒系統(tǒng)進(jìn)行構(gòu)建。表達(dá)系統(tǒng)同野生型。實(shí)施例3CaNB亞基的制備1.超聲破碎菌體按1升菌體培養(yǎng)液的1/10-1/20體積加入緩沖液(20mmol/L tris，pH7.4，1mmol/L EDTA，0.2mmol/L PMSF，1mmol/Lβ巰基乙醇)，然后以輸出功率40％破碎細(xì)胞，時(shí)間為2-3分鐘。
2.分離純化破碎后菌體經(jīng)100℃沸水浴3040分鐘，然后經(jīng)12000rpm離心20分鐘，取上清，此為CaNB亞基的粗提液。按體積加3mmol/L CaCl2.1mmol/L β巰基乙醇和0.5Mol/LNacl后上預(yù)先經(jīng)緩沖液(20mmol/L tris，pH7.4，0.5mmol/L CaCl21mmol/Lβ巰基乙醇，)平衡的Phenel-SepharoseCL-4B層析柱，再用同樣的緩沖液洗盡雜蛋白，最后用緩沖液20mmol/Ltris，pH7.4，1mmol/L EGTA，0.5mmol/L DTT洗脫，每升菌液可得電泳純CaNB亞基～120mg，所得產(chǎn)物可冷凍干燥保存。實(shí)施例4CaNB亞基的檢測鑒定，質(zhì)量控制及使用方法1.DNA序列測定由507個(gè)核苷酸組成，與文獻(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)人CaNB亞基cDNA相同。
2.氨基酸測序測序N末端10個(gè)氨基酸為GNEASYPLRM。證明是人CaNB亞基蛋白，與文獻(xiàn)一致。查證大鼠CaNB亞基和人CaNB亞基序列完全相同。
3.純度分析SDS-PAGE鑒定，純度為98％以上。
4.物理化學(xué)性質(zhì)鑒定等電點(diǎn)4.8，光吸收值ε277nm1％＝3.15.濃度測定用紫外分光光度法。
6.鑒別實(shí)驗(yàn)CanB亞基抗體免疫印跡陽性，紫外吸收光譜。
7.生物活性激活CaNA亞基。
8.性狀及使用方法CaNB亞基為水溶性，水中溶解度大，水溶液無色，澄清。可在生理鹽水或中性pH的緩沖液中(可加甘露醇)冷凍干燥保存2年以上，臨用前用少量生理鹽水或緩沖液溶解即可。實(shí)施例5 CaNB亞基的體內(nèi)抗腫瘤實(shí)驗(yàn)1.H22腹水肝癌防治實(shí)驗(yàn)。延長小鼠存活期及劑量試驗(yàn)BALB/C小鼠，雄性，20±1g，用藥組小鼠腹腔分別注射CaNB亞基10，100，200μg/0.2ml/天/只小鼠，對(duì)照組小鼠注射PBS 0.2ml/天/只小鼠，2天后注射1×106H22腹水癌細(xì)胞，同時(shí)繼續(xù)注射CaNB亞基和PBS共7天，觀察小鼠存活期。生命延長率按以下公式計(jì)算，
結(jié)果如下組別 平均存活天數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤生命延長率 t測驗(yàn)對(duì)照組 19.5±0.7610μgCaNB 24.6±3.35 26％ ＜0.2100μgCaNB 29.2±1.36 50％ ＜0.001組別 平均存活天數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤生命延長率 t測驗(yàn)對(duì)照組 18.75 0.5200μgCaNB 34.25 4.6 82.7％ ＜0.0012.抗H22腹水肝癌，延長小鼠存活期治療實(shí)驗(yàn)BALB/C小鼠，雄性，20±1g腹腔注射1×107H22腹水癌細(xì)胞，2天后分二組，分別注射CaNB亞基200μg/0.2ml/天/只小鼠(給藥組)和PBS 0.2ml/天/只小鼠。(對(duì)照組)，觀察小鼠存活期。結(jié)果如下組別 平均存活天數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤生命延長率t測驗(yàn)對(duì)照組 19.0±1.6給藥組 29.0±8.9 52.6％ ＜0.0253.抗S180實(shí)體瘤治療試驗(yàn)取S180腹水癌小鼠腹水按1∶3 PBS稀釋后。對(duì)每只實(shí)驗(yàn)動(dòng)物昆明種小鼠，雄性，20±1g，于腋窩皮下接種0.2ml(約1×107細(xì)胞)。接種后隨機(jī)分組，第4天(大部分瘤已能看到)分別在腹腔注射PBS 0.2ml/天/只小鼠。(對(duì)照組)和CaNB亞基100μg/0.2ml/天/只小鼠(給藥組)，共7天，停藥24小時(shí)后處死動(dòng)物，解剖剝離瘤塊及脾，并稱重，計(jì)算藥物對(duì)瘤的抑制率。按以下公式計(jì)算，
