專利名稱：：血管抑制素片段和集合血管抑制素及其使用方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及稱為血管抑制素的內(nèi)皮細(xì)胞抑制劑，它可逆地抑制內(nèi)皮細(xì)胞的增殖。更具體地說，本發(fā)明涉及血管抑制素蛋白質(zhì)，它可從體液(如血液或尿液)中分離，或可通過重組、酶促或化學(xué)方法合成。血管抑制素能夠抑制與血管生成有關(guān)的疾病并調(diào)節(jié)血管生成過程。此外，本發(fā)明涉及診斷測(cè)定法和用于血管抑制素測(cè)定的試劑盒、血管抑制素的定位的組織化學(xué)試劑盒、編碼血管抑制素的DNA序列和監(jiān)測(cè)血管抑制素生物合成的分子探針、對(duì)血管抑制素特異性的抗體、血管抑制素受體的蛋白質(zhì)激動(dòng)劑和拮抗劑的開發(fā)、抗血管抑制素受體-特異性的抗體激動(dòng)劑和拮抗劑以及連接到血管抑制素蛋白質(zhì)上的細(xì)胞毒素劑。
背景技術(shù)：
：本文使用的術(shù)語“血管生成”指新的血管在組織或器官中生成。在正常的生理?xiàng)l件下，人或動(dòng)物僅在非常特定的情況下進(jìn)行血管生成。例如，血管生成通常可在創(chuàng)傷愈合、胎兒和胚胎發(fā)育以及黃體、子宮內(nèi)膜和胎盤形成中觀察到。術(shù)語“內(nèi)皮細(xì)胞層”指扁平上皮細(xì)胞薄層，其順著漿膜腔、淋巴血管和血管排列?，F(xiàn)認(rèn)為控制的和不受控制的血管生成以類似的方式進(jìn)行。由基膜圍繞的內(nèi)皮細(xì)胞和周皮細(xì)胞形成毛細(xì)血管。血管生成以內(nèi)皮細(xì)胞和白細(xì)胞釋放的酶侵蝕基膜開始。然后內(nèi)皮細(xì)胞(順著血管腔排列)通過基膜突出。血管生成刺激物誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞遷移穿過受侵蝕的基膜。遷移細(xì)胞形式“萌芽”脫離親本血管，其中內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行有絲分裂和增殖。內(nèi)皮細(xì)胞萌芽相互融合以形成毛細(xì)血管回路，產(chǎn)生了新的血管。持久的、無規(guī)律的血管生成發(fā)生于多種疾病狀態(tài)、通過內(nèi)皮細(xì)胞的腫瘤轉(zhuǎn)移和異常生長(zhǎng)之中，并和這些情況下所見的病理破壞一致。多種病理疾病狀態(tài)(在其中存在無規(guī)律的血管生成)一起作為血管生成依賴性的或血管生成有關(guān)的疾病。腫瘤生長(zhǎng)是血管生成依賴性的假說首先在1971年提出(FollunanJ.，腫瘤血管生成治療暗示，N.Engl.Jour.Med.2851182，1186，1971)。這種假說以其最簡(jiǎn)單的術(shù)語指出“一旦腫瘤‘發(fā)病’出現(xiàn)，在腫瘤細(xì)胞群上的所有增長(zhǎng)必須先進(jìn)行聚集在腫瘤上的新毛細(xì)血管的增長(zhǎng)”。目前對(duì)腫瘤‘發(fā)病’的理解是指腫瘤生長(zhǎng)的前血管階段，其中占據(jù)幾立方毫米體積并不超過幾百萬細(xì)胞的腫瘤細(xì)胞群能在宿主微血管上存活。腫瘤體積在這個(gè)階段以外的擴(kuò)展需要新的毛細(xì)血管的誘導(dǎo)。例如，在小鼠的早期的前血管階段中，肺部的微轉(zhuǎn)移僅可通過高倍顯微鏡在組織切片上檢測(cè)到。支持這個(gè)概念的間接證據(jù)的例子包括(1)移植在小鼠皮下透明室中的腫瘤的生長(zhǎng)速率在新血管形成之前是緩慢的和線性的，在新血管形成后是快速的和近指數(shù)的(AlgireGH等，體內(nèi)正常和惡性腫瘤的血管反應(yīng).I.小鼠血管對(duì)創(chuàng)傷和正常而致瘤性移植物的反應(yīng)，J.Natl.Cancerlnst.67385，1945)。(2)在分離的灌注器官中的腫瘤生長(zhǎng)(其中血管不增殖)限定到1-2mm3，但當(dāng)它們移植到小鼠中并成為新形成的血管時(shí)就迅速擴(kuò)張至1000倍的體積(FollunanJ，等，在分離的灌注器官中的腫瘤行為在兔甲狀腺和犬腸片段中的活組織檢查材料的體外生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移，手術(shù)年報(bào)164491-502，1966)(3)在無血管的角膜中的腫瘤生長(zhǎng)以線性速率緩慢進(jìn)行，但是在新血管形成后轉(zhuǎn)換為指數(shù)生長(zhǎng)(Gimbrone，M.A.，Jr.等，腫瘤生長(zhǎng)與新血管形成使用兔角膜的試驗(yàn)?zāi)Ｐ汀.Natl.CancerInstitute5241-427，1974)。(4)懸浮在兔眼睛的前房含水液體中的腫瘤是有活力的和無血管的，而且體積限制在＜1mm3。一旦把它們移植到虹膜血管床上后，它們形成新血管并迅速生長(zhǎng)，在2周內(nèi)達(dá)到它們?cè)瓉眢w積的16,000倍(GimbroneMAJr.等，通過預(yù)防新血管形成使腫瘤體內(nèi)休眠，J.Exp.Med.136261-276)。(5)當(dāng)把腫瘤移植在雞胚絨膜尿囊膜上時(shí)，它們?cè)冢?2小時(shí)的無血管階段生長(zhǎng)緩慢，但不超過0.93±0.29mm的平均直徑。腫瘤的迅速擴(kuò)展發(fā)生在新血管形成開始后的24小時(shí)內(nèi)，到第7天時(shí)這些血管形成的腫瘤達(dá)到8.0±2.5mm的平均直徑(KnightonD.，在雞胚中的腫瘤生長(zhǎng)的無血管和血管階段，英國(guó)癌癥雜志，35347-356，1977)。(6)在兔肝臟中的轉(zhuǎn)移的血管模型揭示出轉(zhuǎn)移大小的不均勻性，但是顯示出對(duì)于血管形成存在的大小的相對(duì)均勻的截止點(diǎn)。腫瘤通常是無血管地達(dá)到1mm的直徑，但是新血管形成超出了該直徑(LienW.等，試驗(yàn)肝臟轉(zhuǎn)移的血液供應(yīng)。II.使用灌注的硅酮橡膠的正常和腫瘤血管的微循環(huán)研究，外科68334-340，1970)。(7)在患胰島的β細(xì)胞癌的轉(zhuǎn)基因小鼠中，前血管增生的胰島大小限制在＜1mm。在6-7周時(shí)，胰島的4-10％形成新血管，從這些胰島中形成了比前血管胰島的體積大1000倍以上的大血管形成的腫瘤(FollunanJ，等，在從瘤形成到增生轉(zhuǎn)變期間血管生成的誘導(dǎo)，自然33958-61，1989)。(8)抗VEGF(血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子)的特異性抗體減少了微血管密度并引起的三個(gè)患者腫瘤生長(zhǎng)“明顯或劇烈的”抑制，這些腫瘤依賴于VEGF作為其血管生成的唯一介質(zhì)(在裸小鼠中)?？