專利名稱：針對核糖核苷酸還原酶r1和r2組分的抗腫瘤反義序列的制作方法
技術領域：
這項發(fā)明涉及控制腫瘤發(fā)生和/或腫瘤細胞轉(zhuǎn)移的方法。特別是涉及針對核糖核苷酸還原酶的R1和R2組分的反義序列的用途。
背景技術：
導致DNA合成第一個獨特步驟是把核糖核苷酸轉(zhuǎn)化為其相應的脫氧核糖核苷酸。這項反應以細胞周期特有的方式由持家基因核糖核苷酸還原酶催化(Lewis等人，1978；Reichard,1993；Wright,1989a；Wright等人，1990a；Stubbe,1989)。在哺乳動物中這種酶由兩個不同的被稱為R1和R2的二聚體蛋白質(zhì)組分組成，它們由存在于不同染色體的兩個不同基因編碼(Bjorklund等人，1993；Tonin等人，1987)。哺乳動物蛋白質(zhì)R1具有同型二聚體結(jié)構(gòu)，其分子量大約170kDa，它擁有底物位點和能控制酶的活性的變構(gòu)效應作用點和底物特異性(Wright,1989；Thelander等人；1980；Caras等人，1985；Wright等人，1990a)。蛋白質(zhì)R2為同型二聚體，其分子量大約88kDa。它能形成一個穩(wěn)定催化所需要的酪氨酰自由基的兩個等同的雙核鐵中心(Wright等人，1990a,The lander等人，1985；McClarty等人，1990)。蛋白質(zhì)R1和蛋白質(zhì)R2在它們的C末端相互作用形成一個活性全酶(Reichard,1993；Wright等人，1990a；Davis等人，1994)。
在細胞周期中R1和R2被不同的機制調(diào)節(jié)。蛋白質(zhì)R2的從頭合成導致其在S期中相應的增加(Lewis等人，1978；Mann等人，1988)。因而在細胞周期過程中，R2組分的合成和降解控制著增殖細胞中的核糖核苷酸還原酶的活性、DNA的合成以及細胞增殖(Eriksson等人，1984)。限速R2組分是一個能被細胞周期過程中的CDC2和CDK2蛋白質(zhì)激酶調(diào)節(jié)因子磷酸化的磷蛋白(Chan等人，1993)，它含有能穩(wěn)定酶活性需要的獨特的酪氨酰自由基的非血紅素鐵分子(Reichard,1993；McClarty等人，1990)。
蛋白質(zhì)R1的水平在增殖細胞的細胞周期中沒有明顯變化，其值在整個細胞周期過程中可被測定。與R2mRNA類似，R1mRNA的合成也主要存在于細胞周期的S期(Eriksson等人，1984；Choy.等人，1989；Mann等人，1988)。然而與蛋白質(zhì)R2比較，由于蛋白質(zhì)R1具有較長的半衰期而導致它在細胞周期過程中較為廣泛的分布(Choy等人，1988；Mann等人，1988)。
當惡性腫瘤細胞接觸腫瘤啟動因子或腫瘤生長因子(TGF)β時，核糖核苷酸還原酶，特別是其R2組分的調(diào)節(jié)發(fā)生變化(Amara等人，1994；Chen等人，1993；Amara等人，1995b；Hurta and Wright,1995；Hurta等人，1991)。與非腫瘤細胞比較，培養(yǎng)的腫瘤細胞具有較高的酶活性(Weber,1983；Takeda和Weber,1981；Wright等人，1989a)。與正常對照組織樣品比較，人們發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)R2或R2mRNA的水平在腫瘤前期和腫瘤組織中升高(Saeki等人，1995；Jensen等人，1994)。
在腫瘤發(fā)展的生長因子介導機理中，在被轉(zhuǎn)化的細胞中，當這些細胞接觸腫瘤啟動因子或轉(zhuǎn)化生長因子β時，核糖核苷酸還原酶特別是R2組分的調(diào)節(jié)升高。(Amara等人，1996；Chen等人，1993；Amara等人，1995b)。這些研究在來自嚙齒動物和人體組織的腫瘤細胞(Weber,1983；Wright等人，1989a；Saeki等人，1995；Jensen等人，1994)或篩選用于對抗腫瘤藥物如羥脲有耐藥性的培養(yǎng)細胞中進行(Lewis等人，1978；Wright，等人，1989a)。
化合物如羥脲抑制核糖核苷酸還原酶的活性是通過破壞蛋白質(zhì)R2鐵分子中心引起酪氨酰自由基破壞(McClarty等人，1990)，進而阻止細胞在細胞周期中通過S期(Ashihara和Baserga 1979)。
分子生物學的突破和人類基因組計劃開創(chuàng)了意想不到的定向干預哺乳動物基因表達的可能性(Blaese,1997；Felgner,1997)。這些技術包括如特異基因的干擾。設計與目標mRNA中特異性序列雜交的反義(AS)寡核苷酸(AS-ON)是這種定向干預的一個例子?？偟恼f來，反義寡核苷酸能與磷脂膜很好地相互作用(Akhter等人，1991)。其在與細胞質(zhì)膜相互作用后，可以主動或被動的形式轉(zhuǎn)移到活細胞內(nèi)(Loke等人，1989)。這種轉(zhuǎn)移方式可能是通過與涉及細胞膜上的特異受體的飽和機理進行的(Yakubov等人，1989)。
很多精彩的綜述描述了反義技術的主要方面以及潛在的治療能力。它們從化學(Crooke,1995)、細胞(Wagner,1994)和治療(Hanania等人.,1995；Scanlon等人，1995；Gewirtz,1993)方面評述了這項快速發(fā)展的技術。在很短的時期內(nèi)，積累了很多在培養(yǎng)原代細胞和細胞系體外使用反義寡核苷酸以及使用ODN，以瞬時方式抑制某一特異過程和改變體內(nèi)功能的知識。目前已有足夠的體外和體內(nèi)動物模型的實驗以預計它們在人體內(nèi)療效。
可以使反義寡核苷酸用于控制前期腫瘤細胞或惡性腫瘤細胞的腫瘤發(fā)生和/或腫瘤轉(zhuǎn)移，其中應用了核糖核苷酸還原酶的R1和R2組分。
發(fā)明概述本發(fā)明人已表明R2基因的異常表達能決定細胞的惡性特征。人們發(fā)現(xiàn)變化的R2基因表達在腫瘤惡性發(fā)展中與ras相協(xié)作，重組R2表達導致與膜相關的Raf-1蛋白質(zhì)的增加。這些結(jié)果表明R2與Raf-1以及Rac-1協(xié)同作用，影響ras途徑，進而影響細胞增殖以及特別是腫瘤的發(fā)展。
本發(fā)明人也表明R2基因表達的抑制會降低腫瘤細胞的轉(zhuǎn)化性質(zhì)，特別是發(fā)明人證實，新反義R2寡核苷酸減少細胞轉(zhuǎn)化。反義R1寡核苷酸也抑制腫瘤細胞的轉(zhuǎn)化性質(zhì)。反義R1和R2寡核苷酸可在很低的濃度產(chǎn)生這些效果。然而令人驚奇的是正常細胞對這些反義寡核苷酸分子不太敏感。
已經(jīng)發(fā)現(xiàn)R2的異常表達導致腫瘤細胞對化療藥物耐藥性增加。在單獨使用不能殺死腫瘤細胞的低濃度下，反義R2寡核苷酸能降低腫瘤細胞對化療藥物的耐藥性。
廣義上說，本發(fā)明涉及用于調(diào)節(jié)細胞增殖，優(yōu)選地抑制腫瘤細胞增殖的化合物和方法?？杀挥糜谡{(diào)節(jié)細胞增殖的化合物包括核糖核苷酸還原酶表達的抑制劑，即編碼核糖核苷酸還原酶基因轉(zhuǎn)錄或翻譯的抑制劑。與核糖核苷酸還原酶基因互補的反義寡核苷酸是特別有效的抑制劑。
在一實施方案中，本發(fā)明提供了具有互補于核糖核苷酸還原酶基因核酸序列的序列之反義寡核苷酸，其包括至少七個核苷酸或核苷酸類似物。在一優(yōu)選的實施方案中，此寡核苷酸與核糖核苷酸還原酶基因mRNA區(qū)域，更優(yōu)選的與核糖核苷酸還原酶的R1和R2基因互補。
本發(fā)明也涉及一種評價某種化合物是否抑制核糖核苷酸還原酶基因的轉(zhuǎn)錄或翻譯，進而影響細胞增殖的方法。包括用一種表達載體轉(zhuǎn)染細胞，該表達載體包含編碼核糖核苷酸還原酶的核酸序列和該核酸轉(zhuǎn)錄或翻譯必需元件的重組分子；加入待測化合物，然后用核糖核苷酸還原酶的表達水平與不含待測化合物的對照中所獲的水平加以比較。
一種通過分析R2與Raf-1和/或Rac-1相互作用的激動劑或拮抗劑用來評價某種化合物調(diào)節(jié)Ras信號傳導途徑能力的方法，包括在待測化合物存在下，在允許R2與Raf-1和/或Rac-1相互作用的條件下，提供含有R2與Raf-1和/或Rac-1的反應混合液；測定R2與Raf-1和/或Rac-1之間復合物的形成或Ras信號傳導途徑的活化；以及與不含待測化合物的對照反應相比，其中反應混合物中發(fā)現(xiàn)較低水平的復合物或活化程度則表明這種待測化合物干擾R2與Raf-1和/或Rac-1相互作用，而較高水平則表明待測化合物增強Raf-1和/或Rac-1相互作用。
本發(fā)明也提供了一個用于調(diào)節(jié)細胞增殖，優(yōu)選地為腫瘤細胞增殖的藥物組合物。這種藥物組合物包含至少一種R1和R2表達的抑制劑，優(yōu)選地為根據(jù)本發(fā)明的反義寡核苷酸，或依本發(fā)明的方法所確定的化合物，其與生理可接受的載體或稀釋劑混合。
本發(fā)明也構(gòu)思一種調(diào)節(jié)細胞增殖，優(yōu)選地為腫瘤細胞增殖的方法。這種方法通過用有效量的至少一種抑制R2和R1表達的化合物，優(yōu)選地為如本發(fā)明的反義寡核苷酸或是根據(jù)本發(fā)明方法所確定的化合物與細胞接觸。
本發(fā)明也提供了一種用于減少細胞增殖，優(yōu)選地為腫瘤細胞增殖的方法。這種方法包含用有效量的一種R2和R1表達抑制劑，優(yōu)選地為如本發(fā)明的反義寡核苷酸或是根據(jù)本發(fā)明方法所確定的化合物與細胞接觸。
本發(fā)明也提供了一種用于增強腫瘤細胞對化療藥物敏感性的藥物組合物，這種藥物組合物包含至少一種R1或R2表達的抑制劑，優(yōu)選地為如本發(fā)明的反義寡核苷酸，或一種依據(jù)本發(fā)明的方法所確立的化合物，其與生理可接受的載體或稀釋劑混合。本發(fā)明進而提供一種用于調(diào)節(jié)對化療藥物有耐藥性的腫瘤細胞生長的藥物組合物，這種藥物組合物包含至少一種R1和R2表達的抑制劑，優(yōu)選地為如本發(fā)明的反義寡核苷酸，或一種根據(jù)本發(fā)明的方法所確定的化合物，其與生理可接受的載體或稀釋劑混合。
本發(fā)明也包括依據(jù)本發(fā)明的反義寡核苷酸，或一種依據(jù)本發(fā)明的方法所確定的化合物制備用于調(diào)節(jié)細胞增殖的藥物的用途。


通過參照下面的詳細描述并結(jié)合附圖能更好地理解本發(fā)明的其它優(yōu)點。圖1A-C用Western印跡法分析穩(wěn)定感染體中Myc標記的R2表達，A和B為凝膠圖；C為兩個掃描圖。(A)采用抗Myc表位抗體9E10的單克隆抗體，(B)采用多克隆兔抗R2血清，(C)為在細胞周期中用9E10抗體的流式細胞計數(shù)圖(Blosmanis等人，1987,Chaadee等人，1995)。圖2A-C測定轉(zhuǎn)化細胞灶的實驗照片(A和B)與圖表(C)，其中(A)．(a)BALB/C3T3細胞的感染；(b)用SH/mR2轉(zhuǎn)化NIH3T3后沒有形成細胞灶；(B)．用T24H-ras質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后，與B3/SH(a)和N3/SH(c)相比，用B3/mR2(b)和N3/mR2(d)能增加細胞灶的形成；(C)．三次獨立的ras轉(zhuǎn)染實驗中細胞灶的形成數(shù)。圖3A-C為瓊脂生長照片(A)和圖表(B和C)，其中A)．表明ras轉(zhuǎn)化的細胞中Myc-R2表達使在軟瓊脂上的生長速度增加。實驗所示分別為r-3/mR2和無轉(zhuǎn)染的r-3細胞(見表1)。B)．細胞C1/mR2與C1/SH對照細胞比較，腫瘤的潛伏期降低并且生長速度增加。每次實驗收集3×105來自對數(shù)期生長培養(yǎng)物的細胞，皮下注射到五只同系C3H/HeN鼠/細胞系/實驗中。所示為兩次獨立實驗的結(jié)果。顯示了腫瘤生長速度的t檢驗分析的P值，其表明兩種細胞系的生長速度明顯不同。C)．C1/mR2細胞表現(xiàn)增高的轉(zhuǎn)移傾向。圖4A-C的圖表，其中(A)．R2過量表達的細胞中，膜聯(lián)蛋白質(zhì)Raf-1的量增加。用重組的R2表達細胞系B3/mR2、N3/mR2、C1/mR2、r-2/mR2、r-3/mR2和NR4/mR2與其相應的對照細胞系B3/SH、N3/SH、r-2/SH、r3和NR4(對照)比較。在所有的情況下，表達重組R2的細胞均表現(xiàn)出膜聯(lián)蛋白質(zhì)Raf-1增加。兩組細胞系比較時，用t檢驗分析表明顯著差異(P＜0.001)(B)．在R2過量表達的細胞中，促分裂原活化蛋白質(zhì)激酶(MAPK-2)的活性也增加。用重組的R2表達細胞系B3/mR2、N3/mR2、10T/mR2、C1/mR2、r-2/mR2、NR4/mR2(R2)與其相應的用LXSH(對照)感染的對照細胞系比較。在實驗的所有情況下，表達重組R2的細胞酶活性升高，兩組實驗有顯著差異(P＜0.001)。(C)．用活化的V12Rac-1質(zhì)粒(Jelinek et al.,1994)轉(zhuǎn)染后，N3/mR2細胞與N3/SH細胞比較，結(jié)果表明細胞灶形成增加。圖中細胞灶數(shù)目是兩次獨立實驗的平均值±SE。圖5。鼠L細胞的CAD(A)和DHFR(B)的DNA Southern印跡分析的凝膠圖。(A)(a)不接觸藥物的作為對照組的H4細胞，(b)來自在含有50μM PALA條件下增殖的集落的H4細胞，(c)60μMPALA條件下的H4細胞。所用的DNA用Xbal完全消化。(B)(a)不接觸藥物的作為對照組的SC2細胞，(b)和(c)來自在含有80nM氨甲喋呤(MTX)條件下增殖的集落的SC2細胞。所用的DNA用Pstl完全消化。圖6A-B。BALB/C3T3細胞的CAD(A)和DHFR(B)的DNASouthern印跡分析凝膠圖。DNA用PstⅠ消化完全。(A)(a)不加PALA的B3/mR2細胞，(b)來自在含有40μM PALA條件下增殖的集落的B3/mR2細胞，或(c)50μM PALA條件下的B3/mR2細胞。(B)(a)不加MTX的B3/mR2細胞，(b)來自在含有60nM MTX的條件下增殖的集落的B3/mR2細胞，(c)80nMMTX條件下的B3/mR2細胞。圖7。N/R2-4(a)和N/R2+ASR2(b)細胞中蛋白質(zhì)R2的含量的Western印跡分析圖。為了區(qū)分載體蛋白質(zhì)R2與被轉(zhuǎn)染細胞的內(nèi)源基因產(chǎn)物中的蛋白質(zhì)R2，在R2cDNA的5′末端加入編碼人C-myc表位的10個氨基酸和一個甲硫氨酸的序列，在泳道a中可見重組(上帶)和內(nèi)源(下帶)蛋白質(zhì)R2，而在含R2反義序列的細胞中其蛋白質(zhì)R2水平明顯降低(泳道b)。兩個細胞系生長的倍增時間近似，約為16小時。圖8。在含有PALA、MTX或羥脲的條件下增殖的集落中細胞的p53-DNA結(jié)合活性的凝膠圖。(a)無p53的對照1B細胞。(b)在含20μM PALA條件下生長的B3/mR2細胞。(c)在含40μM PALA條件下生長的B3/R2c2細胞。(d)在含40nM MTX條件下生長的B3/mR2細胞。(e)在含60nM MTX條件下生長的B3/R2c2細胞。(f)在含0.2mM羥脲條件下生長的B3/mR2細胞。(g)在含0.3mM羥脲條件下生長的B3/R2c2細胞。在含有421抗體下用32P標記的p53共有結(jié)合序列培養(yǎng)細胞，用于活化p53使之與DNA結(jié)合。從圖中可看到，除不含p53的1B對照組細胞外，所有的細胞系都含p53-DNA復合物。低分子量的復合物的形成是由于p53-DNA的結(jié)合，高分子量的復合物的形成是抗體活化的(supershifted)p53與DNA之間的結(jié)合。圖9。在(a)含H-ras癌基因的NIH-3T3鼠細胞中轉(zhuǎn)化灶數(shù)目。(b)含H-ras癌基因和R2反義序列的鼠NIH-3T3細胞中轉(zhuǎn)化灶數(shù)目。(c)含H-ras癌基因和R2編碼區(qū)序列的鼠NIH-3T3細胞中轉(zhuǎn)化灶數(shù)目。所有結(jié)果均為三次實驗的平均值。圖10A-B。經(jīng)不同處理后L60鼠腫瘤細胞中的蛋白質(zhì)R2水平的Western印跡分析圖。(A)用AS-Ⅱ-626-20抑制后細胞中蛋白質(zhì)R2水平。(B)用不同R2反義序列抑制后細胞中的蛋白質(zhì)R2水平。
