專利名稱：莫拉氏菌屬(moraxella)運鐵蛋白之受體蛋白的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及免疫學領域，具體地涉及莫拉氏菌屬運鐵蛋白之受體蛋白，其生產(chǎn)方法和用途。
背景技術：
中耳炎是最常見的幼兒疾病，所有兒童中，大約80％在3歲前至少患過一次中耳炎(ref．1-在本申請上下文中，引用了諸多參考文獻以更完整詳盡地描述與本發(fā)明有關的現(xiàn)有技術，每次提到的文獻資料全部列于說明書的結尾，即緊接權利要求書之前，這些公開發(fā)表的參考文獻在此引入，作為本發(fā)明的參考)。慢性中耳炎可導致兒童聽力，語言和認識能力的損害。肺炎鏈球菌(Streptococcus pneumoniae)(約50％)，非典型流感嗜血桿菌(Haemophilus influenzae)(約30％)和粘膜炎莫拉氏菌(Moraxella(Branhamella)catarrhalis)(約20％)的感染可導致慢性中耳炎。僅在美國，每年通過抗生素和外科手術治療中耳炎需花費10-20億美元，上述外科手術如扁桃體切除術，增殖腺切除術和鼓膜切開導管插入術。由于中耳炎多發(fā)于語言技巧快速發(fā)展的年齡段，已證實在經(jīng)?；加兄卸椎膬和写嬖谂c學習和聽覺特異性相關的發(fā)育殘疾。
粘膜炎莫拉氏菌主要聚居于呼吸道，是一種主要的粘膜病原體。對通過鼓膜穿刺術得到的中耳液的培養(yǎng)物所作的研究表明約20％的中耳炎病例是由粘膜炎莫拉氏菌引起的(ref．2)。
長期以來，粘膜炎布蘭漢氏菌被認為是條件病原體，但現(xiàn)在認為局部或全身性(較少見)感染粘膜炎布蘭漢氏菌的結果會導致多種潛在的使人衰弱的疾病。
粘膜炎莫拉氏菌是成人下呼吸道感染的重要病原體，尤其是在慢性支氣管炎和肺氣腫的發(fā)作中更是如此(ref．3，4，5，6，7，8和9)。粘膜炎莫拉氏菌也會導致兒童和成人患竇炎(ref．10，11，12，13和14)，偶爾會導致侵害性疾病(ref．15，16，17，18，19和20)。在醫(yī)院的環(huán)境中，粘膜炎莫拉氏菌已被懷疑與院內(nèi)感染的突然爆發(fā)有關(ref．21)。
由粘膜炎莫拉氏菌引起的中耳炎發(fā)病率正逐年增加，由于預防由肺炎球菌和非典型流感嗜血桿菌引起的中耳炎的方法比較完善，粘膜炎莫拉氏菌作為中耳炎病原體的相對重要性有望進一步提高。而且，粘膜炎莫拉氏菌臨床分離物的抗藥性也越來越常見(ref．22)。1970年以前未曾報道過能產(chǎn)生β-內(nèi)酰胺酶的粘膜炎莫拉氏菌菌株，但從70年代中期開始，在分離物中能越來越經(jīng)常地檢測到表達β-內(nèi)酰胺酶的菌株，最近的調查顯示75％的臨床分離物能產(chǎn)生β-內(nèi)酰胺酶。
鐵抑制是宿主抗微生物病原體的一般性防御機制，但卻不能限制所有病原體的生長速率(ref．23)。包括腦膜炎奈瑟氏球菌(Neisseriameningitidis)(ref．24)，淋病奈瑟氏球菌(N．gonorrhoeae)(ref．25)和流感嗜血桿菌(ref．26)的大量細菌種類可表達兩種能與人運鐵蛋白特異性結合的外膜蛋白(ref．27，28)，這些蛋白的表達受生長環(huán)境中鐵含量的調節(jié)。與其它細菌種類的受體不同，粘膜炎莫拉氏菌受體對載鐵的(即鐵-)運鐵蛋白具有優(yōu)先親和性(ref．29)。粘膜炎莫拉氏菌的兩種運鐵蛋白受體(TfR)的分子量是115kDa(TfR1)和約80-90kDa(TfR2)(ref．27)。
外膜蛋白OMP B2(ref．30，31)的分子量與TfR2的近似，據(jù)報道OMP B2的表達受鐵的調節(jié)(ref．32)。
Yu和Schryvers(ref．29)描述了通過使用變性劑鹽酸胍從運鐵蛋白-瓊脂糖凝膠親和柱上選擇性地洗脫，以從粘膜炎莫拉氏菌中純化運鐵蛋白之受體蛋白TfR1和TfR2的方法。
在這種分離制備受體蛋白的方法中，通過加入EDTA至終濃度20mM，十二烷基肌氨酸鈉至0．75％，使粗制的鐵缺乏的粘膜炎莫拉氏菌膜懸浮液溶解，再于20，000×g下將混合物離心15分鐘以除去碎片。在上清液中加入20ml Fe2hTf-瓊脂糖凝膠(即人運鐵蛋白的鐵飽和形式)，室溫下攪拌溫育45分鐘?；旌衔锷现?，除去結合溶液后，用含有250mM鹽酸胍，50mM Tris-HCl，1M NaCl，20mM EDTA，0．75％十二烷基肌氨酸鈉，pH8．0的緩沖液250ml洗樹脂柱。使用含有1．5M鹽酸胍的緩沖液(不含十二烷基肌氨酸鈉)洗脫TfR2蛋白，隨后通過使用含有4M鹽酸胍的緩沖液來洗脫TfR1蛋白。洗脫組分在50mM Tris-HCl，pH8．0條件下透析24小時。
在此方法的進一步改進形式中，將apohTf-瓊脂糖凝膠與溶解的膜制品混合以結合TfR1，然后將經(jīng)處理的溶解的膜制品暴露于Fe2hTf-瓊脂糖凝膠中以結合剩余的TfR2。按上述方法洗滌親和樹脂洗脫受體蛋白。
粘膜炎莫拉氏菌感染可導致嚴重的疾病。下列作法可能是有利的即提供得自粘膜炎莫拉氏菌的未變性運鐵蛋白之受體蛋白以用作包括疫苗的免疫原性制品中的抗原，其它抗原和免疫原的載體和用于產(chǎn)生診斷試劑。
發(fā)明概述本發(fā)明旨在提供粘膜炎莫拉氏菌(Moraxella catarrhalis)和其它莫拉氏菌屬菌株經(jīng)純化和分離的的運鐵蛋白之受體蛋白，所述蛋白的表觀分子量約為80-90kDa。
根據(jù)本發(fā)明的一個方面，提供了莫拉氏菌屬菌株分離純化的，未變性運鐵蛋白之受體蛋白，或其片斷，或其類似物(TfR2)，所述蛋白經(jīng)十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)測定，表觀分子量約為80-90kDa。運鐵蛋白之受體蛋白基本上保持其原有的構象(以基本上保持莫拉氏菌屬菌株運鐵蛋白之受體蛋白特有的免疫原性)，并可以從粘膜炎莫拉氏菌菌株中分離得到，所述菌株如粘膜炎莫拉氏菌4223，5191或135。這種經(jīng)分離和純化的表觀分子量約為80-90kDa的運鐵蛋白之受體蛋白基本上不含莫拉氏菌屬非80-90kDa蛋白質，尤其是莫拉氏菌屬菌株的OMP B2蛋白和表觀分子量約為105 kDa的運鐵蛋白之受體蛋白，莫拉氏菌屬的磷脂和脂多糖。約為80-90kDa的運鐵蛋白之受體蛋白至少約為70wt％純，優(yōu)選至少約為90wt％純，并可以其水溶液的形式存在。
