專利名稱:泌尿生殖癌tlp復(fù)合體肽及其抗體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域:
本發(fā)明涉及從泌尿生殖器癌中分離出來的TLP復(fù)合體(腫瘤釋放蛋白)的肽。
具體地講,本發(fā)明涉及來自人泌尿生殖器的具有抗原活性的TLP蛋白復(fù)合體的肽,以及能與所述肽反應(yīng)的抗體,所述抗體可用于診斷及臨床。
TLP復(fù)合體是存在于人腫瘤細(xì)胞中的蛋白復(fù)合體。有人描述了一種214KDa的TLP蛋白(Tarro G.,Oncology 40,248-253,1983)。可用歐洲專利283443中所描述的方法來從腫瘤組織中分離TLP。意大利專利申請(qǐng)RM92A000506從肺癌中識(shí)別了一種TLP蛋白。本發(fā)明的發(fā)明人驚奇地發(fā)現(xiàn)來自泌尿生殖器癌的TLP含有新肽,這些新肽含有不同于已知TLP肽的序列。
因此,需要從泌尿生殖癌中鑒別出起表位作用的TLP肽,以制備作為抗體的特異試劑。
本發(fā)明的發(fā)明人已識(shí)別出具有一定序列的肽,所述序列包含于來自子宮頸或睪丸腺癌、以及腎瘤的214KDa的TLP蛋白的序列中。
因此本發(fā)明的一個(gè)目的是提供含有特異性泌尿生殖癌TLP表位的肽,其中所述的TLP的特征是含有SEQ ID No.1的氨基酸序列Gly Pro Pro Glu Val Gln Asn Ala Asn按照優(yōu)選實(shí)施方案,其中的肽含有SEQ ID No.1的氨基酸序列。
本發(fā)明的再一目的是提供能從泌尿生殖癌中識(shí)別TLP的特異性試劑,所述試劑優(yōu)選含有TLP抗體。更優(yōu)選地,所述抗體可識(shí)別具有SEQID No.1序列的肽片斷。
本發(fā)明的又一目的是提供診斷試劑盒,所述試劑盒含有本發(fā)明抗體作為特異性試劑,以從樣品中識(shí)別TLP。
本發(fā)明的另一目的是提供含有本發(fā)明肽作為活性劑的藥物組合物。
現(xiàn)在用說明性并非限制性的實(shí)例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行描述。實(shí)施例1 腫瘤浸出液的制備將來自一患有子宮癌的45歲婦女的12.55g的腫瘤在室溫下解凍,并且用外科方法除去壞死組織。當(dāng)將所得到的物質(zhì)勻化后,用Tris 1×(10mM Tris-HCl,pH7.2)進(jìn)行多次洗滌,并且將該組織進(jìn)行三輪冷凍-解凍循環(huán)。
收集使用過的Tris洗滌液并在33,000rpm下離心1小時(shí)。收集上清液并進(jìn)行冷凍。
將組織用聲波處理三次達(dá)3分鐘,隨后在33,000rpm下超離心120分鐘。收集上清液(5.7ml),在Agrodisc過濾器(0.45μm)上過濾,并將過濾后得的組織懸浮在Tris溶液中,比例為1g/ml Tris,并將其在33,000rpm下超離心60分鐘。過濾上清液(0.5ml)并將其加入上一次的上清液中。
對(duì)睪丸癌(總產(chǎn)量1.9ml)及腎瘤樣品進(jìn)行同樣的處理。實(shí)施例2 對(duì)來自泌尿生殖器癌的TLP蛋白中包含的肽的識(shí)別如歐洲專利283443中所述,將TLP復(fù)合物從泌尿生殖器癌浸出液中分離出來。所使用的樣品是1)子宮頸腺癌;2)睪丸癌;3)腎瘤。
所得到的蛋白含量如下
表1樣品 總mg數(shù) mg/ml TLP子宮頸腺癌 59.59.6睪丸癌 7.43.9腎瘤7.4* 1.5*總腎蛋白濃度不允許足夠的TLP純化產(chǎn)量。
用變性電泳分析方法(SDS),通過分子量測(cè)定(214KDa)來進(jìn)行TLP識(shí)別。
通過取下相應(yīng)于表觀分子量214kDa的凝膠部分并進(jìn)一步用電洗脫儀(AMICON)進(jìn)行電洗脫以去除大部分的污染物。
隨后通過變性電泳分析確定TLP的純度。然后將TLP移至具有很高的蛋白質(zhì)結(jié)合能力的PVDF(聚二氟乙烯(Polyvinylidifluoride))膜上,再用Applied Biosystems的蛋白質(zhì)自動(dòng)測(cè)序儀按照Edman方法進(jìn)行氨基酸序列分析。
在所有樣品中發(fā)現(xiàn)的氨基酸序列如下Gly Pro Pro Glu Val Gln Asn Ala Asn(SEQ ID No.1)
序列表(1)一般信息(i)申請(qǐng)人(A)名稱Istituto Farmacoterapico Italiano S.p.A.(B)街道Via Paolo Frisi 21/23(C)城市羅馬(E)國(guó)家意大利(F)郵政編碼(ZIP)00197(A)名稱Tarro Giulio c/o Istituto Farmacoterapica ItalianoS.p.A.(B)街道Via Paolo Frisi 21/23(C)城市羅馬(E)國(guó)家意大利(F)郵政編碼(ZIP)00197(ii)發(fā)明名稱泌尿生殖癌TLP復(fù)合體肽及其抗體(iii)序列數(shù)1(iv)計(jì)算機(jī)可讀形式(A)媒體類型軟盤(B)計(jì)算機(jī)IBM PC兼容機(jī)(C)操作系統(tǒng)PC-DOS/MS-DOS(D)軟件Patentin Release#1.0,Version#1.30(EPO)(2)SEQ ID NO1的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度9個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸學(xué)線性(ii)分子類型肽(xi)序列描述SEQ ID NO1Gly Pro Pro Glu Val Gln Asn Ala Asn1 權(quán)利要求
1.包含TLP泌尿生殖特異性表位的肽,其中所述TLP包含SEQ IDNo.1的氨基酸序列。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的肽,該肽包含SEQ ID No.1的氨基酸序列。
3.可識(shí)別至少一種根據(jù)權(quán)利要求1或2的肽的抗體。
4.從泌尿生殖腫瘤樣品中識(shí)別TLP的診斷試劑盒,所述試劑盒包含根據(jù)權(quán)利要求3的作為特異試劑的抗體。
5.從泌尿生殖腫瘤樣品中識(shí)別TLP復(fù)合體的方法,其特征在于包含以下步驟-用第一份抗權(quán)利要求1或2的肽的免疫血清對(duì)所述樣品進(jìn)行免疫沉淀;-通過與第二份所述免疫血清進(jìn)行反應(yīng)以及用所述反應(yīng)的檢測(cè)方法來從第一免疫沉淀物中檢測(cè)所述TLP復(fù)合體。
6.含有權(quán)利要求1的肽作為活性劑的藥物組合物。
全文摘要
本文描述了含有特異泌尿生殖癌TLP表位的肽,其中TLP包含氨基酸序列:Gly Pro Pro Glu Val Gln Asn AlaAsn。另外也描述了檢測(cè)所述泌尿生殖TLPs的試劑及藥物組合物。
文檔編號(hào)A61K39/395GK1205012SQ97191213
公開日1999年1月13日 申請(qǐng)日期1997年7月2日 優(yōu)先權(quán)日1996年7月10日
發(fā)明者朱利奧·塔若 申請(qǐng)人:意大利法爾馬科特拉皮克研究所公開有限公司