優(yōu)選實施方案的詳細描述1．反義序列和核酶本發(fā)明提供了能抑制核糖核苷酸還原酶蛋白質(zhì)表達進而調(diào)節(jié)細胞增殖的化合物。這種化合物可通過抑制基因轉(zhuǎn)錄或mRNA翻譯成蛋白質(zhì)而抑制核糖核苷酸還原酶的表達。其可包括反義寡核苷酸和核酶。
此處所用術語“反義寡核苷酸”是指與其靶互補的核苷酸序列。術語“寡核苷酸”是指由天然存在的堿基、糖和內(nèi)糖(骨架)鍵組成的核苷酸單體、寡聚體或多聚體。此術語也包括被修飾或取代的寡聚體，其包括功能相似但非天然存在的單體或其部分。這種被修飾或取代的寡核苷酸，由于其性質(zhì)如細胞吸收提高或在核酸酶存在下穩(wěn)定性增強而比天然存在的形式更為優(yōu)選更實用。此術語也包括含有兩個或兩個以上化學不同區(qū)域的嵌合寡核苷酸。例如嵌合寡核苷酸可含有至少一個賦予有益特性的修飾過的核苷酸(如，酶降解抗性增加和細胞吸收能力提高)，或是兩個或兩個以上本發(fā)明寡核苷酸結(jié)合形成的一個嵌合寡核苷酸。
本發(fā)明中的反義寡核苷酸可指核糖核苷酸或脫氧核糖核苷酸，且可包含天然存在的堿基包括腺嘌呤，鳥嘌呤，胞嘧啶，胸腺嘧啶和尿嘧啶。寡核苷酸也可含有被修飾的堿基如黃嘌呤，次黃嘌呤，2-氨基腺嘌呤，6-甲基、2-丙基和其它烷基腺嘌呤，5-鹵代胞嘧啶，5-鹵代尿嘧啶，6-氮雜胞嘧啶、6-氮雜尿嘧啶和6-氮雜胸腺嘧啶，假尿嘧啶，4-硫代尿嘧啶，8-鹵代腺嘌呤，8-氨基腺嘌呤，8-硫代腺嘌呤，8-硫代烷基腺嘌呤，8-羥基腺嘌呤或其它8-取代的腺嘌呤，8-鹵代鳥嘌呤，8-氨基鳥嘌呤，8-硫代鳥嘌呤，8-硫代烷基鳥嘌呤，8-羥基鳥嘌呤或其它8-取代的鳥嘌呤，其它氮雜和脫氮尿嘧啶、胸腺嘧啶、胞嘧啶、腺嘌呤或鳥嘌呤，5-三氟甲基尿嘧啶和5-三氟胞嘧啶。
本發(fā)明中的其它反義寡核苷酸可包含在磷酸骨架上、短鏈烷基或環(huán)烷基糖間(intersugar)鍵或短鏈雜原子或雜環(huán)烷基糖間鍵上，含有被修飾過的磷、氧雜原子。例如，反義寡核苷酸可含有硫代磷酸酯，磷酸三酯，甲基磷酸酯或二硫代磷酸酯。在本發(fā)明的一個實施方案中在3′末端4-6堿基之間連接有硫代磷酸酯鍵。另一個實施方案中是用硫代磷酸酯鍵連接所有的核苷酸。
本發(fā)明的反義寡核苷酸也可以包含可能更適合用作治療或?qū)嶒炘噭┑暮塑账犷愃莆?。核苷酸類似物的一個例子是肽核酸(PNA)，其中DNA(或RNA)中脫氧核糖(或核糖)磷酸鍵被與肽中的鍵相似的聚酰胺鍵所取代產(chǎn)生(P.E.Nielsen等人，科學Science,1991,254,1497)。PNA類似物能耐受酶降解，具有很長的體內(nèi)和體外壽命。由于PNA鏈與DNA鏈之間沒有電荷排斥，PNA能與互補的DNA序列有很強的結(jié)合。其它寡核苷酸可包括具有聚合物骨架、環(huán)狀骨架或開鏈狀骨架的核苷酸。例如，核苷酸可含有嗎啉代骨架結(jié)構(gòu)(美國專利No15,034,506)。寡核苷酸還可有象報告基團一樣的基團(用于改善反義寡核苷酸的藥代動力學性質(zhì)的基團)，或用于改善反義寡核苷酸藥物動力學性的基團。反義寡核苷酸還可含有糖類似物。
篩選表現(xiàn)出最小的二聚體形成、自身互補相互作用以及與靶序列以外的核糖核苷酸還原酶mRNA結(jié)合的可能性之反義寡核苷酸。這些性質(zhì)可通過計算機模擬程序OLIGO引物分析軟件(3.4版，NationalBioSciences)進行測定。這個程序可對上述三個參數(shù)進行定性測定并指出“無可能”，“有一定可能”或“基本上完全可能”。如表7和11所述，所選的寡核苷酸的這三個參數(shù)優(yōu)選的應評估為“無可能”或“有一定可能”，最優(yōu)選的為“無可能”。篩選寡核苷酸，以使它們的功能基本上不受任何修飾或取代影響。
本發(fā)明的反義寡核苷酸優(yōu)選地與核糖核苷酸還原酶基因的mRNA區(qū)域互補。更優(yōu)選地，該反義寡核苷酸與核糖核苷酸還原酶R2基因的mRNA區(qū)域互補。
一般來說，反義寡核苷酸至少含有七個核苷酸或核苷酸類似物，更優(yōu)選的含有至少20個核苷酸或核苷酸類似物，最優(yōu)選的含有30-35個核苷酸或核苷酸類似物。如本發(fā)明優(yōu)選的反義寡核苷酸序列列于表11和7。它們是SEQ.ID.NOS.1-102和SEQ.ID.NOS.103-161.更優(yōu)選的反義寡核苷酸見表12。最優(yōu)選的寡核苷酸為SEQ.ID.NOS1,2, 12,16,18,21,25,29,34,42,44,45,46,52,53,59,60,64,65,66,68,69,70,72,73,74,76,78,79,80,90,91,92,96,99,100和102，如表7所示。
本發(fā)明的反義寡核苷酸優(yōu)選地可通過常規(guī)的和周知的技術制備。例如，可以使用固相合成特別是使用已經(jīng)商品化的設備如AppliedBiosystems生產(chǎn)的裝置制備寡核苷酸。人們也優(yōu)選地純化合成的寡核苷酸以排除可能干擾其活性的因素。本發(fā)明的寡核苷酸也可通過基因互補技術或使用本文所描述的探針進行鑒定。本領域普通技術人員均周知制備被修飾的或取代的反義寡核苷酸。
核酶序列也能被用于調(diào)節(jié)細胞增殖。它含有與本發(fā)明的反義寡核苷酸同源或互補序列，且含有用于切斷寡核苷酸的必需催化中心。本發(fā)明所使用的核酶類型可選自本領域周知的類型。幾種已被鑒別的核酶結(jié)構(gòu)家族包括GroupⅠ內(nèi)含子、RNaseP、丁型肝炎病毒核酶、錘頭核酶和從煙草環(huán)型病毒衛(wèi)星RNA(sTRSV)的陰性鏈衍生出來的發(fā)夾狀核酶(Sullivan,1994美國專利No.5,225,347，卷4至5)。后兩種家族是從類病毒和擬病毒中產(chǎn)生，據(jù)信該核酶是用來分離在滾環(huán)復制中的寡聚體的單體形式(Symons,1989和1992)。錘頭核酶和發(fā)夾狀核酶通常經(jīng)改造以用于基因治療中mRNA的反式切割(Sullivan,1994)?，F(xiàn)在已在臨床上試用的發(fā)夾狀核酶優(yōu)選地用于本發(fā)明。一般該酶長度從30到100核苷酸。2．評價化合物的方法此項發(fā)明設計了一種評價化合物是否抑制核糖核苷酸還原酶基因轉(zhuǎn)錄或翻譯并進而調(diào)節(jié)(即減低)細胞增殖的方法，其包括用一種表達載體轉(zhuǎn)染細胞，該表達載體包含編碼核糖核苷酸還原酶的核酸序列和該核酸轉(zhuǎn)錄或翻譯必需元件；加入待測的化合物；然后用核糖核苷酸還原酶的表達水平與不含待測化合物的對照中所得的水平加以比較。
含有編碼核糖核苷酸還原酶的核酸序列的表達載體可通過用本領域已知的有關基因序列的方法而建立。合適的轉(zhuǎn)錄或翻譯元件可來自多種來源，包括細菌、真菌、病毒、哺乳動物或昆蟲的基因。合適元件的選擇取決于被選用的宿主細胞，可由本領域普通技術人員容易地完成。
報告基因的例子是指編碼蛋白質(zhì)如β-半乳糖苷酶(如lacZ)、氯霉素、乙酰基轉(zhuǎn)移酶、螢火蟲螢光素酶或免疫球蛋白或其部分的基因。通過測定報告蛋白質(zhì)如β-半乳糖苷酶等濃度變化可監(jiān)測報告基因的轉(zhuǎn)錄。因而可通過觀察和分析重組分子的表達來決定一種物質(zhì)對核糖核苷酸還原酶基因表達的影響。
適于進行本發(fā)明的宿主細胞包括CHO、COS、BHK、293和Hela細胞。轉(zhuǎn)染哺乳動物細胞的方法已被本領域所熟知，其中包括磷酸鈣介導的電穿孔法，逆轉(zhuǎn)錄病毒法和原生質(zhì)體融合介導的轉(zhuǎn)染方法。
本發(fā)明發(fā)現(xiàn)R2與Raf-1和/或Rac-1相互協(xié)同作用并籍此影響Ras信號傳導途徑，因此本發(fā)明還設計了評價一種化合物調(diào)節(jié)Ras信號傳導途徑能力的方法，其通過分析R2與Raf-1和/或Rac-1相互作用的激動劑或拮抗劑(即刺激劑或抑制劑)進行。評價一種化合物是R2與Raf-1和/或Rac-1相互作用的激動劑或拮抗劑的基本方法是，在適合R2與Raf-1和/或Rac-1相互作用的條件下制備一種含有R2與Raf-1和/或Rac-1的反應混合液。被測化合物可在開始時或在加入R2與Raf-1和/或Rac-1后加入此反應混合液。同時制備一種不含被測化合物或帶有對照物的對照反應混合液。測定信號傳導途徑的活化或復合物形成。如果僅在對照品中有傳導途徑的活化或復合物形成，則表明此化合物干擾R2與Raf-1和/或Rac-1的相互作用。這種反應可在液相中完成，或者R2與Raf-1和/或Rac-1或者被測化合物可被固定化。
本發(fā)明也可篩選抑制R2與Raf-1和/或Rac-1相互作用之激動劑的作用的拮抗劑。因而本發(fā)明也可用于鑒定競爭R2同一結(jié)合位點的化合物。
本發(fā)明還設計一種鑒定能與同R2相互作用的蛋白質(zhì)結(jié)合，進而抑制R2的化合物的方法。蛋白質(zhì)之間相互作用可通過傳統(tǒng)的方法如共免疫沉淀、交聯(lián)和使用梯度或色譜柱共純化方法進行鑒定。也可使用其它可同時鑒定編碼與R2相互作用的蛋白質(zhì)的基因的方法。這些方法包括用標記的R2探查表達文庫。
雙雜交系統(tǒng)也可被用于體內(nèi)測定蛋白質(zhì)相互作用。一般來說，要先建立編碼兩種雜合蛋白質(zhì)的質(zhì)粒。第一個雜合蛋白質(zhì)由與R2融合的轉(zhuǎn)錄激活蛋白的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域組成，第二個雜合蛋白質(zhì)由與未知蛋白質(zhì)融合的轉(zhuǎn)錄激活蛋白激活結(jié)構(gòu)域組成。未知蛋白質(zhì)被一種重組入作為cDNA文庫的一部分的質(zhì)粒cDNA編碼。然后質(zhì)粒被轉(zhuǎn)化入一株含有報告基因(如lacZ、螢光素酶、堿性磷酸酶、辣根過氧化酶)的酵母中(如S.cerevisiae)，此報告基因的調(diào)節(jié)區(qū)域含有轉(zhuǎn)錄激活蛋白的結(jié)合位點。雜合蛋白質(zhì)單獨不能激活報告基因的轉(zhuǎn)錄，但是二雜合蛋白質(zhì)相互作用可重構(gòu)有功能的激活蛋白進而導致報告基因的表達，這可通過分析報告基因產(chǎn)物測定。
可以推斷融合蛋白質(zhì)能用于上述方法。特別是融合于谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶的R2可用于此方法。
用本發(fā)明所確定的化合物包括但不僅局限于肽，如可溶性肽，其包括具有Ig加尾的肽，隨機肽庫成員和用組合化學衍生出的由D和/或L構(gòu)型氨基酸組成的分子文庫，磷酸肽(包括隨機或部分簡并的和直接磷酸肽文庫的成員)，抗體(如多克隆的、單克隆的、人源化的、抗獨特型的，嵌合的、單鏈抗體、片段(如Fab,F(ab)2和Fab表達文庫片段及其表位結(jié)合片段)，和小的有機或無機分子。這些化合物可以是內(nèi)源生理性化合物，也可為天然或合成的化合物。
適于應用本發(fā)明中的各種方法以評價調(diào)節(jié)R2與Raf-1和/或Rac-1相互作用化合物的試劑可被包裝入方便的藥盒，其能提供裝在合適容器中的必需材料。這種藥盒還可包括應用本發(fā)明的方法所需要的合適支持物。
這里描述的應用本發(fā)明方法確定的化合物和其它R2表達抑制劑(如反義R2序列)可被用來調(diào)節(jié)Ras信號傳導途徑。特別是指那些被用來抑制Raf-1和/或Rac-1信號傳導性質(zhì)、抑制細胞增殖、改變細胞周期和下調(diào)自身免疫病病人免疫反應的化合物。在本發(fā)明的一個實施方案中，這些化合物具有抗癌基因或腫瘤抑制活性。3．調(diào)節(jié)細胞生長或轉(zhuǎn)移的方法及組合物用本發(fā)明中的方法確定的反義寡核苷酸、核酶和化合物調(diào)節(jié)細胞增殖，特別是腫瘤細胞增殖。因此，提供了干預細胞增殖，優(yōu)選地腫瘤細胞增殖的方法，包括用一種或多種本發(fā)明的方法確定的寡核苷酸、核酶和化合物與組織或細胞接觸。優(yōu)選地施用如表7、11或12所列的反義寡核苷酸。
術語“接觸”一詞指將反義寡核苷酸、核酶等以液相載體中的形式加入到細胞懸浮液或組織樣品中，或指直接或間接地將寡核苷酸施予動物體內(nèi)的細胞或組織。
這些方法可用以治療增生性疾病，例如各類癌癥，如白血病，淋巴瘤(何杰森氏和非何杰森氏病)，肉瘤，黑素瘤，腺瘤，實體組織瘤，乏氧腫瘤，口、咽、喉和肺部的鱗狀細胞癌，泌尿生殖道癌，如宮頸和膀胱癌，造血細胞癌，大腸癌，乳腺癌，胰腺癌，頭頸部癌和神經(jīng)系統(tǒng)癌。良性損傷如乳頭狀瘤，關節(jié)硬化癥，牛皮癬，原發(fā)或繼發(fā)的polythemia，肥大細胞增生病，自身免疫疾病，血管生成疾病，細菌感染和病毒感染，如艾滋病毒感染，肝炎和皰疹病毒感染。
用本發(fā)明的方法確定的反義寡核苷酸、核酶以及化合物也可用于治療耐藥性腫瘤。耐藥性腫瘤的例子有如對羥脲耐藥的腫瘤；表達高水平P-糖蛋白質(zhì)的腫瘤(已公認P-糖蛋白質(zhì)賦予多種抗癌藥物，如秋水仙素，長春花堿和阿霉素的耐藥性)，或者那些表達多藥抗藥性蛋白質(zhì)的腫瘤，如R.Deeley等所述(科學258:1650-1654,1992)。
已經(jīng)發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的反義寡核苷酸抑制腫瘤轉(zhuǎn)移。在本發(fā)明的一個實施方案中，提供減少腫瘤轉(zhuǎn)移的方法包括，給予治療對象一定量的本發(fā)明的反義寡核苷酸可以有效地抑制腫瘤轉(zhuǎn)移。優(yōu)選的是SED.ID.NOS1-102或SEQ.ID.NOS.103-161中所列出的反義寡核苷酸序列，最優(yōu)選的是列入表12中的序列。
可檢測所選反義寡核苷酸、核酶和化合物調(diào)節(jié)特定的體內(nèi)和體外實驗系統(tǒng)中的細胞(特別是腫瘤細胞)生長或抑制腫瘤轉(zhuǎn)移的能力。
在治療應用中，用本發(fā)明的方法確定的反義寡核苷酸、核酶和化合物可以制成藥物組合物。這些藥物組合物可含有一種或多種用本發(fā)明的方法所確定的反義寡核苷酸、核酶和化合物，以便用于向患者以生物可接受的方式施用。本發(fā)明的組合物意在用于人類和多種其它哺乳動物，如羊、牛、馬、豬、犬和貓。