贵w在體外不抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)(KimKJ，等，抑制血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子誘導(dǎo)的血管生成在體內(nèi)抑制腫瘤生長(zhǎng)，自然362841-844，1993)。(9)抗bFGF單克隆抗體造成小鼠腫瘤生長(zhǎng)的70％抑制，這種腫瘤生長(zhǎng)依賴于bFGF的分泌作為其血管生成的唯一介質(zhì)?？贵w在體外不抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)(HoriA，等，通過抗人基本成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子的免疫中和單克隆抗體抑制固體腫瘤的生長(zhǎng)，癌癥研究，516180-6184，1991)。(10)bFGF的腹膜內(nèi)注射通過刺激腫瘤中毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的生長(zhǎng)提高最初的腫瘤的生長(zhǎng)及其轉(zhuǎn)移。腫瘤細(xì)胞自身缺乏bFGF受體，在體外bFGF不是腫瘤細(xì)胞的促細(xì)胞分裂劑(GrossJL，等，在體內(nèi)通過bFGF調(diào)節(jié)固體腫瘤生長(zhǎng)，美國(guó)科學(xué)院學(xué)報(bào)，3179，1990)。(11)特異性的血管生成抑制劑(AGM-1470)抑制了腫瘤在體內(nèi)的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移，但在體外抑制腫瘤細(xì)胞增殖的活性卻小得多。它在4logs的低濃度下抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖為它抑制腫瘤細(xì)胞增殖最大值的一半(IngberD，等，血管抑制素抑制血管生成和腫瘤生長(zhǎng)的夫馬霉素的合成同系物，自然，48555-557，1990)。也有腫瘤生長(zhǎng)是血管生成依賴性的間接臨床證據(jù)。(12)轉(zhuǎn)移到玻璃體的人成視網(wǎng)膜細(xì)胞瘤發(fā)育進(jìn)無血管的球狀體，盡管這些無血管的球狀體是可生存的并摻入進(jìn)3H-胸腺嘧啶核甙的事實(shí)，它們被限定在不到1mm3(當(dāng)從摘出的眼中取下并體外分析時(shí))。(13)卵巢癌作為微小的無血管白色子瘤(1-3mm3)轉(zhuǎn)移至腹膜。直到它們中的一個(gè)或多個(gè)形成新血管后，這些移植體很少生長(zhǎng)得更大。(14)在胸部癌中(WeidnerN，等，在入侵性胸部癌中腫瘤血管生成與轉(zhuǎn)移有關(guān)，N.Engl.J.Med.3241-8，1991；WeidnerN，等，腫瘤血管生成在早期胸部癌中的一個(gè)新的明顯而依賴性的預(yù)測(cè)指示，JNatl.CancerInst.841875-1887，1992)和在前列腺癌中(WeidnerN，CarrollPR，F(xiàn)laxJ，BlumenfeldW，F(xiàn)ollunanJ.在入侵性前列腺癌中腫瘤血管生成與轉(zhuǎn)移有關(guān)，美國(guó)病理學(xué)雜志，143(2)401-409，1993)的新血管形成強(qiáng)度和將來轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)高度相關(guān)。(15)在新血管形成之前，人皮膚黑素瘤很少轉(zhuǎn)移。新血管形成的開始導(dǎo)致了損傷厚度的增加和轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)的增加(SrivastavaA，等，在中間厚度(厚0.76-4.0mm)皮膚黑素瘤中腫瘤多血管狀態(tài)預(yù)測(cè)的重要性，美國(guó)病理學(xué)雜志，133419-423，1988)。(16)在膀胱癌中，血管生成蛋白質(zhì)(bFGF)的泌尿水平是比細(xì)胞學(xué)更敏感的狀態(tài)和疾病程度的指示(NguyenM，等，在膀胱癌患者的尿液中提高的血管生成蛋白質(zhì)的水平和基本成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子，J.Natl.CancerInst.85241-242，1993)。這樣，很明顯血管生成在癌的轉(zhuǎn)移中起著主要作用。如果可以抑制或消除這種血管生成活性，腫瘤盡管存在卻不能生長(zhǎng)。在疾病狀態(tài)下，預(yù)防血管生成可避免新血管系統(tǒng)的入侵造成的破壞。針對(duì)控制血管生成過程的療法可導(dǎo)致這些疾病的治愈或減輕。因此，需要的是可抑制血管不期望的生長(zhǎng)(尤其是生長(zhǎng)進(jìn)腫瘤)的組合物與方法。同時(shí)需要的是用于檢測(cè)、測(cè)定和定位的方法和組合物。組合物應(yīng)能克服在轉(zhuǎn)移性腫瘤中的內(nèi)源生長(zhǎng)因子的活性并預(yù)防在腫瘤中的毛細(xì)血管的形成，進(jìn)而抑制腫瘤的生長(zhǎng)。組合物、組合物的部分和對(duì)組合物特異性的抗體也應(yīng)能調(diào)節(jié)其它血管生成過程中(如創(chuàng)傷治愈和再生)的毛細(xì)血管形成。用于抑制血管生成的組合物與方法優(yōu)選地應(yīng)是非毒性的，而且副作用很小。同時(shí)需要的是用于檢測(cè)、測(cè)定和定位組合物的結(jié)合位點(diǎn)以及組合物生物合成的位點(diǎn)。組合物和組合物的片段應(yīng)能和其它分子綴合以用于放射性和非放射性標(biāo)記目的。發(fā)明概述本發(fā)明提供了有效地調(diào)節(jié)血管生成以及抑制不期望的血管生成(具體來說是與腫瘤生長(zhǎng)有關(guān)的血管生成)的組合物和方法。本發(fā)明包括命名為“血管抑制素”的蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)通過其克服內(nèi)源生長(zhǎng)因子(如bFGF)在體外的血管生成活性的能力、其氨基酸序列同源性以及約在纖溶酶原氨基酸98開始的纖溶酶原的內(nèi)部部分的結(jié)構(gòu)相似性定義。血管抑制素包含通過還原聚丙烯酰胺凝膠電泳測(cè)定具有約45至65千道爾頓的分子量以及具有和完整的鼠纖溶酶原分子的第98個(gè)氨基酸開始的鼠纖溶酶原片段實(shí)質(zhì)上類似的氨基酸序列(SEQIDNO2)的蛋白質(zhì)。血管抑制素的氨基酸序列隨物種的變化而稍有變化。例如，在人血管抑制素中，雖然活性人血管抑制素序列可在完整的人纖溶酶原氨基酸序列的第97或99個(gè)氨基酸開始，氨基酸序列實(shí)質(zhì)上類似于上述的鼠纖溶酶原片段的序列。如在小鼠腫瘤模型中所示，人纖溶酶原的片段也有類似的抗血管生成活性?？梢岳斫庠诨钚匝芤种扑胤肿又邪被岬臄?shù)目可以變化，并且具有內(nèi)皮細(xì)胞抑制活性的所有氨基酸序列都包括在本發(fā)明內(nèi)。