專利名稱：球形纖維素dna免疫吸附劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及醫(yī)用吸附材料，特別是一種免疫吸附劑。將活性物質(zhì)DNA以化學(xué)鍵聯(lián)方式固定到載體材料球形纖維素上，成為DNA免疫吸附劑?？捎糜谘汗嗔髦委熛到y(tǒng)性紅斑狼瘡。
系統(tǒng)性紅斑狼瘡(簡(jiǎn)稱SLE)是一種自身免疫性疑難病癥，臨床上尚無(wú)有效療法，病因不詳，患者往往因全身重要器官衰竭而死亡，死亡率較高。
使用DNA免疫吸附劑對(duì)患者進(jìn)行血液灌流，是近十幾年來(lái)發(fā)展起來(lái)的新型療法。Jones，F(xiàn)rank R(EP 0 272 792 A1，1987)對(duì)這種方法作了詳細(xì)說(shuō)明。DNA免疫吸附劑的吸附作用是依靠DNA對(duì)致病物質(zhì)--抗DNA抗體的特異識(shí)別作用，清除患者血液中的致病物質(zhì)，緩解病情，改善患者的免疫功能，從而逐漸恢復(fù)健康。本法療效顯著，目前日益受到臨床醫(yī)學(xué)的重視。
美國(guó)的Terman DS等[Lancet，1979，2(8147)824-7]，首次使用活性炭為載體材料，采用火棉膠包膜固定DNA，得到的DNA免疫吸附劑用于血液灌流治療一名重度SLE患者，使患者生命延長(zhǎng)了31天。從此開(kāi)辟了免疫吸附療法治療SLE的新紀(jì)元。楊彥等[中國(guó)生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)報(bào)，1985，4(2)88-95]采用日本碳化樹(shù)脂為載體，用火棉膠包膜固定DNA。該吸附劑在中國(guó)成功地應(yīng)用于臨床治療SLE，療效顯著。
碳化樹(shù)脂通過(guò)火棉膠包膜固定化DNA，DNA鑲嵌在火棉膠膜內(nèi)，只有暴露在外的DNA片段起特異吸附作用，DNA的活性受到限制。所以越來(lái)越多的DNA免疫吸附劑采用化學(xué)鍵聯(lián)方式固定化DNA，使DNA分子鏈自由伸展，更好的發(fā)揮識(shí)別和結(jié)合作用。如Nagasawa采用葡聚糖凝膠共價(jià)鍵聯(lián)DNA，制備免疫吸附劑(Journal ofApplied Biochemistry，1985，7296-302)。
以球形纖維素為載體的DNA免疫吸附未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道。天然高分子材料纖維素具有良好的生物相容性，已在生物醫(yī)學(xué)材料領(lǐng)域獲得了廣泛應(yīng)用。研究開(kāi)發(fā)球形纖維素DNA免疫吸附劑，將具有良好的使用性能和應(yīng)用前景。朱伯儒[離子交換與吸附，1996，12(6)522-525]研究了球形纖維素的制備方法。本發(fā)明通過(guò)調(diào)節(jié)分散介質(zhì)的比重，改進(jìn)了球形纖維素的制備工藝。
本發(fā)明的目的是提供一種球形纖維素DNA免疫吸附劑，采用新型載體材料球形纖維素，通過(guò)共價(jià)鍵固定化DNA，制備新型DNA免疫吸附劑，利用纖維素的良好生物相容性和化學(xué)鍵聯(lián)DNA的高活性，使新型吸附劑具有更高的吸附性能和更好的臨床治療效果。
