專利名稱：碳化樹脂dna免疫吸附劑的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及醫(yī)用吸附材料，特別是一種免疫吸附劑。將活性物質(zhì)DNA固定到載體材料碳化樹脂上，得到DNA免疫吸附劑，可用于血液灌流治療系統(tǒng)性紅斑狼瘡。
系統(tǒng)性紅斑狼瘡(簡(jiǎn)稱SLE)是一種自身免疫性疑難病癥，臨床上尚無有效療法，病因不詳，患者往往因全身重要器官衰竭而死亡，死亡率較高。
使用DNA免疫吸附劑對(duì)患者進(jìn)行血液灌流，是近十幾年來發(fā)展起來的新型療法。Jones,Frank R(EP 0 272 792 A1,1987)對(duì)這種方法作了詳細(xì)說明。DNA免疫吸附劑的吸附作用是依靠DNA對(duì)致病物質(zhì)抗DNA抗體的特異識(shí)別作用，清除患者血液中的致病物質(zhì)，緩解病情，改善患者的免疫功能，從而逐漸恢復(fù)健康。本法療效顯著，目前日益受到臨床醫(yī)學(xué)的重視。
美國(guó)的Terman DS等[Lancet,1979,2(8147):824-7]，首次使用活性炭為載體材料，采用火棉膠包膜固定DNA，得到的DNA免疫吸附劑用于血液灌流治療一名重度SLE患者，使患者生命延長(zhǎng)了31天。從此開辟了免疫吸附療法治療SLE的新紀(jì)元。Terman的吸附劑由于使用活性炭作載體，機(jī)械強(qiáng)度和耐磨性較差，易脫落微小顆粒，堵塞毛細(xì)血管。所以，楊彥等[中國(guó)生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)報(bào)，1985,4(2):88-95；高等學(xué)校化學(xué)學(xué)報(bào)，1985,6(9):843-847]采用日本碳化樹脂為載體，用火棉膠包膜固定DNA，DNA預(yù)先用氯化四氮唑蘭(BT)絡(luò)合。得到的DNA免疫吸附劑機(jī)械強(qiáng)度大大提高，DNA不脫落。該吸附劑在中國(guó)成功地應(yīng)用于臨床治療SLE，療效顯著。但是臨床應(yīng)用中發(fā)現(xiàn)，病人存在寒顫現(xiàn)象，說明吸附劑存在熱源物質(zhì)。另外，有待改進(jìn)包膜條件，提高吸附劑的吸附性能。進(jìn)口碳化樹脂價(jià)格昂貴，有必要自行研制碳化樹脂，降低成本，有利于免疫吸附劑臨床推廣應(yīng)用。
本發(fā)明的目的是提供一種改進(jìn)的碳化樹脂DNA免疫吸附劑的制備方法。載體材料的結(jié)構(gòu)性能、血液相容性直接影響DNA免疫吸附劑的使用性能，本發(fā)明降低載體材料成本，改進(jìn)碳化樹脂包膜法固定DNA的包膜條件，提高吸附劑的吸附性能。制備過程不引入熱源物質(zhì)，得到符合臨床醫(yī)用要求的高效免疫吸附劑。
本發(fā)明首先從單體苯乙烯、二乙烯苯和丙烯腈開始，通過采用超大量致孔劑和嚴(yán)格的反應(yīng)條件合成三元共聚超大孔樹脂，在500-800℃高溫下碳化得到碳化樹脂。碳化樹脂經(jīng)過酸、堿、乙醇處理后烘干，利用火棉膠包膜法，將小牛胸腺DNA固定于碳化樹脂表面，成為DNA免疫吸附劑，DNA含量為0.3-0.5mg/ml樹脂。最后經(jīng)過淋洗、漂洗、烘干，滅菌、包裝等后處理，得到可直接用于臨床的碳化樹脂DNA免疫吸附劑。
將本發(fā)明制備的DNA免疫吸附劑裝入特制吸附罐，經(jīng)消毒處理成為醫(yī)用吸附裝置。血液從患者動(dòng)脈引出，流經(jīng)吸附裝置，患者血液中的致病物質(zhì)被DNA免疫吸附劑吸附，潔凈的血液從靜脈流回患者體內(nèi)，灌流過程為2-3小時(shí)。血液灌流與血液透析相似，安全、簡(jiǎn)便、費(fèi)用低。