本發(fā)明提供了用于治療由不合需要的和不受控制的血管生成介導(dǎo)的疾病和病變的方法和組合物，該方法通過對(duì)人和動(dòng)物施用組合物進(jìn)行，其中所說的組合物包含實(shí)質(zhì)上純化的足以抑制血管生成之劑量的血管抑制素、血管抑制素衍生物、血管抑制素片段或集合(aggregate)血管抑制素。本發(fā)明特別用于治療并抑制腫瘤的生長(zhǎng)。對(duì)具有前血管形成的轉(zhuǎn)移瘤的人或動(dòng)物施用血管抑制素可預(yù)防這些腫瘤的生長(zhǎng)或擴(kuò)張。本發(fā)明也包括編碼血管抑制素的DNA序列、包含編碼血管抑制素的DNA序列的表達(dá)載體以及包含一個(gè)或多個(gè)含有編碼血管抑制素的DNA序列的表達(dá)載體的細(xì)胞。本發(fā)明還包括基因療法，通過此方法把編碼血管抑制素的DNA序列導(dǎo)入患者中以改善體內(nèi)血管抑制素的水平。本發(fā)明也包括用于檢測(cè)和測(cè)定生物體液和組織中的血管抑制素以及在組織和細(xì)胞中定位血管抑制素的診斷方法和試劑盒。診斷方法和試劑盒可以是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的任何形態(tài)。本發(fā)明也包括對(duì)血管抑制素分子及其部分特異性的抗體以及對(duì)抑制血管抑制素特異性的抗體之結(jié)合的抗體。這些抗體可以是多克隆抗體或單克隆抗體。對(duì)血管抑制素特異性的抗體可用于診斷試劑盒以檢測(cè)血管抑制素的存在和數(shù)量(用于癌或其它血管生成介導(dǎo)的疾病發(fā)生或復(fù)發(fā)的診斷或預(yù)測(cè))。對(duì)血管抑制素特異性的抗體也可施用給人或動(dòng)物以被動(dòng)免疫抗血管抑制素的人或動(dòng)物，進(jìn)而降低血管生成的抑制。本發(fā)明也包括用于檢測(cè)在體液中結(jié)合血管抑制素的抗體的存在和數(shù)量的診斷方法和試劑盒。診斷方法和試劑盒可以是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的任何形態(tài)。本發(fā)明也包括抗血管抑制素受體特異性的抗體，該抗體和血管抑制素受體結(jié)合、向細(xì)胞傳輸適當(dāng)?shù)男盘?hào)并用作激動(dòng)劑或拮抗劑。本發(fā)明也包括血管抑制素蛋白質(zhì)片段和同系物，其可以經(jīng)同位素標(biāo)記或用其他分子和蛋白質(zhì)標(biāo)記，后者是用于以各種技術(shù)(包括但不限于正電子成象術(shù)、放射自顯影法、流式細(xì)胞術(shù)、放射性受體結(jié)合分析以及免疫組織化學(xué))檢測(cè)和使血管抑制素結(jié)合位點(diǎn)可視化的分子和蛋白質(zhì)。這些血管抑制素蛋白質(zhì)和類似物也可作為作為血管抑制素受體的激動(dòng)劑和拮抗劑，由此提高或阻斷血管抑制素的生物活性。這樣的蛋白質(zhì)可用于血管抑制素受體的分離。本發(fā)明也包括連接到細(xì)胞毒素劑以用于治療和研究的血管抑制素、血管抑制素片段、血管抑制素抗血清或血管抑制素受體激動(dòng)劑和血管抑制素受體拮抗劑。本發(fā)明還包括將血管抑制素、血管抑制素片段、血管抑制素抗血清，血管抑制素受體激動(dòng)劑和血管抑制素受體拮抗劑與藥學(xué)上可接受的賦形劑以及可有可無地與持久釋放化合物和組合物(如生物可降解的集合物)組合在一起形成治療組合物。本發(fā)明包括用于參與血管抑制素轉(zhuǎn)錄和翻譯的核糖核酸和脫氧核糖核酸的分子探針。這些分子探針提供了檢測(cè)和測(cè)定組織和細(xì)胞中的血管抑制素生物合成的方法。因此，提供包含血管抑制素的組合物是本發(fā)明的目的。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供治療血管生成介導(dǎo)的疾病和病變的方法。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供檢測(cè)體液或組織中的血管抑制素的存在和含量的診斷或預(yù)測(cè)方法和試劑盒。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供治療血管生成介導(dǎo)的疾病和病變的方法和組合物，其中疾病和病變包括但不限于血管瘤、固體腫瘤、血生腫瘤、白血病、轉(zhuǎn)移、毛細(xì)血管擴(kuò)張、牛皮癬、硬皮馬勃屬、生膿肉芽瘤、心肌血管生成、克羅恩氏病、血小板新血管形成、冠狀側(cè)突、腦部側(cè)突、動(dòng)靜脈畸形、局部缺血的分支血管生成、角膜疾病、發(fā)紅、新血管青光眼、糖尿病視網(wǎng)膜病、晶狀體后纖維組織形成、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、糖尿病新血管形成、黃斑變性、創(chuàng)傷治愈、胃潰瘍、螺桿菌屬有關(guān)的疾病、骨折、瘢痕瘤、血管發(fā)生、血細(xì)胞生成、排卵、月經(jīng)、胎盤形成和貓抓熱。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供用于治療或抑制癌生長(zhǎng)的組合物。本發(fā)明的目的是提供調(diào)節(jié)或模擬在體內(nèi)或體外產(chǎn)生血管抑制素的酶產(chǎn)生或活性的化合物。本發(fā)明的另一個(gè)目的是通過直接把血管抑制素DNA注射進(jìn)需要這樣的血管抑制素或抗血管抑制素抗體的人或動(dòng)物以提供血管抑制素或抗血管抑制素抗體。本發(fā)明的目的是提供用于檢測(cè)和量化體液中對(duì)血管抑制素特異性的抗體的存在。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供由對(duì)血管抑制素特異性的抗體組成的組合物，其中所說的抗體對(duì)于不識(shí)別纖溶酶原的血管抑制素分子區(qū)是選擇性的。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供用于癌癥檢測(cè)或預(yù)測(cè)的方法。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供用于使體內(nèi)和體外血管抑制素結(jié)合位點(diǎn)可視化和量化的組合物。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供用于血管抑制素生物合成的檢測(cè)和定量的組合物。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供具有最小的副作用的用于癌癥的療法。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供包含連接到細(xì)胞毒素劑以用于治療或抑制癌癥生長(zhǎng)的血管抑制素或血管抑制素蛋白質(zhì)的組合物。