本發(fā)明也提供了一種含有免疫有效劑量的活性成分的免疫原性組合物，所述有效成分可以是運鐵蛋白之受體蛋白或其片斷或其類似物，此處它與一種可作藥用的載體一起提供。免疫原性組合物可被配制成疫苗以體內(nèi)用于宿主，從而保護宿主抵抗由莫拉氏菌屬菌株，尤其是粘膜炎莫拉氏菌引起的疾病。免疫原性組合物可被配制成微粒膠囊，ISCOM或脂質體制品。免疫原性組合物可與靶向分子聯(lián)合使用以被輸送到免疫系統(tǒng)的特異性細胞或粘膜表面。一些靶向分子包括如WO 92／17167(BiotechAustralia Pty．Ltd．)所述的品系B12和細菌毒素的片斷，如美國專利5，194，254(Barber等人)所述的單克隆抗體。本發(fā)明的免疫原性組合物(包括疫苗)可進一步包括至少一種其它的免疫原性或免疫刺激物，免疫刺激物可以是至少一種佐劑。適宜用于本發(fā)明的佐劑包括(但不限于)磷酸鋁，氫氧化鋁，QS21，Quil A，其衍生物和組分，磷酸鈣，氫氧化鈣，氫氧化鋅，糖脂類似物，氨基酸的十八烷基酯，胞壁酰二肽，聚磷腈(poly-phosphazene)和脂蛋白。佐劑的優(yōu)化組合描述于1994年6月16日遞交的共同未決的美國專利申請流水號08／261，194中，此申請已轉讓給受讓人，其公開內(nèi)容在此引入，作為參考。本發(fā)明進一步包括針對本文提供的運鐵蛋白之受體蛋白的抗體，通過用本文提供的免疫原性組合物免疫宿主即可產(chǎn)生所述抗體。
本文提供的免疫原性組合物可被配制成含有至少一種另外的免疫原，該免疫原可含有或衍生自副粘病毒屬，衣原體，脊髓灰質炎病毒，乙型肝炎病毒，白喉類毒素，破傷風類毒素，流感病毒，嗜血桿菌屬，百日咳毒素，肺炎鏈球菌，分枝桿菌和甲型肝炎病毒。
本發(fā)明的另一方面提供了一種在宿主體內(nèi)產(chǎn)生免疫應答的方法，包括給宿主施用免疫有效劑量的本文所提供的免疫原性組合物。免疫應答可以是體液或細胞-介導的免疫應答。被賦予抵抗疾病之保護作用的宿主包括靈長類動物，所述靈長類動物包括人。
本發(fā)明的另一方面提供了生產(chǎn)疫苗的方法，包括給試驗宿主施用本文所提供的免疫原性組合物，以測定保護宿主抵抗由莫拉氏菌屬菌株引起的疾病所需施用的運鐵蛋白之受體蛋白的量和頻率，根據(jù)所測定的施用量和頻率，將運鐵蛋白之受體蛋白配制成適于給被治療的宿主施用的形式。被治療的宿主可以是人。
本發(fā)明的另一方面提供了測定樣品中存在的能與莫拉氏菌屬菌株的分子量約為80-90kDa的運鐵蛋白之受體蛋白特異性反應的抗體的方法，所述方法包括以下步驟(a)將樣品與本文提供的運鐵蛋白之受體蛋白接觸以產(chǎn)生復合物，該復合物含有運鐵蛋白之受體蛋白和樣品中存在的能與該蛋白特異性反應的任何所述抗體；和(b)測定產(chǎn)生的復合物。
本發(fā)明的另一方面提供了測定樣品中存在的莫拉氏菌屬菌株的分子量約為80-90kDa的運鐵蛋白之受體蛋白的方法，所述方法包括以下步驟(a)用本文提供的免疫原性組合物免疫受試者，以產(chǎn)生針對運鐵蛋白之受體蛋白的特異性抗體；(b)將樣品與抗體接觸以產(chǎn)生復合物，該復合物含有樣品中存在的任何外膜蛋白和所述外膜蛋白的特異性抗體；和(c)測定產(chǎn)生的復合物。運鐵蛋白之受體蛋白可以是粘膜炎莫拉氏菌菌株的部分。
本發(fā)明的另一方面提供了測定樣品中存在的能與莫拉氏菌屬菌株的分子量約為80-90kDa的運鐵蛋白之受體蛋白特異性反應的抗體的診斷試劑盒，該試劑盒中包括(a)本文提供的運鐵蛋白之受體蛋白；(b)將運鐵蛋白之受體蛋白與樣品接觸以產(chǎn)生含有運鐵蛋白之受體蛋白和樣品中存在的任何所述抗體的復合物的工具；和(c)測定產(chǎn)生的復合物的工具。
本發(fā)明還提供了測定樣品中存在的莫拉氏菌屬菌株的分子量約為80-90kDa的運鐵蛋白之受體蛋白的診斷試劑盒，該試劑盒中包括(a)針對本文提供的約為80-90kDa的運鐵蛋白之受體蛋白的特異性抗體；(b)將抗體與樣品接觸以產(chǎn)生含有運鐵蛋白之受體蛋白和運鐵蛋白之受體蛋白-特異性抗體的復合物的工具；和(c)測定產(chǎn)生的復合物的工具。
本發(fā)明的另一方面提供了生產(chǎn)疫苗的方法，所述方法包括給試驗宿主施用本文所提供的免疫原性組合物，以測定保護宿主抵抗由莫拉氏菌屬菌株引起的疾病所需施用的組合物的量和頻率，所述莫拉氏菌屬菌株可產(chǎn)生運鐵蛋白之受體蛋白，經(jīng)SDS-PAGE測定，該蛋白的表觀分子量約為80-90kDa，或者也可產(chǎn)生能在試驗宿主體內(nèi)誘導能與運鐵蛋白特異性反應的抗體的蛋白質；根據(jù)已測定的施用量和頻率，將免疫原性組合物配制成適于給被治療的宿主施用的形式，被治療的宿主包括人宿主。
本發(fā)明的另一方面提供了生產(chǎn)單克隆抗體的方法，所述單克隆抗體特異針對莫拉氏菌屬菌株的表觀分子量約為80-90kDa的運鐵蛋白之受體蛋白，所述方法包括(a)給至少一只小鼠施用本文提供的運鐵蛋白之受體蛋白以產(chǎn)生至少一只經(jīng)免疫的小鼠；(b)從至少一只經(jīng)免疫的小鼠體內(nèi)移出B淋巴細胞；(c)將得自至少一只經(jīng)免疫的小鼠的B淋巴細胞與骨髓瘤細胞融合，從而產(chǎn)生雜交瘤；(d)克隆雜交瘤；(e)選擇可產(chǎn)生抗運鐵蛋白之受體蛋白的抗體的克?。?f)培養(yǎng)可產(chǎn)生抗運鐵蛋白之受體蛋白的抗體的克??；然后(g)從培養(yǎng)物中分離抗運鐵蛋白之受體蛋白的抗體。
本發(fā)明的另一方面提供了生產(chǎn)莫拉氏菌屬菌株如粘膜炎莫拉氏菌的經(jīng)分離、純化和未變性的運鐵蛋白之受體蛋白的方法，所述蛋白的表觀分子量約為80-90kDa，所述方法包括以下步驟(a)提供莫拉氏菌屬菌株的細胞團塊；(b)從細胞團塊中選擇性地提取水溶性蛋白質以提供第一上清液和第一沉淀物；(c)分離第一沉淀物和第一上清液；(d)從第一沉淀物中選擇性溶解至少一種分子量約為80-90kDa的運鐵蛋白之受體蛋白以提供第二上清液和第二沉淀物；(e)分離第二沉淀物和第二上清液；(f)從第二上清液中純化分子量約為80-90kDa的運鐵蛋白之受體蛋白，基本上不含在選擇性溶解的步驟中從第一沉淀物中溶解的其它莫拉氏菌屬蛋白質。
通過將細胞團塊與含有約50mM-1M Tris-HCl，pH約為7-8．5的緩沖水溶液接觸，超聲處理細胞團塊以破碎之，離心以形成第一沉淀物和第一上清液，即可從細胞團塊中選擇性地提取水溶性的蛋白質。選擇性溶解可通過下列步驟實現(xiàn)將第一沉淀物與含有去污劑和增溶劑的緩沖水溶液至少接觸一次，所述緩沖液可以是約20mM-1M Tris-HCl，所述去污劑可以是約0．2-2wt％的TRITON X-100(非離子型去污劑的商標，為十八酚(乙二醇)10)，所述增溶劑可以是約2-20mM的EDTA，超聲處理第一沉淀物以使其分散，離心以形成第二沉淀物和第二上清液。這種接觸，超聲處理和離心步驟可至少進行兩次，然后收集每次的上清液以提供第二上清液。