根據(jù)治療的區(qū)域以及局部或系統(tǒng)性治療，本發(fā)明的藥物組合物可以不同的方式給藥。組合物可以如口服、皮下或腸道外給藥(包括靜脈、動脈內(nèi)、肌內(nèi)、腹膜腔內(nèi)注射)，或鼻腔內(nèi)給藥，還可以根據(jù)惡性細胞的治療需要采取鞘內(nèi)或持續(xù)輸注給藥。對于在中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)輸運，可用如Ommaya藥池或其它本領域已知的方法進行鞘內(nèi)給藥。藥學可接受的載體、稀釋劑、佐劑和載體以及植入性載體、稀釋劑，一般指那些情性、無毒性的固體或液體填充劑、稀釋劑或不與本發(fā)明的活性物質(zhì)反應的包裝材料。組合物中也可包括陽離子脂類(如Lipofectin,Life Technologies)，以促進寡核苷酸的吸收?；衔飪?nèi)植體也可應用。一般說來，藥物組合物應是無菌的。
本發(fā)明的寡核苷酸和核酶也可以由病毒或非病毒載體來輸運。這些序列可以整合入表達盒或構(gòu)建體中去，以便本發(fā)明的反義寡核苷酸或核酶可以在細胞內(nèi)表達。一般這種構(gòu)建體含有適當?shù)脑试S寡核苷酸或反義寡核苷酸在細胞中轉(zhuǎn)錄的轉(zhuǎn)錄控制區(qū)。
因此，本發(fā)明提供了含有有效地連接到編碼本發(fā)明的反義寡核苷酸或核酶的序列上的轉(zhuǎn)錄控制序列的載體。本發(fā)明還進一步提供了宿主細胞，它們選自于合適的用這些載體轉(zhuǎn)化的真核或原核細胞。這些轉(zhuǎn)化的細胞促成了本發(fā)明對惡性細胞的功能和調(diào)控的研究和本發(fā)明的治療的研究。
載體為已知或可由本領域普通技術人員構(gòu)建。載體應含有取得期望的序列轉(zhuǎn)錄所必需的所有表達元件。這些載體也可有其它有利的特性，比如以不同形式回收核酸的機制。噬菌粒就是這種有利載體的一個特殊例子，因為這種載體既可用作質(zhì)粒又可用作噬菌體載體。其它載體的例子包括病毒，如噬菌體、桿狀病毒和逆轉(zhuǎn)錄病毒、DNA病毒、脂質(zhì)體和其它重組載體。這些載體也可包含用于原核或真核宿主細胞的元件。本領域普通技術人員知曉何種宿主系統(tǒng)與特殊載體可以匹配。
用任何一種本領域已知的技術都可以將載體轉(zhuǎn)入細胞或組織。這類方法可從以下書目所述中找到。Sambrook等所著的《分子克隆，實驗室手冊》(冷泉港試驗室，紐約1989和1992),Ausubel等所著的《當今分子生物學技術》(John Wiley and Sons,Bultimore,Maryland,1989),Chang等所著的《體細胞基因治療》(CRCPress,AnnArbor,MI,1995),Vega等所著的《基因打靶》(CRC Press,Ann Arbor,MI,1995)，《載體分子克隆載體及其應用大全》(Butterworths,Boston,MA,1988)，和Giloa等。且包括穩(wěn)定的或瞬時轉(zhuǎn)染、Lipofection、電穿孔和用重組病毒載體感染細胞。
用感染法導入核酸有幾個益處。因為這種感染具有自然特性，因而感染的效率較高。此外，病毒非常特化且一般僅在特定細胞類型中感染和增殖。因此其天然特異性可被用于將載體定向于體內(nèi)特定的細胞類型或定向于在一種組織或混合培養(yǎng)物中的細胞。病毒載體也可用特異的受體或配基來修飾，以通過受體介導的事件來改變定向特異性。
還可向載體添加額外的特性以確保其安全性和/或增加其治療功效。這種特性包括如，可用于針對用重組病毒感染的細胞負性篩選的標記。這種負性篩選的標記的一個例子為TK基因，其賦予對抗病毒藥物9-[1,3-二羥-2-丙氧甲基]鳥嘌呤(gancyclowir)的敏感性。由于它通過抗生素的加入提供了可誘導的自殺，因此負性篩選是一種控制感染的方法。這種保護特性確保了例如當出現(xiàn)了生產(chǎn)變異形式的病毒載體或序列的突變時，不會發(fā)生細胞轉(zhuǎn)化。所述特性也可包括限制表達于特定細胞類型的特性。這種特性包括如特異性用于期望的細胞類型的啟動子和調(diào)控元件。
重組病毒載體是另一個用于在體內(nèi)引入所需核酸的例子，因為這種載體具有側(cè)面感染(lateral infection)和目標特異性等優(yōu)點。側(cè)面感染是如逆轉(zhuǎn)錄病毒生命循環(huán)中固有的，籍此單一感染的細胞產(chǎn)生很多子代病毒粒，然后其子代病毒粒生長并感染鄰位細胞。其結(jié)果能造成大面積快速感染，而大多數(shù)感染不是被原始病毒粒感染的。這種過程與僅通過子代體傳播感染的垂直型病毒感染相反。也能生產(chǎn)不能進行側(cè)面擴散感染的病毒載體，這種特性對如果想僅引入一個特定基因到目標細胞的附近部位是很有用的。
本發(fā)明的方法所用的載體可依賴于所期望定向的細胞類型進行選擇。例如如果要治療乳腺癌，應該選用對這種上皮細胞特異性的載體。相似地，如果治療造血系統(tǒng)細胞，則應該選用對血液細胞和它們的前體特異性的病毒載體，優(yōu)選地采用對于特定類型的造血細胞特異性的病毒載體。
逆轉(zhuǎn)錄病毒載體可被構(gòu)建成感染性顆?；驑?gòu)建成僅能單次首次感染。在前一種情況下，病毒基因組被修飾以保留了合成新一代病毒蛋白質(zhì)或RNA所需的所有必需基因、調(diào)控序列及裝配信號。一旦合成這些分子，宿主細胞會將RNA包裝入新一代病毒顆粒中，其具備進行新一輪感染的能力。對載體基因組進行改造是為了能編碼和表達所需的重組基因。就非感染性病毒載體而言，通常突變載體基因組來破壞病毒包裝信號，因為這些信號為RNA裝配入病毒顆粒所必需。沒有這種信號，任何形成的顆粒都不含基因組，因而也不能進入下一輪的感染。特殊類型的載體可按使用需要構(gòu)建。實際所用載體已公知并為本領域可得或可使用公知技術由本領域技術人員構(gòu)建。
舉例來說，如果使用病毒載體，其靶向特異性有利于操作程序，因此不必將載體局部施用于患病的位點。然而，局部應用也許更迅速有效。也可用其它的施用方式如靜脈或皮下注射給藥。將病毒載體注入脊髓液也是一種施用方式。注射之后，病毒載體將在體內(nèi)循環(huán)直到識別帶有合適的用于感染的靶向特異性宿主細胞。
轉(zhuǎn)染載體如脂質(zhì)體也可被用于將以上所述的非病毒載體引入到接種區(qū)中的受體細胞中。這種轉(zhuǎn)染載體已被本領域技術人員所熟知。
本發(fā)明的藥物組合物和載體可以按照良好的醫(yī)療實踐和本領域公知的治療模式單獨施用或與其它藥物聯(lián)合使用。可與本發(fā)明的組合物聯(lián)合施用的其它藥物的例子有細胞毒藥物、免疫毒素、烷化劑、抗代謝藥物、抗腫瘤抗生素和其它抗腫瘤藥物。
反義寡核苷酸、核酶和化合物的劑量將取決于所治療疾病的嚴重性和反應性，其治療時間可從數(shù)天到數(shù)月直到獲得疾病改善。通過測定藥物在體內(nèi)積累可計算出最佳給藥時間間隔。本領域普通技術人員可方便地確定最佳劑量、給藥方式和給藥時間間隔。最佳劑量可根據(jù)每個寡核苷酸的相對強度而改變，其一般取決于體外和體內(nèi)動物實驗的ED50值。本發(fā)明的藥物組合物或載體及聯(lián)合用藥可以細胞毒性或無細胞毒性的劑量服用，或一種藥物在細胞毒性劑量下而另一種藥物在無細胞毒性劑量下服用。其劑量選擇決定于其能否產(chǎn)生協(xié)同效果。
實施例實施例通過轉(zhuǎn)基因技術對失去調(diào)節(jié)的R2表達細胞的腫瘤相關特性進行了分析。R2過度表達導致經(jīng)活化的H-ras轉(zhuǎn)染的鼠成纖維細胞轉(zhuǎn)化灶形成的頻率增高。此外，ras轉(zhuǎn)化的細胞中，重組R2表達導致在軟瓊脂上集落形成效率增加，且在體內(nèi)明顯增強其致癌及轉(zhuǎn)移潛能。此外，失去調(diào)節(jié)的R2表達還與其它癌基因，如rac-1在轉(zhuǎn)化機制上有協(xié)同作用。
這里陳述的結(jié)果首次證明，哺乳動物核糖核苷酸還原酶R2組分是癌決定因子，它可與活化的癌基因協(xié)同作用從而改變其致癌潛能；且支持如下模型即由于失去調(diào)節(jié)的R2表達引起主要的Ras途徑發(fā)生變化，從而介導了上述致癌作用。觀察結(jié)果還表明，R2也參與其它重要的細胞功能，并通過與癌基因的協(xié)作而對確定致癌潛能起直接作用。
這些實施例也證明，寡核苷酸還原酶R2基因表達在決定藥物敏感特性上也起重要作用，這一效應至少部分是借助參與基因組穩(wěn)定性的機制實現(xiàn)的。
由于R2異常表達而改變藥物敏感特性的機制并不要求野生型p53功能的丟失或突變型p53的直接參與，雖然由p53調(diào)控途徑的下游遺傳事件有可能參與。正如實施例1中所示，R2表達增加與ras途徑活化有關，涉及Raf-1蛋白質(zhì)和促分裂原活化的蛋白質(zhì)激酶-2(MAPK)活性。在Balb/c3T3和NIH-3T3細胞中，重組R2基因的表達明顯增加Raf-2蛋白質(zhì)的活化以及促分裂原活化的蛋白質(zhì)激酶(MAPK)活性。
對上述觀察結(jié)果能夠提出一個假設而不意在將本發(fā)明局限于這種作用模式。這些觀察提示，蛋白質(zhì)R2除了作為核糖核苷酸還原中的限速成分外，還具有作為MAPK途徑中信號分子的能力。諸如C-myc基因產(chǎn)物的一些轉(zhuǎn)錄因子是MAPK途徑的下游目標，它們控制例如在細胞周期的多個關鍵環(huán)節(jié)起重要調(diào)節(jié)作用的細胞周期蛋白質(zhì)A、D和E的表達(Hunter,1994；1995)。對細胞周期中關鍵環(huán)節(jié)控制的破壞，會加速基因組的不穩(wěn)定性并促進DNA擴增(Kohn,1996；Livingston等人，1992)。C-myc過度表達與DHFR介入的基因擴增機制有直接關系(Mai,1994)。這些觀察結(jié)果提示，由于異常R2表達所致的MAPK途徑變化可至少對觀察到的藥物敏感性和基因組完整性的改變起部分作用。
實施例3證明，針對R1和R2組分的短反義序列具有抗腫瘤活性并對腫瘤細胞有細胞毒性。此外，R2反義序列也可與公知的化療藥物協(xié)同作用。極低濃度(無毒性)的短反義序列可降低腫瘤細胞對化療藥物如N-(膦乙酰)-L-天冬氨酸(PALA)、氨甲喋呤和羥脲等的耐藥性。正如實施例所示，用含有反義方向的R2序列的載體轉(zhuǎn)染細胞。這些細胞對化療藥物更為敏感。鼠10T1/2耐藥細胞經(jīng)反義方向的R2序列轉(zhuǎn)染后，對化療藥物的耐藥性也明顯降低(即敏感性增加)。與R2序列互補的合成短反義序列也增加敏感性。
以上討論為應用針對R2 mRNA反義寡核苷酸和核酶提供了事實依據(jù)。本發(fā)明應用和所涉及的方法由下面的非限制性實施例和圖表所示。通用方法分子生物學通用方法本領域周知的標準分子生物學技術和未特別敘述的技術通常按以下所述操作Sambrook等，分子克隆實驗室手冊，冷泉港實驗室，紐約(1989,1992)；Ausubel等，當代分子生物學方法JohnWiley和Sons,Baltimore,Maryland(1989)；Perbal，分子克隆實踐指南，John Wiley&Sons,New York(1988)。多聚酶鏈反應(PCR)基本按PCR方法方法和應用指南，Academic Press,San Diego,CA(1990)進行。
用于本發(fā)明的載體可由本領域技術人員構(gòu)建，載體應含有實現(xiàn)期望序列轉(zhuǎn)錄所需的所有表達元件。選擇這些表達元件以保證僅僅在目的細胞中表達。其它一些有用的特征也可以包含在這些載體中，如以不同形式回收核酸的機制。本領域普通技術人員知曉與特定的細胞類型相適應的表達元件。這些載體能夠被以上述本領域周知方法的任何一種導入細胞或組織。免疫學通用方法本領域已知的標準免疫學方法和未特別敘述的方法通常按以下所述操作Stites等(編)，基礎與臨床免疫學第8版；Appleton&Lange,Norwalk,CT(1994)；Mishell和Shiigi(編)，細胞免疫學中的篩選方法，W.H.Freeman and Co.，紐約(1980)。致癌性及轉(zhuǎn)移性鑒定按已報道文獻所述方法確定癌變潛能[Wright,1989a；Egan等人1987a,1987b；Damen等人，1989；Taylor等人，1992；Stokoe等人，1994]。六至八周齡同系C3H/HeN小鼠(CharlesRiver,Quebec)用于評價細胞的致癌性及轉(zhuǎn)移性。細胞制備自處于對數(shù)生長期未生長過盛的細胞，經(jīng)胰酶/EDTA溶液溫和消化收獲，用平衡過的鹽溶液調(diào)整到適當濃度。
對于致癌性(腫瘤潛伏期)鑒定總體積0.1ml中含1×105細胞，經(jīng)尾靜脈注射于小鼠背部，記錄形成經(jīng)觸診方法可檢測腫瘤(2×2mm)所需的時間。腫瘤出現(xiàn)后，通過每天測量腫瘤直徑，并計算腫瘤基底面積來評估腫瘤生長(Damen等人，1989)。腫瘤大小通過腫瘤橫切面面積相乘確定。21天后從小鼠上分離腫瘤并記錄重量。如未見腫瘤形成，注射后持續(xù)觀察小鼠兩月，處死小鼠。
對于轉(zhuǎn)移性(轉(zhuǎn)移潛能的確定)鑒定總體積0.2ml中含1×105細胞，經(jīng)尾靜脈注射于六至八周齡同系C3H/HeN小鼠，21天后計數(shù)肺部腫瘤形成數(shù)。處死小鼠，經(jīng)氣管注入Bouin′s液(苦味酸，甲醛，醋酸，15∶5∶1)，肺內(nèi)染色(Egan等人，1987b；Damen等人，1989)。肺部腫瘤在解剖鏡下計數(shù)。為確證相同數(shù)量的試驗組及對照組細胞被注射到鼠內(nèi)，分別用100個細胞接種于含生長培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿，每組細胞接種兩個培養(yǎng)皿。孵育10天后，用亞甲藍染色平板計數(shù)集落。核糖核苷酸還原酶鑒定細胞粗提物中制備的核糖核苷酸還原酶活性的鑒定如文獻所述(Lewis等人，1978；Hurta和Wright,1992；Hurta等；1995)。酶制品由下述方法獲得經(jīng)凍融三次，對數(shù)生長期細胞裂解于含1mM DTT,1mM蛋白質(zhì)酶抑制劑AEBSF(Calbiochem,SanFrancisco,CA)的磷酸緩沖鹽液，pH7.2；離心后，采用[14C]-CDP(Moravek Biomedical,Brea,C)檢測上清中的酶活性，詳見(Lewis等人，1978；Hurta和Wright,1992；Fan等人，1996；Choy等人，1988)。Westerb印跡分析操作程序見報道(Fan等人，1996a；1996b；Choy等人，1988)。簡言之，得到細胞提取物后，測定蛋白質(zhì)總量，部分樣本經(jīng)10％連續(xù)SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分析。蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)印、封閉后，膜與兔抗R2多克隆抗體孵育。堿性磷酸酶偶聯(lián)山羊抗兔IgG(Sigma)用于檢測蛋白質(zhì)R2。