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供用于把血管抑制素有關(guān)的組合物定向施用到特定位點(diǎn)的方法。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供用于調(diào)節(jié)血管生成過程的基因療法的組合物和方法。本發(fā)明的這些以及其它目的、特征和優(yōu)點(diǎn)在閱讀了下列公開的實(shí)施方案和所附的權(quán)利要求的詳盡描述后會(huì)變得很明顯。附圖簡(jiǎn)要描述圖1顯示了SEQIDNO1，即整個(gè)鼠纖溶酶原的氨基酸序列。圖2顯示了鼠的血管抑制素的開始序列(SEQIDNO2)并比較了鼠序列與相應(yīng)的人(SEQIDNO3)、恒河猴(SEQIDNO4)、豬(SEQIDNO5)和牛(SEQIDNO6)的纖溶酶原蛋白質(zhì)片段。首先列出的是小鼠序列，其后為人、恒河猴、豬和牛。圖3顯示了在原發(fā)性瘤存在或不存在下在肺臟中腫瘤細(xì)胞的BrdU標(biāo)記指數(shù)。圖4顯示了體內(nèi)Lewis肺臟原發(fā)性瘤對(duì)bFGF驅(qū)動(dòng)的血管生成的影響的Matrigel分析。圖5顯示了得自患有Lewis小鼠肺臟癌(LLC-低)的血清相對(duì)于得自正常小鼠血清的劑量反應(yīng)曲線。在bFGF-驅(qū)動(dòng)的72-小時(shí)增殖測(cè)定中測(cè)定牛毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞。圖6顯示了低與高轉(zhuǎn)移性的腫瘤在其腹水中包含內(nèi)皮促細(xì)胞分裂活性，但是僅僅低轉(zhuǎn)移性腫瘤系在血清中具有內(nèi)皮抑制活性。圖7顯示了得自患有腫瘤動(dòng)物的部分純化的血清或尿的C4反相色譜圖。圖8顯示了在小鼠用完整的纖溶酶原分子、得自人纖溶酶原的賴氨酸結(jié)合位點(diǎn)I制備物的活性組分、得自患有腫瘤的小鼠的尿液以及得自正常小鼠的尿液處理13天后表面的肺臟轉(zhuǎn)移。圖9在小鼠用完整的纖溶酶原分子、得自人纖溶酶原的賴氨酸結(jié)合位點(diǎn)I制備物的活性組分、得自患有腫瘤的小鼠的尿液以及得自正常小鼠的尿液處理13天后表面的肺臟重量。圖10是pTrcHis載體的圖解描述。圖11描述了得自10L放大發(fā)酵的大腸桿菌表達(dá)的人血管抑制素的免疫印跡，其中用抗人纖溶酶原kringle1-3區(qū)的單克隆抗體探查。箭頭顯示了重組人血管抑制素。A)顯示了用0.2M氨基己酸洗脫的重組血管抑制素；B)顯示了以賴氨酸柱的1×PBS的最后洗滌；C)顯示了得自破裂細(xì)胞的澄清裂解物。圖12是描述作為母液稀釋倍數(shù)的函數(shù)的牛毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制百分比圖；A1、A2、B1、B2和E是表達(dá)人血管抑制素抗血管生成活性的重組克隆；C1、C2、D1和D2對(duì)照是僅包含載體無編碼血管抑制素的人DNA序列的陰性對(duì)照克隆。圖13顯示了體外重組人血管抑制素對(duì)牛毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖的抑制作用。圖14顯示了除去原發(fā)性瘤并以具有抗血管生成活性的鹽或夫馬霉素同系物處理后生長(zhǎng)增殖指數(shù)和編程性細(xì)胞死亡指數(shù)。圖15顯示了在小鼠中通過以人血管抑制素體內(nèi)處理(一次注射40mg/kg/天)T241原發(fā)性瘤的生長(zhǎng)抑制。圖16顯示了在小鼠中通過以人血管抑制素體內(nèi)處理(兩劑，每劑40mg/kg/天(80mg/kg/天))LLC-LM原發(fā)性瘤的生長(zhǎng)抑制。圖17顯示了除去Lewis肺臟癌原發(fā)性瘤對(duì)其肺臟轉(zhuǎn)移生長(zhǎng)的作用。圖18顯示了腫瘤切除后的生長(zhǎng)增殖和編程性細(xì)胞死亡指數(shù)。圖19顯示了對(duì)具有移植的T241纖維肉瘤細(xì)胞的小鼠施用血管抑制素蛋白質(zhì)對(duì)作為時(shí)間的函數(shù)的總腫瘤體積的作用。圖20顯示了對(duì)具有移植的Lewis肺臟癌(LM)細(xì)胞的小鼠施用血管抑制素蛋白質(zhì)對(duì)作為時(shí)間的函數(shù)的總腫瘤體積的作用。圖21顯示了對(duì)具有移植的網(wǎng)狀組織細(xì)胞肉瘤細(xì)胞的小鼠施用血管抑制素蛋白質(zhì)對(duì)作為時(shí)間的函數(shù)的總腫瘤體積的作用。圖22顯示了對(duì)具有移植的人前列腺癌PC-3細(xì)胞的免疫缺陷的SCID小鼠施用血管抑制素蛋白質(zhì)對(duì)總腫瘤體積作為時(shí)間的函數(shù)在24天的時(shí)期內(nèi)的作用。圖23顯示了對(duì)具有移植的人胸部癌MDA-MB細(xì)胞的免疫缺陷的SCID小鼠施用血管抑制素蛋白質(zhì)對(duì)作為時(shí)間的函數(shù)的總腫瘤體積在24天的時(shí)期內(nèi)的作用。圖24是編碼源于小鼠纖溶酶原cDNA的小鼠血管抑制素蛋白質(zhì)的小鼠DNA序列克隆的圖解描述。小鼠血管抑制素包括小鼠纖溶酶原kringle1-4區(qū)。PCR指聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)；P1是PCR的5-端寡核苷酸引物；P2是PCR的3-端寡核苷酸引物；SS指信號(hào)序列；ATG是翻譯起始密碼子；TAA是翻譯終止密碼子；HA代表血細(xì)胞凝集素表位尾端(CYPYDVPDYASL)；K1、K2、K3和K4分別代表小鼠纖溶酶原kringle1、2、3和4區(qū)。CMV是巨細(xì)胞病毒啟動(dòng)子；T7是噬菌體啟動(dòng)子；PA代表前激活蛋白質(zhì)；SP6是Sp6啟動(dòng)子。圖25描述了作為非轉(zhuǎn)染細(xì)胞(模擬)天數(shù)的函數(shù)的細(xì)胞數(shù)目；細(xì)胞以沒有編碼血管抑制素的DNA序列的載體(載體5)單獨(dú)以及兩個(gè)血管抑制素表達(dá)克隆(AST31和AST37)轉(zhuǎn)染。圖(a)代表T241細(xì)胞轉(zhuǎn)染的結(jié)果。圖(b)代表LL2細(xì)胞的結(jié)果。圖26顯示了源于包含血管抑制素克隆的大腸桿菌培養(yǎng)基對(duì)細(xì)胞數(shù)目的結(jié)果。非轉(zhuǎn)染細(xì)胞(模擬)；細(xì)胞以沒有編碼血管抑制素的DNA序列的載體(載體5)單獨(dú)以及三個(gè)血管抑制素表達(dá)克隆(AST25，AST31和AST37)轉(zhuǎn)染。圖(a)代表得自對(duì)照的培養(yǎng)基(模擬)的培養(yǎng)和所有血管抑制素克隆(表達(dá)的和不表達(dá)的)對(duì)細(xì)胞數(shù)目的結(jié)果。圖(b)代表得自對(duì)照的培養(yǎng)基(模擬)的培養(yǎng)、僅載體(載體6)和表達(dá)小鼠血管抑制素的血管抑制素克隆對(duì)細(xì)胞數(shù)目的結(jié)果。