通過多次層析柱操作進行純化步驟，包括(a)在可以是DEAE-Sephacel柱的第一層析柱上進行第一次層析操作，通過使用例如含有約10mM-1M Tris-HCl，pH約為7-8．5的緩沖液，可使運鐵蛋白之受體蛋白選擇性地流出，污染蛋白質結合于柱上，(b)在含有陽離子交換基質，如SE-纖維素／D529的第二層析柱上進行第二次層析操作，通過使用例如含有約10mM-1M Tris-HCl，pH約為7-8．5的緩沖液，可使運鐵蛋白之受體蛋白選擇性地流出，污染蛋白質結合于柱上，(c)在如羥基磷灰石的第三層析柱上進行第三次層析操作，通過例如控制裝柱pH約為7-8．5，可使柱優(yōu)先選擇性地與運鐵蛋白之受體蛋白而不是與OMP B2蛋白結合，和(d)通過例如使用pH約為7-8．5、含有約100-250mM KH2PO4的緩沖溶液，可從第三層析柱上洗脫運鐵蛋白之受體蛋白。本文提供的制備方法能夠分離出純化形式和未變性形式的運鐵蛋白之受體蛋白。
在本申請中，用術語“莫拉氏菌屬菌株表觀分子量約為80-90kDa的運鐵蛋白之受體蛋白(TfR2)”來限定粘膜炎莫拉氏菌的分子量約為80-90kDa的運鐵蛋白之受體蛋白家族，并包括其氨基酸序列有所變化的蛋白質，所述變化包括那些在莫拉氏菌屬的多種菌株中自然產(chǎn)生的變化。在本申請中，如果第一個蛋白質與第二個蛋白質免疫學相關和／或具有相同的功能，則第一個蛋白質是第二個蛋白質的“功能類似物”，功能類似物可以是，例如，蛋白質的片斷或其取代物，增加或缺失的突變體。
本發(fā)明的優(yōu)點包括-從產(chǎn)生運鐵蛋白之受體蛋白的莫拉氏菌屬菌株，包括粘膜炎莫拉氏菌中分離表觀分子量約為80-90kDa的經(jīng)純化的運鐵蛋白之受體蛋白的方法；-可從莫拉氏菌屬菌株中分離得到表觀分子量約為80-90kDa的經(jīng)分離和純化的未變性運鐵蛋白之受體蛋白；和-特異性鑒定莫拉氏菌屬和感染該菌的宿主的診斷試劑盒和免疫學試劑。
附圖簡述參照附圖從下列描述中可進一步地理解本發(fā)明，其中

圖1是根據(jù)本發(fā)明的一個實施方案，從粘膜炎莫拉氏菌中純化運鐵蛋白之受體蛋白的方法的流程圖；圖2顯示了通過SDS-PAGE對表觀分子量約為80-90kDa的經(jīng)分離和純化的運鐵蛋白之受體蛋白進行的分析；圖3顯示了經(jīng)純化的運鐵蛋白之受體對人運鐵蛋白的結合能力；圖4(a)，4(b)和4(c)顯示了經(jīng)純化的運鐵蛋白之受體蛋白的免疫印跡分析；和圖5(a)和5(b)是免疫印跡，它們闡明了豚鼠抗TfR抗血清特異性地區(qū)分粘膜炎莫拉氏菌和能導致中耳炎的其它細菌病原體的能力，所述抗血清是通過用經(jīng)分離和純化的運鐵蛋白之受體蛋白免疫接種產(chǎn)生的。
發(fā)明通述本發(fā)明提供了可用于由粘膜炎莫拉氏菌制備經(jīng)純化的運鐵蛋白之受體蛋白TfR1的新技術。任何能產(chǎn)生TfR2的粘膜炎莫拉氏菌菌株均可便利地用來提供如本文所提供的經(jīng)分離和純化的TfR2。這些菌株一般可從臨床和細菌培養(yǎng)物保藏中心得到。粘膜炎莫拉氏菌的適當菌株包括粘膜炎莫拉氏菌5191，135和4223。
參照圖1，圖解說明了根據(jù)本發(fā)明的一個實施方案，從粘膜炎莫拉氏菌中純化運鐵蛋白之受體蛋白的方法的流程圖，經(jīng)SDS-PAGE測定，所述蛋白的表觀分子量約為80-90kDa。下述的多種操作一般可在約為4℃-30℃的室溫下進行。將整個細胞與可含有約10mM-1M Tris-HCl，pH約為7-8．5的緩沖水溶液介質接觸，超聲處理破碎細胞后，離心以產(chǎn)生第一上清液(S1)和第一沉淀物(PPT1)。上清液(S1)中含有細胞團塊中的大部分可溶性蛋白質，棄去此上清液。選擇性地用去污劑提取留下的沉淀物(PPT1)以除去任何殘留的可溶性蛋白質，并從沉淀物中溶解包括TfR2的膜蛋白。可以用任何便利的方法進行這種選擇性的提取。這種方法其中之一包括對沉淀物進行多次去污劑提取。具體地說，第一次去污劑提取可以使用Triton X-100和EDTA，然后離心以形成第二沉淀物(PPT2)和被保留的第二上清液(S2)。分離出第二上清液(S2)后，應用Triton X-100和EDTA對殘留的沉淀物PPT2再次進行去污劑提取，然后離心。分離第三上清液(S3)和殘留的第三沉淀物(PPT3)，第三沉淀物棄去，第三上清液與第一次提取得到的第二上清液(S2)合并，即可提供合并的上清液(TfR2-1)。在Tris濃度約為10mM-1M，pH約為7-8．5的緩沖條件下，使用濃度約為0．2-2wt％的Triton X-100和2-20mM EDTA即可進行這種Triton X-100提取。
合并的上清液(TfR2-1)中含有TfR2蛋白以及污染的粘膜炎莫拉氏菌蛋白，所述污染蛋白包括與TfR2蛋白具有大致相同分子量的OMB B2蛋白(見泳道3和5，圖2)。在一系列柱層析操作中對合并的上清液(TfR2-1)進行處理以除去這些雜質。
在第一次這種柱層析操作中，可對合并的上清液(TfR2-1)使用經(jīng)適當緩沖的DEAE-Sephacel柱或其它適宜的柱以允許TfR2蛋白流出，而雜質結合于柱上，前述緩沖液可為例如約10mM-1M Tris-HCl，pH約為7-8．5。在進一步處理流出液之前可洗滌DEAE-Sephacel柱。
然后對來自DEAE-Sephacel柱的流出液和洗滌液(TfR2-2)使用經(jīng)適當緩沖的陽離子交換柱，如SE-纖維素／D529或S-瓊脂糖凝膠以允許TfR2蛋白流出，而雜質結合于柱上，前述緩沖液可為例如約10mM-1M Tris-HCl，pH約為7-8．5。在進一步處理流出液之前可洗滌陽離子交換柱(見泳道4，圖2)。
來自陽離子交換柱的流出液和洗滌液(TfR2-3)仍含有OMP B2蛋白以及少量殘留的蛋白質污染物?？稍谥鶅?yōu)先與TfR2蛋白而非OMP B2蛋白及其它污染蛋白質結合，使后者流出柱的緩沖條件下，對TfR2-3使用羥基磷灰石柱。這種條件可通過使用pH約為6-8．5，濃度約為5-50mM的磷酸鉀緩沖液達到。流出液中含有污染蛋白質(見泳道5，圖2)。