實施例一R2與活化癌基因的協(xié)同作用為確定核糖核苷酸還原酶中限速R2組分的失去調(diào)節(jié)表達致癌變的潛能，研究了用攜帶R2組分的逆轉(zhuǎn)錄病毒表達載體(SH/mR2)穩(wěn)定感染的細胞的性質(zhì)。探查了R2與活化癌基因之間的相互作用。材料與方法表達載體如Fan等所述，構(gòu)建了帶有人Myc表位標記的鼠R2組分SH/mR2的逆轉(zhuǎn)錄病毒表達載體并進行包裝(1996b)。病毒原液的感染率大于每毫升1×104集落形成單位。表達T-24H-ras和選擇性標志neo的質(zhì)粒pH06Ti被用于癌轉(zhuǎn)化(Egan等人，1987a,1987b；Taylor等人，1992)。活化的Rac-1質(zhì)粒(V12 Rac-1)由M.Symons惠贈(Stokoe等人，1994)。細胞及細胞培養(yǎng)鼠細胞系BALB/c3T3、NIH3T3以及由T24H-ras轉(zhuǎn)化10T1/2細胞的四個細胞系稱作C1、NR4、r-2和r-3已被用作R2逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的受體(Fan等人，1996b)。細胞按常規(guī)培養(yǎng)于含10％牛血清(FetalcloneⅢ,Hyclone,Logan,UT)α-MEM(Gibco,GrandIsland,NY)。在Polybrene存在下用SH/mR2或?qū)φ詹《綥XSH感染細胞(Miller等人，1993)。穩(wěn)定的受感染細胞(＞1×104集落)經(jīng)潮霉素篩選后收集得到(Fan等人，1996b；Miller等人，1993)。細胞分裂時間、鋪板效率以及對羥脲細胞毒性的相對敏感度通過計算相對集落形成效率加以確定，方法如前述(Lewis等人，1978；Egan等人1987,Hards和Wright,1981)。
在含15ml基底瓊脂(α-MEM含0.5％Bacto瓊脂，10％牛血清)，10ml生長瓊脂(α-MEM含0.33％瓊脂，10％牛血清)的10cm組織培養(yǎng)平皿中評價于軟瓊脂上的生長。細胞取自未生長過盛的培養(yǎng)物，10-15天后計數(shù)形成的集落(Egan等人，1987a,1987b；Hards及Wright,1981)。用SH/mR2或LXSH感染細胞，或者經(jīng)磷酸鈣沉淀法用T-24Ras或V12Rac-1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細胞后測定轉(zhuǎn)化灶形成對轉(zhuǎn)化進行研究(Taylor等人，1992)。在感染或轉(zhuǎn)染后40小時后，細胞被分配到三個10cm組織培養(yǎng)皿中，每天換20ml新鮮完全培養(yǎng)基(α-MEM，加10％牛血清)，持續(xù)10-14天，經(jīng)亞甲藍染色，計數(shù)轉(zhuǎn)化灶(Taylor等人，1992)。在所有實驗中都用同一種常規(guī)方法確定轉(zhuǎn)染頻率，即帶有T24H-ras或V12Rac-1的質(zhì)粒與大腸桿菌β-半乳糖苷酶的哺乳動物表達質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染，隨后用X-gal處理細胞，計數(shù)蘭色細胞(Price等人，1987)。在有些情況下，用遺傳霉素篩選T24H-ras質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的平皿，耐藥克隆在大約14天后用亞甲藍染色后計數(shù)。致癌性及轉(zhuǎn)移性鑒定致癌潛能經(jīng)上述方法確定。蛋白質(zhì)R2分析Western印應分析方法如前述，用如抗myc鼠單克隆抗體9E10(ATCC,Rockville,MD)(Fan等，1996b)或兔抗R2多克隆抗體(Chen等，1993)進行。為確定細胞周期中重組蛋白質(zhì)R2的表達，用如前述9E10異硫氰酸熒光素抗體標記后經(jīng)流式細胞計數(shù)器分析(Blosmanis等，1987；Chadee等，1995)。膜結(jié)合Raf-1蛋白質(zhì)的確定膜組分按前述方法制備(Qui等，1995)，經(jīng)Bio-Rad標準方法確定蛋白質(zhì)成分后，用特異于Raf-1蛋白質(zhì)的多克隆抗體進行Western印跡分析(Santa Craz Biotechnology Inc.,SantaCruz,CA)。Raf-1帶經(jīng)密度儀測定，每一樣品中Raf-1蛋白質(zhì)的量均經(jīng)過用考馬斯蘭染色的平行膠上充分分離的帶的密度分析加以修正。核糖核苷酸還原酶鑒定方法如前所述。在一些實驗中，對酶的檢測采用純化的重組蛋白質(zhì)R1[Salem等，1993]與9E10抗體沉淀的蛋白質(zhì)R2(Hurta和Wright,1992)結(jié)合來進行。在此實施例中，20μg9E10抗體和50μ1鏈球菌蛋白質(zhì)A-瓊脂糖(Sigma Chem.Co.,St.Louis,MO)加入1ml經(jīng)離心的裂解細胞上清液，置于搖振器上4℃混合2小時。鏈球菌蛋白質(zhì)A-瓊脂糖-免疫復合物用1ml含1mg/1ml牛血清白蛋白的冷磷酸緩沖液洗三遍。免疫復合物隨之被用于分析核糖核苷酸還原酶活性(Lewis等，1978；Hurta和Wright,1992；Fan等1996b；Choy等1988)。MAPK活性檢測細胞培養(yǎng)物覆蓋達90％時，將細胞收集于無血清培養(yǎng)液中(Stokoe等，1994；Jelinek等，1994)并提取蛋白質(zhì)，方法如前所述(Alessi等，1995)。用偶聯(lián)有針對MAPK-2蛋白質(zhì)非中和抗體的瓊脂糖珠將該蛋白質(zhì)免疫沉淀(Ssnta Cruz Biotechnology,Inc.)；免疫復合物的激酶活性通過使用得自Upstate Biotechnbology,Inc.(Lake Placid,NY)的MAPK檢測試劑盒測量其磷酸化髓磷脂堿性蛋白質(zhì)的能力而計算。結(jié)果具生物活性的蛋白質(zhì)R2的表達為確定核糖核苷酸還原酶中限速R2組分失去調(diào)節(jié)的表達后的致癌潛能，對用攜帶R2組分的逆轉(zhuǎn)錄病毒表達載體(SH/mR2)穩(wěn)定地感染的細胞的性質(zhì)作了研究(Fan等，1996b)。應用此種表達載體能獲得高感染率和蛋白質(zhì)R2的穩(wěn)定表達。為區(qū)分內(nèi)源性R2和載體基因產(chǎn)物，編碼帶有甲硫氨酸和10氨基酸的人C-myc表位被加入R2 cDNA的5′末端。Western印跡結(jié)果見圖1A。該實驗使用特異性識別Myc表位序列的抗體9E10檢測到在SH/mR2穩(wěn)定感染的BALB/c3T3和NIH3T3細胞(分別命名為B3/mR2和N3/mR2)樣本中約45kDa的R2蛋白質(zhì)；而對照載體(LXSH)感染的細胞B3/SH或N3/SH樣本中未檢測到此帶。表達載體感染的細胞中，用R2特異性抗體能檢測到內(nèi)源性R2和重組R2兩種蛋白質(zhì)；但在對照載體感染的細胞中，正如所預期的那樣，僅檢測到內(nèi)源性蛋白質(zhì)(圖1B)。
流式細胞計數(shù)器分析經(jīng)9E10/異硫氰酸熒光抗體標記，重組蛋白質(zhì)R2在整個細胞周期中組成性地表達(圖1C)。用9E10抗體經(jīng)間接顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，在B3/mR2和N3/mR2群體中，幾乎每個細胞都表達Myc標記的蛋白質(zhì)R2。
進行了幾種實驗以證實載體表達的R2具生物活性。首先，在集落形成實驗中，與對照細胞B3/SH和N3/SH相比(Fan等，1996b),B3/mR2和N3/mR2細胞對蛋白質(zhì)R2抑制劑羥脲(Wrught,1989；Wright等，1989)的細胞毒作用有耐藥性。其次，在三次檢測核糖核苷酸還原酶活性的獨立實驗中，發(fā)現(xiàn)在B3/mR2和N3/mR2細胞中CDP還原酶的活性分別為1.96±0.32和1.71±0.11nmol/mg蛋白質(zhì)/小時，該檢測值分別比從B3/SH和N3/SH細胞所得檢測值高2.6倍和2.1倍(分別為0.74±0.14和0.83±0.08nmol/mg/小時)。最后，酶活性檢測由純化的重組蛋白質(zhì)R1(Salem等，1993)與9E10抗體沉淀的蛋白質(zhì)R2結(jié)合來進行。當B3/mR2和N3/mR2細胞用作Myc標記的R2來源時，檢測到具顯著水平的活性(15到20nmol/mg/小時)；而用B3/SH或N3/SH細胞時，正如預期的那樣，沒有可檢測的活性。借助異常R2基因表達來確定Ras轉(zhuǎn)化潛能上述結(jié)果表明，在具生物活性的蛋白質(zhì)R2調(diào)節(jié)下，細胞會發(fā)生變化。因而測定改變的R2表達以觀測其是否進一步轉(zhuǎn)化像BALB/c3T3或NIH3T3這樣的細胞。與對照B3/SH、N3/SH細胞和未受感染的親代細胞相似，B3/mR2和N3/mR2培養(yǎng)物在組織培養(yǎng)皿中仍保持扁平、非轉(zhuǎn)化的形態(tài)學特征并顯示出接觸和密度抑制生長(數(shù)據(jù)未發(fā)表)。用逆轉(zhuǎn)錄病毒SH/mR2載體感染BALB/c3T3或NIH3T3細胞后，未見轉(zhuǎn)化灶形成(圖2A,a和b)。
結(jié)果表明，R2基因表達的失去調(diào)控本身并不轉(zhuǎn)化BALB/c3T3或NIH3T3成纖維細胞。為檢驗R2失去調(diào)控的表達與癌基因系H-ras有協(xié)同作用的假設，用含T24H-ras的表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染來自BALB/c3T3或NIH3T3的預先建立并能表達重組R2的細胞群。與對照N3/SH細胞相比，經(jīng)H-ras轉(zhuǎn)染N3/mR2細胞形成的轉(zhuǎn)化灶數(shù)目有穩(wěn)定而顯著的增加(3.4倍)(圖2B,c和d，圖2C)。H-ras轉(zhuǎn)染的B3/mR2細胞同B3/SH細胞相比，觀察到更為明顯的數(shù)量增加，約70倍(圖4B,a和b，圖2C)。采用計數(shù)G418篩選的集落和/或在共轉(zhuǎn)染H-ras和大腸桿菌β-半乳糖苷酶表達質(zhì)粒(Price等人，1987)后計數(shù)蘭色細胞的方法，發(fā)現(xiàn)即使用N3/mR2和B3/mR2的細胞轉(zhuǎn)染效率實際上比用N3/SH和B3/SH細胞低(約50％)，上述轉(zhuǎn)化灶數(shù)增加的情況仍然發(fā)生。借助異常R2基因表達來確定Ras致癌潛能由于在Ras轉(zhuǎn)染R2表達已發(fā)生變化的細胞的轉(zhuǎn)化灶形成實驗中觀察到，改變的R2基因表達與活化的H-ras有協(xié)同作用，因而用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體SH/mR2感染了四株獨立的H-ras轉(zhuǎn)化的10T1/2細胞系，對此基因協(xié)同作用做進一步檢驗。這四株細胞系已被表征，分別名為C1、NR4、r-2和r-3(Egan等人，1987a,1987b；Taylor等人，1992；Stokoe等人，1994)。用潮霉素篩選穩(wěn)定的感染株，Western印跡分析及酶活性檢測證實這些感染株表達具生物活性并帶有Myc標記的蛋白質(zhì)R2。
軟瓊脂生長實驗揭示，含重組R2序列的H-ras轉(zhuǎn)化細胞在半固體生長瓊脂中形成集落的效率大大高于未感染的親代細胞(例如r-3)或?qū)φ蛰d體感染的細胞(C1、NR4、r-2)(表1)。且許多用重組R2感染的細胞形成的集落也更大(圖3A)。由于在固體表面生長時，每對重組R2表達細胞和對照細胞有幾乎相同的生長率(對于CI/SH 12.9小時，對于C1/mR212.2小時；對于r-2/SH 13.5小時，對于r-2/mR2 13.9小時；對于r-3 11.6小時，對于r-3/mR2 11.9小時；對于NR4/SH 14.1小時，對于NR4/mR214.3小時)、鋪板效率(對于C1/SH 58％，對于C1/mR2 55％；對于r-2/SH59％，對于r-2/mR2 63％；對于r-3 91％，對于r-3/mR2 88％；對于NR4/SH 73％，對于NR4/mR2 75％)和細胞周期相分布(數(shù)據(jù)未發(fā)表)，在軟瓊脂和轉(zhuǎn)化灶形成實驗中所觀察到的變化，提示在體內(nèi)R2失去調(diào)節(jié)的表達和活化H-ras的聯(lián)合協(xié)同作用可能導致更大的致癌潛能。
因此，用同系C3H/HeN小鼠對C1/mR2和C1/SH細胞的致癌潛能和轉(zhuǎn)移潛能進行了比較。觀察到致癌潛能的顯著差異。與C1/SH細胞相比，C1/mR2細胞表現(xiàn)出更短的腫瘤潛伏期和更快的腫瘤生長(圖3B)。此外，轉(zhuǎn)移實驗清楚表明C1/mR2細胞比C1/SH細胞更具轉(zhuǎn)移性，并且肺腫瘤產(chǎn)生的數(shù)量也顯著增加(圖3C)。R2基因表達和癌基因的協(xié)同作用上述結(jié)果表明，在體外轉(zhuǎn)化和體內(nèi)致癌實驗中，R2表達的改變與活化的H-ras之間有協(xié)同作用。似乎此協(xié)同作用本應導致如細胞周期調(diào)節(jié)的變化，然而并未觀察到生長速率或細胞周期有明顯差異。因而對以下設想進行檢驗失去調(diào)節(jié)的R2表達與ras的協(xié)同作用是否通過提高ras信號傳導途徑的活性來實現(xiàn)？這一設想應該與先前的研究相符，那些研究揭示了ras表達與致癌潛能之間的直接聯(lián)系(Egan等人，1987a,1987b；Wright等人，1993；Bradley等人，1986)。在調(diào)節(jié)基因表達的一條主要Ras途徑中涉及Raf-1蛋白質(zhì)激酶?；罨腞as使Raf補充入質(zhì)膜，Raf和下游信號傳導分子如MAPK等在那里被激活(Stokoe等人，1994；Jelinek等人，1994；Leevers等人，1994)。
用Raf-1特異性抗體檢測了六個細胞系中與膜結(jié)合的Raf-1水平。這些細胞系源于BALB/c3T3、NIH3T3和10T1/2細胞，均存在失去調(diào)節(jié)的R2表達，將它們與僅含內(nèi)源性蛋白質(zhì)R2的對照細胞比較(圖4A)。含失去調(diào)節(jié)的R2的全部六個細胞系中顯示與膜結(jié)合的Raf-1均增加，平均增加約30％，具高度顯著性差異(p＜0.001)。與上述觀察一致，失去調(diào)節(jié)的R2表達細胞系中MAPK-2的活性也呈現(xiàn)穩(wěn)定、顯著地增高，增加約70％(p＜0.001)(圖4B)。致癌Ras也活化與Raf途徑平行的Rac途徑，因而在惡性轉(zhuǎn)化中與膜結(jié)合Raf-1協(xié)同作用組成性地活化Raf-1(Qiu等人，1995)。