現(xiàn)將本發(fā)明詳細(xì)描述如下1．碳化樹脂制備將5.0-7.5％w/w苯乙烯，10.0-12.5％w/w二乙烯苯，7.5-10.0％w/w丙烯腈，50.0％w/w甲苯混合均勻。加入0.15-0.3％w/w引發(fā)劑過氧化苯甲酰，溶解后加入25.0％w/w液體石蠟，充分混合均勻，成為有機(jī)相，致孔劑(甲苯和液體石蠟)是單體總量的三倍。在3000ml三口瓶中，加入2倍于有機(jī)相體積的1-2％聚乙烯醇溶液，水浴加熱至50℃。將有機(jī)相加入到反應(yīng)瓶中，攪拌，升溫至80℃，反應(yīng)3-5小時(shí)。升高水浴溫度至90-100℃，蒸餾甲苯。100℃煮球2小時(shí)，過濾，用熱蒸餾水洗滌樹脂數(shù)遍。50℃烘干，用石油醚淋洗或加熱提取，除去致孔劑液體石蠟，得到三元共聚超大孔樹脂。用標(biāo)準(zhǔn)篩篩選0.45-1.0mm合格樹脂。
在管式電阻爐中加入大孔樹脂，100-300℃預(yù)燒8-10小時(shí)，在N2氣保護(hù)下，以100℃/小時(shí)的速度升溫至500-800℃，在此溫度下通入水蒸汽，活化0.5-1.0小時(shí)，自然冷卻至室溫。得到0.45-0.9mm碳化樹脂約350ml。
將得到的碳化樹脂用2倍體積的5％鹽酸煮沸30分鐘，用二次蒸餾水洗至中性。再用2倍體積的5％氫氧化鈉煮沸30分鐘，用二次蒸餾水淋洗至中性。50℃烘干。用熱無水乙醇提取24小時(shí)，烘干備用。
2．碳化樹脂DNA免疫吸附劑的制備(1)．DNA溶液配制高純度小牛胸腺DNA溶解于0.2mol/L Tris-HCl(pH=7.4)緩沖溶液中，濃度為4mg/ml。依次加入等體積氯化四氮唑蘭飽和水溶液和等體積無水乙醇，攪拌或振蕩至完全溶解。
(2)水棉膠配制5％火棉膠乙醚溶液用無水乙醚稀釋7.4倍。
(3)包膜將19-20％v/vDNA溶液與21.4-22.9v/v火棉膠混合均勻，在攪拌下倒入57.1-59.5％v/v碳化樹脂，攪拌均勻，液體被迅速吸干。在50-60℃熱水浴上恒溫1-2小時(shí)，不時(shí)攪拌，50℃真空干燥2小時(shí)。用高純度注射用水漂洗和淋洗，至流出液在260nm處的紫外吸收為0.000。50℃真空干燥數(shù)小時(shí)，即得成品碳化樹脂DNA免疫吸附劑。
本發(fā)明制備的碳化樹脂DNA免疫吸附劑裝入吸附罐中，共250ml，密封后消毒。使用前用無菌生理鹽水浸泡30分鐘以上，再用3000ml無菌生理鹽水沖洗。在患者股動(dòng)脈和臂靜脈插管，灌流前10-20分鐘靜脈注入肝素1-1.5mg/kg體重。整個(gè)灌流系統(tǒng)保溫37℃。接通動(dòng)靜脈開始灌流，流速由50ml/min逐漸增加至200ml/min。于動(dòng)脈端取血，測(cè)定DNA抗體、免疫復(fù)合物及其它生化指標(biāo)。
本發(fā)明采用新的工藝合成方法合成了性能優(yōu)良的免疫吸附劑載體材料碳化樹脂，首先采用超大量致孔劑(致孔劑用量為單體和交聯(lián)劑總量的三倍)，嚴(yán)格控制引發(fā)劑用量和升溫速度，即嚴(yán)格控制聚合速度。另外，快速蒸餾出致孔劑甲苯，這樣才能最終得到具有超大孔和大比表面積的樹脂。碳化過程的預(yù)燒、程序升溫、碳化溫度和水蒸氣活化至關(guān)重要，直接影響和決定碳化樹脂的收率和結(jié)構(gòu)性能。本發(fā)明制備的碳化樹脂具有適宜的孔徑和比表面積(孔徑20～35，比表面積800～1200m2/ml)，是制備DNA免疫吸附劑的優(yōu)良載體材料，同時(shí)具有非常好的血液相容性，對(duì)血小板和紅細(xì)胞白細(xì)胞的破壞率很低，臨床應(yīng)用結(jié)果也證明本發(fā)明碳化樹脂的優(yōu)越性能。
