專利名稱：重新構(gòu)建的人抗hm1.24抗體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及重新構(gòu)建的人抗HM1.24抗體和嵌合的抗HM1.24抗體及其編碼基因，生產(chǎn)所述抗體的方法以及所述抗體的用途。本發(fā)明的重新構(gòu)建的人抗體和嵌合抗體可用作藥劑，例如用于骨髓瘤。
背景技術(shù)：
人B細(xì)胞經(jīng)過(guò)各種根據(jù)表達(dá)的表面抗原種類分類的分化過(guò)程，并最終發(fā)育成熟為產(chǎn)生抗體的漿細(xì)胞。在其分化的最后階段，一方面，B細(xì)胞獲得產(chǎn)生胞質(zhì)免疫球蛋白的能力，另一方面諸如細(xì)胞表面免疫球蛋白、HLA-DR、CD20、Fc受體、補(bǔ)體C3受體等的B細(xì)胞相關(guān)的抗原消失(Ling,N.R.等，Ⅲ型白細(xì)胞(1986)第320頁(yè)，Oxford,UK,Oxford)。
目前，已有對(duì)于諸如抗PCA-1(Anderson,K.C.等，免疫學(xué)雜志(1983)130,1132)，抗PC-1(Anderson,K.C.等，免疫學(xué)雜志(1983)132,3172)，抗MM4(Tong,A.W.等，血液(1987)69,238)等的單克隆抗體識(shí)別漿細(xì)胞膜上的抗原的報(bào)道。但是，抗CD38單克隆抗體仍然用于檢測(cè)漿細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞(Epstein,J.等，新英格蘭醫(yī)學(xué)雜志，(1990)322,664,Terstappen,L.W.M.M.等，血液(1990)76,1739,Leo,R.等，血液學(xué)年鑒(1992)64,132,shimazaki,C.等，美國(guó)血液學(xué)雜志(1992)39,159,Hata,H.等，血液(1993)81,3357,Harada,H.等，血液(1993)81,2658,Billadeau,D.等，實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志(1993)178,1023)。
然而，抗CD38單克隆抗體是與T細(xì)胞激活相關(guān)的抗原而不是與B細(xì)胞分化相關(guān)的抗原，并且在包括除B細(xì)胞的多種細(xì)胞上表達(dá)。此外，盡管CD38在一些淋巴漿細(xì)胞樣細(xì)胞(lymphoplasmacytoid)上不表達(dá)，但是在造血前身細(xì)胞上大量表達(dá)。因此，認(rèn)為抗CD38單克隆抗體不適宜用于研究人B細(xì)胞的分化和成熟或用于治療漿細(xì)胞疾病。
Goto,T等已報(bào)道了識(shí)別在B細(xì)胞系上特異表達(dá)具有29至33Kda分子量的抗原的小鼠抗HM1.24抗體(血液(1994)84,1922-1930)。事實(shí)上認(rèn)為抗HM1.24單克隆抗體識(shí)別的抗原與B細(xì)胞的終末分化相關(guān)(Goto,T.等，日本臨床免疫學(xué)雜志(1992)16,688-691)，并且對(duì)漿細(xì)胞瘤移植的小鼠施用抗HM1.24抗體導(dǎo)致抗體在腫瘤處特異積累(shuji Ozaki等，第19次日本骨髓瘤研究大會(huì)會(huì)議集，總演講3)，因此建議放射性同位素標(biāo)記的抗HM1.24抗體可用于診斷腫瘤位置，導(dǎo)彈治療如放射免疫治療等。
此外，上述的血液雜志描述了抗HM1.24抗體對(duì)人骨髓瘤細(xì)胞系RPMI8226有補(bǔ)體依賴的細(xì)胞毒性活性。
骨髓瘤是腫瘤疾病，其特征在于單克隆漿細(xì)胞(骨髓瘤細(xì)胞)聚集在骨髓中。骨髓瘤是這樣的一種疾病，其中產(chǎn)生和分泌免疫球蛋白或漿細(xì)胞的終末分化的B細(xì)胞主要在骨髓中呈單克隆增加，并且因此在血清中可測(cè)出單克隆免疫球蛋白或其組成成份，L鏈或H鏈(Masaakikosaka等，Nippon Rinsho(1995)53,91-99)。
常規(guī)化療劑已用作治療骨髓瘤，但未發(fā)現(xiàn)可以引起骨髓瘤減少和延長(zhǎng)骨髓瘤病人存活期的有效治療試劑。因此，長(zhǎng)期以來(lái)骨髓瘤有治療效果的藥物的出現(xiàn)。
小鼠單克隆抗體在人體中有高免疫原性(有時(shí)稱作“抗原性”需要對(duì)。于是，小鼠單克隆抗體在人類中的醫(yī)用治療價(jià)值受到限制。例如，給人體施用的小鼠抗體可能被作為外源物質(zhì)代謝掉，致使人體中的小鼠抗體半衰期相對(duì)較短，因此不能充分發(fā)揮其預(yù)期效果。此外，對(duì)施用的小鼠抗體有抗性的人抗小鼠抗體可能引起對(duì)病人有害和危險(xiǎn)的免疫應(yīng)答，如血清疾病，其它過(guò)敏反應(yīng)等。因此，不能經(jīng)常給人類施用小鼠單克隆抗體。
為解決上述問(wèn)題，已開(kāi)發(fā)了減少諸如鼠源單克隆抗體的非人源抗體的免疫原性的方法。如這樣一個(gè)例子，有一種生產(chǎn)嵌合抗體的方法，其中抗體可變區(qū)(V區(qū))來(lái)自鼠，而其恒定區(qū)(C區(qū))來(lái)自適當(dāng)?shù)娜丝贵w。
因?yàn)檫@樣獲得的嵌合抗體包含完整形式的原始的小鼠抗體的可變區(qū)，預(yù)期具有與原始人鼠抗體一樣的與抗原結(jié)合特異性。此外，嵌合抗體中非人源的氨基酸序列的比率大大減少，因此預(yù)期抗體與原始的小鼠抗體相比有低免疫原性。嵌合抗體以與原始小鼠單克隆抗體相同的方式結(jié)合抗原，并且盡管減少了免疫原性，但可能包括針對(duì)小鼠可變區(qū)的免疫應(yīng)答(LoBuglio,A.F.等，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)，86,4220-4224,1989)。
盡管減小小鼠抗體免疫原性的第二種方法更復(fù)雜得多，但可以進(jìn)一步顯著減小小鼠抗體的潛在免疫原性。在此方法中，僅將小鼠抗體可變區(qū)的互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)移植到人抗體的可變區(qū)以制備“重新構(gòu)建的”人抗體可變區(qū)。
然而，為使重新構(gòu)建的人抗體可變區(qū)的CDR的結(jié)構(gòu)盡可能與原始的小鼠抗體的CDR結(jié)構(gòu)相似，如果需要，可將支持CDR的構(gòu)架區(qū)(FR)氨基酸序列的一部分從小鼠抗體的可變區(qū)移植到人抗體的可變區(qū)。然后，將人源化重新構(gòu)建的人抗體的這部分V區(qū)連接到人抗體的恒定區(qū)。最后在重新構(gòu)建人源化抗體中來(lái)自非人源氨基酸序列的部分是CDR和FR的一部分。CDR是由不表現(xiàn)種特異序列的高度可變的氨基酸序列構(gòu)成的。因此，攜帶小鼠CDR的人源化抗體不應(yīng)比具有人抗體CDR的天然人抗體的免疫原性強(qiáng)。
對(duì)于人源化抗體，參見(jiàn)Riechmann,L.等，自然，332,323-327,1988；Verhoeye,M.等，科學(xué)，239,1534-1536,1988；Kettleborough,C.A.等，蛋白質(zhì)工程，4,773-783,1991；Meada,H.等，人抗體和雜交瘤，2,124-134,1991；Groman,S.D.等，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)，88,4181-4185,1991；Tempest,P.R.等，生物/技術(shù)，9,266-271；1991；Co,M.S.等，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)，88,1869-2873,1991；Carter,P.等，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)，89,4285-4289,1992；Co,M.S.等，免疫學(xué)雜志，148,1149-1154,1992；及Sato,K.等，癌癥研究，53,851-856,1993。
Queen等(國(guó)際申請(qǐng)公開(kāi)號(hào)WO90-07861)描述了一種生產(chǎn)人源化抗體，抗IL-2受體抗體抗Tac的方法。然而，即使按照WO90-07861所述的方法也難以將所有抗體完全人源化。因此，WO90-07861沒(méi)有描述人源化抗體的通用方法，而僅僅描述了一種將抗IL-2受體抗體之一抗Tac抗體人源化的方法。此外，即使完全按照WO90-07861的方法，也難以制備具有與原始小鼠抗體完全相同活性的人源化抗體。
通常，每個(gè)抗體的CDR/FR氨基酸序列是不同的。因此，對(duì)于人源化抗體的構(gòu)建將要替代的氨基酸殘基的確定和可替代上述氨基酸殘基的氨基酸殘基的篩選隨特定抗體變化。所以，如WO90-07861所述的制備人源化抗體的方法不能應(yīng)用于所有抗體的人源化。
Queen等，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)，(1989)86,10029-10033具有與WO90-07861相似的公開(kāi)內(nèi)容。此文獻(xiàn)描述了根據(jù)如WO90-07861所述的方法生產(chǎn)的人源化抗體僅得到原始小鼠抗體的三分之一活性。換句話說(shuō)，這表明WO90-07861的方法本身不能生產(chǎn)與原始小鼠抗體活性相同的完全人源化抗體。
Co等，癌癥研究(1996)56,1118-1125由上述的Queen等的研究組公開(kāi)。此文獻(xiàn)描述了即使根據(jù)WO90-07861所述的生產(chǎn)人源化抗體的方法也不能構(gòu)建與原始小鼠抗體活性相同的人源化抗體。因此，事實(shí)不僅表明WO90-07861方法本身不能生產(chǎn)與原鼠抗體活性相同的完全人源化抗體，而且表明如WO90-07861所述的構(gòu)建人源化抗體的方法不能應(yīng)用于所有抗體的人源化。
Ohtomo等，分子免疫學(xué)(1995)32,407-416描述了小鼠ONS-M21抗體的人源化。此文獻(xiàn)揭示了用于WO90-07861中抗Tac抗體人源化的氨基酸殘基與活性無(wú)關(guān)并且不能使用如WO90-07861所述的方法。
Kettleborough等，蛋白質(zhì)工程(1991)4,773-783公開(kāi)了通過(guò)替代氨基酸殘基從小鼠抗體構(gòu)建幾個(gè)人源化抗體。但是，需要替代的氨基酸殘基比如WO90-07861所述的抗Tac抗體的人源化方法中建議的多。
前述文獻(xiàn)表明WO90-07861所述的生產(chǎn)人源化抗體的方法是僅適用于其中所述抗Tac抗體的技術(shù)并且即使使用該技術(shù)也不產(chǎn)生與原始小鼠抗體相同的活性。
這些文獻(xiàn)中所述的原始小鼠抗體具有不同于WO90-07861中所述的抗Tac抗體的氨基酸序列。于是，能用于抗Tac抗體的構(gòu)建人源化抗體的方法不能用于其它抗體。相似地，因?yàn)楸景l(fā)明的小鼠抗HM1.24抗體具有不同于抗Tac抗體的氨基酸序列，所以不能使用構(gòu)建抗Tac抗體的人源化抗體的方法。此外，本發(fā)明的成功構(gòu)建的人源化抗體具有不同于WO90-07861中所述的人源化抗Tac抗體的氨基酸序列。這一事實(shí)表明相同方法不能用于具有不同CDR-FR序列的抗體的人源化因此，即使用于人源化的原始小鼠抗體是已知的，也要在反復(fù)實(shí)驗(yàn)后可證實(shí)有活性的人源化抗體的CDR-FR序列的相同性。WO90-07861沒(méi)有提及本發(fā)明所構(gòu)建的人源化抗體中結(jié)合的FR序列以及從與FR、較少的CDR序列的結(jié)合得到有活性的人源化抗體這一事實(shí)。
如前述的，預(yù)期人源化抗體可用于治療目的，但是人源化的抗HM1.24抗體是未知的或未提及的。此外，沒(méi)有能普遍適用于任何抗體的人源化抗體生產(chǎn)的標(biāo)準(zhǔn)方法，并且需要用于構(gòu)建表現(xiàn)足夠結(jié)合活性、結(jié)合抑制活性和中和活性的人源化抗體的各種發(fā)明(例如，sato,K.等，癌癥研究，53,851-856,1993)。
發(fā)明公開(kāi)內(nèi)容本發(fā)明提供抗HM1.24抗體的重新構(gòu)建的抗體。本發(fā)明還提供在構(gòu)建所述重新構(gòu)建的抗體的方法中有用的人/小鼠嵌合抗體。本發(fā)明進(jìn)一步提供重新構(gòu)建的抗體的片段。此外，本發(fā)明提供生產(chǎn)嵌合抗體、重新構(gòu)建的抗體及其片段的表達(dá)系統(tǒng)。本發(fā)明進(jìn)一步提供生產(chǎn)抗HM1.24抗體的嵌合抗體及其片段和抗HM1.24抗體的重新構(gòu)建的抗體及其片段的方法。
更具體地，本發(fā)明提供特異識(shí)別具有SEQ ID No:103中所列出的氨基酸序列的多肽的嵌合抗體和重新構(gòu)建的抗體。將編碼所述多肽的cDNA插入pUC19載體的XbaⅠ切割位點(diǎn)間，并制備為質(zhì)粒pRS38-pUC19。按照布達(dá)佩斯條約條款，將包含質(zhì)粒pRS38-pUC19的大腸桿菌作為大腸桿菌DH5α(pRS38-pUC19)于1993年10月5日保存在國(guó)立生命科學(xué)和人體技術(shù)研究所，工業(yè)科學(xué)和技術(shù)代理處，MITI(Higashil-Chome 1-3,Tsukuba City,Ibalaki prefecture，日本)并得到保藏號(hào)為FERM BP-4434(見(jiàn)日本未審查的專利公開(kāi)號(hào)(Kokai)7-196694)。
作為這種嵌合抗體或重新構(gòu)建的抗體的一個(gè)實(shí)施方案，提及了嵌合的抗HM1.24抗體或重新構(gòu)建的人抗HM1.24抗體。以下將給出嵌合的抗HM1.24抗體或重新構(gòu)建的人抗HM1.24抗體的詳細(xì)描述。
因此，本發(fā)明還提供包含人輕(L)鏈恒定區(qū)(C區(qū))和抗HM1.24抗體的L鏈可變(V)區(qū)的嵌合L鏈，以及包含人重(H)鏈恒定區(qū)和抗HM1.24抗體的重(H)鏈V區(qū)的嵌合H鏈。
本發(fā)明進(jìn)一步提供包含以下部分的嵌合抗體(1)包含人L鏈C區(qū)和抗HM1.24抗體的L鏈V區(qū)的L鏈；和(2)包含人H鏈C區(qū)和抗HM1.24抗體的H鏈V區(qū)的H鏈。
本發(fā)明進(jìn)一步包括抗HM1.24抗體的重新構(gòu)建的人L鏈V區(qū)，包含(1)人L鏈V區(qū)的構(gòu)架區(qū)(FR)和(2)抗HM1.24抗體的L鏈V區(qū)的互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)；以及抗HM1.24抗體的重新構(gòu)建的人H鏈V區(qū)，包含(1)人H鏈V區(qū)的FR和(2)抗HM1.24抗體H鏈V區(qū)的CDR。
本發(fā)明進(jìn)一步提供抗HM1.24抗體的重新構(gòu)建的人L鏈，包含(1)人L鏈C區(qū)和(2)包含人L鏈FR和抗HM1.24抗體L鏈CDR的L鏈V區(qū)；以及抗HM1.24抗體的重新構(gòu)建的人H鏈，包含(1)人H鏈的C區(qū)，和(2)包含人H鏈FR和抗HM1.24抗體的H鏈CDR的H鏈V區(qū)。
本發(fā)明進(jìn)一步提供抗HM1.24抗體的重新構(gòu)建的人抗體，包含(A)L鏈，包含(1)人L鏈C區(qū)和(2)包含人L鏈的FR和抗HM1.24抗體的L鏈CDR的L鏈V區(qū)；以及(B)H鏈，包含(1)人H鏈C區(qū)和(2)包含人H鏈的FR和抗HM1.24抗體的H鏈CDR的H鏈V區(qū)。
本發(fā)明進(jìn)一步提供編碼抗HM1.24抗體的L鏈V區(qū)的DNA和編碼抗HM1.24抗體的H鏈V區(qū)的DNA。
本發(fā)明進(jìn)一步提供編碼嵌合L鏈的DNA，包含(1)人L鏈C區(qū)和(2)抗HM1.24抗體的L鏈V區(qū)；以及編碼嵌合H鏈的DNA，包含(1)人H鏈C區(qū)和(2)抗HM1.24抗體的H鏈V區(qū)。
本發(fā)明進(jìn)一步提供抗HM1.24抗體的重新構(gòu)建的人L鏈V區(qū)，包含(1)人L鏈V區(qū)的FR和(2)抗HM1.24抗體的L鏈V區(qū)的CDR；以及編碼抗HM1.24抗體的重新構(gòu)建的人H鏈V區(qū)的DNA，此V區(qū)包含(1)人H鏈V區(qū)的FR和(2)抗HM1.24抗體的H鏈V區(qū)的CDR。
本發(fā)明進(jìn)一步提供編碼抗HM1.24抗體的重新構(gòu)建的人L鏈的DNA，包含(1)人L鏈C區(qū)和(2)包含人L鏈的FR和抗HM1.24抗體L鏈的CDR的L鏈V區(qū)；以及編碼抗HM1.24抗體的重新構(gòu)建的人H鏈的DNA，包含(1)人H鏈C區(qū)和(2)包含人H鏈的FR和抗HM1.24抗體H鏈的CDR的H鏈V區(qū)。
本發(fā)明進(jìn)一步提供包含任意上述多種DNA的載體。
本發(fā)明進(jìn)一步提供用上述載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。
本發(fā)明還提供生產(chǎn)抗HM1.24抗體的嵌合抗體的方法，此方法包括培養(yǎng)用含有編碼所述嵌合L鏈的DNA的表達(dá)載體和含有編碼所述H鏈的DNA的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞以及回收所需抗體。
本發(fā)明進(jìn)一步提供生產(chǎn)抗HM1.24抗體的重新構(gòu)建的人抗體的方法，此方法包括培養(yǎng)用含有編述所述重新構(gòu)建的人L鏈的DNA的表達(dá)載體和含有編碼所述重新構(gòu)建的人H鏈的DNA的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞以及回收所需抗體。
本發(fā)明進(jìn)一步提供包含所述嵌合抗體或重新構(gòu)建的人抗體的藥物組合物，特別是骨髓瘤的治療劑。
本發(fā)明進(jìn)一步提供含有特異識(shí)別具有SEQ ID No:103所列出的氨基酸序列的多肽的嵌合抗體為活性成份的藥物組合物，以及含有特異識(shí)別具有如SEQ ID No:103所列出的氨基酸序列的多肽的重新構(gòu)建的人抗體為活性成份的藥物組合物。作為藥物組合物，特別提供骨髓瘤的治療劑。
附圖簡(jiǎn)述

圖1表示在使用人骨髓瘤細(xì)胞系KPMM2的FCM分析中與對(duì)照抗體相比，嵌合的抗HM1.24抗體的熒光強(qiáng)度與小鼠抗HM1.24抗體的熒光強(qiáng)度以相似的方式變化。
圖2表示在使用WISH細(xì)胞的細(xì)胞ELISA中，與小鼠抗HM1.24抗體相似的嵌合抗HM1.24抗體抑制生物素?；男∈罂笻M1.24抗體與WISH細(xì)胞以劑量依賴方式結(jié)合。
圖3表示對(duì)照的人IgG1或小鼠抗HM1.24抗體沒(méi)有細(xì)胞毒性而嵌合的抗-HM1.24抗體對(duì)E/T比例增加的RPMI8226細(xì)胞顯示細(xì)胞素性增強(qiáng)。
圖4是通過(guò)PCR方式中CDR移植構(gòu)建的重新構(gòu)建的人抗HM1.24抗體L鏈的方法圖示。
圖5是在制備重新構(gòu)建人抗HM1.24抗體H鏈中用PCR方法組裝RVH1,RVH2,RVH3和RVH4的寡聚核苷酸的方法圖解。
圖6是用PCR方法構(gòu)建人鼠雜交的抗HM1.24抗體H鏈V區(qū)的方法圖解。
圖7是用PCR方法構(gòu)建鼠人雜交的抗HM1.24抗體H鏈V區(qū)的方法圖解。
圖8表示重新構(gòu)建的人抗HM1.24抗體L鏈a型具有與嵌合抗HM1.24抗體相同的抗原結(jié)合活性。-1和-2表示為不同的批號(hào)。
圖9表示重新構(gòu)建的人抗HM1.24抗體和嵌合的抗HM1.24抗體的抗原結(jié)合活性，在重新構(gòu)建的人抗HM1.24抗體中L鏈的a型與H鏈的a,b,f或h型結(jié)合。
圖10表示重新構(gòu)建的人抗HM1.24抗體及嵌合的抗HM1.24抗體的結(jié)合活性，在重新構(gòu)建人抗HM1.24抗體中L鏈的b型與H鏈的a,b,f或h型結(jié)合。
圖11表示重新構(gòu)建的人抗HM1.24抗體及嵌合的抗HM1.24抗體的結(jié)合抑制活性，在重新構(gòu)建的人抗HM1.24抗體中L鏈的a型與H鏈的a,b,f或h型結(jié)合。
圖12表示重新構(gòu)建的人抗HM1.24抗體及嵌合的抗HM1.24抗體的結(jié)合抑制活性，在重新構(gòu)建的人抗HM1.24抗體中L鏈的b型與H鏈的a,b,f或h型結(jié)合。
圖13表示重新構(gòu)建的人抗HM1.24抗體H鏈的a,b,c和d型，以及嵌合的抗HM1.24抗體的抗原結(jié)合活性。
圖14表示重新構(gòu)建的人抗HM1.24抗體H鏈的a和e型，以及嵌合的抗HM1.24抗體的抗原結(jié)合活性。-1和-2表示不同的批號(hào)。
圖15表示重新構(gòu)建的人抗HM1.24抗體H鏈的a,c,p和r型，以及嵌合的抗HM1.24抗體的結(jié)合抑制活性。
圖16表示人鼠雜交的抗HM1.24抗體，鼠人雜交的抗HM1.24抗體，以及嵌合的抗HM1.24抗體的抗原結(jié)合活性。
圖17表示重新構(gòu)建的人抗HM1.24抗體H鏈的a,b,c或f型，以及嵌合的抗HM1.24抗體的抗原結(jié)合活性。
圖18表示重新構(gòu)建的人抗HM1.24抗體H鏈的a,g型以及嵌合的抗HM1.24抗體的抗原結(jié)合活性。
圖19表示重新構(gòu)建的人抗HM1.24抗體H鏈的a和g型以及嵌合的抗HM1.24抗體的結(jié)合抑制活性。
圖20表示重新構(gòu)建的人抗HM1.24抗體H鏈的h和I型以及嵌合的抗HM1.24抗體的抗原結(jié)合活性。
圖21表示重新構(gòu)建的人抗HM1.24抗體H鏈的f,h和j型以及嵌合的抗HM1.24抗體的抗原結(jié)合活性。
圖22表示重新構(gòu)建的人抗HM1.24抗體H鏈的h和I型以及嵌合的抗HM1.24抗體的結(jié)合抑制活性。
圖23表示重新構(gòu)建的人抗HM1.24抗體H鏈的f,h和j型以及嵌合的抗HM1.24抗體的結(jié)合抑制活性。
圖24表示重新構(gòu)建的人抗HM1.24抗體H鏈的h,k,l,m,n和o型以及嵌合的抗HM1.24抗體的抗原結(jié)合活性。
圖25表示重新構(gòu)建的人抗HM1.24抗體H鏈的a,h,p和q型以及嵌合的抗HM1.24抗體的抗原結(jié)合活性。
圖26表示重新構(gòu)建的人抗HM1.24抗體H鏈的h,k,l,m,n和o型以及嵌合的人抗HM1.24抗體與WISH細(xì)胞結(jié)合的抑制活性。
圖27表示重新構(gòu)建的人抗HM1.24抗體H鏈的a,h,p和q型以及嵌合的抗HM1.24抗體的結(jié)合抑制活性。
圖28表示重新構(gòu)建的人抗HM1.24抗體H鏈的a,c,p和r型和嵌合的抗HM1.24抗體的抗原結(jié)合活性。
圖29表示重新構(gòu)建的人抗HM1.24抗體S型與重新構(gòu)建的人抗HM1.24抗體的r型具有相同的抗原結(jié)合活性。
圖30表示重新構(gòu)建的人抗HM1.24抗體的類型與重新構(gòu)建的人抗HM1.24抗體的r型具有相同的結(jié)合抑制活性。
圖31表示純化的重新構(gòu)建的人抗HM1.24抗體與嵌合的抗HM1.24抗體具有相同的抗原結(jié)合活性。
圖32表示純化的重新構(gòu)建的人抗HM1.24抗體與嵌合的抗HM1.24抗體具有相同的結(jié)合抑制活性。
圖33表示在人骨髓瘤細(xì)胞移植的小鼠中，與施用對(duì)照人IgG1比較，施用嵌合的抗HM1.24抗體引起存活期的延長(zhǎng)。
圖34表示將來(lái)自健康人外周血的細(xì)胞用作效應(yīng)細(xì)胞時(shí)，對(duì)照人IgG1對(duì)KPMM2細(xì)胞無(wú)細(xì)胞毒性并且小鼠抗HM1.24抗體也有弱的細(xì)胞毒性，然而重新構(gòu)建的人抗HM1.24抗體對(duì)KPMM2細(xì)胞有強(qiáng)的細(xì)胞毒性。
圖35表示將來(lái)自健康人外周血細(xì)胞用作效應(yīng)細(xì)胞時(shí)，對(duì)照的人IgG1對(duì)ARH-77細(xì)胞無(wú)細(xì)胞毒性并且小鼠抗HM1.24抗體也有弱的細(xì)胞毒性，而重新構(gòu)建的人抗-HM1.24抗體對(duì)ARH-77細(xì)胞有強(qiáng)的細(xì)胞毒性。
圖36表示將來(lái)自SCID小鼠的骨髓細(xì)胞用作效應(yīng)細(xì)胞時(shí)，對(duì)照的人IgG1對(duì)KPMM2細(xì)胞無(wú)細(xì)胞毒性，而重新構(gòu)建的人抗HM1.24抗體對(duì)KPMM2細(xì)胞毒性隨抗體濃度的增加而增加。
圖37表示在人骨髓瘤細(xì)胞移植的小鼠中，施用對(duì)照人IgG1后血清IgG水平較施用前水平增加，而施用重新構(gòu)建的人抗HM1.24抗體抑制血清人IgG水平的增加。
圖38表示在人骨髓瘤細(xì)胞移植的小鼠中，與施用對(duì)照人IgG1比較，施用重新構(gòu)建的人抗HM1.24抗體會(huì)延長(zhǎng)存活期。
圖39表示在人骨髓瘤細(xì)胞移植的小鼠中，與施用前相比施用苯丙氨酸氮芥和對(duì)照人IgG1后的血清人IgG水平增加。
圖40表示在人骨骨髓瘤細(xì)胞移植的小鼠中，與施用苯丙氨酸氮芥或?qū)φ杖薎gG1相比，施用重新構(gòu)建的人抗HM1.24抗體會(huì)延長(zhǎng)存活期。
實(shí)施本發(fā)明的方法1．嵌合抗體的構(gòu)建(1)編碼小鼠抗-HM1.24單克隆抗體V區(qū)的DNA的克隆mRNA的制備用如胍超離心方法(Chirgwin,J.M.等，生物化學(xué)(1979),18,5294-5299),AGPC方法(Chomczynski,P，等，(1987)162,156-159)等已知方法從收獲的骨髓瘤中制備總RNA以便克隆編碼小鼠抗-HM1.24單克隆抗體V區(qū)的DNA，并可用寡脫氧胸苷酸纖維素離心柱等和mRNA純化試劑盒等(Pharmacia生產(chǎn))來(lái)制備mRNA。此外，使用QuickPrep mRNA純化試劑盒(Pharmacia生產(chǎn))可不經(jīng)過(guò)提取總RNA步驟制備mRNA。
cDNA的制備和擴(kuò)增用逆轉(zhuǎn)錄酶從上述mRNA制備方法中得到的mRNA來(lái)合成L鏈和H鏈的V區(qū)的cDNA。用AMV逆轉(zhuǎn)錄酶第一條鏈cDNA合成試劑盒合成L鏈V區(qū)的cDNA。將適當(dāng)?shù)囊锱c抗體基因的前導(dǎo)序列和C區(qū)雜交以擴(kuò)增所合成的cDNA(例如，MKV引物含有SEQ ID No:29至39所示的堿基序列，而MKC引物含有SEQ ID No:40所示的堿基序列)。
通過(guò)5’-RACE方法(Frohman,M.A.等，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)，85,8998-9002,1988,Belyavsky,A.等，核酸研究，17,2919-2932,1989)的PCR(聚合酶鏈反應(yīng))用5’-AmpliFINDER RACE試劑盒(CLONTECH)來(lái)合成和擴(kuò)增H鏈V區(qū)的cDNA。Ampli FINDER Anchor連接到上述合成的cDNA5’-端，并作為擴(kuò)增H鏈V區(qū)的引物，可以使用與錨定引物(SEQ ID No:77)和小鼠H鏈(如MHC22引物含有SEQ IDNo:42所示的堿基序列)恒定區(qū)(Cr區(qū))雜交的引物。
DNA純化及其堿基序列的測(cè)定用已知方法對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳以分離目的DNA片段，并回收和純化DNA，然后將其連接到載體DNA中。
用商業(yè)試劑盒(如GENECLEAN Ⅱ；BI0101)純化DNA?？捎靡阎d體DNA(如pUC19,Bluescript，等)保存DNA片段。
用已知的連接反應(yīng)試劑盒(由Takara Shuzo生產(chǎn))將上述DNA和DNA載體連接得到重組載體。在篩選氨芐青霉素抗性克隆并根據(jù)已知方法制備載體DNA后(J.Sambrook等，“分子克隆”，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社1989)，將得到的重組載體導(dǎo)入大腸桿菌JM109。在用限制性內(nèi)切酶消化上述載體DNA后，通過(guò)已知方法(如雙脫氧方法)測(cè)定目的DNA的堿基序列(J.Sambrook等，“分子克隆”，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社，1989)。根據(jù)本發(fā)明，可以用自動(dòng)測(cè)序系統(tǒng)(DNA測(cè)序儀373A；由ABI有限公司生產(chǎn))。
互補(bǔ)決定區(qū)H鏈V區(qū)和L鏈V區(qū)形成抗原結(jié)合位點(diǎn)，兩者整個(gè)結(jié)構(gòu)有相似特征。因而，四個(gè)構(gòu)架區(qū)(FR)中每一個(gè)構(gòu)架區(qū)與三個(gè)高變區(qū)即互補(bǔ)性決定區(qū)(CDR)連接。FR的氨基酸序列相當(dāng)保守而CDR區(qū)氨基酸序列的變異極高(Kabat,E.A.等，“免疫有關(guān)蛋白的序列”，美國(guó)健康和人類服務(wù)部，1983)。