圖(c)代表得自對(duì)照的純化培養(yǎng)基(模擬)的培養(yǎng)和表達(dá)小鼠血管抑制素的血管抑制素克隆對(duì)細(xì)胞數(shù)目的結(jié)果，其中所說的培養(yǎng)基在賴氨酸-瓊脂糖凝膠柱中純化以產(chǎn)生賴氨酸結(jié)合組分。圖27顯示了在小鼠中移植的T241纖維肉瘤細(xì)胞對(duì)作為時(shí)間函數(shù)的整個(gè)腫瘤體積的作用，其中纖維肉瘤細(xì)胞用包含編碼血管抑制素蛋白質(zhì)的DNA序列的載體轉(zhuǎn)染，所說的載體能表達(dá)血管抑制素蛋白質(zhì)?！胺寝D(zhuǎn)染的”指在小鼠中不變的T241纖維肉瘤細(xì)胞移植?！拜d體6”指僅以不包含編碼血管抑制素蛋白質(zhì)的DNA序列的載體轉(zhuǎn)染的、移植進(jìn)小鼠中的T241纖維肉瘤細(xì)胞?！翱寺?5、克隆31和克隆37”代表以不包含編碼血管抑制素蛋白質(zhì)的DNA序列的載體轉(zhuǎn)染的、移植進(jìn)小鼠中的T241纖維肉瘤細(xì)胞的產(chǎn)生血管抑制素的克隆。圖28顯示了人纖溶酶原及其kringle片段結(jié)構(gòu)的圖解。人纖溶酶原是包含791個(gè)氨基酸的單鏈蛋白質(zhì)(在Asn289具有N-連接的葡基的側(cè)鏈)。由存在于五個(gè)分離的結(jié)構(gòu)域中的N-末端561個(gè)氨基酸組成的人纖溶酶原的非蛋白酶區(qū)域和分離這些結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)一起稱為kringles，如在環(huán)(K1、K2、K3、K4和K5)中所示。每個(gè)三聯(lián)的二硫化物結(jié)合的kringle包含80個(gè)氨基酸。血管抑制素覆蓋這些kringle結(jié)構(gòu)域的前四個(gè)(K1-4)，kringle3(K1-3)和kringle4(K4)通過以彈性蛋白酶消化人纖溶酶原獲得。其余的kringle片段是在大腸桿菌中表達(dá)的重組蛋白質(zhì)。SS＝信號(hào)序列。PA＝前活化蛋白質(zhì)。圖29顯示了纖溶酶原的純化的重組和天然的kringle片段在還原條件下的SDS-PAGE分析。(A)把從大腸桿菌細(xì)菌裂解物純化的單個(gè)重組kringle片段裝入15％SDS凝膠上，其后以考馬斯藍(lán)染色。每泳道裝入約5μg的每種蛋白質(zhì)。(泳道2＝kringle1(K1)；泳道3＝kringle2(K2)；泳道4＝kringle3(K3)；泳道5＝kringle4(K4)；泳道1＝分子量標(biāo)記)。(B)純化的大krlngle片段以考馬斯藍(lán)染色。kringles1-4(泳道2)和kringles1-3(泳道3)通過以賴氨酸-瓊脂糖凝膠色譜純化的彈性蛋白酶消化人纖溶酶原獲得。kringles2-3(泳道4)的重組體片段在大腸桿菌中表達(dá)并在體外重新折疊。分子量標(biāo)記在左邊(泳道1)。圖30顯示了通過血管抑制素的重組單個(gè)kringle片段抑制內(nèi)皮細(xì)胞增殖。Kringle片段于1ng/mlbFGF存在下在牛毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞上測(cè)定72小時(shí)。(A)兩種賴氨酸-結(jié)合的kringles(rK1和rK4)的抗內(nèi)皮細(xì)胞增殖的作用。高親和性賴氨酸結(jié)合kringle(K1(-o-))以劑量依賴性方式抑制BCE細(xì)胞的增殖。中間-親和性賴氨酸結(jié)合kringle(K4(-●-)在高濃度下僅顯示了很小的抑制作用。(B)通過非賴氨酸結(jié)合的K2和K3抑制BCE細(xì)胞增殖。K2(-■-)和K3(-□-)以劑量依賴性方式抑制BCE細(xì)胞的增殖。數(shù)據(jù)代表三次重復(fù)的平均值+/-SEM。圖31顯示了血管抑制素的大kringle片段的抗內(nèi)皮增殖活性。蛋白酶解片段K1-4(血管抑制素)(-o-)和K1-3(-■-)以劑量依賴性方式抑制BCE細(xì)胞的增殖。重組K2-3(-●-)片段比K1-3和K1-4顯示出更有力的抑制。數(shù)據(jù)代表了以抑制百分比表示的的三個(gè)測(cè)定的平均值(+/-SEM)。圖32顯示了重組kringle2和kringle3的加性抑制活性。(A)rK2-3的完整片段(也參見圖31)僅在320nM的濃度時(shí)顯示出微弱的抑制作用。在相同的濃度下，當(dāng)rK2突變片段在位置169上的半胱氨酸被絲氨酸取代并在BCE細(xì)胞中一起測(cè)定K3(半胱氨酸被在位置297的絲氨酸取代)時(shí)，可以觀察到加性抑制。每個(gè)值代表三次重復(fù)的平均值+/-SEM。(B)K2和K3的圖解結(jié)構(gòu)和氨基酸序列。曾有報(bào)道內(nèi)鏈kringle二硫鍵存在于K2的半胱氨酸169和K3的半胱氨酸297之間(Sbhndel，S.，Hu，C.-K.，Marti，D.，Affolter，M.，Schaller，J.，Llinas，M.和Rickli，E.E.(1996)生物化學(xué)，待出版)。圖33顯示了通過組合kringle片段抑制內(nèi)皮細(xì)胞增殖。測(cè)定以每種kringle片段320nM的濃度進(jìn)行。數(shù)值代表以抑制百分比表示的三個(gè)測(cè)定的平均值(+/-SEM)。(A)各種單個(gè)kringles的組合的片段的抑制作用。(B)組合的kringle片段的組合抑制活性。圖34顯示了在還原和烷基化后血管抑制素對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的抑制活性。(A)還原形式(泳道2)和非還原形式(泳道1)的人血管抑制素的SDS-PAGE分析。純化的人血管抑制素以DTT還原，然后以過量的碘乙酰胺使蛋白質(zhì)烷基化。透析處理的樣品并在BCE細(xì)胞上測(cè)定。(B)通過還原形式和非還原形式的血管抑制素以320nM的濃度抑制BCE細(xì)胞增殖。數(shù)據(jù)代表三次重復(fù)的抑制平均值+/-SEM。圖35顯示了人血管抑制素推定的kringle區(qū)的氨基酸序列對(duì)比。四種kringle結(jié)構(gòu)域的序列按照其保守的半胱氨酸對(duì)比。相同的和保守的氨基酸加上陰影。在kringle4中加框的氨基酸顯示了鄰近保守的半胱氨酸殘基22和80的正性荷電的雙賴氨酸。圖36顯示了表達(dá)的血管抑制素的賴氨酸結(jié)合特征和反應(yīng)。圖36A顯示了考馬斯染色的凝膠(裝樣40μl)。圖36B顯示了類似凝膠的免疫印跡(裝樣20μl)。泳道1顯示了得自顯示約50kD和一些其它蛋白質(zhì)的血管抑制素的誘導(dǎo)的培養(yǎng)物的振蕩培養(yǎng)瓶的肉湯。把得自誘導(dǎo)培養(yǎng)物的肉湯以1∶1和緩沖液稀釋并直接裝載在賴氨酸-瓊脂糖凝膠上。泳道2顯示了通過賴氨酸柱的未結(jié)合的片段。所有通過巴斯德畢赤酵母(Pichiapastoris)表達(dá)的所有血管抑制素蛋白質(zhì)結(jié)合到賴氨酸柱上。