本發(fā)明首先從初始原料棉短絨開(kāi)始，將棉短絨依次經(jīng)過(guò)次氯酸鈉漂白、氫氧化鈉、二硫化碳處理，得到橙紅色粘稠溶液，即纖維素黃原酸酯衍生物。以氯苯和四氯化碳為分散介質(zhì)，采用懸浮法，80-95℃加熱固化1-3小時(shí)，得到球形纖維素。球形纖維素在堿性條件下用環(huán)氧氯丙烷活化，再與DNA溶液發(fā)生鍵合反應(yīng)，可得到球形纖維素DNA免疫吸附劑，DNA含量為0.5-3.0mg/ml樹(shù)脂。
現(xiàn)將本發(fā)明詳細(xì)描述如下1.球形纖維素的制備本發(fā)明是將棉短絨加入到8倍(重量比)1％NaOCl水溶液中，用HCl溶液調(diào)節(jié)pH＝7-8，滴加5％尿素，棉短絨被漂白，水洗、擠干。經(jīng)漂白的棉短絨在19％NaOH溶液中室溫浸泡2小時(shí)，擠干，放入廣口瓶中，加蓋，室溫下放置老化三天。取小樣，酸中和，水洗后烘干，計(jì)算實(shí)際干重。向老化后的堿棉花中加入計(jì)算量的二硫化碳[CS2毫升數(shù)＝堿棉花干重(克)/2]，密封，25℃振蕩5小時(shí)，得到橙紅色粘稠液體。根據(jù)堿棉干重，用6％NaOH溶液稀釋得到濃度為6-12％的粘膠液(此粘膠液不宜久置)。
于三口瓶中，加入75-100％w/w氯代苯，0-25％w/w四氯化碳，0.2％w/w油酸鉀，組成有機(jī)相分散介質(zhì)，攪拌30分鐘。稱取有機(jī)相1/3重量的粘膠液，向其中加入0-10％w/w的CaCO3(60μm)粉末作為致孔劑，攪拌均勻，攪拌下自漏斗中加到分散介質(zhì)中。緩慢升溫至85～95℃，反應(yīng)1-3小時(shí)。冷卻，倒去有機(jī)相，水洗，用0.5N HCl飽和CaCl2溶液(內(nèi)含20％NaCl)水解除去致孔劑CaCO3。水洗至中性，用標(biāo)準(zhǔn)篩收集0.45-0.9mm產(chǎn)品。
2.球形纖維素DNA免疫吸附劑的制備將球形纖維素、環(huán)氧氯丙烷和NaOH(0.4-3.0N)溶液混合，它們的體積比為1∶0.05-0.5∶0.32-8.0。30-50℃，反應(yīng)2-4小時(shí)。水洗至中性，除去未反應(yīng)環(huán)氧氯丙烷。環(huán)氧基含量達(dá)60-107％μmol/ml。
取環(huán)氧化球形纖維素，加入2倍體積DNA溶液(1.0-4.0mg/ml)，50-90℃，反應(yīng)6-24小時(shí)。依次用10倍體積的0.1M醋酸鹽緩沖溶液(pH＝4.0，含0.5M NaCl)，0.1M碳酸鹽緩沖溶液(pH＝9.0)分別淋洗兩次，再用20倍體積的0.1M硼酸鹽緩沖溶液(pH＝7.3)和1M NaCl溶液分別淋洗，最后用水淋洗，至流出液在260nm處無(wú)紫外吸收。采用磷鉬酸銨顯色法測(cè)定DNA固定量。本發(fā)明得到的球形纖維素DNA免疫吸附劑的DNA含量為0.5-3.0mg/ml。
本發(fā)明是國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目29674014。本發(fā)明制備的球形纖維素DNA免疫吸附劑，DNA固定量大大高于碳化樹(shù)脂DNA免疫吸附劑(0.3-0.5mg/ml)。用SLE病人血漿進(jìn)行靜態(tài)吸附實(shí)驗(yàn)，對(duì)致病抗體的吸附性能明顯優(yōu)于碳化樹(shù)脂DNA免疫吸附劑。
本發(fā)明突出的實(shí)質(zhì)性特點(diǎn)和顯著進(jìn)步，可通過(guò)下述實(shí)施例予以證明，但它們不是對(duì)本發(fā)明作任何限制。
實(shí)施例1.