上述四個(gè)FRs的大部分有β-折疊結(jié)構(gòu)導(dǎo)致三個(gè)CDR形成環(huán)。CDR有時(shí)可以形成β折疊結(jié)構(gòu)的一部分。三個(gè)CDR在空間上互相靠得很近并形成有配對(duì)區(qū)的三個(gè)CDR的抗原結(jié)合位點(diǎn)。
根據(jù)這些事實(shí)，將小鼠抗HM1.24抗體可變區(qū)的氨基酸序列與Kabat等制備的抗體氨基酸序列數(shù)據(jù)庫(kù)(“免疫有關(guān)蛋白的序列”，美國(guó)健康和人類服務(wù)中，1983)相比來(lái)觀察其同源性并可以發(fā)現(xiàn)CDR區(qū)。
(2)嵌合抗體的表達(dá)載體的構(gòu)建一旦克隆了編碼小鼠單克隆抗體L鏈和H鏈V區(qū)的DNA，通過(guò)將這些小鼠V區(qū)與編碼人抗體恒定區(qū)的DNA連接然后通過(guò)表達(dá)就可以得到嵌合的抗HM1.24抗體。
構(gòu)建嵌合抗體的基本方法包括連接已克隆的cDNA中的小鼠前導(dǎo)序列和V區(qū)序列哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)載體中已有的編碼人抗C區(qū)的序列可選擇地，此方法包括先將已克隆的cDNA中小鼠前導(dǎo)序列和V區(qū)序列與編碼人抗C區(qū)的序列連接，然后再連接到哺乳動(dòng)物的表達(dá)載體。
人的抗體C區(qū)可以是任何一個(gè)H鏈的C區(qū)和任何一個(gè)L鏈的C區(qū)。例如，人H鏈的Cγ1,Cγ2,Cγ3或Cγ4，或L鏈的Cλ或Cκ。
構(gòu)建了兩種表在載體產(chǎn)生嵌合抗體它們是包含編碼在如增強(qiáng)子/啟頓動(dòng)子系統(tǒng)的表達(dá)調(diào)節(jié)區(qū)控制下小鼠L鏈V區(qū)和人L鏈C區(qū)的DNA的表達(dá)載體，以及包含編碼在如增強(qiáng)子/啟動(dòng)子系統(tǒng)的表達(dá)調(diào)節(jié)區(qū)控制下小鼠H鏈V區(qū)和人H鏈C區(qū)的DNA的表達(dá)載體。然后，用這些表達(dá)載體共轉(zhuǎn)化如哺乳動(dòng)物細(xì)胞的宿主細(xì)胞，并在體外或體內(nèi)培養(yǎng)轉(zhuǎn)化細(xì)胞以產(chǎn)生嵌合抗體(例如，WO91-16928)。
選擇地，將已克隆的cDNA中編碼小鼠前導(dǎo)序列和小鼠L鏈V區(qū)和人L鏈C區(qū)的DNA及編碼小鼠前導(dǎo)序和小鼠H鏈V區(qū)和人H鏈C區(qū)的DNA導(dǎo)入單表達(dá)載體(見(jiàn)國(guó)際申請(qǐng)公開(kāi)號(hào)WO94-11523)，并用所述載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞。然后在體外或體內(nèi)培養(yǎng)轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞來(lái)產(chǎn)生目的嵌合抗體。
1)嵌合的H鏈的構(gòu)建通過(guò)將編碼小鼠H鏈V區(qū)的cDNA導(dǎo)入含基因組CDN或編碼人抗體H鏈C區(qū)的cDNA的適當(dāng)表達(dá)載體就可以得到適于嵌合抗體H鏈的表達(dá)載體。所提及的H鏈C區(qū)有例如Cr1,Cr2,Cr2或Cr4。
含Cr基因組DNA的嵌合H鏈的表達(dá)載體的構(gòu)建可以使用含Cr1為H鏈C區(qū)的基因組DNA的表達(dá)載體，例如HFE-PMh-gγl(國(guó)際申請(qǐng)公開(kāi)號(hào)WO92/19759)或DHFR-ΔE-RVh-PM1f(國(guó)際申請(qǐng)公開(kāi)號(hào)WO92/19759)。
用PCR方法可以導(dǎo)入合適的堿基序列以便將編碼小鼠H鏈V區(qū)的cDNA插入這些表達(dá)載體中。通過(guò)PCR方法用PCR引物可導(dǎo)入這些適當(dāng)?shù)膲A基序列，一個(gè)PCR引物設(shè)計(jì)為其5’末端具有適當(dāng)?shù)南拗菩詢?nèi)切酶識(shí)別序列并緊接起始密碼子前有Kozak保守序列，另一個(gè)PCR引物設(shè)計(jì)為其3’末端具有適當(dāng)?shù)南拗菩詢?nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)和剪接供體部位，在此部位基因組DNA的初級(jí)轉(zhuǎn)錄物經(jīng)適當(dāng)剪接成為mRNA。
用適當(dāng)?shù)南拗菩詢?nèi)切酶處理這樣構(gòu)建的編碼小鼠H鏈V區(qū)的cDNA，將其插入到上述表達(dá)載體中，就可以構(gòu)建含Cγ1DNA的嵌合H鏈表達(dá)載體。
cDNA嵌合H鏈的表達(dá)載體的構(gòu)建按以下步驟可以構(gòu)建含Cγ1為H鏈C區(qū)的cDNA的表達(dá)載體，先從CHO細(xì)胞中制備mRNA，其中編碼人源化PM1抗體H鏈V區(qū)和人抗體H鏈C區(qū)Cr1(N.Takahashi等，細(xì)胞29,671-679,1982)的基因組DNA表達(dá)載體DHFR-ΔE-RVh-PM1f(國(guó)際申請(qǐng)公開(kāi)號(hào)WO92/19759)及編碼人源化PM1抗體L鏈V區(qū)和人抗體L鏈的K鏈C區(qū)的基因組DNA的表達(dá)載體RV1-PM1a(國(guó)際申請(qǐng)公開(kāi)號(hào)WO92/19759)已整合到此細(xì)胞中；通過(guò)RT-PCR方法對(duì)含人源化PM1抗體H鏈V區(qū)和人抗體H鏈C區(qū)Cr1的cDNA進(jìn)行克隆，并通過(guò)合適的限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)將其連接到動(dòng)物細(xì)胞的適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)載體。
用PCR方法導(dǎo)入適當(dāng)?shù)膲A基序列以便將編碼小鼠H鏈V區(qū)的cDNA與編碼人抗H鏈C區(qū)Cr1直接連接。例如，用PCR引物通過(guò)PCR方法可以導(dǎo)入這些適當(dāng)?shù)膲A基序列，一個(gè)引物設(shè)計(jì)為在其5’末端具有適當(dāng)限制性內(nèi)切酶識(shí)別序列并緊鄰起始密碼子前為Kozak保守序列，另一個(gè)PCR引物設(shè)計(jì)為其3’末端具有用于H鏈C區(qū)Cr1直接連接反應(yīng)的適當(dāng)限制性內(nèi)切酶的識(shí)別序列。
通過(guò)用適當(dāng)限制性內(nèi)切酶處理這樣構(gòu)建的編碼小鼠H鏈V區(qū)的cDNA，將其連接到含H鏈C區(qū)Cγ1的上述cDNA中，并插入如pCOS1或pCHO1的表達(dá)載體中就可以構(gòu)建含cDNA嵌合的H鏈的表達(dá)載體。
2)嵌合抗體的L鏈的構(gòu)建通過(guò)將編碼小鼠L鏈V區(qū)的cDNA與編碼人抗體L鏈C區(qū)的基因組DNA或cDNA連接，然后將其導(dǎo)入適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)載體中，就可以得到嵌合抗體L鏈的表達(dá)載體。所述的L鏈C區(qū)是例如κ鏈或λ鏈。
嵌合L鏈的κ鏈cDNA的表達(dá)載體的構(gòu)建用PCR方法可以導(dǎo)入適當(dāng)?shù)膲A基序列以便構(gòu)建含編碼小鼠L鏈V區(qū)的cDNA的表達(dá)載體。例如，通過(guò)PCR方法用PCR引物可導(dǎo)入這些適當(dāng)?shù)膲A基序列，一個(gè)PCR引物設(shè)計(jì)為在其5’末端具有適當(dāng)限制性內(nèi)切酶的識(shí)別序列和Kozak共有序列，另一個(gè)PCR引物設(shè)計(jì)為在其3’端具有適當(dāng)限制性內(nèi)切酶的識(shí)別序列。
從如含基因組DNA的HEF-PM1K-gk(見(jiàn)國(guó)際申請(qǐng)公開(kāi)號(hào)WO92/19759)中可以構(gòu)建與小鼠L鏈V區(qū)連接的人L鏈C區(qū)K鏈。構(gòu)建cDNA嵌合抗體的L鏈κ鏈的表達(dá)載體的方法包括，通過(guò)PCR方法在編碼L鏈C區(qū)K鏈的DNA的5’末端或3’末端異入限制性內(nèi)切酶識(shí)別序列，將這樣構(gòu)建的小鼠L鏈V區(qū)和L鏈C區(qū)κ鏈連接，然后將其插入如pCOS1或pCHO1的表達(dá)載體中。
2．重新構(gòu)建的人抗體的構(gòu)建(1)設(shè)計(jì)重新構(gòu)建的人抗HM1.24抗體的V區(qū)小鼠單克隆抗體FR和人抗FR間必須具有高同源性以便構(gòu)建重新構(gòu)建的人抗體，其中小鼠單克隆抗體的CDR已移植到人抗體上。因而，使用蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)將小鼠抗HM1.24抗體的L鏈和H鏈的V區(qū)與所有已知結(jié)構(gòu)清楚的抗體V區(qū)比較。
小鼠抗HM1.24抗體L鏈V區(qū)與人抗體(HSGⅣ)L鏈V區(qū)Ⅳ亞群最為相似，同源性為66.4％。另一方面，它與HSGⅠ,HSGⅡ和HSGⅢ的同源性分別為56.9％、55.8％和61.5％。
與已知的人抗體L鏈V區(qū)相比，小鼠抗HM1.24抗體的L鏈V區(qū)與人抗體L鏈V區(qū)亞群I中的人抗體REIL鏈V區(qū)有67.0％的同源性。因此，REI的FR用作構(gòu)建重新構(gòu)建的人抗HM1.24抗體L鏈V區(qū)的原材料。
設(shè)計(jì)重新構(gòu)建的人抗HM1.24抗體L鏈V區(qū)的a型。在此類型中，使人抗體FR和重新構(gòu)建的人CMPATH-1H抗體的REI為基礎(chǔ)的FR相同(見(jiàn)Riekchmann,L.等，自然，322,21-25,(1988)，國(guó)際申請(qǐng)公開(kāi)號(hào)WO92-19759中所述的重新構(gòu)建的人PM-1抗體L鏈V區(qū)模型a含F(xiàn)R)，并使小鼠CDR和小鼠抗HM1.24抗體L鏈V區(qū)中的CDR相同。
小鼠抗HM1.24抗體H鏈V區(qū)與人抗體(HSGⅠ)H鏈V區(qū)的共有序列最相似，其同源性為54.7％。另一方面，它與HSGⅡ和HSGⅢ的同源性分別為34.6％和48.1％。小鼠抗HM1.24抗體H鏈V區(qū)與已知的人抗體H鏈V區(qū)相比時(shí)，F(xiàn)R1至FR3與人H鏈V區(qū)亞類Ⅰ中的人抗體HG3H鏈V區(qū)最相似(Rechavi,G.等，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)，80,855-859)，同源性為67.3％。
因此，人抗體HG3的FR用作構(gòu)建重新構(gòu)建的人抗HM1.24抗體H鏈V區(qū)的原材料。
然而，因?yàn)槿丝贵wHG3的FR4的氨基酸序列未公開(kāi)，所以將與小鼠抗-HM1.24抗體FR4有最高同源性的人抗體JH6的FR4的氨基酸序列(Ravetch,J.V等，細(xì)胞，27,583-591)用作FR4。JR6的FR4與小鼠抗HM1.24抗體H鏈FR4除僅有一個(gè)氨基酸不同外，其它氨基酸序列相同。
在重新構(gòu)建的人抗HM1.24抗體H鏈V區(qū)的第一個(gè)模型a中，除了人FR1第30位和人FR3第71位與小鼠抗HM1.24抗體的氨基酸相同，及CDR與小鼠抗-HM1.24抗體H鏈V區(qū)的CDR相同外，使VFR1至FR3與人抗體HG3的FR1到FR3相同。
(2)重新構(gòu)建的人抗HM1.24抗體L鏈V區(qū)的構(gòu)建通過(guò)CDR移植用PCR方法構(gòu)建重新構(gòu)建的人抗HM1.24抗體L鏈。此方法圖解見(jiàn)圖4。使用8個(gè)PCR引物構(gòu)建含來(lái)自人抗體RE1的FR的重新構(gòu)建的人抗HM1.24抗體(a型)。將外側(cè)引物A(SEQ ID No:47)和H(SEQ ID No:48)設(shè)計(jì)為可與HEF載體HEF-VL-gk的DNA序列雜交。
CDR移植引物L(fēng)1S(SEQ ID No:49),L2S(SEQ ID No:50)和L3S(SEQID No:51)具有正義DNA序列。CDR移植引物L(fēng)1A(SEQ ID No:52),L2A(SEQ ID No:53)和L3A(SEQ ID No:54)具有反義DNA序列，每個(gè)引物分別有引物L(fēng)1S,L2S和L3S的5’末端DNA序列的互補(bǔ)DNA序列(20至23bp)。
在PCR反應(yīng)的第一階段進(jìn)行四種反應(yīng)A-L1A,L1S-L2A,L2SA-L3A，及L3S-H并純化每個(gè)PCR產(chǎn)物。第一次PCR的四個(gè)PCR產(chǎn)物根據(jù)其各身的互補(bǔ)性可相互裝配(見(jiàn)WO92-19759)。然后，加入外側(cè)引物A和H擴(kuò)增編碼重新構(gòu)建的人抗-HM1.24抗體L鏈V區(qū)的全長(zhǎng)DNA(第二個(gè)PCR)。在上述PCR中，將編碼基于人抗體REI源FR的重新構(gòu)建人ONS-M21抗體L鏈V區(qū)模型a的質(zhì)粒HEF-RVL-M21a(見(jiàn)國(guó)際申請(qǐng)公開(kāi)號(hào)WO95-14041)用作模板。
在PCR的第一階段，使用了模板DNA和每個(gè)引物。
用1.5％低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠純化PCR產(chǎn)物A-L1A(215bp),L1S-L2A(98bp),L2S-L3A(140bp)和L3S-H(151bp)并在第二次PCR中使其裝配。在第二次PCR中，使用了第一次PCR產(chǎn)物和每個(gè)外側(cè)引物(A和H)。
用1.5％低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠純化來(lái)自第二次PCR的516bp DNA片段，經(jīng)BamHⅠ和HindⅢ消化，并將此得到的DNA片段克隆進(jìn)HEF表達(dá)載體HEF-VL-gk。包含含有重新構(gòu)建的人抗HM1.24抗體L鏈V區(qū)的正確氨基酸序列DNA片段的質(zhì)粒在確定其DNA序列后命名為質(zhì)粒HEF-RVLa-AHM-gk。此質(zhì)粒HEF-RVLa-AHM-gk所含的L鏈V區(qū)的氨基酸序列和堿基序列見(jiàn)SEQ ID No:9。
通過(guò)誘變用PCR可以構(gòu)建重新構(gòu)建的人抗HM1.24抗體L鏈V區(qū)的b型。誘變劑引物FTY-1(SEQ ID No:55)和FTY-2(SEQ ID No:56)設(shè)計(jì)為能使第71位的苯丙氨酸突變?yōu)槔野彼帷?br> 在用質(zhì)粒HEF-RVLa-AHM-gk作為模板擴(kuò)增以上引物后，純化最終產(chǎn)物。經(jīng)BamHⅠ和HindⅢ消化得到的DNA片段克隆到HEF表達(dá)載體HEF-VL-gk中可得到質(zhì)粒HEF-RVLb-AHM-gk。此質(zhì)粒HEF-RVLb-AHM-gk所含L鏈V區(qū)的氨基酸序列和堿基序列見(jiàn)SEQ IDNo:10。
(3)重新構(gòu)建的人抗HM1.24抗體H鏈V區(qū)的構(gòu)建3-1重新構(gòu)建的人抗HM1.24抗體H鏈V區(qū)的a至e型的構(gòu)建將編碼重新構(gòu)建的人抗HM1.24抗體H鏈V區(qū)的DNA設(shè)計(jì)如下。通過(guò)連接編碼人抗體HG3的FRs1至3和人抗體JH6的FR4的DNA序列與編碼小鼠抗HM1.24抗體H鏈V區(qū)的CDR的DNA序列，可以得到編碼重新構(gòu)建的人抗HM1.24抗體H鏈V區(qū)的全長(zhǎng)DNA。
然后，將HindⅢ識(shí)別位點(diǎn)/KOZAK共有序列和BamHⅠ識(shí)別位點(diǎn)/剪接供體序列分別添加到此DNA序列的5’末端和3’末端使之可以插入HEF表達(dá)載體。
這樣設(shè)計(jì)的DNA序列分為四段寡核苷酸，接著，用計(jì)算機(jī)分析可以潛在阻礙這些寡核苷酸裝配的寡核苷酸的二級(jí)結(jié)構(gòu)。
SEQ ID No:57至60列舉了RVH1至RVH4的四個(gè)寡核苷酸序列。這些寡核苷酸長(zhǎng)度為119至144個(gè)堿基并有25至26bp重疊區(qū)。在這些寡核苷酸中，RVH2(SEQ ID No:58)和RVH4(SEQ ID No:60)含有正義DNA序列而RVH1(SEQ ID No:57)和RVH3(SEQ ID No:59)含的反義DNA序列。通過(guò)PCR方法裝配這四段寡核苷酸的方法如圖所示(見(jiàn)圖5)。
使用四段寡核苷酸和作為外側(cè)引物的RHP1(SEQ ID No:60)和RHP2(SEQ ID No:62)進(jìn)行PCR。
純化擴(kuò)增的438bpDNA片段，用HindⅢ和BamHⅠ消化，然后克隆進(jìn)入HEF表達(dá)載體HEF-VH-gγl。包含編碼H鏈V區(qū)正確氨基酸序列的DNA片段的質(zhì)粒在確定其堿基序列后命名為HEF-RVHα-AHM-gγl。此質(zhì)粒HEF-RVHa-AHM-gγl中所含的H鏈V區(qū)的氨基酸序列和堿基序列如SEQ ID No:11所示。
如下構(gòu)建重新構(gòu)建的人抗HM1.24抗體H鏈V區(qū)的b,c,d和e型。在構(gòu)建每個(gè)重新構(gòu)建的人抗HM1.24抗體H鏈V區(qū)的b至e型中，要構(gòu)建小鼠抗HM1.24抗體V區(qū)的三維結(jié)構(gòu)模型以便預(yù)測(cè)抗體分子中可替代的氨基酸位置。
用設(shè)計(jì)將第66位精氨酸突變?yōu)橘嚢彼岬恼T變劑引物BS(序列63)和BA(SEQ ID No:64)及質(zhì)粒HEF-RVHa-AHM-gγl作為模板通過(guò)PCR方法擴(kuò)增b型來(lái)得到質(zhì)粒HEF-RVHb-AHM-gγl。此質(zhì)粒HEF-RVHb-AHM-gγl中所含的H鏈V區(qū)的氨基酸序列和堿基序列如SEQ IDNo:13所示。
用設(shè)計(jì)為將第66位精氨酸突變?yōu)橘嚢彼岷偷?3位蘇氨酸突變?yōu)橘嚢彼岬恼T變劑引物DS(序列67)和DA(SEQ ID No:68)并以質(zhì)粒HEF-RVHa-AHM-gγl為模板DNA通過(guò)PCR方法，擴(kuò)增模型d以得到質(zhì)粒HEF-RVHd-AHM-gγl。此質(zhì)粒HEF-RVHd-AHM-gγl中所含的H鏈V區(qū)的氨基酸序列和堿基序列如SEQ ID No:14所示。
用設(shè)計(jì)將第67位纈氨酸突變的丙氨酸和第69位蛋氧酸突變?yōu)榱涟彼岬恼T變劑引物ES(序列69)和EA(SEQ ID No:70)并以質(zhì)粒HEF-RVHa-AHM-gγl為模板DNA，擴(kuò)增模型e得到質(zhì)粒HEF-RVHe-AHM-gγl。此質(zhì)粒HEF-RVHe-AHM-gγl中所含H鏈V區(qū)的氨基酸序列和堿基序列如SEQ ID No:15所示。
3-2H鏈雜交V區(qū)的構(gòu)建通過(guò)構(gòu)建H鏈雜交V區(qū)，可以研究哪一個(gè)人源化抗體V區(qū)FR與結(jié)合活性和結(jié)合抑制活性有關(guān)。在所構(gòu)建的兩個(gè)V區(qū)中，一個(gè)V區(qū)的FR1和FR2的氨基酸序列來(lái)自小鼠抗HM1.24抗體及FR3和FR4的氨基酸序列來(lái)自重新構(gòu)建的人抗HM1.24抗體(鼠人雜交的抗HM1.24抗體)H鏈V區(qū)的模型a，另一個(gè)FR1和FR2的氨基酸序列來(lái)自重新構(gòu)建的人抗HM1.24抗體H鏈V區(qū)的a型及FR3和FR4的氨基酸序列來(lái)自小鼠抗HM1.24抗體(人鼠雜交的抗HM1.24抗體)。CDR區(qū)的氨基酸序列都來(lái)自小鼠抗HM1.24抗體。
通過(guò)PCR方法可以構(gòu)建兩個(gè)H鏈雜交V區(qū)。此方法圖解見(jiàn)圖6和圖7。使用四個(gè)引物構(gòu)建兩個(gè)H鏈雜交V區(qū)。將外側(cè)引物a(SEQ ID No:71)和h(SEQ ID No:72)設(shè)計(jì)為能與HEF表達(dá)載體HEF-VH-gγl的DNA序列雜交。將H鏈雜交的構(gòu)建引物HYS(SEQ ID No:73)設(shè)計(jì)為含有義DNA序列及H鏈雜交引物HYA(SEQ ID No:74)設(shè)計(jì)為含有反義DNA序列以便這些DNA序列相互互補(bǔ)。
在PCR的第一階段進(jìn)行用質(zhì)粒HEF-1.24H-gγl為模板，外側(cè)引物a和H鏈雜交引物HYA的PCR，及用質(zhì)粒HEF-RVHa-AHM-gγl為模板，H鏈雜交引物HYA和外側(cè)引物h的PCR來(lái)構(gòu)建H鏈雜交V區(qū)，其中FR1和FR2氨基酸序列來(lái)自于小鼠抗HM1.24抗體及FR3和FR4的氨基酸序列來(lái)自重新構(gòu)建的人抗HM1.24抗體H鏈V區(qū)模型a，并且純化每個(gè)PCR產(chǎn)物。
第一次PCR的兩個(gè)PCR產(chǎn)物可根據(jù)其自身的互補(bǔ)性進(jìn)行裝配(見(jiàn)國(guó)際申請(qǐng)公開(kāi)號(hào)WO92-19759)。然后在第二個(gè)PCR階段通過(guò)加入外側(cè)引物a和h擴(kuò)增編碼H鏈雜交V區(qū)的全長(zhǎng)DNA，在V區(qū)中FR1和FR2的氨基酸序列源自小鼠抗HM1.24抗體及FR3和FR4的氨基酸序列來(lái)自重新構(gòu)建的人抗HM1.24抗體H鏈V區(qū)a型。
在PCR的第一階段進(jìn)行用質(zhì)粒HEF-RVHa-AHM-gγl為模板，外側(cè)引物a和H鏈雜交引物HYA的PCR及用質(zhì)粒HEF-1.4H-gγl為模板，H鏈雜交引物HYS和外側(cè)引物h的PCR以便構(gòu)建H鏈雜交V區(qū)并純化每個(gè)PCR產(chǎn)物，在雜交V區(qū)中FR1和FR2的氨基酸序列源自重新構(gòu)建的人抗HM1.24抗體H鏈V區(qū)的a型及FR3和FR4的氨基酸序列來(lái)自小鼠抗HM1.24抗體。
第一次PCR的兩個(gè)PCR產(chǎn)物根據(jù)其自身的互補(bǔ)性進(jìn)行裝配(見(jiàn)國(guó)際申請(qǐng)公開(kāi)號(hào)WO92-19759)。然后在第二個(gè)PCR階段通過(guò)加入外側(cè)引物a和h擴(kuò)增編碼H鏈雜交V區(qū)的全長(zhǎng)DNA，在V區(qū)中FR1和FR2的氨基酸序列源自重新構(gòu)建的人抗HM1.24抗體H鏈V區(qū)的a型及FR3和FR4的氨基酸序列來(lái)自小鼠抗HM1.24抗體。
根據(jù)“實(shí)施例9，重新構(gòu)建的人抗HM1.24抗體L鏈V區(qū)的構(gòu)建”所示方法進(jìn)行第一個(gè)PCR，純化PCR產(chǎn)物，裝配，第二個(gè)PCR并克隆進(jìn)HEF表達(dá)載體HEF-VH-gγl。包含編碼H鏈雜交V區(qū)正確氨基酸序列的DNA片段的質(zhì)粒在確定DNA序列后命名為HEF-MH-RVH-AHM-gγl，其中FR1和FR2的氨基酸序列源自小鼠抗-HM1.24抗體及FR3和FR4的氨基酸序列來(lái)自重新構(gòu)建的人抗HM1.24抗體H鏈V區(qū)的a型。
此質(zhì)粒HEF-MH-RVH-AHM-gγl中所含H鏈V區(qū)的氨基酸序列和堿基序列如SEQ ID No:75所示。包含編碼H鏈雜交V區(qū)正確氨基酸序列的DNA片段質(zhì)粒也可命名為HEF-HM-RVH-AHM-gγl，在V區(qū)中FR1和FR2的氨基酸序列源自重新構(gòu)建的人抗HM1.24抗體a型及FR3和FR4的氨基酸序列來(lái)自小鼠抗HM1.24抗體H鏈V區(qū)。此質(zhì)粒HEF-HM-RVH-AHM-gγl中所含H鏈V區(qū)的氨基酸序列和堿基序列如SEQ ID No:76所示。
3-3重新構(gòu)建的人抗HM1.24抗體H鏈V區(qū)f到s型的構(gòu)建如下構(gòu)建重新構(gòu)建的人抗HM1.24抗體H鏈V區(qū)的每種類型f、g、h、i、j、k、l、m、n、o、p、q、r、和s。在構(gòu)建重新構(gòu)建的人抗HM1.24抗體H鏈V區(qū)的f至s型中，如上所述應(yīng)構(gòu)建小鼠抗HM1.24抗體V區(qū)的三維結(jié)構(gòu)模型以便預(yù)測(cè)抗體分子中替代的氨基酸殘基位置。
用設(shè)計(jì)將第75位蘇氨酸突變?yōu)榻z氨酸和第78位纈氨酸突變?yōu)楸彼岬恼T變劑引物FS(序列78)和FA(SEQ ID No:79)并以質(zhì)粒HEF-RVHe-AHM-gγl為模板DNA通過(guò)PCR方法擴(kuò)增f型以得到質(zhì)粒HEF-RVHf-AHM-gγl。此質(zhì)粒HEF-RVHf-AHM-gγl中所含H鏈V區(qū)的氨基酸序列和堿基序列如SEQ ID No:16所示。
用設(shè)計(jì)將第40位丙氨酸突變?yōu)榫彼岬恼T變劑引物GS(序列80)和GA(SEQ ID No:81)并以質(zhì)粒HEF-RVHa-AHM-gγl主模板DNA，擴(kuò)增g型以得到質(zhì)粒HEF-RVHg-AHM-gγl。此質(zhì)粒HEF-RVHg-AHM-gγl中所含H鏈V區(qū)的氨基酸序列和堿基序列如SEQ ID No:17所示。
用誘變劑引物FS和FA并以質(zhì)粒HEF-RVHb-AHM-gγl為模板DNA擴(kuò)增h型以得到質(zhì)粒HEF-RVHh-AHM-gγl。此質(zhì)粒HEF-RVHh-AHM-gγl中所含H鏈V區(qū)的氨基酸序列和堿基序列如SEQ ID No:18所示。
用設(shè)計(jì)將第83位精氨酸突變?yōu)楸彼岷偷?4位絲氨酸突變?yōu)楸奖彼岬恼T變劑引物IS(序列82)和IA(SEQ ID No:83)并以質(zhì)粒HEF-RVHh-AHM-gγl為模板DNA擴(kuò)增I型以得到質(zhì)粒HEF-RVHi-AHM-gγl。此質(zhì)粒HEF-RVHi-AHM-gγl中所含H鏈V區(qū)的氨基酸序列和堿基序列如SEQ ID No:19所示。
用設(shè)計(jì)將第66位精氨酸突變?yōu)橘嚢彼岬恼T變劑引物JS(SEQ IDNo:84)和JA(SEQID No:85)并以質(zhì)粒HEF-RVHf-AHM-gγl為模板DNA，擴(kuò)增j型以得到質(zhì)粒HEF-RVHj-AHM-gγl。此質(zhì)粒HEF-RVHj-AHM-gγl中所含H鏈V區(qū)的氨基酸序列和堿基序列如SEQ ID No:20所示。
用設(shè)計(jì)將第81位谷氨酸突變?yōu)楣劝滨０返恼T變劑引物KS(SEQ IDNo:86)和KA(SEQ ID No:87)并以質(zhì)粒HEF-RVHh-AHM-gγl為模板DNA，擴(kuò)增k型以得到質(zhì)粒HEF-RVHk-AHM-gγl。此質(zhì)粒HEF-RVHk-AHM-gγl中所含H鏈V區(qū)的氨基酸序列和堿基序列如SEQ ID No:21所示。
用設(shè)計(jì)將第81位谷氨酸突變?yōu)楣缺彼岷偷?2B位絲氨酸突變?yōu)楫惲涟彼岬恼T變劑引物L(fēng)S(SEQ ID No:88)和LA(SEQ ID No:89)并以質(zhì)粒HEF-RVHh-AHM-gγl為模板DNA，擴(kuò)增1型以得到質(zhì)粒HEF-RVHl-AHM-gγl。此質(zhì)粒HEF-RVHl-AHM-gγl中所含H鏈V區(qū)的氨基酸序列和堿基序列如SEQ ID No:22所示。
用設(shè)計(jì)將第81位谷氨酸突變?yōu)楣缺彼幔?2b位絲氨酸突變?yōu)楫惲涟彼岷偷?7位蘇氨酸突變?yōu)榻?jīng)氨酸的誘變劑引物MS(SEQ IDNo:90)和MA(SEQ ID No:91)并以質(zhì)粒HEF-RVHh-AHM-gγl為模板DNA，擴(kuò)增m型以得到質(zhì)粒HEF-RVHm-AHM-gγl。此質(zhì)粒HEF-RVHm-AHM-gγl中所含H鏈V區(qū)的氨基酸序列和堿基序列如SEQ ID No:23所示。
用設(shè)計(jì)將第82B位絲氨酸突變?yōu)楫惲涟彼岬恼T變劑引物NS(SEQ IDNo:92)和NA(SEQ ID No:93)并以質(zhì)粒HEF-RVHh-AHM-gγl為模板DNA，擴(kuò)增n型以得到質(zhì)粒HEF-RVHh-AHM-gγl。此質(zhì)粒HEF-RVHn-AHM-gγl中所含H鏈V區(qū)的氨基酸序列和堿基序列如SEQ ID No:24所示。
用設(shè)計(jì)將第87蘇氨酸突變?yōu)榻z氨酸的誘變劑引物OS(SEQ IDNo:94)和OA(SEQ ID No:95)并以質(zhì)粒HEF-RVHh-AHM-gγl為模板DNA，擴(kuò)增O型以得到質(zhì)粒HEF-RVHo-AHM-gγl。此質(zhì)粒HEF-RVHo-AHM-gγl中所含H鏈V區(qū)的氨基酸序列和堿基序列如SEQ ID No:25所示。
用設(shè)計(jì)將第78纈氨酸突變?yōu)楸彼岬恼T變劑引物PS(SEQ IDNo:96)和PA(SEQ ID No:97)并以質(zhì)粒HEF-RVHa-AHM-gγl為模板DNA，通過(guò)PCR方法擴(kuò)增P型以得到質(zhì)粒HEF-RVHp-AHM-gγl。此質(zhì)粒HEF-RVHp-AHM-gγl中所含H鏈V區(qū)的氨基酸序列和堿基序列如SEQ ID No:26所示。