在此實施例中，如果因Raf-1在細胞中易位誘導了MAPK的活化并且此活化在R2/ras的協(xié)同作用中起重要作用的話，那么異常R2表達就應該在細胞轉(zhuǎn)化中與活化的Rac-1有協(xié)同作用，因為前面的結(jié)果已揭示了在轉(zhuǎn)化機制中活化的Raf-1與Rac-1有協(xié)同作用(Qiu等人，1995)。圖4C表明這種推測是正確的，因為已知在轉(zhuǎn)化過程中活化的Rac-1與R2之間有陽性協(xié)同作用，其方式與Ras和R2的協(xié)同作用類似，如通過計算用活化的V12 Rac-1轉(zhuǎn)染N3/mR2和N3/SH細胞形成的轉(zhuǎn)化灶所得(Qiu等人，1995)。這些觀察結(jié)果與下面的觀點一致，即失去調(diào)節(jié)的R2基因表達借助于上調(diào)Raf易位及MAPK途徑活性來實現(xiàn)與如ras和rac等癌基因的協(xié)同作用。但這并不排除其它活化Raf可能參與的傳導途徑也受這種調(diào)節(jié)的可能性，因為已有證據(jù)表明，Raf能通過不依賴MAPK途徑調(diào)節(jié)某些細胞活性(Lenormand等人，1996；Koong等人，1994；Agarwal等人，1995)。
本實施例首次表明哺乳動物核糖核苷酸還原酶R2組分是一種新的癌變決定因子，它能與活化的癌基因協(xié)同作用從而改變致癌潛能。必須指出，在此實施例提出以前，認為在細胞中R2的唯一作用是核糖核苷酸還原酶的一個限速成分。這一實施例證明R2也參與其它一些關鍵性的細胞功能并通過與癌基因的協(xié)同作用直接參與確定癌變潛能。
實施例二R2基因表達與藥物敏感性以及基因組穩(wěn)定性的改變材料與方法細胞系及培養(yǎng)條件耐羥脲的鼠細胞系H-2、H-4、LHF和SC2源于鼠L細胞，Choy等(1988)和McClarty等(1986)對細胞特性已有表征。BALB/c3T3細胞用作R2逆轉(zhuǎn)錄病毒表達載體的受體細胞(B3/mR2和B3/R2c2細胞系)，或用作同一逆轉(zhuǎn)錄病毒載體但缺乏R2序列的受體細胞(B3/SH細胞)[Fan等，1996a；1996b]。NIH-3T3也被用作R2逆轉(zhuǎn)錄病毒表達載體的受體細胞(N/R2-4細胞系)，或同一逆轉(zhuǎn)錄病毒載體但缺乏R2序列的受體細胞(N/SH細胞系)(Fan等，1996a；199b)。經(jīng)用LipofectAmine(Life Technologies,N.Y.)(Damen等，1991)共轉(zhuǎn)染含R2編碼序列和含反義方向的R2序列的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體到受體N/R2+ASR2細胞系。RP3和RP6細胞是用T-24 H-ras基因和一種突變p53基因癌基因轉(zhuǎn)染的10T1/2鼠細胞(Taylor等，1992)。RP3和RP6也被用作受體細胞供用LipsfectAmine試劑由含反義方向的R2編碼序列的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體轉(zhuǎn)染(Fsn等，1996b)，從而得到RP3/ASR2和RP6/ASR2細胞。1B細胞為得自胚胎成纖維細胞的p53-/-(Lowe等，1994)。所有細胞在含10％的胎牛血清(Intergen,Purchase,NY)和抗生素(100u/ml青霉素，100μg/ml鏈霉素)的α-MEM培養(yǎng)基中，置于5％CO2潮濕下37℃培養(yǎng)。藥物篩選500到1-2×105個細胞加入100mm組織培養(yǎng)皿，生長培養(yǎng)液含10％預先透析過的胎牛血清，含有或不含篩選藥物(Huang等，1995a；Choy等，1988)。每周更換新鮮培養(yǎng)液一次，共二至三周。經(jīng)亞甲藍染色觀察存活細胞，計數(shù)約50個或更多細胞的集落(Huang等，1995a)。相對集落形成效率定義為在含藥物情況下形成集落的能力除以不含藥物時形成集落的能力?；驍U增試驗經(jīng)酚-氯肪抽提法從對數(shù)生長期細胞中分離基因組DNA(Blin和Stafford,1976)，經(jīng)Southern印跡分析確定可能的基因擴增事件，詳見(Huang等，1995a；Choy等，1988)，所用作探針的cDNA片段見下述。pCAD142質(zhì)粒帶有編碼CAD蛋白質(zhì)復合物的cDNA(Shigesada等，1985)，用其獲得用作探針的6.3kb HindⅢ片段。含鼠二氫葉酸還原酶基因的pLTRDHFR26質(zhì)粒(Chang等，1978)，提供用作探針的1.3kb BamH1片段。針對核糖核苷酸還原酶R2的1487bpSalⅠ/PstⅠ探針從cDNA克隆10制備(Huang等，1995a；Choy等，1988)。電泳遷移率變動分析(EMSA):EMSA用于確定野生型p53的存在。主要實驗步驟如文所述(Price和Calderwood,1993)，其中改進的細節(jié)如下述。培養(yǎng)于150mm培養(yǎng)皿中的細胞用冰冷磷酸緩沖鹽液(PBS)洗一遍后刮入1mlPBS。細胞在4℃經(jīng)1300g離心10分鐘沉淀，儲于-80℃。細胞沉淀置冰上，用300μl緩沖液A(20mM HEPES{pH706},20％甘油，10mM NaCl,1.5mM MgCl2,0.2mM EDTA和0.1％Triton X-100)裂解20分鐘。緩沖液A還含有1mM苯甲磺酰氟(PMSF)和10mM二硫蘇糖醇(DTT)。在4℃,1300g離心10分鐘將核分離。加入20-40μl含500mM NaCl、1mM PMSF和10mM DTT的緩沖液A到核沉淀，置冰上20分鐘制備核裂解物。后者經(jīng)4℃,16000g離心沉淀抽提核；吸出上清，一部分用Bio-Rad蛋白質(zhì)檢測法測定蛋白質(zhì)(Bio-Rad)。
用T4多核苷酸激酶(Boehringer)將[γ-32P]-ATP末端標記于雙鏈p53共有結(jié)合序列(GGACATGCCCGGGCATGTCC)(SEQ.ID.NO.:162)。上述核裂解物與過量的標記物孵育。DNA結(jié)合反應在含20mMHEPES(pH7.6)、20％甘油、1.5mM MgCl2、0.2mM EDTA、1mMPMSF和10mM DTT的緩沖液中進行。每一結(jié)合反應含5μl細胞裂解物、10μg雙鏈poly(dI-dC)(Pharmacia)、1.4ng標記的共有探針和100ng單克隆抗體421(SantaCruz)，總體積20μl。室溫反應30分鐘使DNA結(jié)合，反應混合物經(jīng)5％非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離。電泳在室溫下進行，至示蹤劑二甲苯睛藍泳出凝膠下端，未結(jié)合的探針也泳出凝膠。統(tǒng)計學分析為比較不同組細胞系間的劑量反應數(shù)據(jù)，進行協(xié)同變異分析，顯著性水平設于α=0.05(Huang等，1995a)。結(jié)果對非選擇性藥物敏感性降低的羥脲抗性細胞系H-2、H-4、LHF和SC2為鼠L細胞系中對抗腫瘤藥物羥脲的細胞毒作用耐受的細胞系。在集落形成效率實驗中，該四株細胞系比其所衍生自的野生型鼠L細胞羥脲的耐受性高出約18(H-2)到30(SC2)倍(Choy等，1998；McClarty等，1988)。其中，核糖核苷酸還原酶的活性水平也增高2.2(H-2)到17(LHF和SC2)倍，這主要歸因于核糖核苷酸還原酶中R2組分的增加。因為在增殖的鼠細胞中，R2是該酶活性及細胞分裂的限速因素。表二顯示在集落形成實驗中，與親代野生型鼠L細胞相比，這四株羥脲抗性細胞對PALA和MTX的細胞毒作用也較不敏感。與親代野生型鼠細胞相比，每一細胞系對藥物敏感性的差異都具高度顯著性，P值均小于0.0001。
雖然已知對藥物的耐受有多種機制(Wright,1989；Kohn1996)，但對MTX和PALA的耐藥卻通常伴有藥物所攻擊的基因產(chǎn)物增加，分別為二氫葉酸還原酶(DHTR)或CAD(一種具備氨甲酰磷酸合成酶、天冬氨酸氨甲酰轉(zhuǎn)移酶和二氫乳清酸酶活性的多功能多肽)，這種情況通常由基因擴增機制來實現(xiàn)(Huang等，1995a；Livingston等，1992；Yin等，1992；Mai,1994；Stark,1993)。實際上，鼠細胞對PALA耐受的主要甚至唯一機制是通過CAD基因擴增來實現(xiàn)的(Stark,1993)。因此，在這兩種藥物正常細胞毒濃度環(huán)境下生成的集落被用來檢測可能存在的基因擴增事件。圖5顯示在存在PALA或MTX下增殖的細胞表現(xiàn)出CAD或DHFR基因拷貝數(shù)增加。與先前的研究一致(Stark,1993；Huang等，1995b；Otto等，1989；Stark等，1990)，所有(10/10)于PALA中增殖且被檢測的集落都顯示CAD基因擴增。同另一先前的報導(Huang等，1995b)相一致，部分(3/6)而非所有于MTX中的集落顯示出DHFR基因擴增。對R2基因表達與藥物敏感性降低兩者關系的直接測試因為對羥脲有抗性的鼠細胞除了核糖核苷酸還原酶變化以外，同時伴有其它生化改變(Wright等，1989)，故使用含編碼鼠R2序列的逆轉(zhuǎn)錄病毒表達載體及含同樣逆轉(zhuǎn)錄病毒載體但缺乏R2序列的細胞對藥物的敏感性和R2水平升高的關系作直接測試。由于存在編碼R2的逆轉(zhuǎn)錄病毒表達載體，故B3/mR2是含增高的蛋白質(zhì)R2的BALB/C3T3細胞群。B3/SH含對照的空載體，是蛋白質(zhì)R2僅具野生型水平的細胞群。B3/R2c2是選自B3/mR2R蛋白質(zhì)增高的克隆系。
與以前的報導顯示的R2基因表達增加導致對羥脲的耐受一致，從表三可見，與對照株B3/SH細胞相比，B3/mR2和B3/R2c2細胞對在一定濃度范圍內(nèi)的羥脲細胞毒性作用的耐受性明顯增加。這些結(jié)果也進一步證明，B3/mR2和B3/R2c2細胞表達有活性的核糖核苷酸還原酶R2組分的水平增高。對作用于非核糖核苷酸還原酶位點的PALA和MTX細胞毒作用，B3/mR2和B3/R2c2細胞的敏感性也顯著降低(表3)。對這兩種藥物的耐受程度從用100nM MTX時約增加10倍，到用大多數(shù)不同測試濃度的PALA時超過100倍。
Southern印跡分析進一步表明，從含PALA或MTX培養(yǎng)基中得到的集落，有CAD或DHFR基因的擴增(圖6)。盡管對鼠L細胞的觀察(圖5)和其它研究報導(Hurta和Wright,1992；Hurta等1991)等也顯示，并不是所有得自于含MTX培養(yǎng)基的集落都存在DHRF基因擴增。不同與對PALA的耐受，鼠細胞中對MTX耐受可通過多種機制實現(xiàn)(Otto等，1989；Stark等，1990；Flintoff,1989)。
使用含R2表達逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的NIH-3T3細胞，對含有核糖核苷酸還原酶R2組分水平上升的細胞所顯示的對化療藥物敏感性的變化作進一步的測試(表4)。與僅含缺乏R2編碼序列的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的細胞(N/SH)相比，這些細胞(N/R2-4)對羥脲有耐藥性。N/R2-4細胞對MTX的耐受也顯著增強。與N/SH細胞相比，N/R2-4細胞對PALA的耐受也有增強的趨勢，但這種趨勢沒有統(tǒng)計學顯著性。后一結(jié)果顯示，在該研究中所用的細胞系，除了R2水平增加外，固有遺傳背景差異中的其它因子也影響到對藥物的敏感性。
將表達R2反義構(gòu)建體引入N/R2-4細胞得到N/R2+ASR2細胞群。通過測試在R2水平降低后細胞對藥物的敏感程度，就R2水平在決定對藥物的敏感性上起重要作用的設想進行驗證。圖7表明，與對照N/R2-4細胞相比，NR2+ASR2細胞中蛋白質(zhì)R2水平顯著降低，對羥脲PALA和MTX的敏感性則顯著增高(表4)。當與含空白載體的對照細胞N/SH相比，表達R2反義序列的細胞對這三種藥物的敏感性都顯著增高(表4)。
用活化的Ras和p53突變癌基因型所轉(zhuǎn)染的鼠10T/2細胞對化療藥物有很強的耐受(Huang等，1995b)。由于觀察到R2反義序列的表達能增加NIH-3T3細胞對羥脲、PALA和MTX的敏感性，使我們對以下可能性進行了試驗，即當存在R2反義序列時，含Ras和突變p53的細胞也會表現(xiàn)出降低了的藥物耐受性。表五的結(jié)果證明這一設想是正確的。與僅含相同載體但不帶有反義方向的R2的細胞相比，含R2反義序列的細胞對羥脲、PALA和MTX的敏感性明顯增強。這些結(jié)果顯示，就這些高度轉(zhuǎn)化和惡變的細胞而言，核糖核苷酸還原酶R2的水平至少是藥物敏感性決定因子其中之一。R2介導的耐藥性和基因擴增并不要求p53功能丟失的證據(jù)p53的失活或活性丟失是腫瘤發(fā)展過程中相關的常見事件，在惡性細胞中，則伴隨遺傳穩(wěn)定性的降低，包括經(jīng)歷自發(fā)基因擴增的能力(Liningston等，1992；Yin等，1992；Takenak等，1995)。因而，我們對如下可能性進行了試驗，即過度產(chǎn)生R2的B3/mR2和B3/R2c2細胞所表現(xiàn)的藥物耐受性增強或許其是通過導致野生型p53活性丟失的機制。已證明p53是轉(zhuǎn)錄因子，其野生型、而非突變型轉(zhuǎn)錄活化作用有序列特異性，并與它結(jié)合到共有DNA序列有關(Takenaka等，1995；Kern等，1992；Funk等，1992)。為確定在PALA、MTX或羥脲存在下發(fā)育的耐藥性的集落其野生型p53功能是否存在，細胞抽提物經(jīng)電泳遷移率變動分析EMSA實驗(Price和Calderwood,1993)，檢測p53的序列特異性結(jié)合活性。圖8列出來自過度表達R2細胞的耐藥性的集落表現(xiàn)出野生型p53結(jié)合活性。這些觀察結(jié)果與我們用免疫沉淀實驗無法檢測到耐藥集落細胞中突變型p53蛋白質(zhì)是相符的，該實驗中使用對p53突變株共同型檢測有特異性的Pab240單克隆抗體。
實施例三針對核糖核苷酸還原酶及對人體腫瘤細胞有細胞毒性的反義脫氧核糖核苷酸序列如上實施例所述，全長的R2反義構(gòu)建體影響腫瘤細胞的腫瘤形成和/或轉(zhuǎn)移能力，以及對化療藥物的敏感性。為弄清較短R1和R2的反義構(gòu)建體對腫瘤細胞的影響，申請者研究了這些反義序列。材料和方法集落形成效率和用反義構(gòu)建體處理細胞集落形成效率的測定方法如文獻所述(Huang和Wright 1994)。用含10％胎牛血清的生長培養(yǎng)基在37℃培養(yǎng)細胞24小時。用5ml,pH7.2的磷酸緩沖鹽液洗細胞一次，然后用Lipofectin+/-寡核苷酸處理細胞。
經(jīng)過測試的寡核苷酸加入含2.5μgDOTMA/DOPE(Lipofectin；Lifetechnologies,inc.)的細胞培養(yǎng)物中處理4小時。除特別指明以外，所用的寡核苷酸量均為0.2μM。對照的培養(yǎng)物只用Lipofectin處理而未用寡核苷酸處理。經(jīng)4小時后，除去含有寡核苷酸的培養(yǎng)液，用5ml生長培養(yǎng)液洗一次。細胞在含10％胎牛血清的生長培養(yǎng)液中生長7-10天。然后用亞甲藍染色存活細胞并計數(shù)集落。有些實驗中會從培養(yǎng)液移走細胞等分樣本，用臺酚蘭外排實驗法(Phillips,1973)測定細胞的存活。通過比較實驗組與對照組的細胞存活百分數(shù)分析結(jié)果。結(jié)果鑒定針對核糖核苷酸還原酶的反義序列。如下所示，這些反義序列對多種人體腫瘤細胞具有毒性作用。發(fā)現(xiàn)這些序列還增強對藥物抗性腫瘤細胞的藥物細胞毒性。這意味著針對核糖核苷酸還原酶的反義序列能以很低的無細胞毒性的濃度增加腫瘤細胞對臨床上幾種重要的化療化合物的細胞毒性。