用緩沖液反復洗滌除去柱上殘留的污染物后，使用適當?shù)木彌_液，如pH約為7-8．5濃度約為150-250mM的磷酸鉀緩沖液，將TfR2蛋白從羥基磷灰石柱上洗脫下來。收集洗脫的級分，通過SDS-PAGE分析等分試樣，合并含有TfR2的級分。濃縮合并的級分以提供含有TfR2蛋白的溶液(見泳道6，圖2)。通過此方法提供了經(jīng)分離和純化的未變性TfR2蛋白的水溶液。所提供的TfR2水溶液的濃度可以是與該物質預期的用途一致的任何便利濃度，一般約為100-200μg／ml。
參照圖2，顯示了通過SDS-PAGE對運鐵蛋白之受體蛋白所作的純度分析，所述蛋白是通過本文所述的方法，典型地如通過圖1圖解顯示的方法純化的。在圖2中，泳道1表示粘膜炎莫拉氏菌細胞裂解物，泳道2表示合并的上清液(TfR2-1)，泳道3表示經(jīng)DEAE-Sephacel柱層析后流出的級分(TfR2-2)，泳道4經(jīng)表示SE-纖維素／D529柱層析后流出的級分(TfR2-3)，泳道5表示經(jīng)HTP流出的級分并含有OMP B2蛋白，泳道6表示含有TfR2的與HTP結合的級分，泳道7表示通過基本上如ref．29所述的親和層析分離的運鐵蛋白之受體蛋白TfR2。按本文所提供的純化TfR2蛋白的方法產(chǎn)生了純度至少為70％的TfR2蛋白制品。通過光密度法掃描測定出圖2泳道6中顯示的制品純度至少為95％。
參照圖3，闡明了本文提供的粘膜炎莫拉氏菌的純化的TfR2特異性結合人運鐵蛋白的能力。通過SDS-PAGE分離蛋白質，基本上如ref．27所述評價運鐵蛋白的體外結合。泳道1含有通過基本上如ref．29所述的親和層析分離出的粘膜炎莫拉氏菌的TfR2，泳道2含有按本文所述純化的粘膜炎莫拉氏菌的TfR2，泳道3含有粘膜炎莫拉氏菌的OMP B2蛋白。從圖3中可以看出，結合運鐵蛋白的蛋白質制品能特異性地與運鐵蛋白結合。這些結果進一步證實了通過本文提供的方法可從粘膜炎莫拉氏菌中分離出TfR2。
為了能用作免疫原性組合物(包括疫苗)的成分和診斷實施方案中的抗原，按本文所述純化的運鐵蛋白之受體蛋白應有助于產(chǎn)生識別或中和粘膜炎莫拉氏菌菌株(包括其多數(shù)菌株)的抗體。
參照圖4(a)，4(b)和4(c)，顯示了本文所提供的TfR2的免疫印跡分析，并顯示了TfR2與OMP B2蛋白的特異性分離。在每個圖中，樣品1含有OMP B2蛋白，樣品2含有TfR2蛋白。粘膜炎莫拉氏菌菌株是a菌株5191；b菌株135；和c菌株4223。通過SDS-PAGE分離樣品，樣品3是純化的TfR2。圖4(a)顯示了經(jīng)考馬斯藍染色的凝膠，圖4(b)顯示了使用抗TfR2抗血清的免疫印跡，圖4(c)顯示了使用抗OMP B2抗血清的免疫印跡。圖4的結果進一步證實了通過本文提供的方法可從粘膜炎莫拉氏菌中特異性地純化運鐵蛋白之受體蛋白TfR2，尤其是所述蛋白基本上不含OMP B2蛋白。
參照圖5(b)，免疫印跡的結果顯示了豚鼠抗TfR抗血清識別粘膜炎莫拉氏菌的TfR2蛋白的能力，所述抗血清是通過用本文提供的經(jīng)純化的TfR蛋白免疫豚鼠得到的，所述粘膜炎莫拉氏菌分離自多種來源。測試樣品如下述泳道粘膜炎莫拉氏菌來源1 純化的TfR2粘膜炎莫拉氏菌42232 56 中耳液34223 中耳液在本發(fā)明的一個實施方案中，本文所提供的經(jīng)分離和純化的TfR2蛋白能用于產(chǎn)生抗體，所述抗體可特異性鑒別粘膜炎莫拉氏菌和能引起中耳炎的其它細菌病原體。因此，參照圖5(a)和5(b)，分別通過SDS-PAGE和免疫印跡圖解顯示了豚鼠抗TfR2抗血清的特異反應性，該抗血清通過用本文提供的TfR2蛋白免疫豚鼠得到。被分析的樣品如下所示泳道細菌 來源1 TfR2蛋白 粘膜炎莫拉氏菌42232粘膜炎莫拉氏菌56 中耳液3粘膜炎莫拉氏菌4223中耳液4流感嗜血桿菌菌株125流感嗜血桿菌菌株30中耳分離物6流感嗜血桿菌LCOC1 中耳分離物7肺炎鏈球菌ATCC 63038肺炎鏈球菌ATCC 63049肺炎鏈球菌ATCC 6314圖5(b)所示的結果清楚地表明本文所提供的TfR2-特異性抗血清具有鑒別引起相似臨床癥狀之疾病的細菌病原體的用途。
下表1中所示的結果闡明了通過用本文提供的TfR2蛋白免疫豚鼠產(chǎn)生的抗TfR2抗血清殺死粘膜炎莫拉氏菌的能力。結果表明通過用分離自菌株4223的TfR2蛋白免疫產(chǎn)生的抗血清對于衍生自菌株4223的同源非集群的粘膜炎莫拉氏菌菌株RH408而言是殺菌的。本文所提供的經(jīng)分離和純化的TfR2蛋白產(chǎn)生殺菌抗體的能力是本文所提供的TfR2蛋白能用作保護個體免受由粘膜炎莫拉氏菌引起之疾病的疫苗的活體內(nèi)證據(jù)。
因此，根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供了抗能產(chǎn)生TfR2蛋白或產(chǎn)生能誘導特異性識別TfR2之抗體的蛋白質的莫拉氏菌屬或其它細菌病原體的疫苗，所述疫苗含有免疫原有效量的本文所提供的TfR2蛋白及生理學可接受的載體。本文所提供的TfR2蛋白也可用作半抗原，多糖或肽的載體蛋白以制備抗與TfR2不相關的抗原決定簇的綴合疫苗。
本文所提供的TfR2蛋白也可用作診斷試劑，抗原或用于產(chǎn)生抗TfR2抗體，作為抗原免疫接種以抵抗由莫拉氏菌屬的菌種引起的疾病。
在本發(fā)明另外的實施方案中，本文所提供的TfR2蛋白可作為載體分子以制備抗病原體細菌包括有莢膜的細菌的嵌合分子和綴合疫苗(包括糖綴合物)。因此，例如，使用本發(fā)明的糖綴合物可保護個體抵抗由任何具有多糖抗原的細菌引起的疾病和感染，所述多糖抗原包括脂寡糖(LOS)和PRP。這些細菌病原體可包括例如流感嗜血桿菌，肺炎鏈球菌，大腸桿菌，腦膜炎奈瑟氏球菌，傷寒沙門氏菌(Salmonella typhi)，變異鏈球菌(Streptococcus mutants)，新型隱球菌(Cryptococcusneoformans)，克雷伯氏桿菌(Klebsiella)，金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)和綠膿桿菌(Pseudomonas aeruginosa)。能與TfR2蛋白綴合的特殊抗原和實現(xiàn)這種綴合的方法描述于已公開的PCT申請WO94／12641中，此申請被轉讓給受讓人，并在此引入，作為參考。
在另一個實施方案中，TfR2蛋白的載體功能可被用于，例如誘導針對腫瘤細胞異常多糖的免疫力，或產(chǎn)生能與化療劑或生物活性劑綴合的抗腫瘤抗體。
本發(fā)明尚涉及將TfR2蛋白用作藥物，尤其是用作抗由莫拉氏菌屬菌株感染引起的疾病的疫苗中的活性成分。
在另一方面，本發(fā)明提供了TfR2蛋白用于制備抗由莫拉氏菌屬的菌株感染引起的疾病的免疫藥物的用途。