100g棉短絨，加入800g 1％NaOCl水溶液，用1 N HCl調(diào)節(jié)pH＝7-8，滴加50g 5％尿素水溶液，棉短絨很快被漂白，水洗，擠于。加入600g 19％NaOH溶液，室溫下放置2小時(shí)，過(guò)濾，擠干。放入廣口瓶中加蓋，室溫下放置老化三天。取小樣10g，經(jīng)HCl酸中合、水洗、烘干，稱重1.45g，由此計(jì)算總干重為69.8g。向瓶中加入69.8/2＝34.9ml二硫化碳，密封，室溫振蕩5小時(shí)。得到橙紅色粘稠液，濃度為13.3％。用6％NaOH稀釋成6-12％不同濃度的粘膠液。
實(shí)施例2.
于1000ml三口瓶中，加入320g氯苯，40g四氯化碳，0.7g油酸鉀，攪拌30分鐘。稱取實(shí)施例1制備的9％粘膠液120g，攪拌下自漏斗慢慢加入三口瓶中，調(diào)節(jié)攪拌速度，使液滴分散均勻，粘徑合適。緩慢升高水浴溫度，在1小時(shí)內(nèi)升至90℃，在此溫度下保溫2.5小時(shí)。冷卻，傾去有機(jī)相，水洗。篩選0.45-0.9mm樹(shù)脂，約80ml。
實(shí)施例3.
分散介質(zhì)為270g氯苯，90g四氯化碳，在120g粘膠液中加入9.0g 60μm CaCO3粉末作為致孔劑，其它條件和方法與實(shí)施例2相同。得到的纖維素樹(shù)脂在0.5N HCl飽和CaCl2溶液(內(nèi)含20％NaCl)中水解，除去致孔劑CaCO3，水洗至中性。收集0.45-0.9mm合格樹(shù)脂，約90ml。在同樣條件下，如果分散介質(zhì)為360g氯苯，不用四氯化碳調(diào)節(jié)分散介質(zhì)比重，則極易發(fā)生粘連、結(jié)塊，造成收率低，樹(shù)脂不規(guī)則，或者合成失敗。
實(shí)施例4.
量取10ml實(shí)施例2合成的纖維素樹(shù)脂，吸干表面水，加入2.5ml環(huán)氧氯丙烷，12.0ml 2.5N NaOH。40℃反應(yīng)3小時(shí)。水洗至中性，除去未反應(yīng)環(huán)氧氯丙烷。經(jīng)測(cè)定環(huán)氯基團(tuán)的含量為90.0μmol/ml。
實(shí)施例5.
量取10ml實(shí)施例2合成的纖維素樹(shù)脂，加入5.0ml環(huán)氧氯丙烷，15ml 2.0N NaOH。其他同實(shí)施例4。環(huán)氧基團(tuán)含量為67.4μmol/ml。
實(shí)施例6.
取實(shí)施例4所得的環(huán)氧化球形纖維素10ml，加入20ml 1.5mg/ml DNA溶液，在80℃反應(yīng)24小時(shí)。依次用100ml 0.1M醋酸鹽緩沖溶液(pH＝4.0，內(nèi)含0.5M NaCl)，100ml0.1M碳酸鹽緩沖溶液(pH＝9.0)分別淋洗兩次，再用200ml 0.1M硼酸鹽緩沖溶液(pH＝7.3)和200ml 1M NaCl溶液分別淋洗，最后用水淋洗，直到流出液OD260nm＝0.000。采用磷鉬酸銨比色法測(cè)得DNA固定量為2.0mg/ml。
實(shí)施例7.