用設(shè)計(jì)將第75位蘇氨酸突變?yōu)榻z氨酸的誘變劑引物QS(SEQ IDNo:98)和QA(SEQ ID No:99)并以質(zhì)粒HEF-RVHa-AHM-gγl為模板DNA，通過(guò)PCR方法擴(kuò)增q型以得到質(zhì)粒HEF-RVHq-AHM-gγl。此質(zhì)粒HEF-RVHq-AHM-gγl中所含H鏈V區(qū)的氨基酸序列和堿基序列如SEQ ID No:27所示。
用誘變劑引物CS(SEQ ID No:65)和CA(SEQ ID No:66)并以質(zhì)粒HEF-RVHp-AHM-gγl為模板DNA，通過(guò)PCR方法擴(kuò)增r型以得到質(zhì)粒HEF-RVHr-AHM-gγl。此質(zhì)粒HEF-RVHr-AHM-gγl中所含H鏈V區(qū)的氨基酸序列和堿基序列如SEQ ID No:28所示。
用設(shè)計(jì)將第69位蛋氨酸突變?yōu)楫惲涟彼岬恼T變劑引物SS(SEQ IDNo:100)和SA(SEQ ID No:101)并以質(zhì)粒HEF-RVHr-AHM-gγl為模板DNA，擴(kuò)增S型以得到質(zhì)粒HEF-RVHs-AHM-gγl。此質(zhì)粒HEF-HVHs-AHM-gγl中所含H鏈V區(qū)的氨基酸序列和堿基序列如SEQ IDNo:102所示。
表1表示已構(gòu)建的L鏈V區(qū)的氨基酸序列，表2至表4表示H鏈V區(qū)的氨基酸序列。表1 L鏈V區(qū)的氨基酸序列FR1 CDR1FR21 2 3 412345678901234567890123 45678901234 567890123456789AHMDIVMTQSHKFMSTSVGDRVSITC KASQDVNTAVA WYQQKPGQSPKLLIYHuSG I DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC WYQQKPGKAPKLLIYREIDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC WYQQKPGKAPKLLIYRVLa ----------------------- ----------- ---------------RVLb ----------------------- ----------- ---------------
CDR2 FR35 6 7 80123456 78901234567890123456789012345678AHMSASNRYT GVPDRITGSGSGTDFTFTISSVQAEDLALYYCHuSGI GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCREIGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYCRVLa ------- --------------------------------RVLb ------- --------------Y-----------------CDR3 FR49 10901234567 8901234567AHMQQHYSTPFT FGSGTKLEIKHuSGIFGQGTKVEIKREI FGQGTKVEIKRVLa --------- ----------RVLb --------- ----------表2 H鏈V區(qū)的氨基酸序列(1)FR1CDR1 FR21 2 3 4123456789012345678901234567890 12345 67890123456789AHMQVQLQQSGAELARPGASVKLSCKASGYTFT PYWMQ WVKQRPGQGLEWICHuSGI EVQLVQSGADVKKPGXSVXVSCKASGYTFS WVRQAPGXGLDWVGHG3QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFN WVRQAPGQGLEWMCRVHa -----------------------------T ----- --------------RVHb -----------------------------T ----- --------------RVHc -----------------------------T ----- --------------RVHd -----------------------------T ----- --------------RVHe -----------------------------T ----- --------------RVHf -----------------------------T ----- --------------RVHg -----------------------------T ----- ----R---------RVHh -----------------------------T ----- --------------RVHi -----------------------------T ----- --------------RVHj -----------------------------T ----- --------------RVHk -----------------------------T ----- --------------RVHl -----------------------------T ----- --------------RVHm -----------------------------T ----- --------------RVHn -----------------------------T ----- --------------RVHo -----------------------------T ----- --------------RVHp -----------------------------T ----- --------------RVHq -----------------------------T ----- --------------RVHr -----------------------------T ----- --------------RVHs -----------------------------T ----- --------------表3 H鏈V區(qū)氨基酸序列(2)COR2 FR35 6 7 89012A3456789012345 67890123456789012A8C345678901234AHM SIFPGDGDTRYSQKFKG KATLTADKSSSTAYMQLSILAFEDSAVYYCARHuSGI RVTXTXDXSXNTAYMSLSSLRSEDTAVYYCARHG3 RVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARRVHa----------------- -----A--------------------------RVHb----------------- K----A--------------------------RVHc----------------- -----A-K------------------------RVHd----------------- K----A-K------------------------RVHe----------------- -A-L-A--------------------------RVHf----------------- -A-L-A---S--A-------------------RVH2----------------- -----A--------------------------RVHh----------------- K----A---S--A-------------------RVHi----------------- K----A---S--A-------AF----------RVHj----------------- KA-L-A---S--A-------------------RVHk----------------- K----A---S--A--Q----------------RVHl----------------- K----A---S--A--Q--I-------------RVHm----------------- K----A---S--A--Q--I-----S-------RVHn----------------- K----A---S--A-----I-------------RVHo----------------- K----A---S--A-----------S-------RVHp----------------- -----A------A-------------------RVHq----------------- -----A---S----------------------RVHr----------------- -----A-K----A-------------------RVHs----------------- ----I-A-K----A------------------表4 H鏈V區(qū)的氨基酸序列(3)CDR3 FR410 1157890ABJK12 34567890123AHM GLRRGGYYFDY WGQGTTLTVSSHuSGIWGQGTLVTVSSJH6 WGQGTTVTVSSRVHa----------- ------------RVHb----------- ------------RVHc----------- ------------RVHd----------- ------------RVHe----------- ------------RVHf----------- ------------RVHg----------- ------------RVHh----------- ------------RVHi----------- ------------RVHj----------- ------------RVHk----------- ------------RVHl----------- ------------RVHm----------- ------------RVHn----------- ------------RVHo----------- ------------RVHp----------- ------------RVHq----------- ------------RVHr----------- ------------RVHs----------- ------------
3．嵌合抗體和重新構(gòu)建人抗體的合成為合成嵌合抗體或重新構(gòu)建人抗體，對(duì)每個(gè)抗體構(gòu)建兩個(gè)表達(dá)載體，一個(gè)表達(dá)載體包含編碼在如增強(qiáng)子/啟動(dòng)子系統(tǒng)的表達(dá)調(diào)節(jié)區(qū)控制下的小鼠H鏈V區(qū)和人H鏈C區(qū)的DNA及編碼在如增強(qiáng)子/啟動(dòng)子系統(tǒng)的表達(dá)調(diào)節(jié)區(qū)控制下的小鼠L鏈V區(qū)和人L鏈C區(qū)的DNA，或一個(gè)表達(dá)載體包含編碼在如增強(qiáng)子/啟動(dòng)子系統(tǒng)的表達(dá)調(diào)節(jié)區(qū)控制下的人源化H鏈V區(qū)和人H鏈C區(qū)的DNA及編碼在如增強(qiáng)子/啟動(dòng)子系統(tǒng)的表達(dá)調(diào)節(jié)區(qū)控制下的人源化L鏈V區(qū)和人L鏈C區(qū)的DNA。
隨后，用這些載體共轉(zhuǎn)化如哺乳動(dòng)物細(xì)胞的宿主細(xì)胞，并在體外或體內(nèi)培養(yǎng)這些轉(zhuǎn)化細(xì)胞以產(chǎn)生嵌合抗體或重新構(gòu)建的人抗體(例如，國(guó)際申請(qǐng)公開(kāi)號(hào)WO91-16928)。此外，可將抗體基因?qū)肴缟窖虻炔溉閯?dòng)物以產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，從其乳汁可得到嵌合抗體或重新構(gòu)建的人抗體。
也可將H鏈V區(qū)和H鏈C區(qū)、L鏈V區(qū)和L鏈C區(qū)與單載體連接以轉(zhuǎn)化適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞然后產(chǎn)生抗體。將編碼已克隆cDNA中小鼠前導(dǎo)序列和H鏈V區(qū)和人H鏈C區(qū)的DNA，及編碼小鼠前導(dǎo)序列和L鏈V區(qū)和人L鏈C區(qū)的DNA導(dǎo)入單表達(dá)載體以表達(dá)嵌合抗體(見(jiàn)國(guó)際申請(qǐng)公開(kāi)號(hào)WO94-11523)。
將編碼人源化H鏈V區(qū)和人H鏈C區(qū)的DNA，及編碼人源化L鏈V區(qū)和人L鏈C的DNA導(dǎo)入單表達(dá)載體以表達(dá)重新構(gòu)建的人抗體(見(jiàn)國(guó)際申請(qǐng)公開(kāi)號(hào)WO94-11523)。用所述載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，并在體內(nèi)或體外培養(yǎng)這些轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞以產(chǎn)生目的嵌合抗體或重新構(gòu)建的人抗體。
可培養(yǎng)通過(guò)編碼目的嵌合抗體或重新構(gòu)建的人抗體的基因按上述方法轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)化子，并從細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞外分離所產(chǎn)生的嵌合抗體或重新構(gòu)建的人抗體及純化成均一的抗體。
用親和柱分離和純化本發(fā)明的目的蛋白，嵌合抗體或重新構(gòu)建人抗體。此柱使用蛋白A，例如HyperD、POROS、瓊脂糖凝膠F等。可選擇地，可以使用蛋白質(zhì)的常規(guī)分離和純化方法并且此方法不受任何限制。例如，只要合適，也可用各種層析結(jié)合方法，超濾、鹽析、滲析等來(lái)分離和純化嵌合抗體或重新構(gòu)建的人抗體。
可以用任何表達(dá)方法來(lái)產(chǎn)生本發(fā)明的嵌合的抗HM1.24抗體或重新構(gòu)建的人抗HM1.24抗體，包括例如，如動(dòng)物細(xì)胞、已建立的哺乳動(dòng)物胞系系統(tǒng)、昆蟲(chóng)細(xì)胞系統(tǒng)、真菌細(xì)胞系統(tǒng)和酵母細(xì)胞系統(tǒng)的真核生物細(xì)胞，以及如大腸桿菌等細(xì)菌細(xì)胞的原核生物細(xì)胞。本發(fā)明的嵌合抗體或重新構(gòu)建人抗體優(yōu)選地在COS細(xì)胞、CHO細(xì)胞、HeLa細(xì)胞、Vero細(xì)胞、骨髓瘤細(xì)胞或BHK細(xì)胞中表達(dá)。
在此情形中，可用適于哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)的普通啟動(dòng)子。例如，優(yōu)選地使用人巨細(xì)胞病毒早期(HCMV)啟動(dòng)子。這些包含HCMV啟動(dòng)子的表達(dá)載體實(shí)施例包括HCMV-VH-HCγ1,HCMV-VL-HCκ等和源自pSV2neo的載體(國(guó)際申請(qǐng)公開(kāi)號(hào)WO92-19759)。
此外，可以使用諸如逆轉(zhuǎn)錄病毒、多瘤病毒、腺病素、猿猴病毒40(SV40)等的病毒啟動(dòng)子和諸如人多肽鏈延伸因子1d(HEF-12)等源自哺乳動(dòng)物細(xì)胞的啟動(dòng)子作為本發(fā)明中哺乳動(dòng)物細(xì)胞基因表達(dá)的啟動(dòng)子。例如，當(dāng)使用SV40啟動(dòng)子時(shí)，可以用Mulligan等方法(自然277,108(1979)很容易地進(jìn)行表達(dá)，當(dāng)用HEF-12啟動(dòng)子時(shí)就要用Mizushima,S.等方法(核酸研究，18,5322,1990)。
可以使用源自SV40、多瘤病毒、腺病毒、牛乳頭瘤病毒(BPV)等的啟動(dòng)子作為復(fù)制源，并且表達(dá)載體包括氨基糖苷磷酸轉(zhuǎn)移酶(APH)基因、胸苷激酯(TK)基因、大腸桿菌黃嘌呤-鳥(niǎo)嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(Ecogpt)基因、二氫葉酸還原酶(DHRF)基因等作為選擇標(biāo)記以便在宿主細(xì)胞系統(tǒng)中擴(kuò)增基因拷貝數(shù)。
4．嵌合抗體或重新構(gòu)建的人抗體的結(jié)合抑制活性(1)抗體濃度的測(cè)定通過(guò)ELISA或吸收率測(cè)定方法測(cè)定純化抗體的濃度。
如下制備測(cè)定抗體濃度的ELISA板。用濃度為每毫升1微克的100微開(kāi)羊抗人IgG抗體固定96孔ELISA板(例如Maxisorp，由NUNC生產(chǎn))的每個(gè)孔。
用每毫升100微克的稀釋緩沖液(例如50mM Tris-Hcl,mM Mgcl2,0.15M Nacl,0.05％Tween20,0.02％Nan3,1％胎牛血清白蛋白(BSA),pH8.1)封閉后，向每孔加入可表達(dá)嵌合抗體、雜交抗體或重新構(gòu)建人抗體的如COS細(xì)胞或CHO細(xì)胞培養(yǎng)物上清液的連續(xù)稀釋液，或純化的嵌合抗體、雜交抗體或重新構(gòu)建人抗體。然后加入與羊抗人IgG抗體結(jié)合的100微升堿性磷酸酶，加入每毫升1毫克的底物溶液(由SIGMA生產(chǎn)的Sigma104,p-硝基酚磷酸)，并用微板Reader(Bio Rad)測(cè)定其405納米的吸收值?？捎萌薎gClk(由BInding Site生產(chǎn))作為濃度測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)。通過(guò)測(cè)定抗體在280納米的吸收值并以1.350D的每毫升1毫克計(jì)算就可得到純化抗體的濃度。
(2)結(jié)合活性通過(guò)用人羊膜細(xì)胞系WISH(ATCC CCL25)的細(xì)胞ELISA測(cè)定結(jié)合活性。如下制備細(xì)胞ELISA。將補(bǔ)充10％小牛血清的PRMI1640培養(yǎng)基中適當(dāng)濃度的WISH細(xì)胞加入96孔板，培養(yǎng)過(guò)夜，并用PBS(-)沖洗兩次，再用0.1％戊二醛(由Nakalai-teque生產(chǎn))固定。
封閉后向每孔加入100微升可以表達(dá)嵌合抗HM1.24抗體、雜交抗-HM1.24抗體或重新構(gòu)建人抗HM1.24抗體的如COS細(xì)胞或CHO細(xì)胞培養(yǎng)物上清液的連續(xù)緩沖液，或純化的嵌合抗HM1.24抗體、雜交抗HM1.24抗體或重新構(gòu)建的人抗-HM1.24抗體，然后加入過(guò)氧化物酶標(biāo)記的兔抗抗HM1.24抗體(由DAKO生產(chǎn))。
在室溫培養(yǎng)1小時(shí)后加入底物溶液，再培養(yǎng)。隨后用50微升的6N硫酸停止反應(yīng)，并用型號(hào)為3550的微板閱讀儀(由Bio-Rad生產(chǎn))測(cè)定其在490納米的吸光度。
(3)結(jié)合抑制活性的測(cè)定通過(guò)用人羊膜細(xì)胞系WISH(ATCC CCL25)的細(xì)胞ELISA測(cè)定生物素酰基化的鼠抗HM1.24抗體的結(jié)合抑制活性。根據(jù)上述(2)制備細(xì)胞-ELISA板。將補(bǔ)充10％小牛血清的PRMI1640培養(yǎng)基中適當(dāng)濃度的WISH細(xì)胞加入96孔板，培養(yǎng)過(guò)夜，并用PBS(-)沖洗兩次，再用0.1％戊二醛固定(由Nakalai tesque生產(chǎn))。
封閉后，向每孔加入50微升可以表達(dá)嵌合抗HM1.24抗體、雜交抗HM1.24抗體或重新構(gòu)建人抗HM1.24抗體的如COS細(xì)胞或CHO細(xì)胞培養(yǎng)物上清液的連續(xù)稀釋液，或純化的嵌合抗HM1.24抗體、雜交抗HM1.24抗體或重新構(gòu)建人抗-HM1.24抗體，同時(shí)加入50微升的每毫升2毫克的生物素?；氖罂笻M1.24抗體，然后室溫培養(yǎng)2個(gè)小時(shí)，并在沖洗后加入過(guò)氧化物酶標(biāo)記的抗生蛋白鏈霉素。
在室溫培養(yǎng)1小時(shí)及沖洗后，加入底物溶液并培養(yǎng)。隨后，用50微升的6N硫酸停止反應(yīng)，然后用型號(hào)為3550的微板閱讀耙遷由Bio-Rad生產(chǎn))測(cè)定490納米的吸光度。
ADCC活性的測(cè)定如下測(cè)定本發(fā)明嵌合抗體或重新構(gòu)建人抗體的ADCC活性。首先，通過(guò)密度離心方法從人外周血或骨髓分離出單核細(xì)胞并將其制備成效應(yīng)細(xì)胞。通過(guò)用上Cγ標(biāo)記RPMI8226細(xì)胞(ATCC CCL155)將人骨髓瘤細(xì)胞制備為靶細(xì)胞。然后，將需測(cè)ADCC活性的嵌合抗體或重新構(gòu)建人抗體加到標(biāo)記的靶細(xì)胞中并培養(yǎng)，然后將合適比例的效應(yīng)細(xì)胞加入細(xì)胞并培養(yǎng)。
培養(yǎng)后取上清液，用r計(jì)數(shù)器測(cè)定其放射性。此時(shí)可用1％NP-40測(cè)定最大釋放放射性。按(A-C)/(B-C)×100計(jì)算細(xì)胞毒性(％)，其中A是抗體存在時(shí)釋放的放射性(cpm),B是NP-40釋放的放射性(cpm),C是無(wú)抗體時(shí)培養(yǎng)物液體釋放的放射性(cpm)。
當(dāng)預(yù)期抗體C區(qū)有ADCC活性或CDC活性時(shí)，可用人Cγ1或人Cγ3作為抗體C區(qū)。此外，通過(guò)添加改變或修飾體C區(qū)氨基酸的一部分，可以誘導(dǎo)較高的ADCC活性或CDC活性。
例如，有氨基酸替代引起的IgG的IgM樣聚合作用(Smith,R.I.F.和Morrison,S.L,BIO/TECHNOLOGY(1994)12,683-688)，氨基酸添加劑引起的IgM樣聚合作用(Smith,R.I.F.等，免疫學(xué)雜志(1995)154,2226-2236)，編碼L鏈基因的順序連接表達(dá)(Shuford,W.等，科學(xué)(1991)252,724-727)，氨基酸替代引起的IgG二聚作用(Caron,P.C.等，實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志(1992)176,1191-1195,Shopes,B.J.免疫學(xué)(1992)148,2918-2922)，化學(xué)修飾引起的IgG二聚作用(Wolff,E.A.等，癌癥研究(1993)53,2560-2565)，以及抗體鉸鏈區(qū)的氨基酸替代誘導(dǎo)效應(yīng)物作用(Norderhaug,L.等，歐洲免疫學(xué)雜志(1991)21,2379-2384)。用引物進(jìn)行寡聚物位點(diǎn)指導(dǎo)的誘變，用限制性內(nèi)切酶切割位點(diǎn)加入堿基序列以及誘導(dǎo)共價(jià)鍵的化學(xué)修飾物可以完成這些變化。
骨髓瘤的體內(nèi)診斷本發(fā)明的嵌合抗HM1.24抗體或重新構(gòu)建人抗HM1.24抗體通過(guò)與如放射性同位素等標(biāo)記化合物連接可以用于骨髓瘤的體內(nèi)診斷。
此外，與如放射性同位素等標(biāo)記化合物連接的嵌合抗HM1.24抗體或重新構(gòu)建人抗HM1.24抗體的片段可用于骨髓瘤的體內(nèi)診斷，例如Fab、F(ab’)2、Fv、或單鏈Fv(scFv)，其中Fv或H鏈和L鏈的Fv由合適接頭連接。
通過(guò)構(gòu)建編碼這些抗體片段的基因，將其導(dǎo)入表達(dá)載體，然后在適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞中表達(dá)，或用適當(dāng)酶消化嵌合抗HM1.24抗體或重新構(gòu)建人抗HM1.24抗體可特異地得到這些抗體片段。
可以非腸道方式系統(tǒng)地施用上面提及的骨髓瘤的體內(nèi)診斷法。
骨髓瘤的藥物組合物和治療劑向骨髓瘤細(xì)胞移植的動(dòng)物施用所述抗體并評(píng)估抗腫瘤效果，以證實(shí)本發(fā)明的嵌合抗HM1.24抗體或人源化抗HM1.24抗體的治療效果。
優(yōu)選人骨髓瘤細(xì)胞作為向動(dòng)物移植的骨髓瘤細(xì)胞，例如有KPMM2(日本未審查的專利公開(kāi)(Kokai)號(hào)7-236474)、RPMI8226(ATCC CCL155)、ARH-77(ATCC CRL1621)和S6845(Suzuki,H.等，歐洲免疫學(xué)雜志(1992)22,1989-1993)。優(yōu)選免疫功能降低或缺失的動(dòng)物作為所述細(xì)胞移植的動(dòng)物，例如有裸小鼠、SCID小鼠、褐色小鼠和裸大鼠。
此外，根據(jù)血清中人免疫球蛋白量的變化，腫瘤體積和/或重量的測(cè)定，尿中人本斯-瓊斯氏蛋白重量的變化，動(dòng)物存活期等來(lái)證實(shí)所評(píng)估的抗腫瘤效果。
可以非腸道方式系統(tǒng)或局部施用包含本發(fā)明的嵌合抗HM1.24抗體或重新構(gòu)建人抗HM1.24抗體作為活性成分的骨髓瘤藥物組合物或治療劑。例如，可選擇諸如輸注的靜脈內(nèi)注射、肌內(nèi)注射、腹膜內(nèi)注射或皮下注射并根據(jù)病人年齡和醫(yī)療條件選擇合適劑量方案。
有效劑量范圍是每劑量中每千克體重的0.01毫克至1000毫克藥量?？蛇x擇地劑量是每千克體重5毫克，優(yōu)選地是每千克體重50毫克至100毫克。
根據(jù)給藥途徑，含本發(fā)明的重新構(gòu)建抗HM1.24抗體或重新構(gòu)建人抗HM1.24抗體作為活性成分的骨髓瘤藥物組合物或治療劑可以包含藥學(xué)可接受的載體或添加劑。
這些載體和添加劑的例子有水、藥學(xué)上可接受的有機(jī)溶劑、膠原、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、羧乙烯聚合物、羧甲基纖維素鈉、聚丙烯酸酯、藻酸鈉、水溶性葡聚糖、羧甲基淀粉鈉、果膠、甲基纖維素、乙基纖維素、黃原膠、阿拉伯樹(shù)膠、酪蛋白、聚乙二醇、凡士林、石蠟、硬脂醇、硬脂酸、人血清白蛋白(HSA)、甘露醇、山梨糖醇、乳糖、藥學(xué)可接受表面活性劑等。所用添加劑選自但不限于上述添加劑或其結(jié)合形式。
實(shí)施例下面更具體地說(shuō)明本發(fā)明。實(shí)施例1．編碼小鼠抗HM1.24抗體V區(qū)的cDNA的克隆1．信使RNA(mRNA)的分離使用3.2版本快速mRNA分離試劑盒(Invitrogen公司生產(chǎn))，根據(jù)其中所附說(shuō)明，從產(chǎn)生小鼠抗HM1.24抗體的2×108雜交瘤細(xì)胞中分離mRNA。
2．通過(guò)PCR方法擴(kuò)增編碼抗體可變區(qū)的基因。
使用擴(kuò)增熱循環(huán)儀(Perkin Elmer Cetus生產(chǎn))進(jìn)行PCR。
2-1．編碼小鼠L鏈V區(qū)基因的擴(kuò)增和酶切使用AMV逆轉(zhuǎn)錄酶cDNA第一條鏈合成試劑盒(Life Science生產(chǎn))從所分離的mRNA中合成單鏈cDNA并用于PCR。對(duì)于PCR的引物，使用能與小鼠Kappa型L鏈引導(dǎo)序列雜交的在SEQ ID No:29至39所地的MKV(小鼠Kappa可變的)引物(Jones,S.T.等，生物/技術(shù)，9,88-89,(1991))。
含有10mM Tris-HCl(pH8.3)、50mM KCl,0.1mM dNTPs(dATP,dGTP,dCTP,dTTP)、1.5mM MgCl2、5單位DNA聚合酶Ampli Taq(PerkinElmer Cetus生產(chǎn))、0.25mM顯示于SEQ ID No:29至39中的MKV引物、3mM顯示于SEQ ID No:40中的MKC引物和100ng單鏈cDNA的100μl PCR溶液用50μl礦物油覆蓋，然后在94℃的初始溫度加熱3分鐘，再以94℃1分鐘、35℃1分鐘、72℃1分鐘的順序循環(huán)。此循環(huán)重復(fù)30次后，反應(yīng)混合物在72℃溫育10分鐘。擴(kuò)增的DNA片段用低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠(Sigma生產(chǎn))純化，并在37℃用XmaⅠ(New EnglandBioLabs生產(chǎn))和SalⅠ(Takara Shuzo生產(chǎn))酶切。
2-2．編碼小鼠H鏈V區(qū)的cDNA的擴(kuò)增和酶切使用5’-RACE方法(cDNA末端的快速擴(kuò)增；Frohman,M.A.等，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)，85,8998-9002,(1988),Edwards,J.B.D.M.,等，核酸研究，19,5227-5232,,(1991))擴(kuò)增編碼小鼠H鏈的V區(qū)的基因。使用與小鼠IgG2a的恒定區(qū)特異雜交的引物P1(SEQ ID No:41)合成cDNA以后，通過(guò)5’-AmpliFINDER cDNA末端快速擴(kuò)增試劑盒(CLONTECH生產(chǎn))使用試劑盒所附帶的與小鼠IgG2a恒定區(qū)特異雜交的引物MHC2a(SEQ ID No:42)和錨定引物(SEQ ID No:77)。擴(kuò)增編碼小鼠H鏈V區(qū)的cDNA。擴(kuò)增的DNA片段用低熔點(diǎn)瓊脂糖膠(Sigma生產(chǎn))純化并用EcoRⅠ(Takara Shuzo生產(chǎn))和XmaⅠ(New England BioLabs生產(chǎn))于37℃酶切。