本發(fā)明制備的碳化樹脂DNA免疫吸附劑，已在全國(guó)17個(gè)城市28家醫(yī)院進(jìn)行了150多例床應(yīng)用，有效率達(dá)98％?；颊卟粌H延長(zhǎng)了生命，而且恢復(fù)了健康和勞動(dòng)能力。表1和表2分別列舉了部分SLE臨床報(bào)告。如表1所示，十名患者經(jīng)血液灌流后，血液中的致病物質(zhì)抗ds-DNA抗體的濃度明顯降低，尿蛋白、血沉和抗核抗體滴度均明顯改善。除一人死亡外(存活38個(gè)月)，其余9人已存活32個(gè)月以上，恢復(fù)了生活和勞動(dòng)能力。另外如表2所示，通過對(duì)5名SLE患者進(jìn)行多次血液灌流治療發(fā)現(xiàn)，患者血液生化指標(biāo)、臨床癥狀越來越改善，特別是患者經(jīng)治療后，均停止服用任何激素類藥物，其中4人目前已分別存活9,12,24,24(隨訪日期至1996年底)，只有1人在存活一年后死于綜合癥。這表明DNA免疫吸附劑療法不僅能緩解病情，而且能改善患者免疫系統(tǒng)功能，保持長(zhǎng)期療效，并有治愈的可能。
實(shí)施例1．將45.0g苯乙烯，60.0g二乙烯苯，45.0g丙烯腈，甲苯300.0g混合均勻，加入1.5g引發(fā)劑過氧化苯甲酰，溶解后加入160.0g液體石蠟，充分混合均勻。于3000ml三口瓶中，加入1％聚乙烯醇水溶液1150ml，水浴加熱至50℃，將上述單體溶液倒入反應(yīng)瓶，攪拌，在1小時(shí)內(nèi)使反應(yīng)液升溫至80℃。反應(yīng)5小時(shí)。升高水浴溫度至90℃以上，蒸餾甲苯約1小時(shí)，直到不再有甲苯蒸出為止。100℃煮球2小時(shí)，過濾，用熱蒸餾水洗滌數(shù)遍，除去聚乙烯醇。50℃烘干。用石油醚(60-90℃)淋洗樹脂，除去致孔劑液體石蠟。用標(biāo)準(zhǔn)篩篩選0.45-1.0mm范圍的合格樹脂，約400ml。
實(shí)施例2．在管式電阻爐中加入1000ml上述樹脂，200℃預(yù)燒10小時(shí)后，在N2氣保護(hù)下，以100℃/小時(shí)的速度升溫至800℃，在此溫度下通入水蒸汽活化1小時(shí)，自然冷卻至室溫，得到約350ml 0.45-0.9mm的合格碳化樹脂。比表面積1000-1200m2/g，平均孔徑20-35。
實(shí)施例3．采用實(shí)施例2的方法和步驟，碳化溫度改為580℃，產(chǎn)品比表面積僅100m2/g左右。
實(shí)施例4．采用實(shí)施例2的方法和步驟，水蒸汽活化0.5小時(shí)，產(chǎn)品比表面積為800-1000m2/g。
實(shí)施例5．采用實(shí)施例2的方法和步驟，不經(jīng)過200℃預(yù)燒，產(chǎn)品收率低，不足200ml。
實(shí)施例6．取實(shí)施例2制得的碳化樹脂250ml，用2倍體積的5％鹽酸煮沸30分鐘，用重蒸水漂洗至中性。再用2倍體積的5％氫氧化鈉溶液煮沸30分鐘，用重蒸水漂洗、淋洗至中性。50℃烘干。在提取裝置內(nèi)用無水乙醇回流24小時(shí)，烘干備用。
所用溶液均用注射用水配制，使用純化DNA。在潔凈無菌的環(huán)境下操作，目的是保證產(chǎn)品無熱源。
于1000ml燒杯中加入80ml小牛胸腺DNA溶液(DNA溶解在0.2MpH=7.4的Tris-HCl緩沖溶液中，濃度為4mg/ml，然后依次加入等體積的氯化四氮唑蘭飽和水溶液和無水乙醇，攪拌至絮狀物完全溶解)，90ml火棉膠溶液(55ml5％火棉膠的乙醚溶液，用350ml無水乙醚稀釋)，在攪拌下加入250ml上述經(jīng)過預(yù)處理的碳化樹脂，迅速攪拌均勻，液體被很快吸干。在50-60℃熱水浴上，恒溫2小時(shí)，不時(shí)攪拌，至溶劑完全揮發(fā)。50℃真空干燥2小時(shí)。用注射用水漂洗數(shù)遍，裝入柱子淋洗，直到流出液在260nm處無紫外吸收。再漂洗數(shù)遍，50℃真空干燥，得到成品吸附劑。DNA含量為0.38mg/ml樹脂。用免子進(jìn)行熱源實(shí)驗(yàn)，產(chǎn)品無熱源。