本發(fā)明的多種實施方案在免疫接種，診斷，治療莫拉氏菌屬的感染和生產(chǎn)免疫學試劑等領域具有很多應用，這一點對于本領域的技術人員而言是顯而易見的。下文中進一步展現(xiàn)了這些用途的非限制性討論。1．疫苗制品和用途可由本文公開的免疫原性的運鐵蛋白之受體蛋白或類似物制備適于用作疫苗的免疫原性組合物。優(yōu)選充分透析抗原性物質以除去不符合要求的小分子量分子和／或凍干之以更易于配制到所需的賦形劑中。免疫原性組合物引發(fā)可產(chǎn)生抗體的免疫應答，所述抗體包括抗運鐵蛋白之受體的抗體和調理性或殺菌性抗體。如果被免疫接種的受試者受到莫拉氏菌屬或其它產(chǎn)生運鐵蛋白受體的細菌的攻擊，抗體將與運鐵蛋白受體結合，從而防止細菌接近存活所必需的鐵源。另外，調理性或殺菌性抗TfR抗體也可通過其它機制提供保護作用。
包括疫苗的免疫原性組合物可被制備成能注射的液體溶液或乳劑?？蓪⑦\鐵蛋白之受體蛋白與能與之相容的可藥用的賦形劑混合。這種賦形劑包括水，鹽水，葡萄糖，甘油，乙醇以及它們的組合。免疫原性組合物和疫苗可進一步地含有輔助物質，如增濕劑或乳化劑，pH緩沖劑，或能增強其效力的佐劑。通過皮下或肌內(nèi)注射可以非腸道施用免疫原性組合物和疫苗?；蛘?，以在粘膜表面引起免疫應答的方式配制和釋放根據(jù)本發(fā)明形成的免疫原性組合物。因此，可通過例如鼻內(nèi)或口服(胃內(nèi)的)途徑將免疫原性組合物施用到粘膜表面?；蛘咭部墒褂冒ㄋ▌┖涂诜苿┑钠渌┯媚Ｊ健τ谒▌┒?，結合物和載體可包括例如聚亞烷基二醇或甘油三酯。這種栓劑可由含有約0．5-10％，優(yōu)選約1-2％的活性成分的混合物形成?？诜苿┛砂ㄕＪ褂玫馁x形劑，如藥用級的糖精，纖維素和碳酸鎂。這些組合物的形式可以是溶液，懸浮液，片劑，丸劑，膠囊，緩釋劑或粉末，并含有約1-95％，優(yōu)選約20-75％的運鐵蛋白之受體蛋白。
免疫原性的制品和疫苗的施用方式應與制劑的劑量相容，所使用的量應是治療有效的，保護性的和免疫原性的量。施用的量取決于被治療的受試者，包括例如個體免疫系統(tǒng)合成抗體的能力，所需保護作用的水平和如有必要，產(chǎn)生細胞介導的免疫應答的能力。需要施用的活性成分的精確的量取決于具體操作者的判斷。然而，本領域的技術人員容易決定適當?shù)膭┝糠秶?，該劑量范圍可以是每次免疫接種的運鐵蛋白之受體蛋白為微克級。最初施用和加強劑量的適當安排也可以改變，但可包括首次施用和隨后的再次施用。劑量也取決于施用的途徑，并根據(jù)宿主的大小將有所改變。
根據(jù)本發(fā)明的免疫原性組合物中運鐵蛋白之受體蛋白的濃度一般約為1-95％。含有僅一種病原體的抗原性物質的疫苗是單價疫苗，含有幾種病原體的抗原性物質的疫苗是聯(lián)合疫苗，它也屬于本發(fā)明。這種聯(lián)合疫苗含有例如來自多種病原體或相同病原體的多種株，或來自多種病原體的聯(lián)合的物質。
如果抗原與佐劑共同施用，則可顯著改善抗原的免疫原性，佐劑通常以磷酸鹽緩沖液中的0．05-0．1％溶液使用。佐劑可增強抗原的免疫原性，但其本身不必為免疫原性的物質。佐劑通過將抗原局部保留于施用位點的附近，產(chǎn)生有利于將抗原緩慢、持續(xù)釋放給免疫系統(tǒng)的細胞的倉庫效應而行使其作用。佐劑也可將免疫系統(tǒng)的細胞吸引至抗原倉庫并刺激這種細胞產(chǎn)生免疫應答。
多年來一直使用免疫刺激劑或佐劑以改善宿主對例如疫苗的免疫應答。如脂多糖的內(nèi)部佐劑正常地是用作疫苗的被殺死或減毒的細菌的成分。外部佐劑是免疫調節(jié)劑，它一般與抗原非共價連接，并被配制以增強宿主的免疫應答。因此，佐劑已被鑒定為可增強對非腸道釋放的抗原的免疫應答。然而，一些這種佐劑是有毒的，可導致不需要的副作用，使得它們不適于用于人和很多動物。事實上，在人和獸用疫苗中，僅有氫氧化鋁和磷酸鋁(通?？偡Q為鋁鹽)被常規(guī)用作佐劑。已充分明確了鋁鹽在增加對白喉和破傷風類毒素的抗體應答中的效力，HBsAg疫苗中已使用鋁鹽為佐劑。盡管對于一些應用而言，鋁鹽的用途充分明確，但仍存在局限性。例如，鋁鹽對于流感免疫接種是無效的，它不能自始至終引發(fā)細胞介導的免疫應答。在小鼠中，通過用鋁鹽作佐劑的抗原引發(fā)的抗體主要是IgGl同種型，它對于通過一些接種劑產(chǎn)生的保護作用不是最適的。
廣范圍的外部佐劑可引起針對抗原的潛在免疫應答。這些佐劑包括與膜蛋白抗原絡合的皂苷(免疫刺激復合物)，含礦物油的普盧蘭尼克聚合物，于礦物油中的被殺死的分枝桿菌，弗氏完全佐劑，如胞壁酰二肽(MDP)和脂多糖(LPS)的細菌產(chǎn)物，以及脂質A和脂質體。
為了有效地誘導體液免疫應答(HIR)和細胞介導的免疫力(CMI)，經(jīng)常將免疫原乳化于佐劑中。很多佐劑是有毒的，可誘導肉芽腫，急性和慢性炎癥(弗氏完全佐劑，F(xiàn)CA)，細胞裂解(皂苷和普盧蘭尼克聚合物)和發(fā)熱，關節(jié)炎和前眼色素層炎(LPS和MDP)。盡管FCA是出色的佐劑，并被廣泛用于研究中，但由于其毒性的存在，F(xiàn)CA仍不能被獲準用于人用或獸用疫苗。
理想的佐劑所需要的特征包括(1)無毒性；(2)刺激長期延續(xù)的免疫應答的能力；(3)操作簡單和長期儲存穩(wěn)定；(4)如有必要，對通過多種途徑施用的抗原既引發(fā)CMI又引發(fā)HIR。(5)與其它佐劑的協(xié)同作用；(6)與抗原呈遞細胞(APC)群體選擇性地相互作用的能力；(7)特異性地引發(fā)適當?shù)腡H1或TH2細胞特異性免疫應答的能力；和(8)選擇性地增加針對抗原的適當抗體同種型水平(例如IgA)的能力。
1989年8月8日授權于Lockhoff等人的美國專利4，855，283(列入本文參考文獻)中指出糖脂類似物可用作免疫調節(jié)劑或佐劑，所述糖脂類似物包括N-糖基酰胺，N-糖基脲和N-糖基氨基甲酸酯，它們中的每一個的糖殘基被氨基酸取代。因此，Lockhoff等人(美國專利4，855，283和ref．33)報道了在單純皰疹病毒疫苗和假狂犬病疫苗中，顯示出與天然產(chǎn)生的糖脂，如糖鞘脂類和糖甘油脂具有類似結構的N-糖脂類似物能夠引發(fā)強烈的免疫應答。已由長鏈烷基胺和通過異頭碳原子與糖直接相連的脂肪酸合成了一些糖脂，以模擬天然產(chǎn)生的脂殘基的功能。