泳道3顯示了用0.2M氨基己酸(顯示巴斯德畢赤酵母特異性表達(dá)的血管抑制素蛋白質(zhì)結(jié)合賴氨酸)洗脫并可在賴氨酸-瓊脂糖凝膠上以一步純化至均一。同時(shí)，巴斯德畢赤酵母表達(dá)的血管抑制素蛋白質(zhì)可通過抗kringles1至3產(chǎn)生的構(gòu)象依賴性的單克隆抗體(VAP)識(shí)別。圖37顯示了巴斯德畢赤酵母表達(dá)的血管抑制素蛋白質(zhì)被觀察到在變性的非還原SDS-PAGE考馬斯所染色的凝膠上為遷移49kD和51.5kD的雙重線。從具有對(duì)高甘露糖結(jié)構(gòu)特異性的N-聚糖酶的表達(dá)的血管抑制素蛋白質(zhì)除去單一N-連接的復(fù)合物鏈導(dǎo)致產(chǎn)生49.5kD的單-帶。圖A和圖B分別顯示了考馬斯染色的凝膠和類似凝膠的免疫印跡。泳道1顯示了純化的巴斯德畢赤酵母表達(dá)的血管抑制素蛋白質(zhì)。泳道2顯示了在無N-聚糖酶的消化條件下溫育的純化的巴斯德畢赤酵母表達(dá)的血管抑制素蛋白質(zhì)。泳道3顯示了以N-聚糖酶消化的純化的巴斯德畢赤酵母表達(dá)的血管抑制素蛋白質(zhì)。圖38A顯示了在考馬斯凝膠上作為雙重線的4μg純化的巴斯德畢赤酵母表達(dá)的血管抑制素蛋白質(zhì)。圖38B顯示了純化的重組體抑制BCE增殖。下面顯示了在72小時(shí)后獲得的BCE測(cè)定細(xì)胞計(jì)數(shù)bFGF存在(●)或不存在(o)，具有PBS作為對(duì)照的bFGF存在下(Δ)，在具有巴斯德畢赤酵母表達(dá)的血管抑制素蛋白質(zhì)的bFGF存在下(Δ)。圖38C顯示了抑制是劑量依賴性的。圖39顯示了巴斯德畢赤酵母表達(dá)的純化血管抑制素以全身(皮下)施用給具有原發(fā)性瘤的小鼠。圖39A和B分別顯示了使用鹽水或巴斯德畢赤酵母表達(dá)的血管抑制素或源于纖溶酶原的血管抑制素蛋白質(zhì)處理的小鼠的轉(zhuǎn)移和肺臟重量數(shù)。與使用鹽水處理的小鼠的肺臟相比，使用巴斯德畢赤酵母表達(dá)的血管抑制素蛋白質(zhì)或源于纖溶酶原的血管抑制素蛋白質(zhì)處理的小鼠肺臟是非血管形成的，而且轉(zhuǎn)移受到強(qiáng)烈抑制。圖40顯示了巴斯德畢赤酵母表達(dá)的血管抑制素處理的小鼠肺臟是粉紅色的，具有微轉(zhuǎn)移，而鹽水對(duì)照組的肺臟由血管化轉(zhuǎn)移的完全覆蓋。圖41顯示了于鎳親和柱色譜之下在各種純化和集合階段重組小鼠血管抑制素的還原聚丙烯酰胺凝膠電泳照片(SDS-PAGE)(泳道1-3為包含體洗滌物，泳道4為在尿素中不溶性組分，泳道5為親和柱開始材料，泳道6為柱流通物，泳道7為洗脫的血管抑制素)。圖42顯示了把集合的重組小鼠血管抑制素施用到牛毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞上的作用。圖43顯示了在以Lewis肺癌接種的小鼠中施用2mg/kg/天的集合血管抑制素對(duì)腫瘤體積的作用。圖44顯示了在以Lewis肺癌接種的小鼠中施用10mg/kg/天的集合血管抑制素對(duì)腫瘤體積的作用。發(fā)明詳述本發(fā)明包括用于檢測(cè)并治療由血管生成介導(dǎo)的或與血管生成有關(guān)的疾病和病變的組合物和方法。組合物是血管抑制素，它從體液中(包括但不限于血清、尿液和腹水)分離或通過化學(xué)或生物方法(例如細(xì)胞培養(yǎng)物、重組基因表達(dá)、蛋白質(zhì)合成以及纖溶酶原或纖溶酶的體外酶促催化以產(chǎn)生活性血管抑制素)合成。重組技術(shù)包括使用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)從DNA源擴(kuò)增基因以及使用逆轉(zhuǎn)錄酶/PCR從RNA源擴(kuò)增基因。血管抑制素抑制血管生長(zhǎng)進(jìn)組織，如未血管化的或血管化的腫瘤。本發(fā)明也包括包含含有編碼血管抑制素的DNA序列的載體的組合物(其中所說的載體當(dāng)存在于細(xì)胞中時(shí)能表達(dá)血管抑制素)、包含含有載體的細(xì)胞的組合物(其中所說的載體包含編碼血管抑制素或其片段或其同系物的DNA序列，其中所說的載體當(dāng)存在于細(xì)胞中時(shí)能表達(dá)血管抑制素)以及把包含載體的細(xì)胞移植進(jìn)人或非人動(dòng)物中的方法(其中所說的載體包含編碼血管抑制素的DNA序列，其中所說的載體當(dāng)存在于細(xì)胞中時(shí)能表達(dá)血管抑制素)。本發(fā)明還包括與藥學(xué)上可接受的賦形劑和可有可無的持久釋放化合物或組合物(如生物可降解的集合物)組合形成治療組合物的血管抑制素、血管抑制素片段、血管抑制素抗血清、血管抑制素受體激動(dòng)劑或血管抑制素受體拮抗劑。具體地說，本發(fā)明包括包含與血管抑制素特異性結(jié)合的抗體的組合物，其中所說的抗體不與纖溶酶原結(jié)合。更具體地說，本發(fā)明包括稱為血管抑制素的蛋白質(zhì)，它具有約38至45千道爾頓(kD)的分子量，這種蛋白質(zhì)在體外可克服內(nèi)源生長(zhǎng)因子(如bFGF)的血管生成活性。血管抑制素是具有通過還原聚丙烯酰胺凝膠電泳測(cè)定的分子量約在38千道爾頓至45千道爾頓之間的蛋白質(zhì)，這種蛋白質(zhì)還具有和在完整的鼠纖溶酶原分子的第98個(gè)氨基酸開始的鼠纖溶酶原片段實(shí)質(zhì)上類似的氨基酸序列。術(shù)語“實(shí)質(zhì)上類似”當(dāng)用于指血管抑制素氨基酸序列時(shí)是指具有抗血管生成活性并具有約38kD至45kD分子量的氨基酸序列，該序列也與在小鼠纖溶酶原約第98個(gè)氨基酸開始并且長(zhǎng)度為45kD至38kD的小鼠纖溶酶原的蛋白質(zhì)片段具有高度的序列同源性。高度的同源性指至少約60％氨基酸同源，優(yōu)選地至少約70％氨基酸同源，更優(yōu)選地至少約80％氨基酸同源。本文所使用的術(shù)語“內(nèi)皮細(xì)胞抑制活性”指分子在通常情況下抑制血管生成以及，例如，在成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子存在下抑制培養(yǎng)的牛毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)的能力。完整的鼠纖溶酶原分子的氨基酸序列如圖1和SEQIDNO1所示，血管抑制素的序列約在氨基酸98開始。活性人血管抑制素可在完整的人纖溶酶原分子的第97或99個(gè)氨基酸開始。得自小鼠的血管抑制素的前339個(gè)氨基酸的氨基酸序列在圖2(SEQIDNO2)中顯示，圖2中將它與得自人(SEQIDNO3)、恒河猴(SEQIDNO4)、豬(SEQIDNO5)和牛(SEQIDNO6)纖溶酶原的纖溶酶原蛋白質(zhì)片段比較。假定這些序列有超過其氨基酸的50％相同，可以理解為血管抑制素的氨基酸序列在物種間是實(shí)質(zhì)上類似的。在血管抑制素中氨基酸的總數(shù)目是未知的，但受活性分子的分子量限制。