實(shí)施例7．按實(shí)施例6的方法和條件進(jìn)行包膜，投料改為87.5ml小牛胸腺DNA溶液，100ml火棉膠溶液，250ml碳化樹脂。最終產(chǎn)品DNA含量為0.42mg/ml樹脂。
實(shí)施例8．按實(shí)施例6的方法和條件進(jìn)行包膜，只是全部使用重蒸水。如此所得的DNA免疫吸附劑經(jīng)免子實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)有明顯熱源反應(yīng)，產(chǎn)品有熱源。表1．10例SLE病例報(bào)告總結(jié)(隨訪至1998年2月)<
表2．5例SLE病例報(bào)告總結(jié)(隨訪至1996年底)
權(quán)利要求
1．一種碳化樹脂DNA免疫吸附劑的制備方法，它是使用碳化樹脂作為載體，固定有效量的DNA構(gòu)成，DNA含量為0.3-0.5mg/ml樹脂，其特征在于它是經(jīng)過下述步驟(1)．碳化樹脂的制備以苯乙烯和丙烯腈為單體，二乙烯苯為交聯(lián)劑，以三倍于單體和交聯(lián)劑(重量比)的甲苯和液體石蠟為致孔劑，過氧化苯甲酰為引發(fā)劑，分散介質(zhì)為1-2％聚乙烯醇水溶液，進(jìn)行懸浮聚合，80℃反應(yīng)5小時(shí)。于96℃蒸餾甲苯，100℃煮球3小時(shí)，用熱水洗滌，50℃烘干，石油醚淋洗脫蠟，得到三元共聚超大孔樹脂；將上述樹脂于管式電阻爐中100-300℃預(yù)燒8-10小時(shí)，在惰氣保護(hù)下，升溫至500-800℃，通入水蒸汽活化0.5-1.0小時(shí)，冷卻，即得碳化樹脂；(2)．碳化樹脂DNA免疫吸附劑的制備把小牛胸腺DNA溶液與火棉膠乙醚溶液混合均勻，在攪拌下加入經(jīng)過預(yù)處理的碳化樹脂，迅速攪拌，液體被很快吸干，在50-60℃熱水浴上，恒溫2小時(shí)，不時(shí)攪拌，至溶劑完全揮發(fā)，50℃真空干燥2小時(shí)，用水漂洗數(shù)遍，裝入柱子淋洗，直到流出液在260nm處無紫外吸收，再漂洗數(shù)遍，50℃真空干燥，得到成品吸附劑。
2．按照權(quán)利1所說的碳化樹脂DNA免疫吸附劑的制備方法，其特征在于各個(gè)物料配比為(1)．大孔樹脂的制備有機(jī)相由單體苯乙烯5.0-7.5％w/w，丙烯腈7.5-10.0％w/w，交聯(lián)劑二乙烯苯10.0-12.5％w/w，致孔劑甲苯50.0％w/w，液體石蠟25.0％w/w和0.15-0.3％w/w引發(fā)劑組成，引發(fā)劑過氧化苯甲酰為苯乙烯和二乙烯苯總量的0.5-1.0％，水相為1-2％聚乙烯醇溶液，有機(jī)相與水相的重量比為1/2；(2)．免疫吸附劑的制備碳化樹脂57.1-59.5％v/v,DNA溶液19-20％v/v，火棉膠乙醚溶液21.4-22.9％v/v,DNA濃度為1.33mg/ml，火棉膠濃度為0.68％。
全文摘要
本發(fā)明涉及醫(yī)用吸附材料,特別是一種免疫吸附劑。本發(fā)明從苯乙烯、二乙烯苯和丙烯腈開始,通過采用超大量致孔劑和嚴(yán)格的反應(yīng)條件合成三元共聚超大孔樹脂,在500—800℃高溫下碳化得到碳化樹脂,經(jīng)過酸、堿、乙醇處理后烘干,利用火棉膠包膜法,將小牛胸腺DNA固定于碳化樹脂表面,成為DNA免疫吸附劑,DNA含量為0.3—0.5mg/ml樹脂。本發(fā)明得到的碳化樹脂DNA免疫吸附劑,可直接用于血液灌流治療系統(tǒng)性紅斑狼瘡,是一種新型療法,經(jīng)過近200例臨床應(yīng)用,療效顯著,無毒副作用,無熱源。是一種良好的醫(yī)用血液凈化吸附材料。
文檔編號(hào)A61P37/02GK1209548SQ9810235
公開日1999年3月3日 申請(qǐng)日期1998年6月8日 優(yōu)先權(quán)日1998年6月8日
發(fā)明者俞耀庭, 陳長(zhǎng)治, 孔德領(lǐng) 申請(qǐng)人:南開大學(xué)