最初研究中，制備和研究了針對R2mRNA的兩個反義序列分別由20個核苷酸組成，命名為AS-Ⅱ-336-20和AS-Ⅱ-2229B-20。反義序列AS-Ⅱ-336-20的序列為5′-TCCTGG AAG ATC CTC CTC GC-3′(SEQ.ID.No.1)，其對應于人核糖核苷酸還原酶R2mRNA的336-355核苷酸，按照R2核苷酸序號(Pavloffetal.,1992)。AS-Ⅱ-2229B-20的序列為5′-TCCCAC ATA TGA GAA AAC TC-3′(SEQ.ID No.2)其對應于R2mRNA的2229-2248核苷酸。為了保護寡核苷酸不被核酸酶降解，ASⅡ-336-20和ASⅡ-2229B-20寡核苷酸均構(gòu)建為硫代磷酸酯結(jié)構(gòu)(Anazodo等人，1995)。
如前述測定相對集落形成效率實驗，研究了反義構(gòu)建體AS-Ⅱ-336-20抑制人體腫瘤細胞(Hela)增殖的能力。測定了HelaS3細胞(美國典型培養(yǎng)物保藏中心Rockville,Waryland,ATCC)和Hela細胞系(HelalmM)(見表6)，后者對抗腫瘤藥物羥脲有耐藥性(Wright等.,1987)。用Hela S3細胞進行兩次實驗。經(jīng)0.2μM反義構(gòu)建體AS-Ⅱ-336-20處理四小時后，兩次實驗中集落形成效率分別抑制了92％和82％。用不同濃度的AS-Ⅱ-336-20反義構(gòu)建體在Hela lmM細胞系上重復上述實驗，所得結(jié)果相似(表6)。表明0.2μM是抑制集落形成的有效濃度。
這些數(shù)據(jù)表明，AS-Ⅱ-336-20是人腫瘤細胞集落形成能力的一種十分有效的抑制劑，它不僅有效地抑制人腫瘤細胞增殖和集落形成能力，還能抑制那些抗其它化療化合物的人腫瘤細胞的增殖。類似地，如表6所示，用鼠腫瘤細胞系SC2(一種對羥脲有高抗性的鼠L細胞SRI,McClarty等，1988)進行的實驗結(jié)果也證明，AS-Ⅱ-336-20反義構(gòu)建體是一種有效的抗腫瘤化合物。
用相對集落形成效率實驗檢驗反義序列AS-Ⅱ-2229B-20抑制人Hela腫瘤細胞增殖的能力，也有類似表6中所示的AS-Ⅱ-336-20結(jié)果。用HelaS3細胞和耐藥細胞系Hela lmM進行實驗，所得結(jié)果表明，AS-Ⅱ-2229B-20是一種有效抗腫瘤藥物。測試反義構(gòu)建體AS-Ⅱ-2229B-20抑制人乳腺癌細胞系MDA435的能力，也證實其十分有效(表8)。
測試核糖核苷酸還原酶R2反義構(gòu)建體AS-Ⅱ-2229B-20是通過比較人的腫瘤細胞和非腫癌細胞群所得結(jié)果，以鑒定對腫瘤細胞的細胞毒性作用。用腫瘤細胞Hela S3和正常人非致癌細胞WI38進行實驗。結(jié)果發(fā)現(xiàn)腫瘤細胞比正常非致癌細胞對ASⅡ-2229B-20的細胞毒性作用更為敏感。例如，用AS-Ⅱ-2229B-20處理這兩種細胞3天后，取4-8次測定的平均值分析表明，腫瘤細胞對AS-Ⅱ-2229B-20的細胞毒性作用比正常非致癌細胞敏感約5倍。
以上結(jié)果表明，短的反義方向的寡聚脫氧核糖核苷酸序列是一種很好的抗癌藥物，提示其它針對R2信使反義構(gòu)建體也有相似的性質(zhì)。一種最好的抗腫瘤藥物應具有下列特點，即有與其互補的模板形成寡核苷酸雙鏈適當?shù)哪芰肯嚓P特性，它自身形成二聚體或自身互補的傾向很低(Anzodo等人，1996)。采用計算機程序(OLIGO，引物分析軟件Version3.4)分析R2 mRNA結(jié)構(gòu)，以確定反義序列的融點溫度和自由能性質(zhì)，評估形成自身二聚體的能力和自身互補的性質(zhì)(Anazodo等人，1996)，設計了一系列針對R2mRNA的額外的反義序列(表7,Seq.IDNo.3-102)。表7是帶有合適性質(zhì)的額外的R2反義抑制劑表。
為了檢驗這些硫代磷酸酯脫氧核糖苷酸序列反義作用，用一系列人體腫瘤細胞系以相對集落形成實驗進行檢測。不出所料，結(jié)果證明其中很多反義序列是人體腫瘤細胞增殖的強烈抑制劑。這些腫瘤細胞分別來自膀胱、乳房、肺、結(jié)腸、胰腺、前列腺、肝和子宮頸癌等，結(jié)果見表12中。另外，表13報導了用AS-Ⅱ-626-20在C3H/HeN鼠中所進行的體內(nèi)實驗結(jié)果，表明在反義序列治療鼠中腫瘤的轉(zhuǎn)移大大地降低。
基于實施例2，用很低濃度的短反義序列處理人腫瘤細胞，檢測這些構(gòu)建體是否能致敏腫瘤細胞對其它化療藥物的抑制作用。如表6所示，這些序列所用的濃度本身無細胞毒性作用。用0.02μM反義構(gòu)建體AS-Ⅱ-2229B-20處理HelaS3和Hela lmM細胞，從表9所示結(jié)果可以看出，提高了這些細胞對N-(膦乙酰)-L-天冬氨酸(PALA)和氨甲喋呤(MTX)的敏感性。這些結(jié)果表明針對R2信使的反義化合物能與公知的化療藥物協(xié)同作用。
核糖核苷酸還原酶由兩種不同的蛋白質(zhì)亞基組成，不同的基因R1和R2分別編碼這兩種蛋白質(zhì)。因此，以上結(jié)果也提示，R1信使的結(jié)構(gòu)也可用作合適的靶點來設計具有抗腫瘤活性的短反義分子。為了檢驗這種可能性，設計了代號為AS-Ⅰ-1395-20的反義構(gòu)建體，并測定了它的抗腫瘤能力。這個反義構(gòu)建體是由20個堿基組成的反義方向的脫氧核糖核苷酸硫代磷酸酯序列，其序列為5′ACA GGA ATC TTT GTA GAG CA-3′(Seq.ID.No.103)，對應R1信使的1395-1414核苷酸。如表10所列，用Hela S3細胞和抗藥細胞Hela 1mM表明，這種反義序列也是腫瘤細胞增殖的一種有效抑制劑。這些結(jié)果都證實了設計針對R1信使的反義序列的實用性，并暗示其它的位點也可能有效。因此，為了設計有適當特性的反義脫氧核糖核苷酸序列，分析了R1 mRNA(與上述針對R2 mRNA的方法相同)。表11列出了另一批反義序列，它們也具有抗腫瘤制劑的特性。
實施例四R2反義序列對轉(zhuǎn)化的抑制采用上述實施例1-3的方法，用R2編碼區(qū)的R2反義序列處理哺乳動物細胞，研究R2反義序列對轉(zhuǎn)化的抑制作用(Fan等1996b)。用反義方向的R2編碼序列或有義方向的R2編碼序列分別轉(zhuǎn)染含H-ras腫瘤基因的HIN-3T3鼠細胞。從圖9的結(jié)果可以看出，與對照細胞相比，存在R2反義構(gòu)建體時，轉(zhuǎn)化細胞灶減少且軟瓊脂生長減少(圖9,b道)。如實施例1所示，R2編碼區(qū)可與H-ras協(xié)同作用以增強了致癌性，如轉(zhuǎn)化細胞灶數(shù)目增加所示(圖9,C道)。
此外，如此處所述，在軟瓊脂上進行集落效率分析也得到相似的結(jié)果。對含H-ras腫瘤基因的NIH3T3鼠細胞，引入不同的序列分子后測得的集落形成效率分別為不含R2反義序列的為15.6±6.73，含R2反義序列的為4.4±2.62，而含R2編碼序列的卻高達51±12.29。
實施例五用Western印跡分析AS-Ⅱ-626-20對L60鼠腫瘤細胞中核糖核苷還原酶蛋白質(zhì)R2水平的抑制作用。
用加入Lipofectin但不加反義寡核苷酸(a)或用含0.2μM AS-Ⅱ-626-20 Lipofectin培養(yǎng)基(b)處理細胞4小時。作為加入的對照，腫瘤細胞也用補加Lipofectin和0.2μM雜亂寡核苷酸對照處理4小時，該雜亂寡核苷酸對照含有與AS-Ⅱ-626-20中相同比例的核苷酸但順序不同，(ACGCAC TCA GCT AGT GAC AC,SEQ.ID.No.164)(c)或用與AS-Ⅱ-626-20相比含4個核苷酸錯配突變的0.2μM錯配寡核苷酸處理的(d)。(TCGC改變?yōu)镃TGC)當與對照(a、c和d)相比，注意到用AS-Ⅱ-626-20(b)處理的腫瘤細胞中蛋白質(zhì)R2的明顯減少。用R2反義寡核苷酸變體處理鼠L60腫瘤細胞后如Western印跡分析所測，蛋白質(zhì)R2水平減少。用含Lipofectin的0.2μM寡核苷酸(b-f)或用含Lipofectin不含寡核苷酸的對照(a)處理細胞4小時。用AS-Ⅱ-667-20處理的細胞(b)；用AS-Ⅱ-816-20處理的細胞(c)；用AS-Ⅱ-1288-20處理的細胞(d)；用AS-Ⅱ-1335-20處理的細胞(e)；以及用AS-Ⅱ-1338-20處理的細胞(f)。注意到在用針對R2 mRNA的反義寡核苷酸處理的細胞中蛋白質(zhì)R2水平減少，與其抑制人腫瘤細胞增殖的能力一致(表12)。
在本申請中，以作者、年和卷號方式引用了包括美國專利和公開的專利申請。文獻的全文引用如下所列出。本申請全文引入這些公開文獻和專利作為參考以更為全面地描述本發(fā)明涉及的現(xiàn)有技術。
本發(fā)明已以舉例的方式加以描述，應知曉所用的術語意在所描述的詞語的本質(zhì)而不意在限制。
顯然，參照上述教導，可以對本發(fā)明進行多種修飾和改變。因此，應理解，本發(fā)明可以不同于此處所具體描述的方式加以實施，而仍落在后附的權利要求范圍之內(nèi)。表1含重組R2載體的ras轉(zhuǎn)化細胞在軟瓊脂上集落的形成增加細胞系 不同細胞接種量在軟瓊脂上形成的集落(均值±標準誤差)a103104105C1/SH 0 4±366±9C1/mR23±3 28±7 347±45r-2/SHND 92 105±7r-2/mR2 ND 24±1 298±11NR4/SH0 3±132±4NR4/mR2 2±1 14±2 127±10r-3 7±1 100±11 NDr-3/mR2 31±4 309±17 NDa這里的集落數(shù)是三次獨立實驗所得的結(jié)果，只有來自r-2/SH和r-1/mR2細胞的結(jié)果是三個重復培養(yǎng)皿一次實驗的結(jié)果。ND沒測定。表2相對集落形成效率(X104)所確定的藥物敏感度A:PALA細胞系藥物濃度 W.T. H2 H4 LHF SC220μM172.3±126.3 406.7±2022 322.5±36.4 233.3±3.6 850.1±325.230μM50.3±20.539.4±16.4 84.0±30.0 78.8±7.9187.6±46.440μM15.0±7.0 23.3±10.4 43.3±9.646.5±9.937.5±8.750μM3.6±1.1 7.9±1.723.2±0.525.0±6.847.5±35.860μM1.3±0.4 3.6±0.611.1±1.410.7±3.017.6±1.2B．MTX藥物濃度 W.T. H2 H4 LHF SC240nM 11.2±7.2 52.6±25.2 44.2±20.9 143.4±41.3 880.4±147.460nM 12.3±7.2 73.7±16.6 34.7±11.2 63.5±18.6 566.8±66.280nM 2.2±1.6 67.7±20.0 39.3±18.7 68.2±19.2 306.6±61.5100nM0.8±0.4 75.3±10.0 15.1±8.860.8±16.7 261.8±39.7150nM0.5±0.2 53.3±9.4 32.3±13.7 63.9±16.0 301.6±76.8相對集落形成效率用±標準誤差表示，是4-8次測定的平均值。用細胞系H2(p=0.0004)、H4(p≤0.0001)、LHF(p≤0.0001)和SC2(p≤0.0001)所得數(shù)據(jù)與親代野生型細胞系(W.T)所得數(shù)據(jù)比較，有統(tǒng)計學上的顯著差異。表3相對集落形成效率(×10-4)所確定的藥物敏感度A．羥脲細胞系藥物濃度 B3/SH B3/mR2 B3/R2c20.1mM3.3±1.4 1310±319.0830.8±97.00.4mM0.17±0.1914.6±4.0 33.7±11.00.5mM0.21±0.146.5±4.6 26.9±11.90.6mM0.41±0.225.2±3.7 12.5±4.60.8mM0.19±0.622.6±1.4 13.2±6.4B．PALA濃度 B3/SH B3/mR2 B3/R2c210μM17.9±11.0965.0±529.7 1230.0±97.020μM0.39±0.18120.1±28.455.1±15.640μM0.35±0.0125.0±4.6 20.2±6.850μM0.24±0.1427.6±8.9 15.9±4.060μM0.12±0.0525.0±6.4 18.7±5.380μM0.17±0.0827.1±6.75 20.0±4.9C．MTX濃度 B3/SH B3/mR2 B3/R2c220nM 192.6±44.6 1055.0±239.0 382.4±71.340nM 15.7±2.9 62.1±8.8 60.8±13.060nM 6.1±2.0 76.7±21.6 64.1±20.580nM 2.2±0.7 17.5±3.6 20.1±5.5100nM1.5±0.5 12.3±2.8 21.0±7.2150nM3.0±1.1 23.0±7.6 33.4±14.3相對集落形成效率用+-標準誤差表示，是4-12次測定的平均值。在存在羥脲、PALA或MTX時，用B3/mR2或B3/R2c2所得數(shù)據(jù)與用B3/SH所得數(shù)據(jù)比較，有統(tǒng)計學上的顯著差異，其P值都小于或等于0.0001。表4相對集落形成效率(×104)所確定的藥物敏感度A．羥脲藥物濃度 細胞系N/SH N/R2-4N/R2+ASR203mM1.14±0.1246.1±9.8 0.49±0.340.4mM 0.71±0.1718.0±6.7 0.14±0.14B．PALA濃度N/SH N/R2-4N/R2+ASR210μM 5.28±1.5 6.22±3.3 1.81±0.815μM 5.83±27 10.0±5.5 0.58±0.320μM 0.30±0.1 1.71±1.2 0.04±0.0425μM 0.53±0.3 0.8±0.7 0.04±0.0430μM 0.48±0.081.03±0.070.12±0.1240μM 0.27±0.2 0.14±0.080.04±0.04C．MTX濃度N/SH N/R2-4N/R2+ASR220nM655±74.8 540±25.1 423±11940nM21±121 147±4.2 3.5±1.960nM3.4±2.2 62.2±30.71.9±1.380nM5.0±5.0 50.4±23.92.5±1.5100nM 4.2±2.5 66.1±32.81.1±0.6105nM 1.4±0.9 21.0±11.50,n=4相對集落形成效率用+-標準誤差表示，是4-6次測定的平均值。這里的0表示每次用1×105細胞測定4次(N=4)所得的數(shù)目。在存在PALA下用N/SH所得的數(shù)據(jù)與存在羥脲時，用N/R2-4或N/R2+ASR2所得的數(shù)據(jù)進行比較(都為p=0.0001)；或存在MTX時，與用N/R2-4或N/R2+ASR2所得的數(shù)據(jù)加以比較(分別為p=0.0002或0.032)，它們在統(tǒng)計學上有顯著差異。在存在PALA用N/SH與N/R2+ASR2所得的數(shù)據(jù)加以比較(p=0.002)，統(tǒng)計上有顯著差異，與N/R2-4沒有顯著性差異。