結(jié)果如下組別 平均脾重±標(biāo)準(zhǔn)誤 增重率t測驗(yàn)平均瘤重±標(biāo)準(zhǔn)誤抑制率 t測驗(yàn)對(duì)照組0.25±0.09 1.38±0.66給藥組0.32±0.0825.5％＜0.10.59±0.39 57.1％ ＜0.01實(shí)施例6CaNB亞基的體外細(xì)胞免疫實(shí)驗(yàn)1.CaNB亞基對(duì)大鼠脾淋巴細(xì)胞增殖的直接影響常規(guī)無菌分離大鼠脾淋巴細(xì)胞，用1640培養(yǎng)液制成5×106/ml細(xì)胞懸液，將細(xì)胞0.2ml植入96孔培養(yǎng)板中(5×105細(xì)胞/孔)，加入CaNB亞基(0，2.5，12.5，62.5μg/ml)，37℃，5％二氧化碳條件下培養(yǎng)48小時(shí)，加入3HdR(0.5μCi/孔)繼續(xù)培養(yǎng)8-16小時(shí)，用多頭細(xì)胞收集器將細(xì)胞收集到玻璃纖維濾膜上，烘干后加液閃液，用液閃計(jì)數(shù)儀測定cpm值，比較給藥前后的差異。以增殖倍數(shù)表示，按以下公式計(jì)算，
結(jié)果如下劑量 cpm±標(biāo)準(zhǔn)誤增殖倍數(shù)t測驗(yàn)0(對(duì)照組) 467±812.5μgCaNB亞基 375±2512.5μg CaNB亞基1704±194 3.7 ＜0.001625μgCaNB亞基 3041±390 6.5 ＜0.0012.CaNB亞基與有絲分裂原Con.A對(duì)大鼠脾淋巴細(xì)胞增殖的協(xié)同作用實(shí)驗(yàn)方法基本同實(shí)施例6-1，在96孔培養(yǎng)板中加入細(xì)胞懸液后，在加入CaNB亞基的同時(shí)，還加入免疫刺激劑，有絲分裂原Con.A 5ug/ml，同上培養(yǎng)后，觀察CaNB亞基與有絲分裂原Con.A的協(xié)同增殖作用。結(jié)果如下劑量cpm±標(biāo)準(zhǔn)誤 增殖率t測驗(yàn)0(對(duì)照組) 158000±32002.5μg CaNB亞基155000±700012.5μg CaNB亞基174000±520010.2％＜0.00162.5μg CaNB亞基192000±360021.8％＜0.0013.CaNB亞基對(duì)可的松免疫抑制作用的逆轉(zhuǎn)效應(yīng)實(shí)驗(yàn)方法基本同實(shí)施例6-1，在96孔培養(yǎng)板中，加入細(xì)胞懸液后，先加入免疫刺激劑Con.A5ug/ml和可的松10-7mmol/L，然后再加CaNB亞基，反應(yīng)后觀察CaNB亞基對(duì)可的松免疫抑制作用的逆轉(zhuǎn)效應(yīng)。
結(jié)果如下劑量cpm±標(biāo)準(zhǔn)誤增殖逆轉(zhuǎn)率t測驗(yàn)0(對(duì)照組) 66400±45002.5μg CaNB亞基63500±280012.5μg CaNB亞基79300±400019.4％＜0.00162.5μg CaNB亞基125000±5100 87.9％＜0.001實(shí)施例7CaNB亞基的小鼠急性毒性實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物BALB/C小鼠，雄性，20±1g。結(jié)果如下組別(劑量) 數(shù)量死亡數(shù)量0-24小時(shí)24-48小時(shí)48小時(shí)-1個(gè)月正常劑量4倍(0.4mg/0.2ml/只小鼠)4 00 0正常劑量20倍(2mg/0.2ml/只小鼠) 4 00 0正常劑量50倍(5mg/0.2ml/只小鼠) 8 03 0
權(quán)利要求
1.一種治療哺乳動(dòng)物疾病的藥物組合物，它含有治療這種疾病有效量的CaNB亞基和/或其功能衍生物。
2.按照權(quán)利要求1的藥物組合物，其特征在于，它是通過調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)治療哺乳動(dòng)物疾病的。
3.按照權(quán)利要求1所述的藥物組合物，其特征在于，所述藥物組合物還含有藥學(xué)上可接受的載體和/或賦形劑。
4.按照權(quán)利要求1所述的藥物組合物，其特征在于，所述的哺乳動(dòng)物疾病是一種可通過調(diào)節(jié)哺乳動(dòng)物的免疫反應(yīng)得到治療的疾病。
5.按照權(quán)利要求3所述的藥物組合物，其特征在于，所述的哺乳動(dòng)物疾病是腫瘤疾病。
6.按照權(quán)利要求1所述的藥物組合物，其特征在于，所述的哺乳動(dòng)物是人。
7.按照權(quán)利要求1所述的藥物組合物，其特征在于，所述的哺乳動(dòng)物是小鼠，治療其體內(nèi)腫瘤的有效量為每只小鼠10-200μg/天。
8.鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶B亞基在制備治療哺乳動(dòng)物疾病的藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種通過調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)治療哺乳動(dòng)物疾病的藥物組合物,它含有治療這種疾病有效量的CaNB亞基和/或其功能衍生物。
文檔編號(hào)A61K38/46GK1245720SQ9811764
公開日2000年3月1日 申請(qǐng)日期1998年8月26日 優(yōu)先權(quán)日1998年8月26日
發(fā)明者魏群, 嚴(yán)明山, 高欽山, 姜國華, 連慕蘭, 陳燕 申請(qǐng)人:北京師范大學(xué)