3．連接和轉(zhuǎn)化通過(guò)在含有50mM Tris-HCl(pH7.6)、10mM mgcl2、10mMdithiothreitol、1mM ATP、50mg/ml聚乙二醇(8000)和1單位T4 DNA連接酶(Gibco-BRL生產(chǎn))的反應(yīng)混合物中于16℃反應(yīng)2.5小時(shí)，上述所制備的包含編碼小鼠Kappa類型L鏈的V區(qū)基因的DNA片段和經(jīng)過(guò)SalⅠ和XmaⅠ消化的PUC載體連接。相似地，包含編碼小鼠H鏈V區(qū)基因的DNA片段和經(jīng)過(guò)EcoRⅠ和XmaⅠ消化的PUC19載體在16℃反應(yīng)并連接3小時(shí)。
然后將10μl上述連接混合物加到50μl大腸桿菌DH52的感受態(tài)細(xì)胞中，然后在冰上放置30分鐘、42℃1分鐘、再在冰上放1分鐘。接下來(lái)在其中加入400μl 2×YT培養(yǎng)基(分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)，Sambrook等，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社，(1989)),37℃培養(yǎng)1小時(shí)，然后大腸桿菌在含有50μg/ml氨芐青霉素的zxYT瓊脂培養(yǎng)基上(分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)，Sambrook等，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社，(1989))鋪板，然后于37℃過(guò)夜培養(yǎng)以獲得大腸桿菌轉(zhuǎn)化子。
轉(zhuǎn)化子于37℃在10ml含有50μg/ml氨芐青霉素的2xYT培養(yǎng)基中過(guò)夜培養(yǎng)，然后使用堿裂解方法(分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)，Sambrook等，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社，(1989))從此培養(yǎng)物中制備質(zhì)粒DNA。
如此得到的含有來(lái)自產(chǎn)生抗HM1.24抗體的雜交瘤、編碼小鼠Kappa類型L鏈V區(qū)基因的質(zhì)粒命名為pUCHMVL9。上述方法所獲得的含有來(lái)自產(chǎn)生抗HM1.24抗體的雜交瘤、編碼小鼠H鏈V區(qū)基因的質(zhì)粒命名為pUCHMVHR16。實(shí)施例2．DNA堿基序列的測(cè)定使用自動(dòng)DNA測(cè)序儀(Applied Biosystem Inc.生產(chǎn))和Taq染料雙脫氧終止循環(huán)測(cè)序試劑盒(Applied Biosystem Inc.生產(chǎn))以生產(chǎn)商說(shuō)明的方法測(cè)定上述質(zhì)粒中cDNA編碼區(qū)域的堿基序列。
質(zhì)粒pUCHMVL9中包含的編碼小鼠抗HM1.24抗體L鏈V區(qū)基因的堿基序列顯示于SEQ ID No:1。質(zhì)粒pUCHMVHR16中包含的編碼小鼠抗HM1.24抗體H鏈V區(qū)基因的堿基序列顯示于SEQ ID No:2。實(shí)施例3．CDR的測(cè)定L鏈和H鏈V區(qū)的全面結(jié)構(gòu)相互具有相似性，其中四個(gè)構(gòu)架區(qū)由三個(gè)高度可變的區(qū)域即互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)相連接。構(gòu)架中氨基酸序列是相對(duì)很保守的，但氨基酸序列中的變異是極高的(Kabat,E.A.，等，“免疫目的蛋白的序列”、US Dept.Health and Human Services,1983)。
根據(jù)這些事實(shí)，將抗HM1.24抗體的可變區(qū)的氨基酸序列與數(shù)據(jù)庫(kù)中抗體的氨基酸序列相比較以研究同源性，并且如表5中所示的測(cè)定CDR區(qū)域。表5

實(shí)施例4．克隆cDNA的表達(dá)的確定(嵌合的抗HM1.24抗體的構(gòu)建)1．表達(dá)載體的構(gòu)建為了構(gòu)建表達(dá)嵌合抗HM1.24抗體的表達(dá)載體，分別將編碼小鼠抗HM1.24抗體的L鏈和H鏈V區(qū)的cDNA克隆pUCHMVL9和pUCHMVHR16通過(guò)PCR方法修飾，然后導(dǎo)入HEF表達(dá)載體(國(guó)際申請(qǐng)公開(kāi)號(hào)，WO92-19759)。
設(shè)計(jì)對(duì)應(yīng)于L鏈V區(qū)的反向引物ONS-L722S(SEQ ID No:43)和對(duì)應(yīng)于H鏈V區(qū)的反向引物VHR16S(SEQ ID No:44)以使它們能與編碼每個(gè)V區(qū)前導(dǎo)序列開(kāi)始的DNA雜交，并且它們具有Kozak保守序列(Kozak,M.等，分子生物學(xué)雜志，196,947-950,(1987))和HindⅢ限制性內(nèi)切酶的識(shí)別位點(diǎn)。設(shè)計(jì)對(duì)應(yīng)于L鏈V區(qū)的正向引物VL9A(SEQ IDNo:45)和對(duì)應(yīng)于H鏈V區(qū)的正向引物VHR16A(SEQ ID No:46)以使它們能與編碼丁區(qū)末端的DNA序列雜交，并且它們具有剪接供體序列和BamHⅠ限制性內(nèi)切酶的識(shí)別位點(diǎn)。
含有10mM Tris-HCl(pH8.3)、50mM KCl、0.1mM dNTPs、1.5mMMgCl2、100pmol每一種引物、100ng模板DNA(pUCHMVL9或pUCHMVHR16)和5單位Ampli Taq酶的100μl PCR反應(yīng)混合物用50μl礦物油覆蓋，94％初始變性以后，分別在94℃1分鐘、55℃1分鐘、72℃1分鐘下加熱30個(gè)循環(huán)，最后72℃溫育10分鐘。
PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5％低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠純化，并用HindⅢ和BamHⅠ消化，然后對(duì)于L鏈V區(qū)克隆入HEF-VL-gκ，對(duì)于H鏈V區(qū)克隆進(jìn)HEF-VL-gγl。DNA序列確定以后，包含含有正確DNA序列的DNA片段的質(zhì)粒分別命名為HEF-1.24L-gκ和HEF-1.24H-gγl。
為制備限制性片段，用HindⅢ和BamHⅠ限制性內(nèi)切酶從上述質(zhì)粒HEF-1.34L-gk和HEF-1.24H-gγl中切出編碼各個(gè)可變區(qū)的區(qū)域，將此片段插入質(zhì)粒載體pUC19的HindⅢ和BamHⅠ位點(diǎn)，它們分別命名為pUC19-1.24L-gκ和pUC19-1.24H-gγl。
含有質(zhì)粒pUC19-1.24L-gκ和pUC-1.24H-gγl的大腸桿菌分別命名為大腸桿菌DH5α(pUC19-1.24L-gk)和大腸桿菌DH5α(pUC19-1.24H-gγl)，并于1996年8月29日在布達(dá)佩斯條約的條款下，按國(guó)際慣例儲(chǔ)存于國(guó)立生命科學(xué)和人體技術(shù)研究所，工業(yè)科學(xué)和技術(shù)代理處，MITI(Higashi l-chome 1-3,Tsukuba city,Ibalakiprefecture，日本)，并分別得到保藏號(hào)FERM BP-5646和FERM BP-5644。
2．轉(zhuǎn)染入COS-7細(xì)胞為了觀察嵌合抗HM1.24抗體的瞬時(shí)表達(dá)，在COS-7(美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心CRL-1651)細(xì)胞中檢測(cè)上述表達(dá)載體。使用基因脈沖儀(BioRad生產(chǎn))通過(guò)電穿孔將HEF-1.24L-gκ和HEF-1.24H-gγl共轉(zhuǎn)化入COS-7細(xì)胞。將每一份DNA(10μg)加入0.8ml PBS中，其中含1×107細(xì)胞/ml COS-7細(xì)胞，然后接受1500V和25UF電容的脈沖。
在室溫經(jīng)過(guò)10分鐘的恢復(fù)期之后，將電穿孔的細(xì)胞加到30ml含有10％無(wú)γ球蛋白的胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液(GIBCO生產(chǎn))中。在CO2培養(yǎng)箱BNA120D(TABAI生產(chǎn))培養(yǎng)72小時(shí)后，收集培養(yǎng)物上清，離心去除細(xì)胞碎片，然后用于下面的實(shí)驗(yàn)。
3．FCM分析使用KPMM2細(xì)胞通過(guò)FCM(流式細(xì)胞計(jì)數(shù))分析嵌合抗HM1.24抗體的抗原結(jié)合活性。4.7×105KPMM2細(xì)胞(日本未審查專利公開(kāi)(Kokai)號(hào)，7-236475)用PBS(-)洗滌后，加入50μl能夠產(chǎn)生上述嵌合抗HM1.24抗體的COS-7細(xì)胞培養(yǎng)物和50μl FACS緩沖液(含有2％胎牛血清和0.1％疊氮化鈉的PBS(-))，或加入5μl 500μg/ml純化的小鼠抗HM1.24抗體和95μlFACS緩沖液，在冰上溫育1小時(shí)。
作為對(duì)照，加入50μl 2μg/ml嵌合SK2(國(guó)際申請(qǐng)出版號(hào).WO94-28159)和50μl FACS緩沖液?；蚣尤?μl 500μg/ml純化的小鼠IgG2aR(UPC10)(CAPPEL生產(chǎn))而不是純化的小鼠抗HM1.24抗體和95μl FACS緩沖液，并經(jīng)相似地溫育。用FACS緩沖液洗滌以后，加入100μl 25μg/ml的FITC偶聯(lián)的羊抗人抗體(GAH)(CAPPEL生產(chǎn))或10μg/ml FITC偶聯(lián)的羊抗小鼠抗體(GAM)(Becton Dickonson生產(chǎn))，并在冰上溫育30分鐘。用FACS緩沖液沖洗以后，懸浮于1ml FACS緩沖液中，用FACScan(Becton Dickinson生產(chǎn))測(cè)量每一個(gè)細(xì)胞的熒光強(qiáng)度。
如圖1中所示，表明嵌合抗HM1.24抗體和KPMM2細(xì)胞結(jié)合，因?yàn)榕c對(duì)照相比在嵌合抗HM1.24抗體中入的細(xì)胞中熒光強(qiáng)度的峰向右移動(dòng)，相似于加入小鼠抗HM1.24抗體的情況。這證實(shí)克隆的cDNA編碼小鼠抗HM1.24抗體的可變區(qū)域。實(shí)施例5．能夠穩(wěn)定產(chǎn)生嵌合抗HM1.24抗體的CHO細(xì)胞系的建立1．嵌合H鏈的表達(dá)載體的構(gòu)建用限制性內(nèi)切酶PvuⅠ和BamHⅠ消化上述質(zhì)粒HEF-1.24H-gγl以后，用1.5％低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠純化得到均2.8kbp的片段，它包含EF1啟動(dòng)子和編碼小鼠抗HM1.24抗體H鏈V區(qū)的DNA。接著將上述DNA片段插入約6kbp的片段，此片段是通過(guò)PvuⅠ和BamHⅠ消化用于人H鏈表達(dá)載體的表達(dá)載體DHFR-ΔE-Rvh-PM1f(見(jiàn)國(guó)際申請(qǐng)公開(kāi)號(hào)WO92/19759)而制備的，此載體包含DHFR基因和編碼人H鏈恒定區(qū)的基因以構(gòu)建嵌合抗HM1.24抗體H鏈的表達(dá)載體DHFR-ΔE-HEF-1.24H-gγl。
2．基因?qū)隒HO細(xì)胞為了建立嵌合抗HM1.24抗體的穩(wěn)定合成系統(tǒng)，用PvuⅠ消化使上述表達(dá)載體HEF-1.24-gk和DHFR-ΔE-HEF-1.24H-gγl的基因線形化，在與上述(上述對(duì)COS-7細(xì)胞的轉(zhuǎn)染)相似的條件下用電穿孔方法同時(shí)導(dǎo)入CHO細(xì)胞DXB11(由醫(yī)學(xué)研究委員會(huì)合作中心贈(zèng)送)。
3．由MTX誘導(dǎo)的基因擴(kuò)增在基因?qū)氲腃HO細(xì)胞中，只有L鏈和H鏈表達(dá)載體都導(dǎo)入的那些CHO細(xì)胞才能在加入500μg/ml G418(GIBCO-BRL生產(chǎn))和10％胎牛血清的無(wú)核苷α-MEM培養(yǎng)液(GIBCO-BRL生產(chǎn))中生存，因此對(duì)它們進(jìn)行了選擇。接下來(lái)將10nm MTX(Sigma生產(chǎn))加入上述培養(yǎng)液。在增殖的克隆中，挑選那些能大量合成嵌合抗HM1.24抗體的克隆。因此獲得了合成效率為大約20μg/ml嵌合抗體的克隆#8-13，并命名為嵌合抗HM1.24抗體合成細(xì)胞系。實(shí)施例6．嵌合抗HM1.24抗體的構(gòu)建用以下方法構(gòu)建嵌合抗HM1.24抗體。上述嵌合抗HM1.24抗體合成CHO細(xì)胞通過(guò)高密度細(xì)胞培養(yǎng)儀Verax系統(tǒng)20(CELLEX BIOSCIENCEInc.生產(chǎn))在含有5％無(wú)γ-球蛋白的新生牛血清(GIBCO-BRL)的Iscove修改的Dulbecoo培養(yǎng)基中，繼續(xù)培養(yǎng)30天。
開(kāi)始培養(yǎng)后第13、20、23、26和30天，使用壓力濾器儀器SARTOBRAN(Sartorius生產(chǎn))回收培養(yǎng)液，接著使用大體積抗體收集系統(tǒng)Afiprep系統(tǒng)(Nippon Gaishi生產(chǎn))和超級(jí)蛋白質(zhì)A柱(床體積100ml,Nippon Gaishi生產(chǎn))，并根據(jù)所附說(shuō)明用PBS作為吸附/沖洗緩沖液和0.1M檸檬酸鈉緩沖液(pH3)作為洗脫緩沖液嵌合抗HM1.24抗體進(jìn)行親和純化。向洗脫組分中立即加入1M Tris-HCl(pH8.0)調(diào)至pH7.4。通過(guò)280nm的吸光度測(cè)定抗體濃度，并用1μg/ml相當(dāng)于1.350D來(lái)計(jì)算。實(shí)施例7．嵌合抗HM1.24抗體的活性測(cè)定通過(guò)以下結(jié)合抑制活性來(lái)評(píng)估嵌合抗HM1.24抗體。
1．結(jié)合抑制活性的測(cè)定1-1．生物素化抗HM1.24抗體的構(gòu)建用0.1M碳酸氫鹽緩沖液將小鼠抗HM1.24抗體稀釋至4mg/ml后，加入4μl 50mg/ml生物素-N-羥基琥珀酰胺(EY LABS InC.生產(chǎn))并在室溫下反應(yīng)3小時(shí)。之后向其中加入1.5ml 0.2M甘氨酸溶液在室溫下溫育30分鐘終止反應(yīng)，接著用PD-10柱(Pharmacia Biotech生產(chǎn))收集生物素化的IgG組份。
1-2．結(jié)合抑制活性的測(cè)定使用人羊膜細(xì)胞系WISH細(xì)胞(美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心CCL25)通過(guò)細(xì)胞ELISA測(cè)定生物素化小鼠抗HM1.24抗體的結(jié)合抑制活性。如下制備細(xì)胞ELISA板。往96孔板中加入在補(bǔ)加10％胎牛血清的PRMI1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)的4×105細(xì)胞/ml，過(guò)夜培養(yǎng)，用PBS(-)洗兩遍后，用0.1％戊二醛(Nakalai tesque生產(chǎn))固定。
封閉后，向每加樣孔中加入50μl嵌合的抗HM1.24抗體或親和純化獲得的小鼠抗HM1.24抗體的連續(xù)稀釋液，并同時(shí)加入50μl 2μg/ml生物素化的小鼠抗HM1.24抗體，室溫下溫育2小時(shí)，然后加入過(guò)氧化物酶標(biāo)記的抗生素蛋白鏈霉素(DAKO生產(chǎn))。室溫下溫育1小時(shí)后沖洗，加入底物溶液。加入50μl 6N硫酸終止反應(yīng)后，用微板閱讀儀3550型(Bio-Rad生產(chǎn))測(cè)定490nm的吸光度。
顯示于表2的結(jié)果表明嵌合抗HM1.24抗體和小鼠抗HM1.24抗體對(duì)生物素化的小鼠抗HM1.24抗體有相同的結(jié)合抑制活性。這表明嵌合抗體和小鼠抗HM1.24抗體有相同的V區(qū)。實(shí)施例8．嵌合抗HM1.24抗體ADCC活性的測(cè)定根據(jù)免疫學(xué)現(xiàn)行方法，第7章，人類免疫學(xué)研究，編輯John E,Cokigan et al.,John Wiley&Sons,Inc.,1993所闡明的方法測(cè)定ADCC(抗體依賴性細(xì)胞毒性)活性。
1．效應(yīng)細(xì)胞的制備通過(guò)密度離心的方法從健康者和多發(fā)性骨髓瘤患者的外周血或骨髓中分離單核細(xì)胞。這樣，將等量的PBS(-)加到健康者和多發(fā)性骨髓瘤患者的外周血和骨髓中，它們?cè)趂icoll(Pharmacia生產(chǎn))-Conrey(Daiichi Pharmaceutical Co.Ltd.生產(chǎn))(比重，1.077)上層，400g離心30分鐘。收集單核細(xì)胞，用補(bǔ)加10％胎牛血清(Witaker生產(chǎn))的RPMI1640(Sigma生產(chǎn))洗滌兩次，用相同的培養(yǎng)液將細(xì)胞稀釋為5×106/ml。
2．靶細(xì)胞的制備將人骨髓瘤細(xì)胞系RPML8226(美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心CCL155)在補(bǔ)加10％胎牛血清(Witaker生產(chǎn))的RPMI1640(Sigma生產(chǎn))和0.1mci51Cr鉻酸鈉RPMI1640中于37℃培養(yǎng)60分鐘使之放射性標(biāo)記。放射性標(biāo)記后，細(xì)胞用HanKS平衡的鹽溶液(HBSS)洗三次，濃度調(diào)至2×105/ml。
3．ADCC試驗(yàn)在96孔U型底板(Corning生產(chǎn))中加入50μl 2×105靶細(xì)胞/ml，1μg/ml親和純化的嵌合抗HM1.24抗體和小鼠抗HM1.24抗體、或?qū)φ杖薎gG(Serotec生產(chǎn))，4℃反應(yīng)1分鐘。
然后，當(dāng)效應(yīng)細(xì)胞(E)對(duì)靶細(xì)胞(T)的比率(E∶T)設(shè)為0∶1,5∶1,20∶1，或50∶1時(shí)，往其中加入100μl 5×106效應(yīng)細(xì)胞/ml，在CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4小時(shí)。
取出100μl上清，用計(jì)數(shù)器(ARC361,Aloka生產(chǎn))測(cè)定釋放到培養(yǎng)上清中的放射活性。為了測(cè)定最大放射活性，使用1％NP-40。細(xì)胞毒性(％)用(A-C)/(B-C)×100計(jì)算，其中A是在抗體的存在時(shí)所釋放的放射活性(cpm),B是NP-40釋放的放射活性(cpm),C是不存在抗體單獨(dú)由培養(yǎng)液釋放的放射活性(cpm)。
如圖3所示，與對(duì)照IgG1相比，當(dāng)嵌合抗HM1.24抗體加入時(shí)，細(xì)胞毒性隨著E∶T比的增加而增加，這表明這個(gè)嵌合抗HM1.24抗體有ADCC活性。此外，因?yàn)榧词巩?dāng)加入小鼠抗HM1.24抗體時(shí)也觀察到細(xì)胞毒性，這表明當(dāng)效應(yīng)細(xì)胞是來(lái)自人的細(xì)胞時(shí)，為了獲得ADCC活性需要人抗體的Fc部分。實(shí)施例9．重新構(gòu)建的人抗HM1.24抗體的構(gòu)建1．重新構(gòu)建的人抗HM1.24抗體V區(qū)的設(shè)計(jì)為了構(gòu)建重新構(gòu)建的人抗體，其中小鼠單克隆抗體的CDR已移植到人抗體，優(yōu)選在小鼠抗體的FR和人抗體的FR之間存在高同源性。這樣，使用蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)將小鼠抗HM1.24抗體的L鏈和H鏈V區(qū)和結(jié)構(gòu)已清楚的所有已知抗體的V區(qū)相比較。
小鼠抗HM1.24抗體L鏈V區(qū)與和人L鏈V區(qū)亞組Ⅳ(HSGⅣ)的保守序列最相似，具有66.4％的同源性。另一方面與HSGⅠ、HSGⅡ和HSGⅢ分別具有56.9％、55.8％和61.5％的同源性。
當(dāng)將小鼠抗HM1.24抗體L鏈V區(qū)與已知人抗體L鏈V區(qū)相比較時(shí)，它表明與人L鏈V區(qū)REI，即人L鏈V區(qū)亞組I之一有67.0％的同源性。因此FRI的FR作為重新構(gòu)建的人抗HM1.24抗體L鏈V區(qū)構(gòu)建的起始材料。
設(shè)計(jì)重新構(gòu)建的人抗HM1.24抗體L鏈V區(qū)的a型。在此類型中，人FR和重新構(gòu)建的人CAMPATH-1H抗體(見(jiàn)Riechmann,L.等，自然，322,21-25,(1988)國(guó)際申請(qǐng)專利號(hào)WO92-19759中所描述的、重新構(gòu)建的人PM-1L鏈V區(qū)的a型所含有的FR)所出現(xiàn)的、以REI為基礎(chǔ)的FR相同，小鼠CDR和小鼠抗HM1.24抗體L鏈V區(qū)中的CDR相同。
小鼠抗HM1.24抗體H鏈V區(qū)與人H鏈V區(qū)HSGⅠ的保守序列最相似。具有54.7％的同源性。另一方面，它與HSGⅡ和HSGⅢ分別顯示有34.6％和48.1％的同源性。當(dāng)小鼠抗HM1.24抗體H鏈V區(qū)和已知人抗體H鏈V區(qū)相比較時(shí)，F(xiàn)R1和FR3和人抗體HG3H鏈V區(qū)，即人H鏈V區(qū)亞組I之一(Rechavi,G.et al.，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)，80,855-859)最相似，具有67.3％的同源性。
所以，人抗體HG3的FR作為重新構(gòu)建的人抗HM1.24抗體H鏈V區(qū)構(gòu)建的起始材料。然而，因?yàn)檫€未描述人HG3的FR4的氨基酸序列，所以使用與小鼠抗HM1.24抗體H鏈FR4有最高同源性的人抗體JH6 FR4的氨基酸序列(Ravetch,J.V.等，細(xì)胞，27,583-591)。除了一個(gè)氨基酸外，JH6的FR4和小鼠抗HM1.24抗體H鏈FR4有相同的氨基酸序列。
在重新構(gòu)建的人抗HM1.24抗體H鏈V區(qū)的第一種類型a型中，除了人FR1第30位的氨基酸和人FR3中第71位的氨基酸和小鼠抗HM1.24抗體中的氨基酸相同外，F(xiàn)R1至FR3和人HG3的FR1至FR3相同，CDR和小鼠抗HM1.24抗體H鏈V區(qū)的CDR相同。
2．重新構(gòu)建的人抗HM1.24抗體L鏈V區(qū)的構(gòu)建通過(guò)PCR方法中CDR的移植構(gòu)建重新構(gòu)建人抗HM1.24抗體的L鏈。方法顯示于圖4。8個(gè)PCR引物用于構(gòu)建具有起源于人抗體REI FR的重新構(gòu)建人抗HM1.24抗體(a型)。設(shè)計(jì)外引物A(SEQ ID No:47)和H(SEQ ID No:48)使之與表達(dá)載體HEF-VL-gκ的DNA序列雜交。
CDR移植引物L(fēng)1S(SEQ ID No:49)、L2S(SEQ ID No:50)和L3S(SEQID No:51)有正義DNA序列。CDR移植引物L(fēng)1A(SEQ ID No:52)、L2A(SEQID No:53)和L3A(SEQ ID No:54)具有反義DNA序列，每一個(gè)分別具有與引物L(fēng)1S、L2S和L3S 5’末端的DNA序列互補(bǔ)的DNA序列(20至23bp)。
在PCR第一階段，進(jìn)行四個(gè)反應(yīng)A-L1A、L1S-L2A、L2S-L3A和L3S-H以純化每個(gè)PCR產(chǎn)物。第一階段PCR的四個(gè)產(chǎn)物能夠通過(guò)它們自己的互補(bǔ)與另一個(gè)進(jìn)行裝配(見(jiàn)國(guó)際申請(qǐng)公開(kāi)號(hào)WO92-19759)。接著，加入外引物A和H擴(kuò)增編碼重新構(gòu)建的人抗HM1.24抗體L鏈V區(qū)的全長(zhǎng)DNA(第二次PCR)。在上述PCR中，編碼根據(jù)人抗體REI起源的FR而重新構(gòu)建的人ONS-M21抗體L鏈V區(qū)a型的質(zhì)粒HEF-RVL-M21a(見(jiàn)國(guó)際申請(qǐng)公開(kāi)號(hào)WO95-14041)作為模板。
在PCR的第一階段，使用含有10mM Tris-HCl(pH8.3)、50mMKCl、0.1mM dNTP、1.5mM MgCl2、100ng模板DNA、100pmol每一引物和5U Ampli Taq的PCR混合物。每一個(gè)PCR試管用50μ礦物油覆蓋。94℃加熱首先變性后，進(jìn)行94℃1分鐘、55℃1分鐘和72℃1分鐘的一個(gè)反應(yīng)循環(huán)，然后72℃溫育10分鐘。
用1.5％低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠純化PCR產(chǎn)物A-L1A(215bp)、L1S-L2A(98bp)、L2S-L3A(140bp)和L3S-H，并在第二次PCR中裝配。在第二次PCR中，含有1μg每一個(gè)第一階段PCR產(chǎn)物和5U Ampli Taq的98μlPCR混合物在94℃2分鐘、55℃2分鐘和72℃兩分鐘下溫育2個(gè)反應(yīng)循環(huán)，然后加入100pmol每一種外引物(A和H)。用50μl礦物油覆蓋PCR管子，并在如上的相同條件下進(jìn)行30個(gè)循環(huán)的PCR反應(yīng)。
用1.5％低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠從第二次PCR中純化獲得516bp DNA片段，然后用BamHⅠ和HindⅢ消化，將如此獲得的DNA片段克隆入HEF表達(dá)載體HEF-VL-gκ。確定DNA序列后，含有重新構(gòu)建的人抗HM1.24抗體L鏈V區(qū)正確氨基酸序列的DNA片段的質(zhì)粒命名為質(zhì)粒HEF-RVLa-AHM-gκ。質(zhì)粒HEF-RVLa-AHM-gκ中含有的L鏈V區(qū)的氨基酸序列和堿基序列顯示于SEQ ID No:9。
使用PCR通過(guò)誘變構(gòu)建重新構(gòu)建的人抗HM1.24抗體L鏈V區(qū)的b型。設(shè)計(jì)誘變引物FTY-1(SEQ ID No:55)和FTY-2(SEQ ID No:56)使得71位的苯丙氨酸突變成酪氨酸。
使用質(zhì)粒HEF-RVLa-AHM-gκ作模板擴(kuò)增上述引物以后，純化并用BamHⅠ和HindⅢ消化終產(chǎn)物。獲得的DNA片段克隆進(jìn)HEF表達(dá)載體HEF-VL-gκ以得到質(zhì)粒HEF-RVLb-AHM-gκ。質(zhì)粒HEF-RVLb-AHM-gκ含有的L鏈V區(qū)的氨基酸序列和堿基序列顯示于SEQID No:10。
3．重新構(gòu)建的人抗HM1.24抗體H鏈V區(qū)的構(gòu)建3-1．重新構(gòu)建的人抗HM1.24抗體H鏈V區(qū)a至e型的構(gòu)建按如下設(shè)計(jì)編碼重新構(gòu)建的人抗HM1.24抗體H鏈V區(qū)的DNA。通過(guò)將編碼人抗體HG3 FR1至3和人抗體JH6 FR4的DNA序列連接到編碼小鼠抗HM1.24抗體H鏈V區(qū)CDR的DNA序列上，設(shè)計(jì)編碼重新構(gòu)建人抗HM1.24抗體H鏈V區(qū)的全長(zhǎng)DNA。
接著，分別將HindⅢ識(shí)別位點(diǎn)/KOZAK保守序列和BamHⅠ識(shí)別位點(diǎn)/剪接供體序列加到此DNA序列的5’末端和3’-未端使得插入HEF表達(dá)載體。
如此設(shè)計(jì)的DNA序列分成四個(gè)寡核苷酸。接下來(lái)有可能阻礙這些寡核苷酸裝配的寡核苷酸接受對(duì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的計(jì)算機(jī)分析。四個(gè)寡核苷酸RVH1至RVH4的序列顯示于SEQ ID No:57至60。這些寡核苷酸具有119至144個(gè)堿基的長(zhǎng)度和25至26bp的交錯(cuò)區(qū)。在這些寡核苷酸中，RVH2(SEQ ID No:58)和RVH4(SEQ ID No:60)具有正義DNA序列，RVH1(SEQ ID No:57)和RVH3(SEQID No:59)具有反義DNA序列。通過(guò)PCR裝配這四個(gè)寡核苷酸的方法顯示于圖中(見(jiàn)圖5)。
包含100ng每種寡核苷酸和5U Ampli Taq的PCR混合物(98μl)首先在94℃加熱2分鐘變性，并接受94℃2分鐘，55℃2分鐘和72℃2分鐘的兩個(gè)循環(huán)溫育。在加入100pmol RHP1(SEQ ID No:61)和RHP2(SEQ ID No:62)作為外引物后，PCR試管用50μl礦物油覆蓋。接著首先在94℃加熱1分鐘變性，然后于94℃1分鐘、55℃1分鐘、72℃1分鐘30個(gè)循環(huán)，并在72℃溫育10分鐘。