表5相對集落形成效率(×10-4)所確定的藥物敏感度A．羥脲細胞系藥物濃度 RP3/SH RP3/ASR2RP6/SH RP6/ASR20.1mM263.64±19.3 109.8±43 201.3±27.2 43.8±12.30.2mM53.6±13.7 2.9±3.135.5±8.48.6±2.50.3mM20.8±7.56.6±2.512.6±2.44.5±1.10.4mM5.8±1.9 1.0±0.210.8±4.11.2±0.50.5mM4.8±1.9 0.2±0.112.1±3.91.8±0.90.6mM0.7±0.3 0.3±0.16.6±2.9 1.5±0.70.8mM0.8±0.3 0.1±0.05 1.7±1.2 0.4±0.3B．PALA濃度 RP3/SH RP3/ASR2RP6/SH RP6/ASR210μM2569±3381183±384 4619±6482083±96020μM123.4±19.3 86.1±32.9 1220±255368±15430μM45.2±7.819.5±4.7 450±129 316±17140μM15.0±4.94.7±0.6271±68 116±5450μM9.3±3.6 2.1±0.8109±23 41.7±2360μM3.9±1.6 0.3±0.255.5±13 13.2±6.3C．MTX濃度 RP3/SH RP3/ASR2RP6/SH RP6/ASR220nM 961.7±134 485.9±165 1856±4641504±48640nM 347.1±154 77.8±18177±41.391.5±28.160nM 123.8±6418.1±6.2 77.3±15.6 49.9±14.180nM 66.5±37 4.4±0.868.7±16.7 36.0±6.0100nM34.8±21 0.6±0.06 46.6±5.614.4±3.8150nM4.7±3 0.2±0.111.1±4.43.5±0.9相對集落形成效率用+-標準誤差表示，是4-10次測定的平均值。在存在羥脲、PALA或MTX時，用RP6/SH與RP6/ASR2所得的數(shù)據(jù)加以比較(分別為p=0.0001、0.0001和0.0001)，在統(tǒng)計學上有顯著差異。在存在羥脲、PALA或MTX時，用RP3/SH與用RP3/ASR2所得的數(shù)據(jù)加以比較(分別為p=0.04,0.0001,0.004)，在統(tǒng)計學上有顯著性差異。表6用R2反義構(gòu)建體處理細胞后集落形成效率降低細胞系HelaS3AS-Ⅱ-336-20a抑制％AS-Ⅱ-0009B-20b抑制％濃度 濃度0- 0 -0.2μM 92％ 0.05μM50％0.2μM 82％ 0.10μM80％0.20μM95％0.20μM97％細胞系Hela1MmAS-Ⅱ-336-20a抑制％AS-Ⅱ-0009B-20b抑制％濃度 濃度0- 0-0.01μM 15％0.01μM 0％0.05μM 25％0.02μM 0％0.10μM 60％0.03μM 21％0.20μM 85％0.04μM 34％0.05μM 48％0.05μM 50％0.10μM 78％0.20μM 97％0.20μM 90％細胞系鼠SC2濃度 AS-Ⅱ-336-20a抑制％0 -0.2μM 95％
表7針對R2mRNA設計的反義序列





表7腳注AS=反義序列Ⅱ=R2第一組數(shù)字代表R2mRAN序列上的第一個核苷酸的位置第二組數(shù)字代表序列片段的長度表中序列AS-Ⅱ-2229A與文中所述的AS-Ⅱ-2229B為不同序列，2229A選自Genebank(Parloff提供)的R2序列，而2229B選自Pavoloff等，DNA測序和圖譜雜志(J.DNA Sequencing and Mapping)2:227-234,1992發(fā)表的序列。除特別指明是部分硫代的序列外，序列都是完全硫代的。1TM℃=形成的寡核苷酸雙鏈的解鏈溫度2dG=形成寡核苷酸互補雙鏈的自由能值除以上的分析外，還可獲得其它評價數(shù)據(jù)，例如二聚體形成能力(D)，自身互補相互作用能力(H)，與靶序列以外的R2mRNA其它序列結(jié)合的能力(B)。上述分析和評價數(shù)據(jù)都由計算機模擬程序OLIGO引物分析軟件獲得(版本3.40由National BioSeience發(fā)布)。這個程序可以測定TM℃和dG值，也用作定性地評價D、H和B等參數(shù)，表示為“不可能”，“有一定可能”或“基本上完全可能”等。在選擇寡核苷酸序列時，優(yōu)先選擇那些表現(xiàn)出高TM℃和dG值的，這對于反義分子和其互補鏈的緊密結(jié)合十分重要，也優(yōu)先選擇那些D、H和B被評價為“不可能”的序列。這三個參數(shù)(D、H、B)中最重要的是D和H，因為B(即與除精確的靶序列外的R2mRNA的其它區(qū)域結(jié)合)不會降低，反而會提高反義序列的活性。表7中的絕大多數(shù)序列在D和H標準上均為不可能。某些序列在D和H上表現(xiàn)為“有一定可能”，但是在腫瘤細胞生長抑制的研究中證實是有效的(表12)，因此也列在表7中。我們發(fā)現(xiàn)，用這種方法篩選反義寡核苷酸抑制劑是十分有效的。在表12所示的結(jié)果中，絕大部分所選序列都具有抗腫瘤的性質(zhì)。表8用一種R2反義構(gòu)建體處理細胞的結(jié)果反義構(gòu)建體 濃度(μM)MDA435的集落形成抑制AS-Ⅱ-2229B-20 0.02 25％0.03 56％0.05 78％0.10 94％0.20 99％表9AS-Ⅱ2229B-20反義構(gòu)建體的協(xié)同作用細胞 藥物藥物濃度AS-Ⅱ2229B-20a相對集落形成效率C0.02-MHela S3 PALAa20μM-30±50PALA 20μM+90±10Hela S3 MTXa40μM-118±32MTX 60μM-116±13MTX 40μM+25±5MTX 60μM+0Hela 1mM PALA 20μM-377±21PALA 30μM-311±9.5PALA 20μM+108±7.5PALA 30μM+ 101±2.0Hela 1mM MTX 40μM-28±1.0MTX 60μM-12±0.5MTX 40μM+65±5.5MTX 60μM+3.5±0.5APALA=N-(膦乙酰)-L-天冬氨酸AMTX=氨甲喋呤b-=未處理b+=進行處理c值為兩次實驗的平均值表10用R1反義構(gòu)建體處理后集落形成效率減少細胞系HelaS3AS-Ⅰ-1395-20濃度α抑制％0 -0.2μM75％(實驗1)0.2μM77％(實驗2)細胞系Hela1mMAS-Ⅰ-1395-20濃度a抑制％0-0.01μM 00.05μM 30％0.10μM 60％細胞系鼠SC2AS-Ⅰ-1395-20a濃度抑制％0 -0.2μM 76％表11針對R1信使所設計的反義序列



表11注AS=反義Ⅰ=R1第一個數(shù)字表示在R1 mRNA序列中第一個核苷酸的位置第二個數(shù)字表示該序列片段的長度1TM℃=形成寡核苷酸雙鏈的解鏈溫度2dG=寡核苷酸互補二聚體形成的自由能值除上面的分析以外，還獲得了評價形成二聚體的能力(D)、自身互補相互作用的能力(H)和與靶序列以外的R1信使結(jié)合的能力(B)等參數(shù)。采用表7注中同樣的方法進行分析。表11中所示序列選擇的原則與表7注所述相同。
表12用0.2μM的多種針對R2信使的反義寡聚脫氧核糖核苷酸硫代磷酸酯處理人體腫瘤細胞后，集落形成效率降低。表中數(shù)據(jù)為抑制百分數(shù)(％)。

<p>表12(續(xù))

<p>表12(續(xù))<

<p>表12(續(xù))

表12(續(xù))

<p>表12(續(xù))

表12注-如表7所示，除特別指明以外(*)，所有反義寡核苷酸均為完全硫代的。-相對集落形成效率為2-8次測定的平均值。-多種細胞系均來自美國典型培養(yǎng)物保藏中心Rockville,Maryland-ND=沒測定人體腫瘤細胞的有關資料T24 =膀胱細胞癌HCT116=結(jié)腸細胞癌A549 =肺細胞癌MDA-MB-231=乳腺細胞癌MIA PaCa-2=胰細胞癌PC-3 =前列腺細胞癌HepG2 =肝細胞癌Hela S3 =分離自子宮頸癌的細胞T-47D =乳腺管細胞癌H596 =肺鱗狀腺細胞癌Colo320 =結(jié)腸腺細胞癌表13用反義寡核苷酸AS-Ⅱ-626-20處理后在同系R-3鼠10T1/2腫瘤細胞中的轉(zhuǎn)移特性寡核苷酸處理*鼠腫瘤發(fā)生率肺腫瘤數(shù)目(平均值±標準誤差)無 4/4 6.0±1.580.2μM 1/4 0.25±0.25*用Lipofectin不補加寡核苷酸(無)和用Lipofectin加上0.2μM MAS-626-20培養(yǎng)液分別處理105細胞，靜脈注射(尾靜脈)到C3H/HeN同系鼠中，按文獻(Damen,J.E.,Greenberg,A.H.和Wright J.A.生物化學生物物理學報(Biochem.Biophys.Acta)1097:103-110,1991)所述方法分析肺腫瘤。R-3細胞系高度致癌且已有描述(Tayler,W.R.,Egan,S.E.,Mowat,M.,Greenberg,A.H.和Wright,J.A.癌基因(Oncogene),7:1383-1390,1992)。
參考文獻Agrawal,1996.反義寡核苷酸的臨床試驗，TIBECH,14:376。Agarwal等人，1995.癌基因(Oncogen)11:427-438。Akhter等人，1991.反義DNA寡核苷酸類似物與磷脂膜(脂質(zhì)體)的相互作用，Nuc.Res.19:5551-5559。Alessi等人，1995.酶學方法(Meth.Enzymol.)255:279-290。Amara等人，1994.哺乳動物核糖核苷酸還原酶R2mRNA3′非翻譯區(qū)的一種新型胞質(zhì)蛋白質(zhì)結(jié)合活性的佛波酯調(diào)節(jié)及其在信使穩(wěn)定中的作用，生物化學雜志(J.Biol.Chem.)269:6709-7071。Amara等人，1995B.在哺乳動物核糖核苷酸還原酶R2組分mRNA3′-非翻譯區(qū)中一種新順式元件的確定在轉(zhuǎn)化生長因子誘導的mRNA穩(wěn)定性中的作用，核酸研究(Nucleic Acids Res.)23:1461-1467。Amara等人，1996.在哺乳動物核糖核苷酸還原酶R2組分mRNA的3′非翻譯區(qū)中新順式元件的確定順反相互作用和信使穩(wěn)定性，生物化學雜志271:20126-20131。Anazodo等人，1995.針對人免疫缺陷病毒Ⅰ型基因組非調(diào)節(jié)區(qū)的新反義寡聚脫氧核糖苷酸硫代磷酸酯對基因表達的序列特異性抑制，病毒學雜志(J.Virol.)69:1794-1801。Anazodo等人，1996.針對HIV-1gag基因組+1129至+1268核苷酸的不同20mer反義寡核苷酸序列對p24基因表達的相對抑制水平一種分析機制，生物化學與生物物理研究通訊(Biochem.Biophys.Res.Commun.)229:305-309Ashihara and Baserga,1979.細胞同步培養(yǎng)，酶學方法58:248-262。Blaesse,1997.癌癥的基因治療，科學美國人(ScientificAmerican)276(6):111-115。Bjorklund等人，1993.編碼鼠核糖核苷酸還原酶大亞基(蛋白質(zhì)R1)的基因結(jié)構(gòu)和啟動子特征，美國國家科學院院報(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)90:11322-11326。Blin和Stafford,1976.從真核生物分離高分子量DNA的一般方法，核酸研究3:2303-2308。Blosmanis等人，1987.癌癥研究(Cancer Res)47:1273-1277。Bradley等人，1986.美國國家科學院院報83:5277-5281。Calabretta等人，1996.淋巴癌治療中的反義策略Semin.Oncol.23:78.Caras,1985.克隆的鼠核糖核苷酸還原酶亞基M1 cDNA呈現(xiàn)出與大腸桿菌和肝炎病毒核糖核苷酸還原酶的氨基酸序列同源性，生物化學(BiolChem.)260:7015-7022。Chadee et al,1995.生物化學雜志270:20098-20105。Chan等人，1993.生物化學32:12835-12840。Chang等人，1978.編碼鼠二氫葉酸還原酶的DNA序列在大腸桿菌中的表型表達，自然(Nature),275:617-624。Chen等人，1993.在正?；蚍鸩ゴ碳l件下哺乳動物核糖核苷酸還原酶R1 mRNA的穩(wěn)定性3′-非翻譯區(qū)的順反相互作用的參與，EMBOJ.,12:3977-3986。Chen等人，1994B.結(jié)合一種獨特胞質(zhì)反式作用蛋白質(zhì)的新型核糖核苷酸還原酶R1mRNA順式元件的確定，核酸研究22:4796-4797。Choy等人，1988.涉及核糖核苷酸還原酶的藥物抗性的分子機制于增加藥物濃度條件下篩選的一系列集落相關細胞系的羥脲抗性，癌癥研究48:2029-2035。Chadee等人，1995.生物化學雜志270:20098-20105。Chan等人，1993.生物化學32:12835-12840。Crooke,1995.反義治療進展Hematol.Pathol.2:59。Damen等人，1989.在突變子和擴增子突變的細胞灶中轉(zhuǎn)移變株的產(chǎn)生，國家癌癥研究雜志(J.Natl.Cancer Inst.)81:628-631。Damen等人，1991.NIH-3T3細胞中k-fgf原癌基因的轉(zhuǎn)化和擴增及轉(zhuǎn)移潛能的誘導，生物化學與生物物理學報(Biochem Biophys.Acta)1097:103-110。Davis等人，1994.重組鼠核糖核苷酸還原酶R1組分的亞基相互作用區(qū)域的純化、表征和定位，生物化學(Biol.Chem.)269:23171-23176。Eckstein 1985.核苷酸硫代磷酸酯，生物化學年鑒( ANN.Rev.Biochem.)54:367-402。Egan等人，1987A.與轉(zhuǎn)移潛能相關的H-ras表達10T1/2和NIH-3T3細胞中轉(zhuǎn)移表型的直接調(diào)節(jié)的證據(jù)，分子細胞生物學(Mol.Cell.Biol.)7:830-837。Egan等人，1987B.編碼蛋白質(zhì)激酶的癌基因的轉(zhuǎn)化誘導轉(zhuǎn)移表型，科學，(Science)238:202-205。Eriksson等人，1984.哺乳動物核糖核苷酸還原酶的細胞周期依賴型調(diào)控M2亞基的S期相關增加由蛋白質(zhì)從頭合成調(diào)控，生物化學雜志259:11695-11700。Fan等人，1996A.核糖核苷酸還原酶R2組分是與活化的癌基因協(xié)同作用以確定轉(zhuǎn)化和癌變潛能的新型癌變決定因子，美國國家科學院學報93:14036-14040。Fan等人，1996B.如逆轉(zhuǎn)錄病毒載體介導的R2 cDNA穩(wěn)定表達證實鐵蛋白基因表達與核糖核苷酸還原酶蛋白質(zhì)R2相關，F(xiàn)EBS lett.382:145-148.Flintoff,1989.氨甲喋呤Gupta,R.S.