采用50℃，其它條件下實(shí)施例6相同。最終產(chǎn)品DNA固定量為0.5mg/ml。
權(quán)利要求
1.一種球形纖維素DNA免疫吸附劑，其特征在于它是使用球形纖維素作為載體材料，負(fù)載有效量的活性物質(zhì)DNA構(gòu)成，其中，DNA含量為0.5-3.0mg/ml樹(shù)脂。
2.權(quán)利要求1所述球形纖維素DNA免疫吸附劑的制備方法，其特征在于它是經(jīng)過(guò)下述步驟(1).球形纖維素的制備棉短絨首先用1％NaOCl水溶液漂白，再放入19％NaOH溶液中室溫浸泡2小時(shí)，擠干，密封，室溫下老化三天，取小樣測(cè)定干重，然后與計(jì)量的二硫化碳，25℃下反應(yīng)5小時(shí)，得到橙紅色粘稠液體；以氯代苯為分散介質(zhì)，用四氯化碳調(diào)節(jié)分散介質(zhì)比重，油酸鉀為分散劑，粘膠液中加入CaCO3粉末作為致孔劑，采用懸浮聚合方法，80～95℃反應(yīng)1-3小時(shí)，水洗，用0.5NHCl飽和CaCl2溶液(內(nèi)含20％NaCl)水解除去致孔劑CaCO3，水洗至中性，用標(biāo)準(zhǔn)篩收集0.45-0.9mm球形纖維素產(chǎn)品。(2)球形纖維素DNA固定化球形纖維素在堿性條件下，與環(huán)氧氯丙烷在30-50℃，反應(yīng)2-4小時(shí)，得到環(huán)氧化球形纖維素；環(huán)氧化球形纖維素與DNA溶液在50-90℃下反應(yīng)6-24小時(shí)，依次用醋酸鹽緩沖溶液、碳酸鹽緩沖溶液、硼酸鹽緩沖溶液和1M NaCl溶液分別淋洗，最后用水淋洗，至流出液在260nm處無(wú)紫外吸收，采用磷鉬酸銨顯色法測(cè)定DNA固定量。
3.按照權(quán)利要求2所述的球形纖維素DNA免疫吸附劑的制備方法，其特征在于各個(gè)物料配比為(1).球形纖維素的制備75-100％w/w氯代苯、0-25％w/w四氯化碳和0.2％w/w油酸鉀，組成有機(jī)相分散介質(zhì)；稱取有機(jī)相1/3重量的粘膠液，向其中加入0-10％w/w的CaCO3(60μm)粉末作為致孔劑，(2)球形纖維素DNA固定化球形纖維素、環(huán)氧氯丙烷和NaOH(0.4-3.0N)溶液的體積比為1∶0.05-0.5∶0.32-8.0；環(huán)氧化球形纖維素與2倍體積DNA溶液(1.0-4.0mg/ml)反應(yīng)。
4.權(quán)利要求1所說(shuō)的球形纖維素DNA免疫吸附劑的應(yīng)用，其特征在于它用于臨床血液灌流治療系統(tǒng)性紅斑狼瘡，特異性吸附患者血液中的致病物質(zhì)。
全文摘要
本發(fā)明涉及醫(yī)用吸附材料,特別是一種球形纖維素DNA免疫吸附劑。本發(fā)明是以棉短絨為原料,依次經(jīng)過(guò)次氯酸鈉漂白、氫氧化鈉、二硫化碳處理,得到橙紅色粘稠溶液,即纖維素黃原酸酯衍生物;以氯苯和四氯化碳為分散介質(zhì),采用懸浮法,85～95℃加熱固化1—3小時(shí),得到球形纖維素。球形纖維素在堿性條件下用環(huán)氧氯丙烷活化,再與DNA溶液發(fā)生反應(yīng),可得到球形纖維素DNA免疫吸附劑,DNA含量為0.5—3.0mg/ml樹(shù)脂;本發(fā)明制備的DNA免疫吸附劑在DNA固定量和吸附性能上優(yōu)于碳化樹(shù)脂DNA免疫吸附劑,用于治療疑難病系統(tǒng)性紅斑狼瘡,屬新一代產(chǎn)品。
文檔編號(hào)A61K47/38GK1199643SQ9810235
公開(kāi)日1998年11月25日 申請(qǐng)日期1998年6月8日 優(yōu)先權(quán)日1998年6月8日
發(fā)明者俞耀庭, 孫德領(lǐng), 陳長(zhǎng)治 申請(qǐng)人:南開(kāi)大學(xué)