用1.5％低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠純化438bp DNA片段，用HindⅢ和BamHⅠ消化，并克隆入HEF表達(dá)載體HEF-VH-gγl。堿基序列測(cè)定后，含有編碼H鏈正確V區(qū)氨基酸序列的DNA片段的質(zhì)粒命名為HEF-RVHa-AHM-gγl。質(zhì)粒HEF-RVHa-AHM-gγl中所含H鏈V區(qū)的氨基酸序列和堿基序列顯示于SEQ ID No:11。
按如下構(gòu)建重新構(gòu)建的人抗HM1.24抗體H鏈V區(qū)的每一類型b、c、d、和e。
設(shè)計(jì)誘變引物BS(SEQ ID No:63)和BA(SEQ ID No:64)使66位精氨酸突變成賴氨酸，并將質(zhì)粒HEF-RVHa-AHM-gγl作為模板，通過(guò)PCR方法擴(kuò)增b型獲得質(zhì)粒HEF-RVHb-AHM-gγl。質(zhì)粒HEF-RVHb-AHM-gγl中所含H鏈V區(qū)的氨基酸序列和堿基序列顯示于SEQ IDNo:12。
設(shè)計(jì)誘變引物CS(SEQ ID No:65)和CA(SEQ ID No:66)使73位蘇氨酸突變成賴氨酸，質(zhì)粒HEF-RVHa-AHM-gγl作為模板，通過(guò)PCR方法，擴(kuò)增C型以獲得質(zhì)粒HEF-RVHc-AHM-gγl。質(zhì)粒HEF-RVHc-AHM-gγl中所含H鏈V區(qū)的氨基酸序列和堿基序列顯示于SEQ IDNo:13。
設(shè)計(jì)誘變引物DS(SEQ ID No:67)和DA(SEQ ID No:68)使66位精氨酸突變成賴氨酸，質(zhì)粒HEF-RVHa-AHM-gγl作為模板，通過(guò)PCR方法擴(kuò)增d型以獲得質(zhì)粒HEF-RVHd-AHM-gγl。質(zhì)粒HEF-RVHd-AHM-gγl中所含H鏈V區(qū)的氨基酸序列和堿基序列顯示于SEQ IDNo:14。
設(shè)計(jì)誘變引物ES(SEQ ID No:69)和EA(SEQ ID No:70)使67位纈氨酸突變成丙氨酸，69位蛋氨酸突變成亮氨酸，質(zhì)粒HEF-RVHa-AHM-gγl作為模板，通過(guò)PCR方法擴(kuò)增e型以獲得質(zhì)粒HEF-RVHe-AHM-gγl。質(zhì)粒HEF-RVHe-AHM-gγl中所含H鏈V區(qū)的氨基酸序列和堿基序列顯示于SEQ ID No:15。
3-2．H鏈雜合V區(qū)的構(gòu)建構(gòu)建兩個(gè)H鏈雜合V區(qū)域。一個(gè)是小鼠人雜合抗HM1.24抗體，其中FR1和FR2的氨基酸序列來(lái)自小鼠抗HM1.24抗體，F(xiàn)R3和FR4的氨基酸序列來(lái)自重新構(gòu)建的人抗HM1.24抗體H鏈V區(qū)的a型。另一個(gè)是人小鼠雜合抗HM1.24抗體，其中FR1和FR2的氨基酸序列來(lái)自于重多人抗HM1.24抗體H鏈V區(qū)的a型，F(xiàn)R3和FR4的氨基酸序列來(lái)自于小鼠抗HM1.24抗體。CDR區(qū)的氨基酸序列都來(lái)自小鼠抗HM1.24抗體。
用PCR方法構(gòu)建兩個(gè)H鏈雜合V區(qū)。此方法按圖式顯示于圖6和7。為構(gòu)建兩個(gè)H鏈雜合V區(qū)，使用四個(gè)引物。設(shè)計(jì)外引物a(SEQ ID No:71)和h(SEQ ID No:72)使它與HEF表達(dá)載體HEF-VH-gγl的DNA序列雜交。設(shè)計(jì)H鏈雜合構(gòu)建引物HYS(SEQ ID No:73)使之有正義DNA序列，并設(shè)計(jì)H鏈雜合引物HYA(SEQ ID No:74)使之有反義DNA序列以使DNA序列能夠相互互補(bǔ)。
為了構(gòu)建H鏈雜合V區(qū)，其中FR1和FR2的氨基酸序列來(lái)自小鼠抗HM1.24抗體，F(xiàn)R3和FR4的氨基酸序列來(lái)自重新構(gòu)建的人抗HM1.24抗體H鏈V區(qū)的a型，在PCR的第一階段進(jìn)行以質(zhì)粒HEF-1.24H-gγl為模板、外引物a和H鏈雜合引物HYA的PCR和以質(zhì)粒HEF-RVHa-AHM-gγl為模板、H鏈雜合引物HYS(SEQ ID No:73)和外引物h(SEQID No:72)的PCR，并純化每一PCR產(chǎn)物。第一階段兩個(gè)PCR產(chǎn)物通過(guò)它們自身的互補(bǔ)性能夠裝配起來(lái)(見(jiàn)國(guó)際申請(qǐng)公開(kāi)號(hào)WO92-19759)。
接著加入外引物a(SEQ ID No:71)和h(SEQ ID No:72)在第二階段PCR中擴(kuò)增編碼H鏈雜合V區(qū)的全長(zhǎng)DNA，其中FR1和FR2的氨基酸序列來(lái)自小鼠抗HM1.24抗體，F(xiàn)R3和FR4的氨基酸序列來(lái)自重新構(gòu)建的人抗HM1.24抗體H鏈V區(qū)的a型。
為了構(gòu)建H鏈雜合V區(qū)，其中FR1和FR2的氨基酸序列來(lái)自重新構(gòu)建的人抗HM1.24抗體H鏈V區(qū)的a型，F(xiàn)R3和FR4的人抗HM1.24抗體H鏈V區(qū)的a型，F(xiàn)R3和FR4的氨基酸序列來(lái)自小鼠抗HM1.24抗體，在PCR的第一階段進(jìn)行以質(zhì)粒HEF-HVHa-AHM-gγl為模板、外引物a上H鏈雜合引物HYA的PCR和以質(zhì)粒HEF-1.24--gγl為模板、H鏈雜合引物HYS和外引物h的PCR，并純化每一PCR產(chǎn)物。第一階段兩個(gè)PCR產(chǎn)物通過(guò)它們自來(lái)的互補(bǔ)性能夠裝配起來(lái)(見(jiàn)國(guó)際申請(qǐng)公開(kāi)號(hào)WO92-19759)。
接著加入外引物a和h，在第二階段PCR中擴(kuò)增編碼H鏈雜合V區(qū)的全長(zhǎng)DNA，其中FR1和FR2的氨基酸序列來(lái)自重新構(gòu)建人抗HM1.24抗體H鏈V區(qū)的a型，F(xiàn)R3和FR4的氨基酸序列來(lái)自小鼠抗HM1.24抗體。
進(jìn)行第一階段PCR、PCR產(chǎn)物的純化、裝配、第二階段PCR和克隆入HEF表達(dá)載體HEF-VH-gγl的方法按照“實(shí)施例9．重新構(gòu)建人抗HM1.24抗體L鏈V區(qū)的構(gòu)建”中所示的方法。
DNA序列測(cè)定后，含有編碼H鏈雜種V區(qū)正確氨基酸序列的DNA片段的質(zhì)粒命名為HEF-MH-RVH-AHM-gγl，其中FR1和FR2的氨基酸序列來(lái)自小鼠抗HM1.24抗體，F(xiàn)R3和FR4的氨基酸序列來(lái)自重新構(gòu)建的人抗HM1.24抗體H鏈V區(qū)的a型。質(zhì)粒HEF-MH-RVH-AHM-gγl中所含H鏈V區(qū)的氨基酸序列和堿基序列顯示于SEQ ID No.75。含有編碼H鏈雜合V區(qū)正確氨基酸序列的DNA片段的質(zhì)粒命名為HEF-HM-RVH-AHM-gγl，其中FR1和FR2的氨基酸序列來(lái)自重新構(gòu)建的人抗HM1.24抗體H鏈V區(qū)的a型，F(xiàn)R3和FR4的氨基酸序列來(lái)自于小鼠抗HM1.24抗體。質(zhì)粒HEF-HM-RVH-AHM-gγl中所含H鏈V區(qū)的氨基酸序列和堿基序列顯示于SEQ ID No:76。
3-3．重新構(gòu)建人抗HM1.24抗體H鏈V區(qū)f至s型的構(gòu)建按如下構(gòu)建重新構(gòu)建的人抗HM1.24抗體H鏈V區(qū)的每一類型f、g、h、i、j、k、l、m、n、o、p、q、r和s。
設(shè)計(jì)誘變引物FS(SEQ ID No:78)和FA(SEQ ID No:79)使75位蘇氨酸突變成絲氨酸，78位纈氨酸突變成丙氨酸，質(zhì)粒HEF-RVHe-AHM-gγl作為模板DNA，通過(guò)PCR方法擴(kuò)增f型以獲得質(zhì)粒HEF-RVHf-AHM-gγl。質(zhì)粒HEF-RVHf-AHM-gγ1中所含H鏈V區(qū)的氨基酸序列和堿基序列顯示于SEQ ID No:16。
設(shè)計(jì)誘變引物GS(SEQ ID No:80)和GA(SEQ ID No:81)使40位丙氨酸突變成精氨酸，質(zhì)粒HEF-RVHa-AHM-gγl作為模板DNA，擴(kuò)增g型以獲得質(zhì)粒HEF-RVHg-AHM-gγl。質(zhì)粒HEF-RVHg-AHM-gγl中所含H鏈V區(qū)的氨基酸序列和人源化重新構(gòu)建的人抗體顯示于SEQ IDNo:17。
設(shè)計(jì)誘變引物FS(SEQ ID No:78)和FA(SEQ ID No:79)，質(zhì)粒HEF-RVHb-AHM-gγl作為模板DNA，擴(kuò)增h型以獲得質(zhì)粒HEF-RVHh-AHM-gγl。質(zhì)粒HEF-RVHh-AHM-gγl中所含H鏈V區(qū)的氨基酸序列和堿基序列顯示于SEQ ID No:18。
設(shè)計(jì)誘變引物IS(SEQ ID No:82)和IA(SEQ ID No:83)使83位精氨酸突成丙氨酸，84位絲氨酸突變成苯丙氨酸，質(zhì)粒HEF-RVHh-AHM-gγl作為模板DNA，擴(kuò)增i型以獲得質(zhì)粒HEF-RVHi-AHM-gγl。質(zhì)粒HEF-RVHi-AHM-gγl中所含H鏈V區(qū)的氨基酸序列和堿基序列顯示于SEQ ID No:19。
設(shè)計(jì)誘變引物JS(SEQ ID No:84)和JA(SEQ ID No:85)使66位精氨酸突變成賴氨酸，質(zhì)粒HEF-RVHf-AHM-gγl作為模板DNA，擴(kuò)增j型以獲得質(zhì)粒HEF-RVHj-AHM-gγl。質(zhì)粒HEF-RVHj-AHM-gγl中所含H鏈V區(qū)的氨基酸序列和堿基序列顯示于SEQ ID No:20。
設(shè)計(jì)誘變引物KS(SEQ ID No:86)和KA(SEQ ID No:98)使81位的谷氨酸突變成谷氨酰胺，質(zhì)粒HEF-RVHh-AHM-gγl作為模板DNA，擴(kuò)增K型以獲得質(zhì)粒HEF-RVHk-AHM-gγl。質(zhì)粒HEF-RVHk-AHM-gγl中所含H鏈V區(qū)的氨基酸序列和堿基序列顯示于SEQ IDNo:21。
設(shè)計(jì)誘變引物L(fēng)S(SEQ ID No:88)和LA(SEQ ID No:89)使81位的谷氨酸突變成谷氨酰酰胺，82B位的絲氨酸突變成異亮氨酸，質(zhì)粒HEF-RVHh-AHM-gγl作為模板DNA，擴(kuò)增1型以獲得質(zhì)粒HEF-RVHl-AHM-gγl。質(zhì)粒HEF-RVHl-AHMH-gγl中所含H鏈V區(qū)的氨基酸序列和堿基序列顯示于SEQ ID No:22。
設(shè)計(jì)誘變引物MS(SEQ ID No:90)和MA(SEQ ID No:91)使81位的谷氨酸突變成谷氨酸胺，82b位的絲氨酸突變成異亮氨酸，87位的蘇氨酸突變成絲氨酸，質(zhì)粒HEF-RVHh-AHM-gγl作為模板DNA，擴(kuò)增m型以獲得質(zhì)質(zhì)粒HEF-RVHm-AHM-gγl。質(zhì)粒HEF-RVHm-AHM-gγl中中所含H鏈V區(qū)的氨基酸序列和堿基序列顯示于SEQ ID No:23。
設(shè)計(jì)誘變引物NS(SEQ ID No:92)和NA(SEQ ID No:93)使82B位的絲氨酸突變成異亮氨酸，質(zhì)粒HEF-RVHh-AHM-gγl作為模板DNA，擴(kuò)增n型以獲得質(zhì)粒HEF-RVHn-AHM-gγl。質(zhì)粒HEF-RVHn-AHM-gγl中所含H鏈V區(qū)的氨基酸序列和堿基序列顯示于SEQ IDNo:24。
設(shè)計(jì)誘變引物OS(SEQ ID No:94)和OA(SEQ ID No:95)使87位蘇氨酸突變成絲氨酸，質(zhì)粒HEF-RVHh-AHM-gγl作為模板DNA，擴(kuò)增o型以獲得質(zhì)粒HEF-RVHo-AHM-gγl。質(zhì)粒HEF-RVHo-AHM-gγl中所含H鏈V區(qū)的氨基酸序列和堿基序列顯示于SEQ ID No:25。
設(shè)計(jì)誘變引物PS(SEQ ID No:96)和PA(SEQ ID No:97)使78位纈氨酸突變成丙氨酸。質(zhì)粒HEF-RVHa-AHM-gγl作為模板DNA，通過(guò)PCR方法擴(kuò)增p型以獲得質(zhì)粒HEF-RVHp-AHM-gγl。質(zhì)粒HEF-RVHp-AHM-gγl中所含H鏈V區(qū)的氨基酸序列和堿基序列顯示于SEQ IDNo:26。
設(shè)計(jì)誘變引物QS(SEQ ID No:98)和QA(SEQ ID No:99)使75位蘇氨酸突變成絲氨酸，質(zhì)粒HEF-RVHa-AHM-gγl作為模板DNA，通過(guò)PCR方法擴(kuò)增q型以獲得質(zhì)粒HEF-RVHq-AHM-gγl。質(zhì)粒HEF-RVHq-AHM-gγl中所含H鏈V區(qū)的氨基酸序列和堿基序列顯示于SEQ IDNo:27。
設(shè)計(jì)誘變引物CS(SEQ ID No:65)和CA(SEQ ID No:66)，質(zhì)粒HEF-RVHp-AHM-gγl作為模板DNA，通過(guò)PCR方法擴(kuò)增r型以獲得質(zhì)粒HEF-RVHr-AHM-gγl。質(zhì)粒HEF-RVHr-AHM-gγl中所含H鏈V區(qū)的氨基酸序列和堿基序列顯示于SEQ ID No:28。
使用PCR通過(guò)誘變構(gòu)建重新構(gòu)建的人抗HM1.24抗體H鏈V區(qū)的S型。設(shè)計(jì)誘變引物SS(SEQ ID No:100)和SA(SEQ ID No:101)使69位蛋氨酸突變成異亮氨酸。
使用質(zhì)粒HEF-RVHr-AHM-gγl作為模板DNA擴(kuò)增上述引物以后，純化終產(chǎn)物，用BamHⅠ和HindⅢ消化，獲得的DNA片段克隆入HEF表達(dá)載體HEF-VH-gγl以獲得質(zhì)粒HEF-RVHs-AHM-gγl。質(zhì)粒HEF-RVHs-AHM-gγl中所含H鏈V區(qū)的氨基酸序列和堿基序列顯示于SEQ ID No:102。
編碼每一上述質(zhì)粒HEF-RVLa-AHM-gκ可變區(qū)的區(qū)域和HEF-RVHr-AHM-gγl用限制性內(nèi)切酶HindⅢ和BamHⅠ消化以制備限制性片段。將它們插入質(zhì)粒載體pUC19的HindⅢ和BamHⅠ位點(diǎn)。每個(gè)質(zhì)粒命名為pUC19-RVLa-AHM-gκ和pUC19-RVHr-AHM-gγl。
含有每種質(zhì)粒pUC19-RVLa-AHM-gk和pUC19-RVHr-AHM-gγl的大腸桿菌分別命名為大腸桿菌DH5α(pUC19-RVLa-AHM-gk)和大腸桿菌DH5α(pUC19-RVHr-AHM-gγl)，并在布達(dá)佩斯條約的條款下，于1996年8月29日按國(guó)際慣例儲(chǔ)存在國(guó)立生命科學(xué)和人體技術(shù)研究所、工業(yè)科學(xué)和技術(shù)代理處、MITI(Higashil-Chome1-3,Tsukuba city,Ibalaki Prefecture，日本)，并分別得到保藏號(hào)FERMBP-5645和FERMBP-5643。
編碼上述質(zhì)粒HEF-RVHs-AHM-gγl可變區(qū)的區(qū)域用限制性內(nèi)切酶HindⅢ和BamHⅠ消化以制備限制性片段。將它們插入質(zhì)粒載體pUC19的HindⅢ和BamHⅠ位點(diǎn)。獲得的質(zhì)粒命名為pUC19-RVHs-AHM-gγl。
含有質(zhì)粒pUC19-RVHs-AHM-gγl的大腸桿菌命名為大腸桿菌DH5α(pUC19-RVHs-AHM-gγl)，并在布達(dá)佩斯條約的條款下，于1997年9月29日按國(guó)際慣例儲(chǔ)存在國(guó)立生命科學(xué)和體技術(shù)研究所、工業(yè)科學(xué)和技術(shù)代理處、MITI(Higashil-Chmoe1-3,Tsukuba City,Ibalaki Prefecture，日本)，并獲得保藏號(hào)FERM BP-6127。
4．重新構(gòu)建的人抗HM1.24抗體、嵌合的抗HM1.24抗體和H鏈雜合抗體的構(gòu)建為了評(píng)估重新構(gòu)建的人抗HM1.24抗體的每一條鏈，允許重新構(gòu)建的人抗HM1.24抗體和嵌合抗HM1.24抗體作為正對(duì)照表達(dá)，在每個(gè)b型的構(gòu)建中和重新構(gòu)建的人抗-HM1.24抗體H鏈V區(qū)的構(gòu)建后，為了研究FR中哪一個(gè)氨基酸序列應(yīng)當(dāng)被替代。允許表達(dá)H鏈雜合抗體。此外，為了評(píng)估重新構(gòu)建的人抗HM1.24抗體L鏈的a型，將它與嵌合H鏈聯(lián)合表達(dá)。
4-1．重新構(gòu)建的人抗HM1.24抗體的表達(dá)(1)使用基因脈沖儀(Biorad生產(chǎn))通過(guò)電穿孔將10μg每種重新構(gòu)建的人抗HM1.24抗體H鏈的表達(dá)載體(HEF-RVHa-AHM-gγl-HEF-RVHr-AHM-gγl)和重新構(gòu)建的人抗HM1.24抗體的L鏈的表達(dá)載體(HEF-RVLa-AHM-gk或HEF-RVLb-AHM-gk)共轉(zhuǎn)化入COS-7細(xì)胞。將每一份DNA(10μg)加入0.8ml溶液中，此溶液是PBS中含有濃度為1×107細(xì)胞/ml的細(xì)胞，并接受1500V和25UF電容的脈沖。
室溫下10分鐘的恢復(fù)期后，將電穿孔的細(xì)胞加到30ml含10％無(wú)γ-球蛋白胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基(GIBCO生產(chǎn))中。在37℃和5％CO2條件下在CO2培養(yǎng)箱BNA120D(TABAI生產(chǎn))中培養(yǎng)72小時(shí)后，收集培養(yǎng)上清，在帶有離心轉(zhuǎn)頭O3(HITACHI生產(chǎn))的離心機(jī)15PR-22(HITACHI生產(chǎn))1000rpm離心5分鐘去除細(xì)胞碎片，用帶有離心轉(zhuǎn)頭JA-20.1(BECKMAN生產(chǎn))的離心機(jī)J2-21(BECKMAN生產(chǎn))超濾微量濃縮器(Centricon100,Amicon生產(chǎn))，并且用于細(xì)胞ELISA。重新構(gòu)建的人抗HM1.24抗體的表達(dá)(2)使用基因脈沖儀(Biorad生產(chǎn))通過(guò)電穿孔將10μg每種重新構(gòu)建的人抗HM1.24抗體H鏈“S”型的表達(dá)載體(HEF-RVHs--AHM-gγl)和重新構(gòu)建的人抗HM1.24抗體L鏈的表達(dá)載體(HEF-RVLa-AHM-gk)共轉(zhuǎn)化入COS-7細(xì)胞。將每一份DNA(10μg)加入0.8ml溶液中，此溶液是PBS中含有濃度為1×107細(xì)胞/ml的細(xì)胞，并接受1500V和2.5UF電容的脈沖。
室溫下10分鐘的恢復(fù)期后，電穿孔的細(xì)胞加到30ml含10無(wú)γ-球蛋白胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基(GIBCO生產(chǎn))中。在37℃和5％CO2條件下于CO2培養(yǎng)箱BNA120D(TABAI生產(chǎn))中培養(yǎng)72小時(shí)后，收集培養(yǎng)上清，在帶有離心轉(zhuǎn)頭O3(HITACHI生產(chǎn))的離心機(jī)05PR-22(HITACHI生產(chǎn))1000rpm離心5分鐘去除細(xì)胞碎片，用帶有離心轉(zhuǎn)頭JA-20.1(BECKMAN生產(chǎn))的離心機(jī)J2-21(BECKMAN生產(chǎn))通過(guò)超濾濃縮微量濃縮器(Centricon100,Amicon生產(chǎn))，用濾器MillexGVBmm(Millipore生產(chǎn))進(jìn)行過(guò)濾除菌，然后用于細(xì)胞ELISA。
4-2．嵌合抗HM1.24抗體的表達(dá)使用10μg每種嵌合抗HM1.24抗體H鏈的表達(dá)載體HEF-1.24-gγl和嵌合抗HM1.24抗體L鏈的表達(dá)載體HF-1.24L-gk，根據(jù)上述重新構(gòu)建的人抗-HM1.24抗體的表達(dá)方法制備用于細(xì)胞-ELISA的嵌合抗HM1.24抗體。
4-3．包含人a型L鏈和嵌合H鏈的抗HM1.24抗體的表達(dá)使用10μg的嵌合抗HM1.24抗體的表達(dá)載體HEF-1.24-gγl和重新構(gòu)建的人抗HM1.24抗體L鏈a型的表達(dá)載體HEF-RVLa-AHM-gκ，根據(jù)上述重新構(gòu)建的人抗HM1.24抗體的表達(dá)方法制備用于細(xì)胞ELISA的含有人a型L鏈和嵌合H鏈的抗HM1.24抗體。
4-4．H鏈雜合抗體的表達(dá)使用10μgH鏈雜種V區(qū)的表達(dá)載體(HEF-MH-RVH-AHM-gγl或HEF-HM-RVH-AHM-gγl)和重新構(gòu)建的人抗HM1.24抗體L鏈的表達(dá)載體HEF-RVLa-AHM-gκ，根據(jù)上述重新構(gòu)建的人抗HM1.24抗體的表達(dá)方法制備用于細(xì)胞ELISA的H鏈雜合抗體。
4-5．抗體濃度的測(cè)定用ELISA測(cè)定獲得的抗體濃度。加入100μl用包被緩沖液(0.1MNaHCO3、0.02％NaN3、pH9.6)稀釋為1μg/ml的羊抗人IgG抗體(BIOSOURCE生產(chǎn))固定96孔ELISA板(MaXi Sorp,NUNC生產(chǎn))的每一加樣個(gè)孔。并在室溫下溫育1小時(shí)。用100μl稀釋緩沖液(50mMTris-HCl、1mM MgCl2、0.15M NaCl、0.05％Tween 20、0.02％NaN3、1％牛血清白蛋白(BSA)、pH8.1)封閉后，將100μl超濾濃縮的含有重新構(gòu)建的人抗HM1.24抗體、嵌合的抗HM1.24抗體或H鏈雜合抗體的COS-7細(xì)胞培養(yǎng)上清的每一連續(xù)稀釋液加到每一孔中，在室溫下溫育1小時(shí)。洗滌以后，加入100μl堿性磷酸酶標(biāo)記的羊抗人IgG抗體(DAKO生產(chǎn))。
室溫下溫育1小時(shí)和洗滌后，加入100μl溶解在底物緩沖液(50mMNaHCO3、10mMMgcl2、pH9.8)中的1μg/ml底物溶液(Sigma104、對(duì)硝基苯磷酸、SIGMA)，然后使用微板閱讀儀3550型(Bio Rad生產(chǎn))測(cè)定405nm的吸光度。使用人IgG1R(binding Site生產(chǎn))作為濃度測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)。
5．穩(wěn)定合成重新構(gòu)建的人抗HM1.24抗體的CHO細(xì)胞系的建立5-1．對(duì)重新構(gòu)建的人抗HM1.24抗體H鏈的表達(dá)載體的構(gòu)建用限制性內(nèi)切酶PvuⅠ和BamHⅠ消化質(zhì)粒HEF-RVHr-AHM-gγl,通過(guò)1.5％低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠純化含有編碼EF1啟動(dòng)子和重新構(gòu)建的人抗HM1.24抗體H鏈V區(qū)DNA的約2.8kbp片段。接著，將上述DNA片段插入6kbp片段的構(gòu)建重新構(gòu)建的人抗HM1.24抗體H鏈的表達(dá)載體DHFR-ΔE-HEF-RVHr-AHM-gγl，其中6kbp片段是用PvuⅠ和BamHⅠ消化用于人H鏈表達(dá)的表達(dá)載體DHFR-ΔE-RVh-pmlf(國(guó)際申請(qǐng)出版號(hào)，WO92-19759)而制備的，它含有DHFR基因和編碼人H鏈恒定區(qū)的基因。
5-2．基因?qū)隒HO細(xì)胞為了建立重新構(gòu)建的人抗HM1.24抗體的穩(wěn)定合成系統(tǒng)，在與上述(轉(zhuǎn)染入上述COS-7細(xì)胞)相似的條件下通過(guò)電穿孔方法將用PvuⅠ消化而線性化的上述表達(dá)載體DHFR-ΔE-HEF-RVHr-AHM-gγl和HEF-RVLa-AHM-gκ的基因同時(shí)導(dǎo)入CHO細(xì)胞DXB-11。
5-3．通過(guò)MTX的基因擴(kuò)增在基因?qū)氲腃HO細(xì)胞中，只有L鏈和H鏈表達(dá)載體都導(dǎo)入的那些CHO細(xì)胞才能在加有500μg/ml G418(GIBCO-BRL生產(chǎn))和10％胎牛血清的無(wú)核苷a-MEM培養(yǎng)基(GIBCO-BRL生產(chǎn))中成活。接下來(lái)，將10nm MTX(Sigma生產(chǎn))加入上述培養(yǎng)基中。在增殖的克隆中，挑選能大量合成重新構(gòu)建的人抗HM1.24抗體的那些克隆。因此獲得重新構(gòu)建的人抗HM1.24抗體合成效率約3μg/ml的克隆1，并命名為重新構(gòu)建的人抗HM1.24抗體合成細(xì)胞系。
5-4．重新構(gòu)建的人抗HM1.24抗體的構(gòu)建在下列方法中構(gòu)建重新構(gòu)建的人抗HM1.24抗體。上述能合成重新構(gòu)建人抗HM1.24抗體的CHO細(xì)胞在37℃和5％CO2條件下，用CO2培養(yǎng)箱BNAS120D(TABAI生產(chǎn))在加入500μg/ml G418(GIBCO-BRL生產(chǎn))和10％無(wú)γ-球蛋白的胎牛血清的無(wú)核苷α-MEM培養(yǎng)基(GIBCO-BRL生產(chǎn))中培養(yǎng)10天。開(kāi)始培養(yǎng)后第8天和第10天回收培養(yǎng)液，使用帶有TS-9轉(zhuǎn)頭的離心機(jī)RL-500SP(Tony Seiko生產(chǎn))在2000rpm下離心10分鐘除去細(xì)胞碎片，并用具有直徑0.45μM濾膜的瓶頂濾器(FALCON生產(chǎn))過(guò)濾除菌。
等量PBS(-)加到能合成重新構(gòu)建的人抗HM1.24抗體的CHO細(xì)胞培養(yǎng)液中之后，根據(jù)所附說(shuō)明使用PBS(-)作為吸附/洗滌緩沖液，0.1M檸檬酸鈉緩沖液(pH3)作為洗脫緩沖液，使用高速抗體純化系統(tǒng)ConSep LC100(MILLIPORE生產(chǎn))和超D蛋白A柱(Nippon Gaishi)親和純化重新構(gòu)建的人抗HM1.24抗體。向洗脫組分中立即加入1MTris-HCl(pH8.0)調(diào)節(jié)到約pH7.2，接著使用離心超濾濃縮儀Centriprep--10(MILLIPORE生產(chǎn))進(jìn)行濃縮和對(duì)PBS(-)的置換，并使用孔徑0.22μM的膜濾器MILLEX-GV(MILLIPORE生產(chǎn))進(jìn)行過(guò)濾除菌以得到純化的重新構(gòu)建的人抗HM1.24抗體。通過(guò)280nm的吸光度測(cè)定抗體濃度，并用1.350D相當(dāng)于1mg/ml進(jìn)行計(jì)算。實(shí)施例11．重新構(gòu)建的人抗HM1.24抗體活性的測(cè)定評(píng)估重新構(gòu)建的人抗HM1.24抗體的下列抗原結(jié)合活性和結(jié)合抑制活性1．抗原結(jié)合活性和結(jié)合抑制活性測(cè)定方法1-1．抗原結(jié)活性的測(cè)定使用WICH細(xì)合胞通過(guò)細(xì)胞ELISA測(cè)定抗原結(jié)合活性。如上述實(shí)施例7.1-2中所述制備細(xì)胞ELISA板。
封閉以后，將100μl從COS-7細(xì)胞培養(yǎng)上清濃縮液中獲得的或從CHO細(xì)胞培養(yǎng)上清中純化的重新構(gòu)建的人抗HM1.24抗體連續(xù)稀釋液加入每一孔中。室溫下溫育2小時(shí)并洗滌以后，加入過(guò)氧化物酶標(biāo)記的免抗人IgG抗體(DAKO生產(chǎn))。室溫下溫育1小時(shí)并洗滌后，向每一孔中加入100μl底物溶液。溫育后，用50μl 6N硫酸終止反應(yīng)，使用微板閱讀儀3550型(Bio-Rad生產(chǎn))測(cè)定490nm吸光度。
1-2．結(jié)合抑制活性的測(cè)定用WISH細(xì)胞通過(guò)細(xì)胞ELISA測(cè)定通過(guò)生物素標(biāo)記的小鼠抗HM1.24抗體的結(jié)合抑制活性。如上述實(shí)施例7.1-2所描述制備細(xì)胞ELISA板。封閉后，將50μl從COS-7細(xì)胞培養(yǎng)上清濃縮液中獲得的或從CHO細(xì)胞培養(yǎng)上清中純化的重新構(gòu)建人抗HM1.24抗體連續(xù)稀釋液加入每一孔中，同時(shí)加入50μl生物素標(biāo)記的小鼠抗-HM1.24抗體。室溫下溫育2小時(shí)并洗滌后，加入過(guò)氧化物酶標(biāo)記的鏈霉親和素(DAKO生產(chǎn))。室溫下溫育1小時(shí)并洗滌后，每一孔中加入100μl底物溶液。溫育后，用50μl 6N硫酸終止反應(yīng)，使用微板閱讀儀3550型(Bio-Rad生產(chǎn))測(cè)定490nm的吸光度。
2．重新構(gòu)建的人抗HM1.24抗體的評(píng)估按所提到的以抗原結(jié)合活性的測(cè)定來(lái)評(píng)估重新構(gòu)建的人抗HM1.24抗體L鏈的a型。如圖8所顯示，當(dāng)L鏈版本a和嵌合H鏈聯(lián)合表達(dá)時(shí)，它具有相似水平的抗原結(jié)合活性。然而考慮到活性的進(jìn)一步提高以及和H鏈的相容性，構(gòu)建L鏈的b型。當(dāng)和H鏈版本a、b、f和g聯(lián)合，L鏈的a和b型放在一起評(píng)估抗原連接活性和連接抑制活性。如圖.9、10、11和12所顯示，在L鏈所有a、b、f和h型中L鏈a型比b型在兩個(gè)活性上都有高活性。所以重新構(gòu)建人抗HM1.24抗體L鏈a型用于以下實(shí)驗(yàn)。