授予Moloney的美國專利4，258，029(此專利已轉讓給本文的受讓人，并被列入本文參考文獻)指出當十八烷基酪氨酸鹽酸化物(OTH)與破傷風類毒素和經(jīng)福爾馬林滅活的Ⅰ，Ⅱ和Ⅲ型脊髓灰質炎病毒疫苗絡合時，可行使佐劑的功能。Nixon-George等人(ref．34)也報道了與重組的乙肝病毒表面抗原絡合的芳香族氨基酸十八烷基酯可增強宿主抗乙肝病毒的免疫應答。2．免疫測定本發(fā)明的運鐵蛋白之受體蛋白可用作免疫原以產(chǎn)生抗運鐵蛋白之受體蛋白的抗體，也可用作免疫測定中的抗原，所述免疫測定包括酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)，RIA和其它非酶聯(lián)抗體結合試驗或本領域中已知的檢測抗細菌，抗莫拉氏菌屬和抗TfR抗體的方法。在ELISA測定中，運鐵蛋白之受體蛋白被固定于選定的表面上，例如象聚苯乙烯微量滴定板的孔那樣能結合蛋白質的表面。洗滌以除去未完全吸附的運鐵蛋白之受體蛋白后，可將已知對檢測樣品而言抗原性為中性的非特異性蛋白質，如牛血清白蛋白(BSA)的溶液結合到選定的表面上。這樣即可封閉固定化表面上的非特異性吸附位點，從而降低由抗血清非特異性地結合于表面而產(chǎn)生的背景。
然后以有助于免疫復合物(抗原／抗體)形成的方式，將固定化的表面與需檢測的如臨床或生物學材料等的樣品接觸。這可以包括用稀釋劑稀釋樣品，所述稀釋劑如BSA，牛γ球蛋白(BGG)和／或磷酸鹽緩沖液(PBS)／吐溫的溶液。然后在大致為25℃-37℃的溫度下，將樣品保溫2-4小時。保溫后，洗滌與樣品接觸的表面以除去未經(jīng)免疫絡合的材料。洗滌方法可包括用如PBS／吐溫或硼酸鹽緩沖液的溶液洗滌。當檢測樣品和被結合的運鐵蛋白之受體蛋白之間形成特異性的免疫復合物，并再次洗滌之后，通過使免疫復合物接觸對第一抗體具有特異性的第二抗體即可測定免疫復合物的形成，甚至對其定量。如果檢測樣品來源于人，第二抗體是對人免疫球蛋白具有特異性的抗體，一般為IgG。為了提供檢測的手段，第二抗體可具有相關的活性，如通過與適當?shù)纳孜锉乜娠@色的酶活性。通過使用例如分光光度計測量顯色的程度即可定量。
實施例以上內(nèi)容一般性地描述了本發(fā)明，參照下列具體的實施例可更完整地理解本發(fā)明。描述這些實施例只是為了闡明而不是限制本發(fā)明的范圍。若情況所需或較為便利時，也可考慮形式的改變和等價的替代。盡管本文使用了特殊的術語，但這種術語只是為了描述而不是限制本發(fā)明。
本文描述部分和實施例中使用的、但未詳述的分子遺傳學，蛋白質生物化學和免疫學方法在科技文獻中有大量報道，這些方法也完全在本領域技術人員的能力范圍之內(nèi)。實施例1此實施例闡明了粘膜炎莫拉氏菌的培養(yǎng)。
所用的粘膜炎莫拉氏菌菌株是135，4223(ref．35)，5191(ref．35)(都是中耳分離物)，ATCC 25240，Q8(痰液分離物)和RH408。
為了提供細胞以分離TfR2，按常規(guī)在巧克力瓊脂平板(BBL)上維持粘膜炎莫拉氏菌菌株。
將粘膜炎莫拉氏菌菌株4223接種到20ml腦心浸液(BHI)肉湯中，在37℃下，通氣溫育培養(yǎng)物過夜。為了在鐵限制的條件下生長，將1ml過夜生長的培養(yǎng)物接種到20ml含有25μM EDDA的BHI肉湯中，在37℃下，使培養(yǎng)物生長約3-4小時。通過在10，000×g下離心20分鐘收獲生長至對數(shù)中期(A578＞0．5)的細胞。如下文實施例3所述，使用細胞沉淀物提取運鐵蛋白之受體(TfR2)蛋白。實施例2此實施例闡明了粘膜炎莫拉氏菌的非集群菌株(RH408)的產(chǎn)生。
將粘膜炎莫拉氏菌菌株4223接種于幾個含有20ml BHI肉湯的燒瓶中，在37℃下，振蕩(170rpm)溫育培養(yǎng)物過夜。將5ml每種過夜培養(yǎng)物轉移到各個1ml的試管中，在室溫下靜置3-8小時以使細菌沉降。用各個培養(yǎng)物清亮的上層液100μl接種25ml BHI肉湯，如上所述在37℃下將培養(yǎng)物溫育過夜。每次用25μl清亮的培養(yǎng)基接種25ml BHI過夜培養(yǎng)，重復傳代6次。為了比較傳代株與原始的粘膜炎莫拉氏菌菌株4223培養(yǎng)物的沉降速度，通過以3小時為間隔期測量A578以鑒定非集群的細菌培養(yǎng)物。包括粘膜炎莫拉氏菌RH408的非集群突變體在3小時的期限內(nèi)不會聚集。在BHI瓊脂平板上，菌株RH408具有所有非集群的菌株的典型菌落形態(tài)。根據(jù)布達佩斯條約的條款，于1994年12月13日將菌株RH408保藏于美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)，12301 ParklawnDrive，Rockville，MD 20852，U．S．A．，給予的ATCC保藏號為55637。實施例3此實施例闡明了通過親和純化提取運鐵蛋白之受體蛋白TfR2。
按參考文獻29所述，使用與人運鐵蛋白(Sigma)綴合的瓊脂糖凝膠4B(Pharmacia)由總膜制備親和純化的TfR2。使用50mM Tris-HCl，pH8．0，1M NaGl，10mM EDTA，0．05％十二烷基肌氨酸鈉，2M胍的緩沖液選擇性地洗脫與親和基質結合的細菌受體蛋白。將經(jīng)洗脫的蛋白質對50mM的Tris-HCl，pH8．0透析。實施例4
此實施例闡明了運鐵蛋白之受體蛋白TfR2的提取和純化。
通過圖1中一般性闡明的方法從粘膜炎莫拉氏菌中分離運鐵蛋白之受體蛋白。
將得自鐵缺乏的粘膜炎莫拉氏菌過夜培養(yǎng)物的細胞沉淀物重懸于50mM的Tris-HCl，pH8．0中，通過超聲處理破碎細胞。在20，000×g下將超聲處理物離心30分鐘，棄去所得的含有可溶性蛋白質的上清液(S1)，將沉淀物(PPT1)懸浮于含有0．5％Triton X-100和10mM EDTA的50mM Tris，pH8．0中，此提取步驟溶解了TfR2。在20，000×g下將懸浮液離心20分鐘以除去不溶性的物質，將上清液上樣到用50mMTris-HCl緩沖液，pH8．0平衡過的DEAE-Sephacel(Pharmacia)柱上。TfR2在流出級分中收集，使用用50mM Tris-HCl，pH8．0平衡過的SE-纖維素D529柱進一步純化TfR2。然后將含有TfR2的流出級分上樣于用10mM磷酸鹽緩沖液，pH8．0平衡過的羥基磷灰石(HTP)柱上。此步驟將OMP B2(存在于HTP的流出級分中)與結合于HTP上的TfR2分離開來。用50mM磷酸鹽緩沖液，pH8．0充分洗滌HTP柱之后，用200mM磷酸鹽緩沖液，pH8．0將TfR2從基質上洗脫下來。通過SDS-PAGE分析評價TfR2的純度。實施例5此實施例描述了粘膜炎莫拉氏菌外膜蛋白B2 OMP B2的純化。