本發(fā)明的血管抑制素的氨基酸序列可隨纖溶酶原分子所源于的物種變化。這樣，雖然本發(fā)明的源于人纖溶酶原的血管抑制素和源于小鼠的血管抑制素具有稍不同的序列，如在小鼠腫瘤模型中顯示，它具有抗血管生成活性。已顯示血管抑制素在體外能夠抑制內(nèi)皮細(xì)胞的生長(zhǎng)。血管抑制素不抑制源于其它細(xì)胞類型的細(xì)胞系的生長(zhǎng)。具體地說，血管抑制素對(duì)Lewis肺癌細(xì)胞系、貂肺臟上皮細(xì)胞、3T3成纖維細(xì)胞、牛主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞、牛視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞、MDCk細(xì)胞(犬腎部上皮細(xì)胞)、WI38細(xì)胞(人胎肺臟成纖維細(xì)胞)、EFN細(xì)胞(鼠胎成纖維細(xì)胞)和LM細(xì)胞(鼠結(jié)締組織)無作用。在患腫瘤的小鼠中，內(nèi)源血管抑制素以約10mg血管抑制素/kg體重的全身濃度可有效地抑制轉(zhuǎn)移。血管抑制素具有由纖溶酶原分子的kringle區(qū)限定的特定的三維構(gòu)象(Robbins，K.C.，“纖溶酶原-纖溶酶系統(tǒng)”止血和血栓形成，基本原則和實(shí)踐，第2版，Colman，R.W.等編輯，J.B.Lippincott公司，340-357，1987).有五個(gè)這樣的kringle區(qū)，它是構(gòu)象有關(guān)的基元并在纖溶酶原分子的NH2末端部分中具有實(shí)質(zhì)上的序列同源性。現(xiàn)在認(rèn)為血管抑制素的三維構(gòu)象包括纖溶酶原kringle1至3區(qū)和kringle4區(qū)的一部分。纖溶酶原分子的每個(gè)kringle區(qū)包含約80個(gè)氨基酸并包含3個(gè)二硫鍵。已知半胱氨酸基元存在于其它生物學(xué)活性的蛋白質(zhì)之中。這些蛋白質(zhì)包括但不限于凝血素、肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子、分散因子和巨噬細(xì)胞刺激蛋白質(zhì)(Yoshimura，T，等，“人巨噬細(xì)胞刺激蛋白質(zhì)(MSP，MST1)的克隆、測(cè)序和表達(dá)確證了MSP作為kringle蛋白質(zhì)族的成員并把MSP基因定位在第3染色體上”，生物化學(xué)雜志，第268卷，21，15461-15468，1993)。在體內(nèi)具有抗血管生成活性的任何分離的蛋白質(zhì)或具有類似三維的kringle構(gòu)象或半胱氨酸基元的蛋白質(zhì)都是本發(fā)明的一部分。本發(fā)明也包括為了疾病(如癌)的診斷或預(yù)測(cè)目的檢測(cè)在體液和組織中的血管抑制素的方法。本發(fā)明也包括在細(xì)胞和組織中檢測(cè)血管抑制素結(jié)合位點(diǎn)和受體的方法。本發(fā)明也包括治療或預(yù)防血管生成疾病和病變的方法，所述疾病和病變包括但不限于風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和腫瘤，所述方法是通過刺激血管抑制素和/或通過施用實(shí)質(zhì)上純化的血管抑制素或激動(dòng)劑或拮抗劑和/或血管抑制素抗血清或直接抗患者血管抑制素抗血清的抗血清進(jìn)行的。其它的治療方法包括施用血管抑制素、血管抑制素片段、血管抑制素同系物、血管抑制素抗血清或和連接到細(xì)胞毒素劑的血管抑制素受體激動(dòng)劑和拮抗劑。可以理解血管抑制素可以源于動(dòng)物或人。血管抑制素也能通過化學(xué)反應(yīng)或通過重組技術(shù)結(jié)合表達(dá)系統(tǒng)合成產(chǎn)生。血管抑制素也可以通過酶促裂解分離的纖溶酶原或纖溶酶以產(chǎn)生具有抗血管生成活性的蛋白質(zhì)。血管抑制素也可以通過化合物模擬把血管抑制素裂解成纖溶酶原的內(nèi)源酶的作用產(chǎn)生。血管抑制素產(chǎn)生也可以通過影響纖溶酶原裂解酶活性的化合物調(diào)節(jié)。使用特異性結(jié)合血管抑制素的抗體的被動(dòng)抗體療法可用于調(diào)節(jié)血管生成依賴性的過程，如再生、發(fā)育、創(chuàng)傷治愈和組織修復(fù)。此外，可以施用直接抗血管抑制素抗體的Fab區(qū)的抗血清以封閉內(nèi)源血管抑制素抗血清結(jié)合血管抑制素的能力。本發(fā)明也包括這樣的基因療法，通過這種療法調(diào)節(jié)在患者中的編碼血管抑制素的基因。把DNA轉(zhuǎn)移或施用到表達(dá)基因產(chǎn)物蛋白質(zhì)的細(xì)胞中的各種方法(其它方式的基因療法)在以下文獻(xiàn)中公開在體內(nèi)把基因轉(zhuǎn)移進(jìn)哺乳動(dòng)物體細(xì)胞中，N.Yang，Crit.Rev.Biotechn.12(4)335-356(1992)，本文一并參考?；虔煼òò袲NA序列摻入體細(xì)胞或胚系細(xì)胞中以用于體外或體內(nèi)治療?；虔煼ㄔ谌〈?、加強(qiáng)正常或異常的基因功能、并抗擊傳染病和其它病理中起作用。用基因療法治療這些醫(yī)學(xué)問題的策略包括治療策略，如鑒別缺陷基因，然后添加功能基因以取代缺陷基因的功能或加強(qiáng)微弱功能的基因；或預(yù)防策略，如添加產(chǎn)生蛋白質(zhì)的基因，該蛋白質(zhì)將治療疾病或使組織或器官對(duì)治療用藥方式更敏感。作為預(yù)防策略的例子，可以把一種基因(如血管抑制素)置于患者中，這樣預(yù)防血管生成的發(fā)生；或插入使腫瘤細(xì)胞對(duì)輻射更敏感的基因，然后腫瘤輻射就可以造成腫瘤細(xì)胞殺滅的增加。本發(fā)明提出了許多轉(zhuǎn)移血管抑制素DNA或血管抑制素調(diào)節(jié)序列的方案。啟動(dòng)子序列的轉(zhuǎn)染(不同于人們通常發(fā)現(xiàn)的與血管抑制素特異性有關(guān))或其它序列的轉(zhuǎn)染(這將增加血管抑制素蛋白質(zhì)的產(chǎn)量)也可預(yù)見為基因治療的方法。這種技術(shù)的例子在Transkaryotic治療公司(Cambridge，Massachusetts)中可以找到，它使用同源重組以插入打開細(xì)胞中紅細(xì)胞生成素基因的“遺傳開關(guān)”。參見遺傳工程新聞，1994年4月15日。這樣的“遺傳開關(guān)”可用于在不正常表達(dá)血管抑制素(或血管抑制素受體)的細(xì)胞中活化血管抑制素(或血管抑制素受體)。用于基因療法的基因轉(zhuǎn)移方法分成三個(gè)大類項(xiàng)-物理的(例如，電穿孔，直接的基因轉(zhuǎn)移和離子轟擊)、化學(xué)的(基于脂的載體或其它非病毒載體)以及生物學(xué)的方法(源于病毒的載體和受體吸收)。例如，可以使用非病毒載體(包括用DNA包衣的脂質(zhì)體)。可以把這樣的脂質(zhì)體/DNA復(fù)合物直接靜脈內(nèi)注射進(jìn)患者。