2-2．H鏈的a至e型按所提到的以抗原結(jié)合活性和結(jié)合抑制活性的測(cè)定和L鏈a型聯(lián)合起來(lái)對(duì)重新構(gòu)建的人抗HM1.24抗體H鏈a至e型進(jìn)行評(píng)估。如圖11、13、14、和15，結(jié)果顯示和嵌合抗HM1.24抗體相比所有類型在兩個(gè)活性上都稍弱。表明需要更多的氨基酸置換。
2-3．H鏈雜合抗體按所提到的以抗原結(jié)合活性的測(cè)定對(duì)H鏈雜合抗體進(jìn)行評(píng)估。如圖.16所示，結(jié)果顯示對(duì)抗原結(jié)合活性人鼠雜合抗HM1.24抗體具有和嵌合抗HM1.24抗體相似的活性。而小鼠人雜合抗HM1.24抗體具有比嵌合抗HM1.24抗體稍弱的活性。這表明為了構(gòu)建具有與嵌合抗HM1.24抗體相似的抗原結(jié)合活性的重新構(gòu)建的人抗HM1.24抗體，有必要置換H鏈V區(qū)所含的包括在FR3至FR4中的氨基酸。
2-4．H鏈的f至r型按所提到的以抗原結(jié)合活性的測(cè)定評(píng)估重新構(gòu)建人抗HM1.24抗體H鏈的f型。如圖17所示，結(jié)果顯示和嵌合抗HM1.24抗體相比它的結(jié)合活性降低，但和上面a至c型相比活性升高，表明在此類型中新置換的67、69、75和78位四個(gè)氨基酸負(fù)責(zé)重新構(gòu)建的人抗體的活性。
按所提到的以抗原結(jié)合活性的測(cè)定評(píng)估重新構(gòu)建人抗HM1.24抗體H鏈的g型。如圖18和19所示，結(jié)果顯示此類型在多數(shù)時(shí)候具有和上面a型相似活性，揭示如上面H鏈人小鼠雜種抗體所示，此類型所置換的40位氨基酸不負(fù)責(zé)重新構(gòu)建的人抗體活性的提高。
按所提到的以抗原結(jié)合活性和結(jié)合抑制活性的測(cè)定評(píng)估重新構(gòu)建人抗HM1.24抗體H鏈的h至j型。如圖20、21、22和23所示，結(jié)果顯示和嵌合抗HM1.24抗體相比所有類型在兩個(gè)活性上較弱與上述f型具有相似活性。表明f型中新置換的四個(gè)氨基酸中67和69位氨基酸不負(fù)責(zé)重新構(gòu)建的人抗體活性的提高。
按所提到的從抗原結(jié)合活性和結(jié)合抑制活性的測(cè)定評(píng)估重新構(gòu)建人抗-HM1.24抗體H鏈的k至p型。如圖24、25、26和27所示，結(jié)果顯示和嵌合抗HM1.24抗體相比所有類型在兩個(gè)活性上較弱和上述版本h具有相似活性，表明在這6個(gè)類型中80位氨基酸和之后新置換的氨基酸是不負(fù)責(zé)重新構(gòu)建的人抗體活性的提高。
按所提到的以抗原結(jié)合活性和結(jié)合抑制活性的測(cè)定評(píng)估重新構(gòu)建人抗HM1.24抗體H鏈的q型。如圖25和27所示，結(jié)果顯示此版本和上面h型或p型相比在兩個(gè)活性上較弱和上述a型具有相似活性，表明78位氨基酸的置換對(duì)重新構(gòu)建的人抗體活性的提高是必要的。
通過(guò)上面所提到的方法評(píng)估重新構(gòu)建的人抗HM1.24抗體H鏈的r型。如圖15和28所示，結(jié)果表明r型和嵌合抗HM1.24抗體具有相似水平的抗原結(jié)合活性和結(jié)合抑制活性。
上述結(jié)果顯示為了具有與小鼠抗HM1.24抗體嵌合抗HM1.24抗體相似水平的抗原結(jié)合活性，對(duì)于重新構(gòu)建的人抗HM1.24抗體所需最少的置換是30、71、和78位氨基酸和更進(jìn)一步73位氨基酸。
重新構(gòu)建的人抗HM1.24抗體H鏈a至r型的抗原結(jié)合活性和結(jié)合抑制活性總結(jié)于表6。
表6H鏈型 抗原結(jié)合活性結(jié)合抑制活性a + +b + +c + +d + 未測(cè)定e + 未測(cè)定f ++ ++g + +h ++ ++i ++ ++j ++ ++k ++ ++l ++ ++m ++ ++n ++ ++o ++ ++p ++ ++q + +r+++ +++2.5S型的H鏈按所提到的以抗原結(jié)合活性和結(jié)合抑制活性的測(cè)定和上述L鏈a型聯(lián)合對(duì)重新構(gòu)建的人抗HM1.24抗體H鏈S型進(jìn)行評(píng)估。如圖29和30所示，結(jié)果顯示S型和r型具有相似水平的抗原結(jié)合活性和結(jié)合抑制活性。
如上面所提到的，即使一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基被其它氨基酸替換后，本發(fā)明的重新構(gòu)建的人抗HM1.24抗體仍保留有與抗體結(jié)合的能力。因此本發(fā)明包括重新構(gòu)建的人抗HM1.24抗體，其中只要它保留原有特性，在H鏈或L鏈可變區(qū)可用其它氨基酸替換一個(gè)或更多氨基酸殘基。
3．純化的重新構(gòu)建的人抗HM1.24抗體的評(píng)估以上述抗原結(jié)合活性和結(jié)合抑制活性評(píng)估純化的重新構(gòu)建的人抗HM1.24抗體。如圖31和32所示，結(jié)果顯示重新構(gòu)建的人抗HM1.24抗體和嵌合的抗HM1.24抗體具有相似水平的抗原結(jié)合活性和結(jié)合抑制活性。事實(shí)表明重新構(gòu)建的人抗HM1.24抗體和小鼠抗HM1.24抗體具有相同的抗原結(jié)合活性。實(shí)施例12.嵌合的抗HM1.24抗體對(duì)人骨髓瘤小鼠模型的抗腫瘤效應(yīng)1．施用抗體的制備1-1．嵌合的抗HM1.24抗體的制備使用離心超濾濃縮儀Centriprep10(Amicon生產(chǎn))濃縮上面實(shí)施例6中得到的純化的嵌合抗HM1.24抗體，并用PBS(-)替換緩沖溶液。使用具有0.22μM孔徑的膜濾器MILLEX-GV(MILLIPORE)過(guò)濾除菌。使用過(guò)濾除菌的PBS(-)將抗體制備成200μg/ml的濃度，并用于以下實(shí)驗(yàn)。用280nm的吸光度測(cè)定抗體的濃度，并用1.350D相當(dāng)于1mg/ml計(jì)算。
1-2．對(duì)照人IgG1的純化用作嵌合抗HM1.24抗體對(duì)照的人IgG1按如下純化。將等量的PBS(-)加到純化的Hu IgG1 Kappa(BINDING SITE生產(chǎn))中，按照所附說(shuō)明將PBS(-)作為洗脫緩沖液使用高速抗體純化系統(tǒng)ConSep LC100(MILIPORE生產(chǎn))和Hyper D蛋白A柱(Nippon Gaishi生產(chǎn))親和純化人IgG1。向洗脫組分中立即加入1M Tris-Hcl(pH8.0)調(diào)節(jié)至pH7.4左右，然后使用離心超濾濃縮儀Centriprep10(Amicon生產(chǎn))進(jìn)行濃縮和PBS(-)緩沖液的置換，用0.22μM孔徑的膜濾器MILLEX-GV1MILLIPORE生產(chǎn))過(guò)濾除菌。用過(guò)濾除菌的PBS(-)將人IgG1調(diào)至200μg/ml并用于以下實(shí)驗(yàn)。用280nm的吸光度測(cè)定抗體濃度，并用1.350D相當(dāng)于1mg/ml計(jì)算。
2．小鼠血清中人血清IgG定量的方法通過(guò)下面ELISA定量小鼠血清中所含人IgG。用0.1M碳酸氫鹽緩沖液(pH9.6)稀釋至1μg/ml的100μl羊抗人IgG加到96孔板(NUNC生產(chǎn))中，4℃過(guò)夜溫育以固定抗體。封閉后，將100μl連續(xù)稀釋的小鼠血清或作為標(biāo)準(zhǔn)的人IgG(CAPPEL生產(chǎn))加入并在室溫下溫育1小時(shí)。洗滌后，將100μl稀釋2000倍的堿性磷酸酶標(biāo)記的抗人IgG(CAPPEL生產(chǎn))加入并溫育，接著使用微板閱讀儀3550型(Bio-Rad生產(chǎn))測(cè)定405nm吸光度。
3．嵌合抗HM1.24抗體對(duì)人骨髓瘤細(xì)胞移植小鼠的抗腫瘤效應(yīng)3-1．人骨髓瘤細(xì)胞移植小鼠的建立按如下建立人骨髓瘤細(xì)胞移植小鼠。用加10％胎牛血清(GIBCOBRL生產(chǎn))的RPMI1640培養(yǎng)基在3×107細(xì)胞/ml的濃度下制備用于SCID小鼠(由Nihon CLEA飼養(yǎng))體內(nèi)傳代的KPMM2細(xì)胞。將200μl上述KPMM2細(xì)胞懸浮液通過(guò)尾靜脈注射到SCID小鼠(雄性、8周、由Nihon(LEA飼養(yǎng))中，此小鼠在前一天已經(jīng)腹膜注射了100μl抗脫唾液酸GM1(由Wako Pure Chemical Industries Co.,Ltd生產(chǎn))。
3-2．抗體的施用KPMM2細(xì)胞移植后第12天，從上述人骨髓瘤細(xì)胞移植小鼠中收集血清，使用上面2中提到的ELISA對(duì)血清中人IgG進(jìn)行定量。通過(guò)血清中人IgG水平的上升證實(shí)KPMM2細(xì)胞已進(jìn)入骨髓中。KPMM2細(xì)胞移植后第14、21和28天，將上面1中所制備的100μl每種抗體腹膜注射入這些小鼠中。
3-3．嵌合抗HM1.24抗體對(duì)人骨髓瘤細(xì)胞移植小鼠的抗腫瘤效果的評(píng)估用小鼠存活時(shí)間評(píng)估基因抗HM1.24抗體的抗腫瘤效果。如圖33所示，接受嵌合抗HM1.24抗體的小鼠和接受對(duì)照人IgG1的小鼠相比具有延長(zhǎng)的存活時(shí)期。因而可以確定嵌合抗HM1.24抗體對(duì)人骨髓瘤細(xì)胞移植小鼠有抗腫瘤效果。實(shí)施例13．重新構(gòu)建的人抗HM1.24抗體ADCC活性的測(cè)定根據(jù)人類免疫研究，編輯John E.Coligan et al.,John Wiley&Sons.Inc.,1993，第七章，免疫學(xué)現(xiàn)行方法闡明的方法測(cè)定ADCC(抗體-依賴的細(xì)胞毒性)。
1．效應(yīng)細(xì)胞的制備通過(guò)密度離心的方法從健康者外周血中分離單核細(xì)胞。這樣，將等量的PBS(-)加到健康者外周血中，它們位于Ficoll-Paque PLUS(Pharmacia生產(chǎn))上層，并在400g下離心40分鐘。收集單核細(xì)胞層，用加10％胎牛血清(GIBCO BRL生產(chǎn))的RPMI1640培養(yǎng)基(GIBCO BRL生產(chǎn))洗四次，用相同的培養(yǎng)液制備成5×106/ml的細(xì)胞密度。
從SCID小鼠(由Nihon CLEA飼養(yǎng))骨髓細(xì)胞中誘導(dǎo)LAK(淋巴因子激活的殺傷細(xì)胞)。從小鼠股骨中分離骨髓細(xì)胞，并用加10％胎牛血清(GIBCO BRL生產(chǎn))的RPMI 1640培養(yǎng)基(GIBCO BRL生產(chǎn))洗兩次，用相同的培養(yǎng)基制備成2×105/ml的細(xì)胞密度。它們與50ng/ml重組人IL-2(R&D SYSTEMS生產(chǎn))和10ng/ml重組小鼠GM-CSF(R&D SYSTEMS生產(chǎn))一起在CO2培養(yǎng)箱(TABAI)中培養(yǎng)7天。用相同的培養(yǎng)基將細(xì)胞數(shù)目調(diào)整為2×106/ml。
2．靶細(xì)胞的制備通過(guò)在加10％胎牛血清(GIBCO BRL生產(chǎn))的RPMI1640培養(yǎng)基(GIBCO BRL生產(chǎn))中和0.1mCi的51Cr鉻酸鈉(ICN生產(chǎn))在37℃下培養(yǎng)60分鐘，放射標(biāo)記的人骨髓瘤細(xì)胞系KPMM2(日本未審查專利出版(Kokai)號(hào)，7-236475)或來(lái)自漿細(xì)胞白血病的ARH-77[美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(CL-1621)]。放射標(biāo)記后，細(xì)胞用相同的培養(yǎng)基洗三次并調(diào)整為2×105/ml。
3．ADCC實(shí)驗(yàn)在96孔U型底平板(Becton Dickinson生產(chǎn))中加入50μl 2×105靶細(xì)胞/ml、50μl重新構(gòu)建的人抗HM1.24抗體、小鼠抗HM1.24抗體、對(duì)照人IgG1(THE BINDING SITE生產(chǎn))或?qū)φ招∈驣gG2a(UPC10,CAPPEL生產(chǎn))并在4℃下反應(yīng)15分鐘。
當(dāng)效應(yīng)細(xì)胞(E)和靶細(xì)胞(T)的比率(E∶T)設(shè)為0∶1、3.2∶1、8∶1、20∶1或50∶1時(shí)，100μl效應(yīng)細(xì)胞在CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4小時(shí)。
取出100μl上清，用r計(jì)數(shù)器(ARC-300,Aloka生產(chǎn))測(cè)定釋放到培養(yǎng)上清中的放射活性。為了測(cè)定最大放射活性，使用1％NP-40(Nakalai生產(chǎn))。通過(guò)(A-C)/(B-C)×100計(jì)算細(xì)胞毒性，其中A是抗體存在時(shí)釋放的放射活性(cpm),B是NP-40釋放的放射活性(cpm),C是沒(méi)有抗體只有培養(yǎng)基釋放的放射活性(cpm)。
圖34表示當(dāng)從健康者外周血中制備的細(xì)胞作為效應(yīng)細(xì)胞和KPMM2細(xì)胞作為靶細(xì)胞時(shí)得到的結(jié)果。圖35表示當(dāng)從健康者外周血中制備的細(xì)胞用作效應(yīng)細(xì)胞和ARH-77用作靶細(xì)胞時(shí)得到的結(jié)果。當(dāng)加入重新構(gòu)建的人抗HM1.24抗體時(shí)與對(duì)照人IgG1相比，細(xì)胞毒性隨著抗體濃度的增加而增加，表明重新構(gòu)建的人抗HM1.24抗體具有ADCC活性。
此外，當(dāng)加入重新構(gòu)建的人抗HM1.24抗體和小鼠抗HM1.24抗體相比細(xì)胞毒性顯著增加，表明重新構(gòu)建的人抗HM1.24抗體比小鼠抗HM1.24抗體有更高的ADCC活性。而且，當(dāng)KPMM2用作靶細(xì)胞時(shí)，重新構(gòu)建的人抗HM1.24抗體以0.1μg/ml或更高濃度加入不引起細(xì)胞毒性的改變，表明0.1μg/ml或更高的濃度有充分的細(xì)胞毒性。當(dāng)ARH-77用作靶細(xì)胞時(shí)，重新構(gòu)建的人抗HM1.24抗體以0.1μg/ml或更高濃度加入不引起細(xì)胞毒性的改變，表明0.1μg/ml或更高的濃度有充分的細(xì)胞毒性。
圖36表示當(dāng)從SCID小鼠骨髓中制備的細(xì)胞用作效應(yīng)細(xì)胞時(shí)獲得的結(jié)果。當(dāng)加入重新構(gòu)建的人抗HM1.24抗體時(shí)與對(duì)照人IgG1相比，細(xì)胞毒性隨著抗體濃度的增加而增加，表明重新構(gòu)建人抗HM1.24抗體具有ADCC活性。此外重新構(gòu)建的人抗HM1.24抗體以0.1μg/ml或更高濃度加入不引起細(xì)胞毒性的改變，表明0.1μg/ml或更高的濃度有充分的細(xì)胞毒性。
這些結(jié)果顯示當(dāng)所用效應(yīng)細(xì)胞來(lái)自于人或小鼠時(shí)重新構(gòu)建人抗HM1.24抗體都有ADCC活性。實(shí)施例14．重新構(gòu)建的人抗HM1.24抗體對(duì)人骨髓瘤小鼠模型的抗腫瘤效應(yīng)1．施用抗體的制備將質(zhì)粒HEF-RVLa-AHM-gγl和質(zhì)粒HEF-RVHr-AHM-gγl導(dǎo)入CHO細(xì)胞得到的重新構(gòu)建人抗HM1.24抗體用過(guò)濾除菌的PBS(-)稀釋至40、200和1000ug/ml的濃度。實(shí)施例12.1-2中得到的對(duì)照人IgG1用過(guò)濾除菌的PBS(-)稀釋至200ug/ml的濃度，它們用作施用的抗體。
2．重新構(gòu)建的人抗HM1.24抗體對(duì)人骨髓瘤細(xì)胞移植小鼠的抗腫瘤效應(yīng)2-1．人骨髓瘤細(xì)胞移植小鼠的建立根據(jù)實(shí)施例12.3-1建立人骨髓瘤細(xì)胞移植小鼠。所用小鼠是SCID小鼠(5周)(由Nihon CLEA飼養(yǎng))。
2-2．抗體的施用KPMM2細(xì)胞移植后第9天，從上面2-1所制備的人骨髓瘤細(xì)胞移植小鼠中收集血清，用上面12.2中所提到的ELISA對(duì)血清中的人IgG進(jìn)行定量。通過(guò)血清中人IgG水平的上升證實(shí)KPMM2細(xì)胞進(jìn)入了骨髓中。KPMM2細(xì)胞移植后第10天，將上面1中所制備的100μl每種抗體腹膜注射到這些小鼠中。
2-3．重新構(gòu)建的人抗HM1.24抗體對(duì)人骨髓瘤細(xì)胞移植小鼠抗腫瘤效果的評(píng)估通過(guò)小鼠血清中人IgG量以及小鼠存活時(shí)間的改變來(lái)評(píng)估重新構(gòu)建的人抗HM1.24抗體的抗腫瘤效果。
對(duì)KPMM2細(xì)胞移植后第35天收集的血清使用實(shí)施例12.2中所提到的ELISA，通過(guò)測(cè)定人IgG來(lái)測(cè)定小鼠血清中人IgG量的改變。
如圖37所示，結(jié)果表明在對(duì)照人IgG1施用組中與第9天(抗體施用的前一天)相比，KPMM2細(xì)胞移植后第35天血漿中人IgG的量增加約1000倍，而在重新構(gòu)建的人抗HM1.24抗體的施用組中，對(duì)任何劑量，血清中人IgG的量幾乎等于或低于第9天，這表明重新構(gòu)建的人抗HM1.24抗體抑制KPMM2細(xì)胞的生長(zhǎng)。另一方面如圖38所示，存活時(shí)間與對(duì)照人IgG1施用組相比，在重新構(gòu)建的人抗HM1.24抗體施用組中觀察到存活時(shí)間的延長(zhǎng)。這些表明重新構(gòu)建的人抗HM1.24抗體對(duì)人骨髓瘤細(xì)胞移植小鼠有抗腫瘤效果。實(shí)施例15．重新構(gòu)建的人抗HM1.24抗體和生存藥物苯丙氨酸氮芥之間對(duì)人骨髓瘤小鼠模型抗腫瘤效果的比較1．施用藥物的制備1-1．施用抗體的制備將質(zhì)粒HEF-RVLa-AHM-gk和質(zhì)粒HEF-RVHr-AHM-gγl導(dǎo)入CHO細(xì)胞得到的重新構(gòu)建的人抗HM1.24抗體用過(guò)濾除菌的PBS(-)稀釋至40和200μg/ml的濃度，實(shí)施例12.1-2中得到的對(duì)照人IgG1用過(guò)濾除菌的PBS(-)稀釋至200μg/ml的濃度，它們用作施用的抗體。
1-2．苯丙氨酸氮芥的制備苯丙氨酸氮芥(SIGMA生產(chǎn))是用于骨髓瘤的生存藥物，用0.2％的羥甲基纖維素(CMC)(Daicel Chemical Industries,Ltd生產(chǎn))配成0.1mg/ml的濃度。
2．重新構(gòu)建的人抗HM1.24抗體和苯丙氨酸氮芥對(duì)人骨髓瘤細(xì)胞移植小鼠的抗腫瘤效果2-1．人骨髓瘤細(xì)胞移植小鼠的建立根據(jù)實(shí)施例14.2-1制備人骨髓瘤細(xì)胞移植小鼠。
2-2．藥物的施用KPMM2細(xì)胞移植后第9天，從上面2-1所制備的人骨髓瘤細(xì)胞移植小鼠中收集血清，用上面12.2中所提到的ELISA對(duì)血清中的人IgG進(jìn)行定量。通過(guò)血清中人IgG水平的上升證實(shí)KPMM2細(xì)胞進(jìn)入了骨髓中。KPMM2細(xì)胞移植后第10天，將上面1-1中所制備的100μl每一種抗體腹膜注射到這些小鼠中。此外，從移植后第10天，每天一次，連續(xù)5天口服200μl 0.2％CMC溶液。另一方面對(duì)苯丙氨酸氮芥施用組，從KPMM2細(xì)胞移植后第10天，每天一次，連續(xù)5天，以每10g體重100μl的量(即1mg苯丙氨酸氮芥/kg)連續(xù)5天，以每10g體重100μl的量(即1mg苯丙氨酸氮芥/kg)口服上面1-1所制備的苯丙氨酸氮芥溶液。
2-3．重新構(gòu)建的抗HM1.24抗體對(duì)人骨髓瘤細(xì)胞移植小鼠抗腫瘤效果的評(píng)估通過(guò)小鼠血清中人IgG量以及小鼠存活時(shí)間的改變來(lái)評(píng)估重新構(gòu)建的抗HM1.24抗體的抗腫瘤效果。
對(duì)KPMM2細(xì)胞移植后第35天所收集的血清使用實(shí)施例12.2中所述的ELISA，通過(guò)測(cè)定人IgG來(lái)測(cè)定小鼠血清中人IgG量的改變。如圖39所示，結(jié)果表明在對(duì)照人IgG1施用組中與第9天(抗體施用的前一天)相比，KPMM2細(xì)胞移植后第35天血清中人IgG的量增加約1000倍，看起來(lái)KPMM2細(xì)胞在這些小鼠中生長(zhǎng)。同樣在苯丙氨酸氮芥施用組中，盡管沒(méi)有對(duì)照人IgG施用組中那么高，但與藥物施用前相比血清人IgG的量增高很多。這個(gè)結(jié)果表明丙氨酸氮芥沒(méi)有很好地抑制KPMM2細(xì)胞的生長(zhǎng)。另一方面，在重新構(gòu)建的人抗HM1.24抗體施用組中，對(duì)任何劑量，血清中人IgG的量少于移植后第9天，表明重新構(gòu)建的人抗HM1.24抗體抑制KPMM2細(xì)胞的生長(zhǎng)。
另一方面，如圖40所示的存活期與對(duì)照人IgG1施用組或苯丙氨酸氮芥施用組相比，在重新構(gòu)建的人抗HM1.24抗體施用組中觀察到存活時(shí)間的延長(zhǎng)。以上表明重新構(gòu)建的人抗HM1.24抗體對(duì)人骨髓瘤細(xì)胞移植小鼠有抗腫瘤效果，本抗體的抗腫瘤效果強(qiáng)于生存藥物苯丙氨酸氮芥。
上面結(jié)果表明當(dāng)使用來(lái)源于人的效應(yīng)細(xì)胞時(shí)，小鼠抗HM1.24抗體對(duì)人骨髓瘤細(xì)胞幾乎無(wú)細(xì)胞毒性，而重新構(gòu)建的人抗HM1.24抗體和嵌合抗HM1.24抗體具有很強(qiáng)的細(xì)胞毒性。此事實(shí)表明人源抗體的重要性，并提供重新構(gòu)建的人抗HM1.24抗體用于人體的希望。
重新構(gòu)建的人抗HM1.24抗體在人骨髓瘤細(xì)胞移植的SCID小鼠中具有很強(qiáng)的抗腫瘤效果。因此在人體中，效應(yīng)細(xì)胞來(lái)自于人體。通常還存在淋巴細(xì)胞，預(yù)期重新構(gòu)建的人抗HM1.24抗體有更強(qiáng)的抗腫瘤效果。
在骨髓瘤模型中與生存藥物相比，重新構(gòu)建的人抗HM1.24抗體有強(qiáng)的抗腫瘤效果，因此預(yù)期重新構(gòu)建的人抗HM1.24抗體在治療骨髓瘤上會(huì)是劃時(shí)代的藥物。參考實(shí)施例1．合成小鼠抗HM1.24單克隆抗體的雜交瘤的構(gòu)建根據(jù)Goto,T.等，血液(1994)84,1992-1930中描述的方法制備能合成小鼠抗HM1.24單克隆抗體的雜交瘤。
對(duì)來(lái)自多發(fā)骨髓瘤患者的EB病毒核酸抗原(EBNA)陰性的漿細(xì)胞系KPC-32(1×107細(xì)胞)(Goto,T.等，日本臨床血液學(xué)雜志(11991),32,1400)每6周2次腹膜注入BALB/c小鼠(Charles River飼養(yǎng))。
為了進(jìn)一步提高抗體合成的滴度，在殺死動(dòng)物前3天將1.5×106KPC-32細(xì)胞注入小鼠脾中(Goto,T.等，Tokushima J.Exp.Med(1990)37、89)。殺死小鼠后，去除脾，將根據(jù)Groth,de st.&Schreidegger(腫瘤研究(1981)41,3465)方法取得的脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞SP210進(jìn)行細(xì)胞融合。
使用KPC-32細(xì)胞覆蓋的平板通過(guò)ELISA(Posner,M.R.等，免疫方法雜志(1982)48,23)篩選雜交瘤培養(yǎng)物上清中的抗體。將5×104KPC-32細(xì)胞懸浮于50ml PBS中并等分到96孔板(U型底，Corning,Iwaki生產(chǎn))中。用含有1％牛血清白蛋白(BSA)的PBS封閉以后，加入雜交瘤上清并在4℃溫育2小時(shí)。接下來(lái)，它與過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗小鼠IgG抗體(Zymed生產(chǎn))一起于4℃反應(yīng)1小時(shí)，洗滌1次，并與鄰苯二胺底物溶液(Sumitomo Bakelite生產(chǎn))在室溫下反應(yīng)30分鐘。
用2N硫酸終止反應(yīng)后，用ELISA閱讀儀(Bio-Rad生產(chǎn))測(cè)定492nm的吸光度。為了取得合成抗人免疫球蛋白抗體的雜交瘤，篩選以前吸附到人血清并與其它亞細(xì)胞成分有反應(yīng)性的陽(yáng)性雜交瘤培養(yǎng)上清。選擇陽(yáng)性雜交瘤，并用流式細(xì)胞術(shù)研究它們與各種細(xì)胞系和人樣品的反應(yīng)性。最終挑選的雜交瘤克隆經(jīng)兩次無(wú)性傳代，并注射入降植烷處理的BALB/C小鼠的腹腔內(nèi)，然后從那里獲取腹水。
用硫酸銨沉淀和蛋白A親和層析試劑盒(Ampure PA、Amersham生產(chǎn))從小鼠腹水中純化單克隆抗體。用Quick Tag FITC偶聯(lián)試劑盒(Boehringer Mannheim生產(chǎn))將純化抗體偶聯(lián)上異硫氰酸熒光素(FITC)。
作為結(jié)果，30個(gè)雜交瘤克隆合成的單克隆抗體與KPC-32以及RPMI8226細(xì)胞反應(yīng)。無(wú)性傳代以后，研究這些雜交瘤上清與其它細(xì)胞系以及來(lái)自外周血的單核細(xì)胞的反應(yīng)性。
在它們中間，有三個(gè)克隆合成能與漿細(xì)胞特異反應(yīng)的單克隆抗體。這三個(gè)克隆之外，挑選能夠合成對(duì)流式細(xì)胞分析有用并對(duì)RPMI8226細(xì)胞有完全依賴細(xì)胞毒性的單克隆抗體的雜交瘤克隆，而且命名為HM1.24。用亞類特異的兔抗小鼠抗體(Zymed生產(chǎn))通過(guò)ELISA測(cè)定此雜交瘤合成的單克隆抗體的亞類?？笻M1.24抗體有IgG2aK亞類。合成抗HM1.24抗體的雜交瘤在布達(dá)佩斯條約的條款下，于1995年9月14日按國(guó)際慣例儲(chǔ)存于國(guó)立生命科學(xué)和人體技術(shù)研究所、工業(yè)科學(xué)和技術(shù)代理處、MITI(Higashil-Chome1-3、Tsukuba City、IbvalakiPrefecture、日本)，并得到保藏號(hào)FERM BP-5233。參考實(shí)施例2．編碼HM1.24抗原多肽的cDNA的克隆1．cDNA文庫(kù)的建立1)總RNA的制備按如下分離編碼HM1.24抗原的cDNA,HM1.24抗原是能被小鼠抗-HM1.24單克隆抗體特異識(shí)別的多肽。根據(jù)Chirgwin等的方法(生物化學(xué)，18,5294(1979))從人多發(fā)骨髓瘤細(xì)胞系KPMM2中制備總RNA。這樣2.2×108KPPM2細(xì)胞在20ml 4M硫氰酸胍(Nakalai tesque生產(chǎn))中完全勻漿。
勻漿在離心管中位于5.3M氯化鈀上層，然后用Beckman SW40轉(zhuǎn)頭在20℃以31,000rpm離心24小時(shí)以沉淀RNA。RNA沉淀用70％乙醇洗滌，溶于300μl含1mM EDTA和0.5％SDS的10nm Tris-Hcl(pH7.4)中。往其中加入鏈霉蛋白酶(Boehringr生產(chǎn))至0.5mg/ml濃度后，于37℃下溫育30分鐘?；旌衔镉梅雍吐确鲁樘嵋猿恋鞷NA。然后RNA沉淀溶于200μl含1mM EDTA的10mM Tris-HCl(pH7.4)中。
2)Poly(A)+RNA的制備使用約500μg上面制備的總RNA作為原材料，用Fast Track 2.0mRNA分離試離盒(Invitrogen生產(chǎn))根據(jù)附于試劑盒的說(shuō)明純化Poly(A)+RNA。
3)cDNA文庫(kù)的構(gòu)建用10μg上面的Poly(A)+RNA作為原材料，用cDNA合成試劑盒Time Saver cDNA合成試劑盒(Pharmacia生產(chǎn))根據(jù)附于試劑盒的說(shuō)明合成雙鏈cDNA，并使用定向克隆工具盒(Pharmacia生產(chǎn))，根據(jù)附于試劑盒的說(shuō)明將EcoRⅠ接頭連接到雙鏈cDNA上。根據(jù)附于試劑盒的說(shuō)明用限制性內(nèi)切酶NotⅠ處理EcoRⅠ接頭。用1.5％低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠(SIGMA生產(chǎn))分離和純化約500bp或更長(zhǎng)的接頭連接的雙鏈cDNA以得到約40μl的接頭連接的雙鏈cDNA。
使用T4 DNA連接酶(GIBCO BRL生產(chǎn))將上面制備的接頭連接的雙鏈cDNA連接到pCOS1載體(日本未審查專利出版(Kokai)8-255196)上以建立cDNA文庫(kù)，其中pCOS1載體事先用限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ和NotⅠ以及堿性磷酸酶(Takara Shuzo)處理過(guò)。構(gòu)建的cDNA文庫(kù)轉(zhuǎn)導(dǎo)入大腸桿菌DH5α(GIBCO BRL生產(chǎn))，總的大小約有2.5×106獨(dú)立的克隆。