通過12．5％的SDS-PAGE分析HTP柱的流出級分，電泳后，從凝膠上切下對應于OMP B2蛋白帶的凝膠薄片，通過在100伏特下，于洗脫緩沖液(15mM NH4CO3／0．1％SDS)中電洗脫12小時從凝膠薄片中回收蛋白質。實施例6此實施例闡明了豚鼠的免疫接種。
在第一天用乳化于完全弗氏佐劑(CFA)中的5μg劑量的TfR2或OMP B2蛋白肌內(nèi)(i．m．)免疫豚鼠(Charles River，Quebec)。在第+14和+28天用乳化于不完全弗氏佐劑(IFA)中的相同劑量的蛋白質加強免疫動物。在第+42天取血樣。所得結果示于表1。實施例7此實施例描述了對經(jīng)純化的TfR2和OMP B2蛋白所作的分析。
按Lugtenberg等人(ref．36)的描述，在分離凝膠中使用11．5％或12．5％(w／v)的丙烯酰胺(BRL)通過SDS-PAGE分離蛋白質。通過用考馬斯亮藍(BioRad)染色凝膠即可肉眼觀察到蛋白質，蛋白質標準分子量的標記物來自BioRad和Pharmacia。
通過Towbin等人的方法(ref．37)在聚偏二氟乙烯膜(PVDF，Millipore)上電印跡通過SDS-PAGE分離的蛋白質。為了進行免疫印跡，使用1∶1，000稀釋的抗血清。按1∶4，000稀釋的重組G蛋白辣根過氧化物酶偶聯(lián)物(Zymed)被用作報道分子。使用比色反應(4CN／DAB；Pierce)或化學發(fā)光反應(LumiGlo；Kirkegaard和Perry)顯現(xiàn)印跡。兩種檢測方法都要遵從廠商推薦的操作過程。預染色的分子量標記物購自BioRad。
按照作了一些改動的Schryvers和Lee(ref．27)所述的方法評價經(jīng)純化的蛋白質在體外結合運鐵蛋白的活性。簡單地說，通過SDS-PAGE分離蛋白質樣品，然后將樣品電泳轉移到PCDF膜上，在4℃下，將膜與同辣根過氧化物酶偶聯(lián)的人運鐵蛋白(1∶50稀釋；JacksonImmunoResearch)一起保溫過夜。使用上述的LumiGlo化學發(fā)光反應顯現(xiàn)印跡。實施例8此實施例闡明了對B．catarrhalis的殺菌試驗。
將抗血清樣品(25μl)加熱至56℃達30分鐘以消除補體活性，在含有0．1％BSA的佛羅那(veronal)緩沖液(NaCl 8．0g／1， NaHCO30．25g／l，巴比妥酸鈉0．30g／l，巴比妥酸0．45g／l，MgCl2．6H2O 0．1g／l，CaCl2·2H2O 0．05g／l)(VBS)中按1∶8稀釋樣品，然后將經(jīng)稀釋的樣品加入96孔Nunc微量滴定板的第一個孔中。將用VBS兩倍系列稀釋的抗血清置于剩余的孔中，用VBS按1∶200，000稀釋生長至OD578＞0．5的細菌細胞，在每個孔中加入25μl細菌懸浮液。用VBS按1∶10稀釋豚鼠的補體(Biowhittaker，Walkersville，MD)，在每個孔中加入25μl溶液以啟動反應。在37℃下保溫培養(yǎng)板60分鐘，然后將50μl各個反應混合物涂布于含有2．2％Mueller-Hinton肉湯和1．5％瓊脂的Mueller-Hinton瓊脂平板上。在37℃下溫育48小時后，計數(shù)菌落以測定殺菌滴度(與含有免疫前的血清的對照相比，能殺死50％以上細菌的抗血清的最高稀釋度的倒數(shù))，結果示于表1。
本發(fā)明概要概括地說，本發(fā)明提供了分離自粘膜炎莫拉氏菌，表觀分子量約為80kDa-90kDa的運鐵蛋白之受體蛋白，其制備方法和作為免疫原性組合物的用途和診斷實施方案。上述內(nèi)容的改動也在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。
表1應用來自粘膜炎莫拉氏菌4223的運鐵蛋白之受體蛋白(TfR2)免疫豚鼠得到的抗血清的抗TfR2抗體滴度和殺菌活性免疫原殺菌滴度1抗TfR2滴度2免疫前免疫后 免疫前免疫后TfR2 ＜3．013．5＜0．514．0OMP B2 ＜3．0＜3．0 ＜0．5＜0．51殺菌滴度以log2表示為能殺死50％粘膜炎莫拉氏菌4223細菌的抗血清稀釋度。2抗TfR2滴度以log2表示(滴度／100)。
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權利要求
1．莫拉氏菌屬菌株的經(jīng)分離和純化的未變性運鐵蛋白之受體蛋白或其片斷或其類似物，所述蛋白經(jīng)十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)測定，其表觀分子量約為80-90kDa。
2．權利要求1的蛋白，其中莫拉氏菌屬的菌株是粘膜炎莫拉氏菌。
3．權利要求2的蛋白，其中菌株是粘膜炎莫拉氏菌4223，5191或135。
4．權利要求1的蛋白，至少約70wt％純。
5．權利要求4的蛋白，至少約90wt％純。
6．權利要求1的蛋白的水溶液形式。
7．權利要求1的蛋白，基本上不含莫拉氏菌屬菌株的OMP B2蛋白。
8．權利要求1的蛋白，基本上不含莫拉氏菌屬菌株的表觀分子量約為105kDa的運鐵蛋白之受體蛋白。
9．含有免疫有效劑量的權利要求1的蛋白的免疫原性組合物。
10．權利要求8的免疫原性組合物，被配制成疫苗以體內(nèi)施用于宿主，從而保護宿主抵抗由莫拉氏菌屬菌株引起的疾病。
11．權利要求10的免疫原性組合物，其中菌株是粘膜炎莫拉氏菌。
12．權利要求10的免疫原性組合物，被配制成微粒，膠囊，ISCOM或脂質體制品。
13．權利要求10的免疫原性組合物，與靶向分子聯(lián)合以釋放至免疫系統(tǒng)的特異細胞或粘膜表面。
14．權利要求10的免疫原性組合物，進一步含有至少一種其它的免疫原性或免疫刺激性物質。
15．權利要求10的免疫原性組合物，其中至少一種其它的免疫刺激性的物質是至少一種佐劑。
16．權利要求13的免疫原性組合物，其中至少一種佐劑選自磷酸鋁，氫氧化鋁，QS21，Quil A，或其組分或衍生物，磷酸鈣，氫氧化鈣，氫氧化鋅，糖脂類似物，氨基酸的十八烷基酯，胞壁酰二肽，脂蛋白，聚磷腈，ISCOM基質，ISCOPREP，DC-chol和DDBA。
17．權利要求16的免疫原性組合物，其中宿主是靈長類動物。
18．權利要求17的免疫原性組合物，其中靈長類動物是人。
19．特異針對莫拉氏菌屬運鐵蛋白之受體蛋白的抗體，可通過用權利要求9的免疫原性組合物免疫宿主產(chǎn)生。
20．在宿主中產(chǎn)生免疫應答的方法，包括給宿主施用免疫有效劑量的權利要求9的免疫原性組合物。