(編)哺乳動物細胞的藥物抗性Boca Raton,Florida:CRC Press,1-14。Gewirtz,1993.用于人白血病的基于寡聚脫氧核苷酸的治療，Stem CellsDayt.11:96。Gilboa等人，1986.用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體進行克隆基因的轉(zhuǎn)移和表達，生物技術，(Bio Techniques)4(6):504-512。Gannon等人，1990.p53中的活化突變產(chǎn)生一種常見輪廓作用一種用于突變型的單克隆抗體，EMBO J.,9:1595-1602。Hampel and Tritz,1989.最簡(-)sTRSV序列的RNA催化性質(zhì)，生物化學28:4929-4933。Hanania等人1995.應用于人類疾病的基因治療最新進展，美國醫(yī)學雜志(Am.J.Med.)99:537。Huang等人，1995A.由轉(zhuǎn)化生長因子基因表達調(diào)控的藥物抗性和基因擴增潛能，癌癥研究，55:1758-1762。Huang等人，1995B,Has、C-myc和突變p53基因過量表達的結(jié)合對藥物敏感性、基因組穩(wěn)定性和轉(zhuǎn)移潛能的多重作用Int.J.Oncol.7:57-63.Hunter,1995.蛋白質(zhì)激酶和磷酸酶蛋白質(zhì)磷酸化和信號傳導的陰和陽，細胞(Cell),80:225-236。Hurta等人，1991.通過在致癌H-ras轉(zhuǎn)化細胞系中的轉(zhuǎn)化生長因子對核糖核苷酸還原酶基因表達的早期誘導，生物化學雜志，266:24097-24100.Hurta和Wright,1992.由DNA破壞劑苯丁酸氮芥造成的哺乳動物核糖核苷酸還原酶之活性和調(diào)控的改變，生物化學雜志267:7066-7071Hurta和Wright,1995.H-ras致癌轉(zhuǎn)化導致由轉(zhuǎn)化生長因-1對核糖核苷酸還原酶基因表達調(diào)控的異常，細胞生物化學雜志(J.Cell.Biochem.)57:543-556。Iyer等人1990.J.Org.Chem.55:4693-4699。Jelinek等人，1994.分子細胞生物學14:8212-8218。Jensen等人，1994.依顯微鏡指導的克隆鑒定前癌乳腺疾病中表達的基因，美國國家科學院院報，91:9257-9261。Kern等人，1992.癌基因型P53抑制P53調(diào)控的基因表達，科學，256-827-830。Kohn,1996.調(diào)控基因和藥物敏感性，國家癌癥研究雜志，88:1255-1256.Koong等人，1994.癌癥研究54:5273-5279。Leevers等人，1994.自然369:411-414Lefebvre-d′Hellencourt et al,1995.細胞因子反義寡核苷酸的免疫調(diào)控，Eur.Cytokine Netw.6:7。Lenormand等人，1996.生物化學雜志271:15762-15768。Lev-Lehman等人，1997.體外及體內(nèi)反義寡聚物，反義治療，A.Cohen和S.Smicek，編(Plenum Pres，紐約)Lewis等人，1978.核苷酸通透性倉鼠細胞中核糖核苷酸還原的鑒定，細胞生理學雜志，(J.Cell Physiol.)94:287-298。Livingston等人，1992，伴隨野生型p53缺失的細胞周期阻滯改變和基因擴增潛能，細胞70:923-935。Loke et al,1989.活細胞中寡核苷酸轉(zhuǎn)運的特征，美國國家科學院院報，86:3474。Lowe等人，1994.癌基因相關細胞凋亡的取消允許P53缺失細胞的轉(zhuǎn)化，美國國家科學院院報p5391:2026-2030。Mai,1994.C-myc的過度表達先于編碼二氫葉酸還原酶基因擴增，基因，148:253-260。Mann等人，1988.細胞增殖、靜止和分化期中的核糖核苷酸還原酶M1亞基，癌癥研究雜志48:5151-5156。McClarty等人，1988.在羥脲抗性鼠L細胞系中負責核糖核苷酸還原酶水平的藥物誘導轉(zhuǎn)錄后調(diào)控的分子機制，生物化學，27:7524-7547。McClarty等人，1990.增加鐵基因表達與增加核糖核苷酸還原酶基因表達相關以及在哺乳動物細胞中羥脲抗性的建立，生物化學雜志，265:7539-7547Miller等人，1993.用于基因轉(zhuǎn)移和表達的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的用途，酶學方法217:571-599。Morrison,1991.由反義寡核苷酸對堿性成纖維生長因子表達的抑制可抑制轉(zhuǎn)化的人星形膠質(zhì)細胞的生長，生物化學雜志，266:728。Otto等人，1989.在腫瘤發(fā)生大鼠系中CAD基因擴增的發(fā)生率增加作為癌細胞基因組去穩(wěn)定作用的指示劑，生物化學雜志，264:3390-3396。Phillips,1973.“測定細胞活性的染料外排試驗，”組織培養(yǎng)方法與應用，編者(P.F.Kruse,Jr和M.K.Patterson,Jr.),Academic Press，紐約和倫敦pp.406-408。Price等人，1987.美國國家科學院院報，84,156-160。Price和Calderwood,1993.佛波酯減弱DNA破壞后增加序列特異性p53-DNA結(jié)合活性，癌基因，8:3055-3062。Qiu等人，1995.自然374:457-459。Radhakrishnan等人，1990.用3H-1,2-苯并二硫酚-3酮，1,1，二氧化物作為轉(zhuǎn)硫試劑的含硫脫氧核糖核苷酸的自動合成，有機化學雜志(J.Org.Chem.)55:4693-4699。Reichard,1993.從RNA到DNA為什么會有那么多核糖核苷酸還原酶？科學60:1773-1777。Rosolen等人，1990.癌癥研究50:6316。Saeki等人，1995.人乳腺腫瘤中核糖核苷酸還原酶的免疫組化測定，Int,J.Oncol.6:523-529。Salem等人，1993FEBS Letters 323:93-95。Scanlon等人，1995.哺乳動物基因表達的寡核苷酸介導的調(diào)控FASEBJ.9:1288。Shaw等人，1991.血清中修飾過的脫氧寡核苷酸抗外切核酸酶降解，核酸研究19:747-750。Shigesada等人，1985.倉鼠CAD基因cDNA的構(gòu)建及其對確定天冬氨酸氨甲酰轉(zhuǎn)移酶結(jié)構(gòu)域的應用，分子細胞生物學，5:1735-1742。Spitzer和Eckstein 1988.寡聚脫氧核糖核苷酸中的硫代磷酸酯基對脫氧核酸酸的抑制，核酸研究18:11691-11704。Stark等人，1990.基因重排，B.D.Hames和D.M.Glover(編)，分子生物學前沿Oxford，英國IRL；99P149。Stark,1993.哺乳動物基因擴增的調(diào)控和機理，癌癥研究進展(Ady.CancerRes),61:87-113。Stokoe等人，1994.Raf活化作為重構(gòu)質(zhì)脂的結(jié)果，科學264:1463-1467。Stubbe,1989.生物催化中蛋白質(zhì)自由基參入嗎？生物化學年鑒58:257-285.Takenaka等人，1995.由蛋白質(zhì)激酶C和蛋白質(zhì)磷酸酶對p53序列特異性DNA結(jié)合功能的調(diào)控，生物化學雜志，270:5405-5411。Taylor等人，1992.在細胞轉(zhuǎn)化和腫瘤擴散中ras、myc和突變型p53之間相互協(xié)同的證據(jù)，癌基因，270:1383-1390。Thelander等人，1985.哺乳動物核糖核苷酸還原酶M2亞基一種分離自M2過量表達的鼠細胞的同源蛋白質(zhì)特征，生物化學雜志，260:2737-2741.Thelander等人，1980.來自牛胸腺的核糖核苷酸還原酶將該酶分成兩個不同的亞基蛋白質(zhì)M1和M2，生物化學雜志，255:7426-7432。Tonin等人，1980.羥脲抗性倉鼠細胞中擴增基因在染色體中的分配，Cytogenet.CellGenet.45:102-108。Uhlenbeck,1987.自然328:596-600。Wagner等人，1996.一種反義核苷酸對基因表達強烈的選擇性抑制，自然生物技術，(Nature Biotechnology)14:840-844。Wagner,1994.利用反義寡聚脫氧核苷酸的基因抑制，自然，372:333。Weber,1983.癌癥細胞的生化對策和化療設計，癌癥研究，43:3466-3492.Whitesell等人，1991.附加體產(chǎn)生的N-myc反義RNA限制原始神經(jīng)外胚層細胞系的分化能力，分子細胞生物學11:1360。Woolf等人，1990.非洲瓜蟾卵母細胞和胚中未修飾的和硫代磷酸酯反義寡聚脫氧核苷酸的穩(wěn)定性、毒性和效率，核酸研究，Acids Res,18:1763-1769。Wright等人，1987.在羥脲抗性倉鼠、小鼠、大鼠和人細胞系中核糖核苷酸還原酶的表達改變以及M2基因擴增的作用，Somat.CellMol.Genet.13:155-165。Wright,1989A.突變細胞系的改變的哺乳動物核糖核苷酸還原酶，Encycl.Pharmacol.Therapeut.128:89-111。Wright等人，1989B.羥脲及相關化合物R.S.Gupta(編)，哺乳動物細胞的藥物抗性Boca Raton,FL；CRC Press,Inc；68:15-27。Wright等人，1990A.哺乳動物核糖核苷酸還原酶的調(diào)控和藥物抗性機制及對DNA合成的意義，生化細胞生物學68:1364-1371。Wright等人，1993.轉(zhuǎn)化生長因子β和成纖維生長因子作為腫瘤發(fā)展中致癌變的啟動子，Crit.Rev.Oncogen.4:473-492。Yakubov et al,1989.美國國家科學院院報86:6454。Yin等人，1992.在帶突變p53等位基因的細胞中野生型p53恢復細胞周期控制及抑制基因擴增，細胞，70:937-948。
權利要求
1．一種反義寡核苷酸，其具有互補于來自核糖核苷酸還原酶基因的序列，且包含至少7個核苷酸或核苷酸類似物。
2．一種如權利要求1的寡核苷酸，其互補于來自核糖核苷酸還原酶基因的mRNA區(qū)域。
3．一種如權利要求2的寡核苷酸，其互補于來自核糖核苷酸還原酶R2基因的mRNA區(qū)域。
4．一種如權利要求3的寡核苷酸，其中的寡核苷酸具有如表7所示的SEQ.ID.NOS1-102中之一所示的核酸序列或其類似物。
5．一種如權利要求3的寡核苷酸，其中的寡核苷酸具有如表7所示的SEQ.ID.NOS1、2、12、16、18、21、25、29、34、42、44、45、46、52、53、59、60、64、65、66、68、69、70、72、73、74、76、78、79、80、90、91、92、96、99、100、或102所示的核酸序列。
6．一種如權利要求3的寡核苷酸，其中的寡核苷酸具有如表12所示的核酸序列。
7．一種如權利要求2的寡核苷酸，其互補于來自核糖核苷酸還原酶R1基因的區(qū)域。
8．一種如權利要求7的寡核苷酸，其中的寡核苷酸具有如表11所示的SEQ.ID.NOS103-161中之一所示的核酸序列或其類似物。
9．一種如權利要求7的寡核苷酸，其中的寡核苷酸具有如表11所示的SEQ.ID.NOS103所示的核酸序列或其類似物。
10．一種用于調(diào)節(jié)腫瘤細胞生長的藥物組合物，包括至少一種如權利要求1-9中任一項的反義寡核苷酸，與生理可接受的載體或稀釋劑一起混合。
11．一種用于抑制腫瘤細胞增殖的藥物組合物，包括至少一種如權利要求1-9中任一項的反義寡核苷酸，與生理可接受的載體或稀釋劑一起混合。
12．一種用于增加腫瘤細胞對于化療藥物敏感性的藥物組合物，包括至少一種如權利要求1-9中任一項的反義寡核苷酸，與生理可接受的載體或稀釋劑一起混合。
13．一種用于調(diào)節(jié)耐受化療藥物的腫瘤細胞生長的藥物組合物，包括至少一種如權利要求1-9中任一項的反義寡核苷酸，與生理可接受的載體或稀釋劑一起混合。
14．一種如權利要求1-9中任一項的反義寡核苷酸用于制備調(diào)節(jié)腫瘤細胞生長的藥物的用途。
15．一種如權利要求1-9中任一項的反義寡核苷酸用于制備抑制腫瘤細胞增殖的藥物的用途。
16．一種包含轉(zhuǎn)錄起始區(qū)域及編碼一種如權利要求1-9中任一項的反義寡核苷酸的序列的DNA序列。
17．一種包含如權利要求16的DNA序列的載體。
18．一種如權利要求1-9中任一項的反義寡核苷酸，其中該寡核苷酸表現(xiàn)為二聚體形成減少以及自身互補相互作用降低。
19．一種增加哺乳動物中腫瘤細胞對化療藥物敏感性的方法，其通過用至少一種如權利要求1-9中任一項的反義寡核苷酸和一種化療藥物與腫瘤接觸。
20．如權利要求19所列出的方法，其中的化療藥物選自羥脲、MTX和PALA。
21．一種如權利要求19的方法，其中的反義寡核苷酸及化療藥物以無細胞毒性的劑量施用。
22．一種如權利要求19的方法，其中的反義寡核苷酸及化療藥物以細胞毒性的劑量施用。
23．一種如權利要求19的方法，其中的反義寡核苷酸以無細胞毒性的劑量施用而藥物以細胞毒性的劑量施用。
24．一種如權利要求19的方法，其中的反義寡核苷酸以細胞毒性的劑量施用而藥物以無細胞毒性的劑量施用。
25．一種用于調(diào)節(jié)腫瘤細胞增殖的方法，包括用有效量的至少一種如權利要求1-9中的反義寡核苷酸接觸細胞。
26．一種評價一種化合物是否抑制核糖核苷酸還原酶基因的轉(zhuǎn)錄或翻譯并進而影響細胞增殖的方法，包括用一種表達載體轉(zhuǎn)染細胞，該表達載體含有編碼核糖核苷酸還原酶之核酸序列以及該核酸轉(zhuǎn)錄或翻譯之必需元件的重組分子；施用待測化合物；以及用核糖核苷酸還原酶的表達水平與不含待測化合物的對照中所獲的水平加以比較。
27．一種通過鑒定R2與Raf-1和/或Rac-1相互作用的激動劑或拮抗劑評價一種化合物調(diào)節(jié)Ras信號傳導途徑能力的方法，包括在待測化合物存在時，在允許R2與Raf-1和/或Rac-1相互作用的條件下提供含有R2與Raf-1和/或Rac-1的反應混合物；測定R2與Raf-1和/或Rac-1之間復合物的形成或是Ras信號傳導途徑的活化；以及與不含待測化合物的對照反應進行比較，其中反應混合物中較低水平的復合物或活化程度表明待測化合物干擾R2與Raf-1和/或Rac-1相互作用，而較高水平的復合物或活化程度表明待測化合物增強R2與Raf-1和/或Rac-1相互作用。
全文摘要
本發(fā)明描述了用于調(diào)節(jié)細胞增殖,優(yōu)先的抑制腫瘤細胞增殖的化合物和方法。可作于調(diào)節(jié)細胞增殖的化合物包括核糖核苷酸還原酶表達的抑制劑,即編碼核糖核苷酸還原酶基因的轉(zhuǎn)錄或翻譯的抑制劑。互補于核糖核苷酸還原酶基因區(qū)域的反義寡核苷酸是特別有效的抑制劑。
文檔編號A61P35/00GK1231694SQ97198163
公開日1999年10月13日 申請日期1997年8月1日 優(yōu)先權日1996年8月2日
發(fā)明者J·A·威里特, A·P·揚 申請人:吉倪塞思技術公司