2．通過(guò)定向表達(dá)進(jìn)行克隆1)轉(zhuǎn)染入COS-7細(xì)胞通過(guò)將上面轉(zhuǎn)導(dǎo)的大腸桿菌5×105個(gè)克隆在含有50μg/ml氨芐青霉素的2-YT培養(yǎng)基(分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)、Sambrook等，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版、(1989))上培養(yǎng)擴(kuò)增cDNA，并用堿裂解法(分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)、Sambrook et al.，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版、(1989))從大腸桿菌中回收質(zhì)粒。獲得的質(zhì)粒使用基因脈沖儀(BioRad生產(chǎn))通過(guò)電穿孔轉(zhuǎn)染進(jìn)COS-7細(xì)胞。
這樣，10μg純化的質(zhì)粒DNA加到以1×107細(xì)胞/ml懸浮于PBS中的0.8ml COS-7細(xì)胞中，并接受1500V和25UF電容的脈沖。室溫下10分鐘恢復(fù)期后，電穿孔細(xì)胞于37℃和5％CO2的條件下在加10％胎牛血清的DMEM(GIBCO BRL生產(chǎn))中培養(yǎng)3天。
2)淘選平板的制備用B.Seed等(美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院，84,3365-3369(1987))的方法制備用小鼠抗HM1.24抗體覆蓋的淘選平板。將小鼠抗HM1.24抗體加到50mM Tris-HCl(pH9.5)中至濃度為10μg/ml。將如此制備的3ml抗體溶液加到直徑60mm的組合培養(yǎng)平板中，并在室溫下溫育2小時(shí)。用0.5M NaCl溶液洗滌3次并用含有5％胎牛血清、1mM EDTA和0.02％NaN3的PBS封閉后，這些平板用于以下的克隆。
3)cDNA文庫(kù)的克隆如上所述轉(zhuǎn)染的COS-7細(xì)胞用含5mM EDTA的PBS分離，然后用含5％胎牛血清的PBS洗一次。這些細(xì)胞懸浮在含有5％胎牛血清和0.02％NaN3的PBS中至濃度為1×106細(xì)胞/ml，然后加到上面制備的淘選平板中，室溫下溫育2小時(shí)。用含5％胎牛血清和0.02％NaN3的PBS洗3次后，用含0.6％SDS和10mM EDTA的溶液從粘附到淘選平板上的細(xì)胞中回收質(zhì)粒DNA。
將回收的質(zhì)粒DNA再次轉(zhuǎn)導(dǎo)入大腸桿菌DH5α中。按如上擴(kuò)增質(zhì)粒DNA后，用堿裂解法提取質(zhì)粒DNA。按上面所述回收的質(zhì)粒DNA用電穿孔方法轉(zhuǎn)染入COS-7細(xì)胞并從粘附細(xì)胞中回收質(zhì)粒DNA。相同的步驟再重復(fù)一次，回收的DNA用限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ和NotⅠ消化。因此證實(shí)具有0.9kbp大小的插入片段。部分回收質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)導(dǎo)的大腸桿菌在含有50μg/ml氨芐青霉的2-YT瓊脂板上接種。過(guò)夜培養(yǎng)后，從單克隆中回收質(zhì)粒DNA。用限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ和NotⅠ消化此質(zhì)粒，獲得具有0.9kbp插入子的克隆p3.19。
根據(jù)附在試劑盒上的說(shuō)明，用PRISM染料終止循環(huán)測(cè)序試劑盒(Perkin Elmer生產(chǎn))反應(yīng)并用ABI373A DNA測(cè)序儀(Perkn Elmer生產(chǎn))測(cè)序來(lái)確定此克隆的堿基序列。其氨基酸序列和堿基序列顯示于SEQ ID No:103。
將編碼具有如SEQ ID No:103所說(shuō)明的氨基酸序列的多肽的cDNA插入pUC19載體的XbaⅠ酶切位點(diǎn)，所制備的質(zhì)粒命名為pRS38-pUC19。含有質(zhì)粒pRS38-pUC19的大腸桿菌作為大腸桿菌DH5α(pRS38-pUC19)在布達(dá)佩斯條約的條款下，于1993年10月5日按國(guó)際慣例儲(chǔ)存于國(guó)立生命科學(xué)和人體技術(shù)研究所、工業(yè)科學(xué)和技術(shù)代理處、MITI(Higashil-Chome 1-3,Tsukuba City,Ibalaki Prefecture,日本)，并得到保藏號(hào)FERM BP-4434(見(jiàn)日本來(lái)審查專利公開(kāi)(Kokai)號(hào)，7-196694)。
工業(yè)應(yīng)用因?yàn)榍逗峡笻M1.24抗體含有小鼠抗HM1.24抗體的可變區(qū)和人抗體的恒定區(qū)，重新構(gòu)建的人抗HM1.24抗體含有小鼠抗HM1.24抗體的互補(bǔ)決定區(qū)、人抗體的構(gòu)架區(qū)和人抗體的恒定區(qū)，它對(duì)人體有低的抗原性，有希望用作藥物成分，尤其是治療骨髓瘤的藥物成份。
保藏生物和有關(guān)國(guó)際保藏單位的參考名稱國(guó)立生命科學(xué)和人體技術(shù)研究所，工業(yè)科學(xué)和技術(shù)代理處，MITI地址Higashil-Chome 1-3,Tsukuba City,Ibalaki prefecture,日本1．大腸桿菌DH5α(pRS38-pUC19)保藏號(hào)FERM BP-4434保藏日期1993年10月5日2．小鼠-小鼠雜交瘤HM1.24保藏號(hào)FERM BP-5233保藏日期1995年4月27日3．大腸桿菌DH5α(pUC19-RVHr-AHM-gγl)保藏號(hào)FERM BP-5643保藏日期1996年8月29日4．大腸桿菌DH5α(pUC19-1.24H-gγl)保藏號(hào)FERM BP-5644保藏日期1996年8月29日5．大腸桿菌DH5α(pUC19-RVLa-AHM-gκ)保藏號(hào)FREM BP-5645保藏日期1996年8月29日6．大腸桿菌DH5α(pUC19-1.24L-gκ)保藏號(hào)FERM BP-5646保藏日期1996年8月29日7．大腸桿菌DH5α(pUC19-RVHs-AHM-gγl)保藏號(hào)FERM BP-6127保藏日期1997年9月29日序列表關(guān)于SEQ ID NO:1的信息長(zhǎng)度394類型核酸拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型分子類型cDNA序列描述ATG GGC TTC AAG ATG GAG TCA CAT TTT CTG GTC TTT GTA TTC GTG TTT 48Met Gly Phe Lys Met Glu Ser His Phe Leu Val Phe Val Phe Val Phe-20 -15 -10CTC TGG TTG TCT GGT GTT GAC GGA GAC ATT GTG ATG ACC CAG TCT CAC 96Leu Trp Leu Ser Gly Val Asp Gly Asp Ile Val Met Thr Gln Ser His-5 -1 1 5AAA TTC ATG TCC ACA TCA GTA GGA GAC AGG GTC AGC ATC ACC TGC AAG 144Lys Phe Met Ser Thr 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類型核酸拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型分子類型合成DNA序列描述GGCGGATCCA CTCACGTTTT ATTTCCAACT TTGT 34關(guān)于SEQ ID NO:46的信息長(zhǎng)度34類型核酸拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型分子類型合成DNA序列描述GGCGGATCCA CTCACCTGAG GAGACTGTGA GAGT 34關(guān)于SEQ ID NO:47的信息長(zhǎng)度18類型核酸拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型分子類型合成DNA序列描述CAGACAGTGG TTCAAAGT18關(guān)于SEQ ID NO:48的信息長(zhǎng)度26類型核酸拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型分子類型合成DNA序列描述GAATTCGGAT CCACTCACGT TTGATT 26關(guān)于SEQ ID NO:49的信息長(zhǎng)度48類型核酸拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型分子類型合成DNA序列描述AGTCAGGATG TGAATACTGC TGTAGCCTGG TACCAGCAGA AGCCAGGA 48關(guān)于SEQ ID NO:50的信息長(zhǎng)度39類型核酸拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型分子類型合成DNA序列描述GCATCCAACC GGTACACTGG TGTGCCAAGC AGATTCAGC 39關(guān)于SEQ ID NO:51的信息長(zhǎng)度45類型核酸拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型分子類型合成DNA序列描述CAACATTATA GTACTCCATT CACGTTCGGC CAAGGGACCA AGGTG 45關(guān)于SEQ ID NO:52的信息長(zhǎng)度47類型核酸拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型分子類型合成DNA序列描述GCAGTATTCA CATCCTGACT GGCCTTACAG GTGATGGTCA CTCTGTC47關(guān)于SEQ ID NO:53的信息長(zhǎng)度38類型核酸拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型分子類型合成DNA序列描述ACACCAGTGT ACCGGTTGGA TGCCGAGTAG ATCAGCAG 38關(guān)于SEQ ID NO:54的信息長(zhǎng)度41類型核酸拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型分子類型合成DNA序列描述GTGAATGGAG TACTATAATG TTGCTGGCAG TAGTAGGTAG C 41關(guān)于SEQ ID NO:55的信息長(zhǎng)度31類型核酸拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型分子類型合成DNA序列描述GGTACCGACT ACACCTTCAC CATCAGCAGC C 31關(guān)于SEQ ID NO:56的信息長(zhǎng)度31類型核酸拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型分子類型合成DNA序列描述GGTGAAGGTG TAGTCGGTAC CGCTACCGCT A 31關(guān)于SEQ ID NO:57的信息長(zhǎng)度144類型核酸拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型分子類型合成DNA序列描述ATGCCTTGCA GGAAACCTTC ACTGAGGCCC CAGGCTTCTT CACCTCAGCC CCAGACTGCA60CCAGCTGCAC CTGGGAGTGA GCACCTGGAG CTACAGCCAG CAAGAAGAAG ACCCTCCAGG 120TCCAGTCCAT GGTGGAAGCT TATC 144關(guān)于SEQ ID NO:58的信息長(zhǎng)度130類型核酸拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型分子類型合成DNA序列描述TCAGTGAAGG TTTCCTGCAA GGCATCTGGA TACACCTTCA CTCCCTACTG GATGCAGTGG 60GTGCGACAGG CCCCTGGACA AGGGCTTGAG TGGATGGGAT CTATTTTTCC TGGAGATGGT 120GATACTAGGT 130關(guān)于SEQ ID NO:59的信息長(zhǎng)度131類型核酸拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型分子類型合成DNA序列描述AATACACGGC CGTGTCCTCA GATCTCAGGC TGCTCAGCTC CATGTAGACT GTGCTCGTGG 60ACGTGTCTGC GGTCATGGTG ACTCTGCCCT TGAACTTCTG ACTGTACCTA GTATCACCAT 120CTCCAGGAAA A 131關(guān)于SEQ ID NO:60的信息長(zhǎng)度119類型核酸拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型分子類型合成DNA序列描述GAGATCTGAG GACACGGCCG TGTATTACTG TGCGAGAGGA TTACGACGAG GGGGGTACTA60CTTTCACTAC TGGGGGCAAG GGACCACGGT CACCGTCTCC TCAGGTCAGT GGATCCGAC119關(guān)于SEQ ID NO:61的信息長(zhǎng)度25類型核酸拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型分子類型合成DNA序列描述GATAAGCTTC CACCATGGAC TGGAC25關(guān)于SEQ ID NO:62的信息長(zhǎng)度25類型核酸拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型分子類型合成DNA序列描述GTCGGATCCA CTCACCTGAG GAGAC25關(guān)于SEQ ID NO:63的信息長(zhǎng)度26類型核酸拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型分子類型合成DNA序列描述AAGTTCAAGG GCAAAGTCAC CATGAC 26關(guān)于SEQ ID NO:64的信息長(zhǎng)度26類型核酸拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型分子類型合成DNA
序列描述GTCATGGTGA CTTTGCCCTT GAACTT 26關(guān)于SEQ ID NO:65的信息長(zhǎng)度26類型核酸拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型分子類型合成DNA序列描述ATGACCGCAG ACAAGTCCAC GAGCAC 26關(guān)于SEQ ID NO:66的信息長(zhǎng)度26類型核酸拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型分子類型合成DNA序列描述GTGCTCGTGG ACTTGTCTGC GGTCAT 26關(guān)于SEQ ID NO:67的信息長(zhǎng)度46類型核酸拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型分子類型合成DNA序列描述AAGTTCAAGG GCAAAGTCAC CATGACCGCA GACAAGTCCA CGAGCAC46關(guān)于SEQ ID NO:68的信息長(zhǎng)度47類型核酸拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型分子類型合成DNA序列描述GTGCTCGTGG ACTTGTCTGC GGTCATGGTG ACTTTGCCCT TGAACTT47關(guān)于SEQ ID NO:69的信息長(zhǎng)度38類型核酸拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型分子類型合成DNA序列描述AAGTTCAAGG GCAGAGCCAC CCTGACCGCA GACACGTC 38關(guān)于SEQ ID NO:70的信息長(zhǎng)度38類型核酸拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型分子類型合成DNA序列描述GACGTGTCTG CGGTCAGGGT GGCTCTGCCC TTGAACTT 38關(guān)于SEQ ID NO:71的信息長(zhǎng)度18類型核酸拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型分子類型合成DNA序列描述CAGACAGTGG TTCAAAGT18關(guān)于SEQ ID NO:72的信息長(zhǎng)度17類型核酸拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型分子類型合成DNA序列描述GCCCCAAAGC CAAGGTC 17關(guān)于SEQ ID NO:73的信息長(zhǎng)度23類型核酸拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型分子類型合成DNA序列描述ATTTTTCCTG GAGATGGTGA TAC 23關(guān)于SEQ ID NO:74的信息長(zhǎng)度23類型核酸拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型分子類型合成DNA序列描述GTATCACCAT CTCCAGGAAA TAT 23關(guān)于SEQ ID NO:75的信息長(zhǎng)度418類型核酸拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型分子類型cDNA序列描述ATG GAA TGT AAC TGG ATA CTT CCT TTT ATT CTG TCA GTA ACT TCA GGT 48Met Glu Cys Asn Trp Ile Leu Pro Phe Ile Leu Ser Val Thr Ser Gly-15 -10 -5GCC TAC TCA CAG GTT CAA CTC CAG CAG TCT GGG GCT GAG CTG GCA AGA 96Ala Tyr Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg-1 1 5 10CCT GGG GCT TCA GTG AAG TTG TCC TGC AAG GCT TCT GGC TAC ACC TTT144Pro Gly Ala Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe15 20 25ACT CCC TAC TGG ATG CAG TGG GTA AAA CAG AGG CCT GGA CAG GGT CTG 192Thr Pro Tyr Trp Met Gln Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu30 35 40 45GAA TGG ATT GGG TCT ATT TTT CCT GGA GAT GGT GAT ACT AGG TAC AGT240Glu Trp Ile Gly Ser Ile Phe Pro Gly Asp Gly Asp Thr Arg Tyr Ser50 55 60CAG AAG TTC AAG GGC AGA GTC ACC ATG ACC GCA GAC ACG TCC ACG AGC 288Gln Lys Phe Lys Gly Arg Val Thr Met Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser65 70 75ACA GTC TAC ATG GAG CTG AGC AGC CTG AGA TCT GAG GAC ACG GCC GTG 336Thr Val Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val80 85 90TAT TAC TGT GCG AGA GGA TTA CGA CGA GGG GGG TAC TAC TTT GAC TAC 384Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Leu Arg Arg Gly Gly Tyr Tyr Phe Asp Tyr95 100 105TGG GGG CAA GGG ACC ACG GTC ACC GTC TCC TCA G 418Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser110 115 120關(guān)于SEQ ID NO:76的信息長(zhǎng)度418類型核酸拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型分子類型cDNA序列描述ATG GAC TGG ACC TGG AGG GTC TTC TTC TTG CTG GCT GTA GCT CCA GGT 48Met Asp Trp Thr Trp Arg Val Phe Phe Leu Leu Ala Val Ala Pro Gly-15 -10 -5GCT CAC TCC CAG GTG CAG CTG GTG CAG TCT GGG GCT GAG GTG AAG AAG 96Ala His Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys-1 1 5 10CCT GGG GCC TCA GTG AAG GTT TCC TGC AAG GCA TCT GGA TAC ACC TTC 144Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe15 20 25ACT CCC TAC TGG ATG CAG TGG GTG CGA CAG GCC CCT GGA CAA GGG CTT 192Thr Pro Tyr Trp Met Gln Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu30 35 40 45GAG TGG ATG GGA TCT ATT TTT CCT GGA GAT GGT GAT ACT AGG TAC AGT 240Glu Trp Met Gly Ser Ile Phe Pro Gly Asp Gly Asp Thr Arg Tyr Ser50 55 60CAG AAG TTC AAG GGC AAG GCC ACA TTG ACT GCA GAT AAA TCC TCC AGT 288Gln Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser65 70 75ACA GCC TAC ATG CAA CTC AGC ATC TTG GCA TTT GAG GAC TCT GCG GTC 336Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ile Leu Ala Phe Glu Asp Ser Ala Val80 85 90TAT TAC TGT GCA AGA GGA TTA CGA CGA GGG GGG TAC TAC TTT GAC TAC 384Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Leu Arg Arg Gly Gly Tyr Tyr Phe Asp Tyr95 100 105TGG GGC CAA GGC ACC ACT CTC ACA GTC TCC TCA G 418Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser110 115 120關(guān)于SEQ ID NO:77的信息長(zhǎng)度38類型核酸拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型分子類型合成DNA序列描述CTGGTTCGGC CCACCTCTGA AGGTTCCAGA ATCGATAG 38關(guān)于SEQ ID NO:78的信息長(zhǎng)度35類型核酸拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型分子類型合成DNA序列描述GCAGACACGT CCTCGAGCAC AGCCTACATG GAGCT 35關(guān)于SEQ ID NO:79的信息長(zhǎng)度35類型核酸拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型分子類型合成DNA序列描述AGCTCCATGT AGGCTGTGCT CGAGGACGTG TCTGC 35關(guān)于SEQ ID NO:80的信息長(zhǎng)度26
類型核酸拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型分子類型合成DNA序列描述TGGGTGCGAC AGCGCCCTGG ACAAGG 26關(guān)于SEQ ID NO:81的信息長(zhǎng)度26類型核酸拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型分子類型合成DNA序列描述CCTTGTCCAG GGCGCTGTCG CACCCA 26關(guān)于SEQ ID NO:82的信息長(zhǎng)度41類型核酸拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型分子類型合成DNA序列描述TACATGGAGC TGAGCAGCCT GGCATTTGAG GACACGGCCG T 41關(guān)于SEQ ID NO:83的信息長(zhǎng)度41類型核酸拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型分子類型合成DNA序列描述ACGGCCGTGT CCTCAAATGC CAGGCTGCTC AGCTCCATGT A 41關(guān)于SEQ ID NO:84的信息長(zhǎng)度26類型核酸拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型分子類型合成DNA序列描述AAGTTCAAGG GCAAAGCCAC CCTGAC 26關(guān)于SEQ ID NO:85的信息長(zhǎng)度26類型核酸拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型分子類型合成DNA序列描述GTCAGGGTGG CTTTGCCCTT GAACTT 26關(guān)于SEQ ID NO:86的信息長(zhǎng)度23類型核酸拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型分子類型合成DNA序列描述GCCTACATGC AGCTGAGCAG CCT 23關(guān)于SEQ ID NO:87的信息長(zhǎng)度23類型核酸拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型分子類型合成DNA序列描述AGGCTGCTCA GCTGCATGTA GGC 23關(guān)于SEQ ID NO:88的信息長(zhǎng)度38類型核酸拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型分子類型合成DNA序列描述GCCTACATGC AGCTGAGCAT CCTGAGATCT GAGGACAC 38關(guān)于SEQ ID NO:89的信息長(zhǎng)度35類型核酸拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型分子類型合成DNA序列描述GATCTCAGGA TGCTCAGCTG CATGTAGGCT GTGCT 35關(guān)于SEQ ID NO:90的信息長(zhǎng)度50類型核酸拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型分子類型合成DNA序列描述GCCTACATGC AGCTGAGCAT CCTGAGATCT GAGGACTCGG CCGTGTATTA 50關(guān)于SEQ ID NO:91的信息長(zhǎng)度50類型核酸拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型分子類型合成DNA序列描述ACGGCCGAGT CCTCAGATCT CAGGATGCTC AGCTGCATGT AGGCTGTGCT 50關(guān)于SEQ ID NO:92的信息長(zhǎng)度26類型核酸拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型分子類型合成DNA序列描述GAGCTGAGCA TCCTGAGATC 20關(guān)于SEQ ID NO:93的信息長(zhǎng)度26類型核酸拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型分子類型合成DNA