21．權利要求20的方法，其中免疫應答是體液或細胞介導的免疫應答。
22．測定樣品中存在的能與莫拉氏菌屬菌株的表觀分子量約為80-90kDa的運鐵蛋白之受體蛋白特異性反應的抗體的方法，所述方法包括步驟(a)將樣品與權利要求1的蛋白接觸以產(chǎn)生復合物，該復合物含有蛋白和樣品中存在的能與該蛋白特異性反應的任何所述抗體；和(b)測定產(chǎn)生的復合物。
23．測定樣品中存在的莫拉氏菌屬菌株的表觀分子量約為80-90kDa的運鐵蛋白之受體蛋白的方法，所述方法包括步驟(a)用權利要求9的免疫原性組合物免疫受試者以產(chǎn)生特異針對運鐵蛋白之受體蛋白的抗體；(b)將樣品與抗體接觸以產(chǎn)生復合物，該復合物含有樣品中存在的任何運鐵蛋白之受體蛋白和所述運鐵蛋白之受體蛋白特異性的抗體；和(c)測定產(chǎn)生的復合物。
24．測定樣品中存在的能與莫拉氏菌屬菌株的表觀分子量約為80-90kDa的運鐵蛋白之受體蛋白特異性反應的抗體的診斷試劑盒，該試劑盒中包括(a)權利要求1的運鐵蛋白之受體蛋白；(b)將運鐵蛋白之受體蛋白與樣品接觸以產(chǎn)生含有運鐵蛋白之受體蛋白和樣品中存在的任何所述抗體的復合物的工具；和(c)測定產(chǎn)生的復合物的工具。
25．測定樣品中存在的莫拉氏菌屬菌株的表觀分子量約為80-90kDa的運鐵蛋白之受體蛋白的診斷試劑盒，該試劑盒中包括(a)權利要求19的抗體；(b)將抗體與樣品接觸以產(chǎn)生含有運鐵蛋白之受體蛋白和運鐵蛋白之受體蛋白特異性抗體的復合物的工具；和(c)測定產(chǎn)生的復合物的工具。
26．生產(chǎn)疫苗的方法，所述方法包括給試驗宿主施用權利要求9的免疫原性組合物，以測定保護宿主抵抗由莫拉氏菌屬菌株引起的疾病所需的施用量和頻率，所述莫拉氏菌屬菌株可產(chǎn)生經(jīng)SDS-PAGE測定表觀分子量約為80-90Kda的運鐵蛋白之受體蛋白，或者產(chǎn)生能在試驗宿主體內(nèi)誘導能與運鐵蛋白之受體蛋白特異性反應的抗體的蛋白質；和根據(jù)經(jīng)測定的施用量和頻率，將免疫原性組合物配制成適于給被治療的宿主施用的形式。
27．權利要求26的方法，其中被治療的宿主是人。
28．生產(chǎn)單克隆抗體的方法，所述單克隆抗體特異針對莫拉氏菌屬菌株的運鐵蛋白之受體蛋白，經(jīng)SDS-PAGE測定該蛋白的表觀分子量約為80-90kDa，所述方法包括(a)給至少一只小鼠施用權利要求1的運鐵蛋白之受體蛋白以產(chǎn)生至少一只經(jīng)免疫的小鼠；(b)從至少一只經(jīng)免疫的小鼠體內(nèi)取出B淋巴細胞；(c)將得自至少一只經(jīng)免疫的小鼠的B淋巴細胞與骨髓瘤細胞融合，從而產(chǎn)生雜交瘤；(d)克隆雜交瘤；(e)選擇可產(chǎn)生抗運鐵蛋白之受體蛋白的抗體的克?。?f)培養(yǎng)可產(chǎn)生抗運鐵蛋白之受體蛋白的抗體的克?。蝗缓?g)從培養(yǎng)物中分離抗運鐵蛋白之受體蛋白的抗體。
29．生產(chǎn)莫拉氏菌屬菌株的經(jīng)分離和純化的未變性運鐵蛋白之受體蛋白的方法，所述蛋白的表觀分子量約為80-90kDa，所述方法包括步驟(a)提供莫拉氏菌屬菌株的細胞團塊；(b)從所述細胞團塊中選擇性提取水溶性蛋白質以提供第一上清液和第一沉淀物；(c)分離第一沉淀物和第一上清液；(d)從第一沉淀物中選擇性地溶解至少一種分子量約為80-90kDa的運鐵蛋白之受體蛋白，以提供第二上清液和第二沉淀物；(e)分離第二沉淀物和第二上清液；(f)從第二上清液中純化分子量約為80-90kDa的運鐵蛋白之受體蛋白，其中基本上不含在所述選擇性溶解步驟中從第一沉淀物中溶解的其它莫拉氏菌屬蛋白質。
30．權利要求29的方法，其中所述水溶性蛋白質按以下步驟選擇性地由細胞團塊中提取將細胞團塊與緩沖水溶液接觸，超聲處理所述的細胞團塊以破碎之，離心以形成所述第一沉淀物和第一上清液。
31．權利要求30的方法，其中所述緩沖水溶液含有約50mM-1M的Tris-HCl，pH約為7-8．5。
32．權利要求29的方法，其中所述選擇性溶解步驟可通過下列步驟實現(xiàn)將第一沉淀物與含有去污劑和增溶劑的緩沖水溶液至少接觸一次，超聲處理第一沉淀物以使其分散，離心以形成所述第二沉淀物和第二上清液。
33．權利要求32的方法，其中所述緩沖水溶液的pH約為7-8．5，并含有約10mM-1M的Tris-HCl，約0．2-2wt％的去污劑和約2-20mM的EDTA。
34．權利要求33的方法，其中所述去污劑是Triton X-100。
35．權利要求32的方法，其中所述接觸，超聲處理和離心步驟可至少進行兩次，并合并每次這種步驟中的上清液以提供所述的第二上清液。
36．權利要求29的方法，其中通過多次層析柱操作進行所述的純化步驟。
37．權利要求36的方法，其中所述的多次層析柱操作包括(a)在第一層析柱上進行的第一次層析操作，可使運鐵蛋白之受體蛋白選擇性地流出，污染蛋白質結合于柱上，(b)在含有陽離子交換基質的第二層析柱上進行的第二次層析操作，可使運鐵蛋白之受體蛋白選擇性地流出，污染蛋白質結合于柱上，(c)在第三層析柱上進行的第三次層析操作，可使柱優(yōu)先選擇性地結合運鐵蛋白之受體蛋白而不是OMP B2蛋白，和(d)從第三層析柱上洗脫運鐵蛋白之受體蛋白。
38．權利要求37的方法，其中使用pH約為7-8．5的約10mM-1MTris-HCl在DEAE-Sephacel柱上進行第一次層析操作。
39．權利要求38的方法，其中使用pH約為7-8．5的約10mM-1MTris-HCl在SE-纖維素柱上進行第二次層析操作。
40．權利要求38的方法，其中第三次層析操作通過使用pH約為7-8．5的約5-50mM KH2PO4緩沖溶液對第三層析柱上樣來完成，所述第三層析柱是羥基磷灰石柱，所述的洗脫步驟通過使用pH約為7-8．5的含有約150-250mM KH2PO4的緩沖溶液洗脫上樣柱來完成。
全文摘要
莫拉氏菌屬菌株,尤其是粘膜炎莫拉氏菌的經(jīng)分離和純化的未變性運鐵蛋白之受體蛋白,經(jīng)SDS－PAGE測定其表觀分子量約為80—90kDa。運鐵蛋白之受體蛋白或其片斷類似物可用于診斷應用和免疫原性組合物中,尤其是可體內(nèi)施用于宿主以保護宿主抵抗由莫拉氏菌屬引起的疾病。
文檔編號A61P31/04GK1204344SQ96198905
公開日1999年1月6日 申請日期1996年10月11日 優(yōu)先權日1995年10月11日
發(fā)明者楊燕平, L·E·邁爾斯, R·E·哈克納斯, M·H·克萊 申請人:康諾特實驗室有限公司