序列描述GATCTCAGGA TGCTCAGCTC CATGTA 26關(guān)于SEQ ID NO:94的信息長(zhǎng)度20類型核酸拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型分子類型合成DNA序列描述AGATCTGAGG ACTCGGCCGT 20關(guān)于SEQ ID NO:95的信息長(zhǎng)度20類型核酸拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型分子類型合成DNA序列描述ACGGCCGAGT CCTCAGATCT 20關(guān)于SEQ ID NO:96的信息長(zhǎng)度35類型核酸拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型分子類型合成DNA序列描述GCAGACACGT CCACGAGCAC AGCCTACATG GAGCT 35關(guān)于SEQ ID NO:97的信息長(zhǎng)度35類型核酸拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型分子類型合成DNA序列描述AGCTCCATGT AGGCTGTGCT CGTGGACGTG TCTGC 35關(guān)于SEQ ID NO:98的信息長(zhǎng)度35類型核酸拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型分子類型合成DNA序列描述GCAGACACGT CCTCGAGCAC AGTCTACATG GAGCT 35關(guān)于SEQ ID NO:99的信息長(zhǎng)度35類型核酸拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型分子類型合成DNA序列描述AGCTCCATGT AGACTGTGCT CGAGGACGTG TCTGC 35關(guān)于SEQ ID NO:100的信息長(zhǎng)度26
類型核酸拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型分子類型合成DNA序列描述AGAGTCACCA TCACCGCAGA CAAGTC 26關(guān)于SEQ ID NO:101的信息長(zhǎng)度26類型核酸拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型分子類型合成DNA序列描述GACTTGTCTG CGGTGATGGT GACTCT 26關(guān)于SEQ ID NO:102的信息長(zhǎng)度418類型核酸拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型分子類型cDNA序列描述ATG GAC TGG ACC TGG AGG GTC TTC TTC TTG CTG GCT GTA GCT CCA GGT 48Met Asp Trp Thr Trp Arg Val Phe Phe Leu Leu Ala Val Ala Pro Gly-15 -10 -5GCT CAC TCC CAG GTG CAG CTG GTG CAG TCT GGG GCT GAG GTG AAG AAG 96Ala His Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys-1 1 5 10CCT GGG GCC TCA GTG AAG GTT TCC TGC AAG GCA TCT GGA TAC ACC TTC l44Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe15 20 25ACT CCC TAC TGG ATG CAG TGG GTG CGA CAG GCC CCT GGA CAA GGG CTT 192Thr Pro Tyr Trp Met Gln Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu30 35 40 45GAG TGG ATG GGA TCT ATT TTT CCT GGA GAT GGT GAT ACT AGG TAC AGT 240Glu Trp Met Gly Ser Ile Phe Pro Gly Asp Gly Asp Thr Arg Tyr Ser50 55 60CAG AAG TTC AAG GGC AGA GTC ACC ATC ACC GCA GAC AAG TCC ACG AGC 288Gln Lys Phe Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser65 70 75ACA GCC TAC ATG GAG CTG AGC AGC CTG AGA TCT GAG GAC ACG GCC GTG 336Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val80 85 90TAT TAC TGT GCG AGA GGA TTA CGA CGA GGG GGG TAC TAC TTT GAC TAC 384Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Leu Arg Arg Gly Gly Tyr Tyr Phe Asp Tyr95 100 105TGG GGG CAA GGG ACC ACG GTC ACC GTC TCC TCA G 418Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser110 115 120關(guān)于SEQ ID NO:103的信息長(zhǎng)度1013類型核酸拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型分子類型cDNA序列描述GAATTCGGCA CGAGGGATCT GG ATG GCA TCT ACT TCG TAT GAC TAT TGC 49Met Ala Ser Thr Ser Tyr Asp Tyr Cys1 5AGA GTG CCC ATG GAA GAC GGG GAT AAG CGC TGT AAG CTT CTG CTG GGG 97Arg Val Pro Met Glu Asp Gly Asp Lys Arg Cys Lys Leu Leu Leu Gly10 15 20 25ATA GGA ATT CTG GTG CTC CTG ATC ATC GTG ATT CTG GGG GTG CCC TTG 145Ile Gly Ile Leu Val Leu Leu Ile Ile Val Ile Leu Gly Val Pro Leu30 35 40ATT ATC TTC ACC ATC AAG GCC AAC AGC GAG GCC TGC CGG GAC GGC CTT 193Ile Ile Phe Thr Ile Lys Ala Asn Ser Glu Ala Cys Arg Asp Gly Leu45 50 55CGG GCA GTG ATG GAG TGT CGC AAT GTC ACC CAT CTC CTG CAA CAA GAG241Arg Ala Val Met Glu Cys Arg Asn Val Thr His Leu Leu Gln Gln Glu60 65 70CTG ACC GAG GCC CAG AAG GGC TTT CAG GAT GTG GAG GCC CAG GCC GCC289Leu Thr Glu Ala Gln Lys Gly Phe Gln Asp Val Glu Ala Gln Ala Ala75 80 85ACC TGC AAC CAC ACT GTG ATG GCC CTA ATG GCT TCC CTG GAT GCA GAG337Thr Cys Asn His Thr Val Met Ala Leu Met Ala Ser Leu Asp Ala Glu90 95 100 105AAG GCC CAA GGA CAA AAG AAA GTG GAG GAG CTT GAG GGA GAG ATC ACT385Lys Ala Gln Gly Gln Lys Lys Val Glu Glu Leu Glu Gly Glu Ile Thr110 115 120ACA TTA AAC CAT AAG CTT CAG GAC GCG TCT GCA GAG GTG GAG CGA CTG433Thr Leu Asn His Lys Leu Gln Asp Ala Ser Ala Glu Val Glu Arg Leu125 130 135AGA AGA GAA AAC CAG GTC TTA AGC GTG AGA ATC GCG GAC AAG AAG TAC481Arg Arg Glu Asn Gln Val Leu Ser Val Arg Ile Ala Asp Lys Lys Tyr140 145 150TAC CCC AGC TCC CAG GAC TCC AGC TCC GCT GCG GCG CCC CAG CTG CTG529Tyr Pro Ser Ser Gln Asp Ser Ser Ser Ala Ala Ala Pro Gln Leu Leu155 160 165ATT GTG CTG CTG GGC CTC AGC GCT CTG CTG CAG TGA GATCCCAGGA 575Ile Val Leu Leu Gly Leu Ser Ala Leu Leu Gln ***170 175 180AGCTGGCACA TCTTGGAAGG TCCGTCCTGC TCGGCTTTTC GCTTGAACAT TCCCTTGATC 635TCATCAGTTC TGAGCGGGTC ATGGGGCAAC ACGGTTAGCG GGGAGAGCAC GGGGTAGCCG 695GAGAAGGGCC TCTGGAGCAG GTCTGGAGGG GCCATGGGGC AGTCCTGGGT CTGGGGACAC 755AGTCGGGTTG ACCCAGGGCT GTCTCCCTCC AGAGCCTCCC TCCGGACAAT GAGTCCCCCC 815TCTTGTCTCC CACCCTGAGA TTGGGCATGG GGTGCGGTGT GGGGGGCATG TGCTGCCTGT 875TGTTATGGGT TTTTTTTGCG GGGGGGGTTG CTTTTTTCTG GGGTCTTTGA GCTCCAAAAA 935AATAAACACT TCCTTTGAGG GAGAGCACAC CTTAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA 995AAAATTCGGG CGGCCGCC 101權(quán)利要求
1．包含人輕(L)鏈恒定區(qū)(C區(qū))和抗HM1.24抗體的L鏈可變(V)區(qū)的嵌合L鏈。
2．根據(jù)權(quán)利要求1所述的嵌合L鏈，其中所述的L鏈V區(qū)具有如SEQ ID No:1列出的氨基酸序列。
3．根據(jù)權(quán)利要求1所述的嵌合L鏈，其中所述人L鏈C區(qū)是Cκ。
4．包含人重(H)鏈恒定區(qū)和抗HM1.24抗體的H鏈可變(V)區(qū)的嵌合H鏈。
5．根據(jù)權(quán)利要求4所述的嵌合H鏈，其中所述的H鏈V區(qū)具有如SEQ ID No:2列出的氨基酸序列。
6．根據(jù)權(quán)利要求4所述的嵌合H鏈，其中所述的人H鏈C區(qū)是Cγ。
7．一種嵌合抗體，包含(1)含有人L鏈C區(qū)和抗HM1.24抗體的L鏈V區(qū)的L鏈；和(2)含有人H鏈C區(qū)和抗HM1.24抗體的H鏈V區(qū)的H鏈。
8．根據(jù)權(quán)利要求7所述的嵌合抗體，其中所述的L鏈V區(qū)含有如SEQ ID No:1列出的氨基酸序列，而所述的H鏈V區(qū)含有如SEQ ID No:2列出的氨基酸序列。
9．抗HM1.24抗體的重新構(gòu)建的人L鏈的V區(qū)，包含(1)人L鏈V區(qū)的構(gòu)架區(qū)(FR)，和(2)抗HM1.24抗體的L鏈V區(qū)的互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)。
10．根據(jù)權(quán)利要求9所述的重新構(gòu)建的人L鏈的V區(qū)，其中所述CDR含有由以下氨基酸序列表示的氨基酸序列CDR1:Lys Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala Val Ala(SEQID No:3)CDR2:Ser Ala Ser Asn Arg Tyr Thr(SEQ ID No:4)CDR3:Gln Gln His Tyr Ser Thr Pro Phe Thr(SEQ ID No:5)。
11．根據(jù)權(quán)利要求10所述的重新構(gòu)建的人L鏈的V區(qū)，其中所述FR來(lái)自人亞群Ⅰ(HSGⅠ)的人抗體的FR。
12．根據(jù)權(quán)利要求11所述的重新構(gòu)建的人L鏈的V區(qū)，其中所述FR來(lái)自人抗體REI的FR。
13．根據(jù)權(quán)利要求11所述的重新構(gòu)建的人L鏈的V區(qū)，其中所述FR基本上與人抗體REI的FR相同。
14．根據(jù)權(quán)利要求11所述的重新構(gòu)建的人L鏈的V區(qū)，其中所述的L鏈V區(qū)具有如表1中RVLa為代表的氨基酸序列。
15．抗HM1.24抗體的重新構(gòu)建的人H鏈的V區(qū)，包含(1)人H鏈V區(qū)的FR，和(2)抗HM1.24抗體的H鏈V區(qū)的CDR。
16．根據(jù)權(quán)利要求15所述的重新構(gòu)建的人H鏈的V區(qū)，其中所述CDR具有由以下氨基酸序列表示的氨基酸序列CDR1:Pro Tyr Trp Met Gln(SEQ ID No:6)CDR2:Ser Ile Phe Gly Asp Gly Asp Thr Arg Tyr Ser Gln LysPhe Lys Gly(SEQ ID No:7)CDR3:Gly Leu Arg Arg Gly Gly Tyr Tyr Phe Asp Tyr(SEQID No:8)。
17．根據(jù)權(quán)利要求16所述的重新構(gòu)建的人H鏈的V區(qū)，其中所述FR來(lái)自HSGⅠ的人抗體的FR。
18．根據(jù)權(quán)利要求16所述的重新構(gòu)建的人H鏈的V區(qū)，其中所述FR1-3來(lái)自人抗體HG3的FR1-3。
19．根據(jù)權(quán)利要求16所述的重新構(gòu)建的人H鏈的V區(qū)，其中所述FR1-3基本上與人抗體HG3的FR1-3相同，并且所述FR4基本上與人抗體JH6的FR4相同。
20．根據(jù)權(quán)利要求16所述的重新構(gòu)建的人抗體的H鏈，其中根據(jù)Kabat定義所述FR1中第30位氨基酸是蘇氨酸，根據(jù)Kabat定義所述FR3中第71位氨基酸是丙氨酸，根據(jù)Kabat定義所述FR3中第78位氨基酸是丙氨酸。
21．根據(jù)權(quán)利要求16所述的重新構(gòu)建的人抗體的H鏈，其中根據(jù)Kabat定義所述FR3中第73位氨基酸是賴氨酸。
22．根據(jù)權(quán)利要求17所述的重新構(gòu)建的人H鏈的V區(qū)，其中所述的H鏈V區(qū)含有如表2至4中RVHf、RVHh、RVHi、RVHj、RVHk、RVHl、RVHfm、RVHn、RVHo、RVHp、RVHr或RVHs代表的氨基酸序列。
23．抗HM1.24抗體的重新構(gòu)建的人L鏈，包含(1)人L鏈C區(qū)，和(2)包含人L鏈FR和抗HM1.24抗體的L鏈CDR的L鏈V區(qū)。
24．根據(jù)權(quán)利要求23所述的重新構(gòu)建的人L鏈，其中所述的人L鏈C區(qū)是人Cκ區(qū)，所述的人L鏈的FR來(lái)自HSGI的人抗體的FR，并且所述的L鏈CDR具有權(quán)利要求10所示的氨基酸序列。
25．根據(jù)權(quán)利要求23所述的重新構(gòu)建的人L鏈的V區(qū)，其中所述的FR來(lái)自人抗體REI的FR。
26．根據(jù)權(quán)利要求23所述的重新構(gòu)建的人L鏈的V區(qū)，其中所述FR基本上與人抗體REI的FR相同。
27．根據(jù)權(quán)利要求23所述的重新構(gòu)建的人L鏈，其中所述的L鏈V區(qū)具有如表3中RVLa所代表的氨基酸序列。
28．抗HM1.24抗體的重新構(gòu)建的人H鏈，包含(1)人H鏈C區(qū)，和(2)包含人H鏈FR和抗HM1.24抗體的H鏈CDR的H鏈V區(qū)。
29．根據(jù)權(quán)利要求28所述的重新構(gòu)建的人H鏈，其中所述的人H鏈C區(qū)是人Cγ1區(qū)，所述的人H鏈FR來(lái)自HSGⅠ的人抗體FR，并且所述的H鏈CDR具有權(quán)利要求16中所示的氨基酸序列。
30．根據(jù)權(quán)利要求28所述的重新構(gòu)建的人H鏈，其中所述的FR1-3來(lái)自人抗體HG3的FR1-3并且所述的FR4來(lái)自人抗體JH6的FR4。
31．根據(jù)權(quán)利要求28所述的重新構(gòu)建的人H鏈，其中所述FR1-3基本上與人抗體HG3的FR1-3相同并且所述FR4基本上與人抗體JH6的FR4相同。
32．根據(jù)權(quán)利要求28所述的重新構(gòu)建的人抗體的H鏈，其中根據(jù)Kabat定義所述FR1中第30位氨基酸是蘇氨酸，根據(jù)Kabat定義所述FR3中第71位氨基酸是丙氨酸，以及根據(jù)Kabat定義所述FR3中第78位氨基酸是丙氨酸。
33．根據(jù)權(quán)利要求28所述的重新構(gòu)建的人抗體的H鏈，其中根據(jù)Kabat定義所述FR3中第73位氨基酸是賴氨酸。
34．根據(jù)權(quán)利要求28所述的重新構(gòu)建的人H鏈，其中所述的H鏈V區(qū)具有如表2至表4中RVHf、RVHh、RVHi、RVHj、RVHk、RVHl、RVHfm、RVHn、RVHo、RVHp、RVHr或RVHs所代表的氨基酸序列。
35．抗HM1.24抗體的重新構(gòu)建的人抗體，包含(A)L鏈，包含(1)人L鏈C區(qū)，和(2)包含人L鏈的FR和抗HM1.24抗體的L鏈CDR的L鏈V區(qū)；以及(B)H鏈，包含(1)人H鏈C區(qū)，和(2)包含人H鏈的FR和抗HM1.24抗體的H鏈CDR的H鏈V區(qū)。
36．根據(jù)權(quán)利要求35所述的重新構(gòu)建的人抗體，其中所述的L鏈CDR具有權(quán)利要求10中所示的氨基酸序列并且所述的H鏈CDR具有權(quán)利要求16中所示的氨基酸序列。
37．根據(jù)權(quán)利要求35所述的重新構(gòu)建的人抗體，其中所述的L鏈CDR具有權(quán)利要求10中所示的氨基酸序列；所述的H鏈CDR含有權(quán)利要求16中所示的氨基酸序列；所述的人L鏈的FR來(lái)自HSGⅠ的抗體的FR；所述的人H鏈的FR來(lái)自HSGⅠ的人抗體的FR；所述的人L鏈C區(qū)是人Cκ區(qū)；并且所述的人H鏈C區(qū)是人Cγ1區(qū)。
38．根據(jù)權(quán)利要求35所述的重新構(gòu)建的人抗體，其中所述的L鏈的FR來(lái)自人抗體REI的FR，所述的H鏈的FR1-3來(lái)自人抗體HG3，并且所述的H鏈的FR4來(lái)自人抗體JH6的FR4。
39．根據(jù)權(quán)利要求35所述的重新構(gòu)建的人抗體，其中所述的L鏈V區(qū)具有如表1中RVLa所代表的氨基酸序列。
40．根據(jù)權(quán)利要求35所述的重新構(gòu)建的人抗體，其中所述的H鏈V區(qū)具有如表2至表4中RVHf、RVHh、RVHi、RVHj、RVHk、RVHl、RVHfm、RVHn、RVHo、RVHp、RVHr或RVHs所代表的氨基酸序列。
41．編碼抗HM1.24抗體的L鏈V區(qū)的DNA。
42．根據(jù)權(quán)利要求41所述的DNA，其中所述的L鏈V區(qū)編碼如SEQID No:1中列出的氨基酸序列。
43．根據(jù)權(quán)利要求41所述的DNA，其中編碼所述L鏈V區(qū)的DNA具有SEQ ID No:1中列出的核苷酸序列。
44．編碼抗HM1.24抗體的H鏈V區(qū)的DNA。
45．根據(jù)權(quán)利要求44所述的DNA，其中所述的H鏈V區(qū)編碼如SEQID No:2中列出的氨基酸序列。
46．根據(jù)權(quán)利要求44所述的DNA，其中編碼所述H鏈V區(qū)的DNA具有如SEQ ID No:2中列出的核苷酸序列。
47．編碼嵌合L鏈的DNA，包含(1)人L鏈C區(qū)；和(2)抗HM1.24抗體的L鏈V區(qū)。
48．根據(jù)權(quán)利要求47所述的DNA，其中所述的L鏈V區(qū)編碼如SEQID No:1中列出的氨基酸序列。
49．根據(jù)權(quán)利要求47所述的DNA，其中所述的L鏈V區(qū)含有如SEQID No:1中列出的核苷酸序列。
50．編碼嵌合H鏈的DNA，包含(1)人H鏈C區(qū)；和(2)抗HM1.24抗體的H鏈V區(qū)。
51．根據(jù)權(quán)利要求50所述的DNA，其中所述的H鏈V區(qū)編碼如SEQID No:2中列出的氨基酸序列。
52．根據(jù)權(quán)利要求50所述的DNA，其中所述的H鏈V區(qū)具有如SEQID No:2中列出的核苷酸序列。
53．編碼抗HM1.24抗體的重新構(gòu)建的人L鏈V區(qū)的DNA，包含(1)人L鏈V區(qū)的FR；和(2)抗HM1.24抗體的L鏈V區(qū)的CDR。
54．根據(jù)權(quán)利要求53所述的編碼重新構(gòu)建的人L鏈V區(qū)的DNA，其中所述CDR具有權(quán)利要求10中所示的氨基酸序列。
55．根據(jù)權(quán)利要求53所述的編碼重新構(gòu)建的人L鏈V區(qū)的DNA，其中所述FR來(lái)自HSGⅠ的人抗體的FR。
56．根據(jù)權(quán)利要求53所述的編碼重新構(gòu)建的人L鏈V區(qū)的DNA，其中所述FR來(lái)自人抗體REI的FR。
57．根據(jù)權(quán)利要求53所述的編碼重新構(gòu)建的人L鏈V區(qū)的DNA，其中所述FR基本上與人抗體REI的FR相同。
58．根據(jù)權(quán)利要求51所述的DNA，其中所述的L鏈V區(qū)編碼如表1中RVLa所代表的氨基酸序列。
59．根據(jù)權(quán)利要求53所述的編碼重新構(gòu)建的人V區(qū)的DNA，具有如SEQ ID No:9中列出的核苷酸序列。
60．編碼抗HM1.24抗體的重新構(gòu)建的人H鏈V區(qū)的DNA，包含(1)人H鏈V區(qū)的FR；和(2)抗HM1.24抗體的H鏈V區(qū)的CDR。
61．根據(jù)權(quán)利要求60所述的編碼重新構(gòu)建的人H鏈V區(qū)的DNA，其中所述CDR具有權(quán)利要求16中所示的氨基酸序列。
62．根據(jù)權(quán)利要求60所述的編碼重新構(gòu)建的人H鏈V區(qū)的DNA，其中所述FR來(lái)自HSGI的人抗體的FR。
63．根據(jù)權(quán)利要求60所述的編碼重新構(gòu)建的人H鏈V區(qū)的DNA，其中所述FR1-3來(lái)自人抗體HG3的FR1-3。
64．根據(jù)權(quán)利要求60所述的編碼重新構(gòu)建的人H鏈V區(qū)的DNA，其中所述FR1-3基本上與人抗體HG3的FR1-3相同。
65．根據(jù)權(quán)利要求60所述的編碼重新構(gòu)建的人抗體H鏈V區(qū)的DNA，其中根據(jù)Kabat定義所述FR1中第30位氨基酸是蘇氨酸，根據(jù)Kabat定義所述FR3中第71位氨基酸是丙氨酸，根據(jù)Kabat定義所述FR3中第78位氨基酸是丙氨酸。
66．根據(jù)權(quán)利要求60所述的編碼重新構(gòu)建的人抗體H鏈V區(qū)的DNA，其中根據(jù)Kabat定義所述FR3中第73位氨基酸是賴氨酸。
67．根據(jù)權(quán)利要求60所述的編碼重新構(gòu)建的人H鏈V區(qū)的DNA，其中所述H鏈V區(qū)具有如表2至4中RVHf、RVHh、RVHi、RVHj、RVHk、RVHl、RVHfm、RVHn、RVHo、RVHp、RVHr或RVHs所代表的氨基酸序列。
68．根據(jù)權(quán)利要求60所述的編碼重新構(gòu)建的人H鏈V區(qū)的DNA，具有如SEQ ID No:18、19、20、21、22、23、24、25、26、28或102中列出的核苷酸序列。
69．編碼抗HM1.24抗體的重新構(gòu)建的人L鏈的DNA，包含(1)人L鏈C區(qū)；和(2)包含人L鏈的FR和抗HM1.24抗體L鏈的CDR的L鏈V區(qū)。
70．根據(jù)權(quán)利要求69所述的DNA，其中所述的L鏈V區(qū)編碼如表1中RVLa所代表的氨基酸序列。
71．根據(jù)權(quán)利要求69所述的DNA，其中所述的L鏈V區(qū)具有SEQ IDNo:9中列出的核苷酸序列。
72．根據(jù)權(quán)利要求69所述的DNA，其中所述的L鏈C區(qū)是人L鏈的Cκ區(qū)。
73．編碼抗HM1.24抗體的重新構(gòu)建的人H鏈的DNA，包含(1)人H鏈C區(qū)；和(2)包含人H鏈的FR和抗HM1.24抗體H鏈的CDR的H鏈V區(qū)。
74．根據(jù)權(quán)利要求73所述的編碼重新構(gòu)建的人H鏈的DNA，其中所述H鏈V區(qū)具有如表2至4中RVHf、RVHh、RVHi、RVHj、RVHk RVHl、RVHfm、RVHn、RVHo、RVHp、RVHr、或RVHs所代表的氨基酸序列。
75．根據(jù)權(quán)利要求73所述的編碼重新構(gòu)建的人H鏈的DNA，其中所述H鏈V區(qū)具有如SEQ ID No:18、19、20、21、22、23、24、25、26、28或102中列出的核苷酸序列。
76．根據(jù)權(quán)利要求73所述的編碼重新構(gòu)建的人H鏈的DNA，其中所述的人H鏈C區(qū)是人H鏈的Cγ1區(qū)。
77．包含根據(jù)權(quán)利要求41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75和76中任意一項(xiàng)所述的DNA的載體。
78．用含根據(jù)權(quán)利要求41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75和76中任意一項(xiàng)的所述DNA的載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。
79．一種生產(chǎn)抗HM1.24抗體的嵌合抗體的方法，包括以下步驟培養(yǎng)用包含根據(jù)權(quán)利要求41、42、43、47、78和49中任意一項(xiàng)所述DNA的表達(dá)載體和包含根據(jù)權(quán)利要求44、45、46、50、51和52中任意一項(xiàng)所述DNA的表達(dá)載體；并回收所需抗體。
80．一種生產(chǎn)抗HM1.24抗體的重新構(gòu)建的人抗體的方法，包含以下步驟培養(yǎng)用包含根據(jù)權(quán)利要求53、54、55、56、57、58、59、69、70、71和72中任意一項(xiàng)所述DNA的表達(dá)載體和包含根據(jù)權(quán)利要求61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、和76中任意一項(xiàng)所述DNA的表達(dá)載體共轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞；并回收所需抗體。
81．含嵌合抗體為活性成分的藥物組合物，所述嵌合抗體特異識(shí)別具有如SEQ ID No:103中列出的氨基酸序列的多肽。
82．含嵌合的抗HM1.24抗體為活性成分的藥物組合物。
83．含嵌合抗體為活性成分的骨髓瘤治療劑，所述嵌合抗體識(shí)別具有SEQ ID No:103中列出的氨基酸序列的多肽。
84．含嵌合的抗HM1.24抗體為活性成分的骨髓瘤治療劑。
85．含重新構(gòu)建的人抗體為活性成分的藥物組合物，所述抗體特異識(shí)別具有如SEQ ID No:103中列出的氨基酸序列的多肽。
86．含重新構(gòu)建的抗HM1.24抗體為活性成分的藥物組合物。
87．含重新構(gòu)建的人抗體為活性成分的骨髓瘤治療劑，所述抗體識(shí)別具有如SEQ ID No:103中列出的氨基酸序列的多肽。
88．含重新構(gòu)建的人抗HM1.24抗體為活性成分的骨髓瘤治療劑。
全文摘要
重新構(gòu)建的人抗HM1.24抗體,包含:(A)L鏈,包含:(1)人L鍵C區(qū)和(2)含有人L鏈構(gòu)架區(qū)(FR)和小鼠抗HM1.24抗體L鏈互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)的L鏈V區(qū);以及(B)H鏈,包含:(1)人H鏈C區(qū)和(2)含有人H鏈FR和小鼠抗HM1.24抗體CDR的H鏈V區(qū)。因?yàn)榇丝贵w大部分來(lái)自人抗體并且CDR抗原性較弱,所以這種重新構(gòu)建的人抗體對(duì)人具有弱抗原性,因此預(yù)期可用于治療。
文檔編號(hào)A61K39/395GK1235639SQ97199215
公開(kāi)日1999年11月17日 申請(qǐng)日期1997年10月3日 優(yōu)先權(quán)日1996年10月4日
發(fā)明者小野浩一郎, 大友俊彥, 土屋政幸, 吉村康史, 小石原保夫, 小阪昌明 申請(qǐng)人:中外制藥株式會(huì)社