人們相信脂質(zhì)體/DNA復(fù)合物在肝臟中濃縮(在肝臟中它們把DNA傳送到巨噬細(xì)胞和枯否氏細(xì)胞中)。這些細(xì)胞長(zhǎng)期存活，這樣就提供了施用的DNA的長(zhǎng)期表達(dá)。另外，可把載體或基因的“裸”DNA直接注射進(jìn)所需要的器官、組織或腫瘤中以用于治療DNA的靶施用?；虔煼ㄒ部梢酝ㄟ^施用位點(diǎn)描述。施用基因的基本方法包括體外(exvivo)基因轉(zhuǎn)移、體內(nèi)基因轉(zhuǎn)移、體外(invitro)基因轉(zhuǎn)移。在體外(exvivo)基因轉(zhuǎn)移中，從患者身上取下細(xì)胞并在細(xì)胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)。把DNA轉(zhuǎn)染進(jìn)細(xì)胞，使轉(zhuǎn)染的細(xì)胞在數(shù)量擴(kuò)增并重新移植進(jìn)患者中。在體外基因轉(zhuǎn)移中，轉(zhuǎn)化的細(xì)胞是在培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的細(xì)胞，如組織培養(yǎng)細(xì)胞，但不是得自特定患者的特定細(xì)胞。轉(zhuǎn)染這些“實(shí)驗(yàn)細(xì)胞”，選擇并擴(kuò)增轉(zhuǎn)染的細(xì)胞用于移植進(jìn)患者或其它用途。體內(nèi)基因轉(zhuǎn)移包括當(dāng)細(xì)胞在患者體內(nèi)時(shí)把DNA導(dǎo)入患者細(xì)胞。該方法包括用非感染性的病毒使用病毒介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移以把基因施用到患者中或把裸DNA注射進(jìn)患者中的位點(diǎn)，DNA按照基因產(chǎn)物蛋白質(zhì)在其中表達(dá)的細(xì)胞的百分比吸收。另外，本文描述的其它方法(例如使用“基因槍”)可用于體外插入血管抑制素DNA或血管抑制素調(diào)節(jié)序列?；蛑委煹幕瘜W(xué)方法可包括基于脂的化合物(不是必需是脂質(zhì)體)以使DNA橫跨細(xì)胞膜。脂轉(zhuǎn)染或細(xì)胞轉(zhuǎn)染(結(jié)合到陰性荷電的DNA的基于脂的陽(yáng)離子)制做了可穿越細(xì)胞膜的復(fù)合物并使DNA進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部。另一種化學(xué)方法使用基于受體的胞吞作用(它包括把特異性配體結(jié)合到細(xì)胞表面受體上、包被它并將其轉(zhuǎn)運(yùn)過細(xì)胞膜)。配體和DNA結(jié)合，整個(gè)復(fù)合物轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞之中。把配體基因復(fù)合物注射血流中，具有受體的靶細(xì)胞可特異性地和配體結(jié)合并把配體-DNA復(fù)合物轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)細(xì)胞。許多基因治療方法使用病毒載體把基因插入到細(xì)胞中。例如，在來自體內(nèi)的方法中使用改變的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體以把基因?qū)胪鈬暮湍[瘤滲透的淋巴細(xì)胞、肝細(xì)胞、表皮細(xì)胞、肌細(xì)胞或其它體細(xì)胞中。然后把這些改變的細(xì)胞導(dǎo)入患者中以提供插入DNA的基因產(chǎn)物。病毒載體也用于使用體內(nèi)方案把基因插入到細(xì)胞中。為了指導(dǎo)外源基因的組織特異性表達(dá)，可以使用已知是組織特異性的順式作用調(diào)節(jié)單元或啟動(dòng)子。另外，這可以使用在體內(nèi)把DNA或病毒載體原位施用到特異性的結(jié)構(gòu)位點(diǎn)中達(dá)到。例如，在體內(nèi)把基因轉(zhuǎn)移到血管中可通過體外把轉(zhuǎn)導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞移植進(jìn)在動(dòng)脈壁上的選擇的位點(diǎn)中完成。病毒感染周圍也表達(dá)基因產(chǎn)物的細(xì)胞。病毒載體可直接施用到體內(nèi)位點(diǎn)中(例如通過導(dǎo)管)，這樣使得僅施用到受到病毒感染的一定區(qū)域并可提供長(zhǎng)期的和位點(diǎn)特異性的基因表達(dá)。已經(jīng)證明在體內(nèi)使用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體在乳房組織和肝組織中通過把改變的病毒注射進(jìn)血管中的基因轉(zhuǎn)移也導(dǎo)致器官。用于基因療法方案的病毒載體包括但不限于逆轉(zhuǎn)錄病毒、其它RNA病毒(如脊髓灰質(zhì)炎病毒或Sindbis病毒、腺病毒、腺伴隨病毒、皰疹病毒、SV40、牛痘)和其它DNA病毒。復(fù)制缺陷的鼠逆轉(zhuǎn)錄病毒載體是最廣泛使用的基因轉(zhuǎn)移載體。鼠白血病逆轉(zhuǎn)錄病毒由與核核心蛋白質(zhì)和集合酶(pol)復(fù)合的單鏈RNA組成，裝入蛋白質(zhì)核心(gag)并由決定宿主范圍的糖蛋白被膜(env)包被。逆轉(zhuǎn)錄病毒的基因組結(jié)構(gòu)包括被5和3長(zhǎng)末端重復(fù)序列(LTR)包被的gag、pol和env基因。逆轉(zhuǎn)錄病毒載體系統(tǒng)利用了這樣的事實(shí)假定病毒結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)在包裝法細(xì)胞系中順式供給，包含5和3LTRs并包裝信號(hào)序列的最小載體足以使載體包裝、感染并整合進(jìn)靶細(xì)胞中。用于基因轉(zhuǎn)移的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的本質(zhì)優(yōu)點(diǎn)包括在大多數(shù)細(xì)胞類型中有效的感染和基因表達(dá)、精確的單拷貝載體整合進(jìn)靶細(xì)胞染色體DNA以及逆轉(zhuǎn)錄病毒基因組易于操作。腺病毒由與核心蛋白質(zhì)復(fù)合并被衣殼蛋白包被的線性的、雙鏈DNA組成。分子病毒學(xué)的進(jìn)步導(dǎo)致了利用這些有機(jī)體的生物學(xué)創(chuàng)造可在體內(nèi)把新的遺傳序列轉(zhuǎn)導(dǎo)進(jìn)靶細(xì)胞的載體的能力?；谙俨《镜妮d體以高水平表達(dá)基因產(chǎn)物蛋白質(zhì)。腺病毒載體具有高效的感染率(即使是低滴度的病毒)。另外，病毒作為無細(xì)胞病毒顆粒充分感染以使不必注射產(chǎn)生細(xì)胞系。對(duì)腺病毒載體來說，另一種潛在的優(yōu)點(diǎn)是在體內(nèi)能完成異源基因的長(zhǎng)期表達(dá)。DNA施用的機(jī)械方法包括融合脂小泡(如脂質(zhì)體或其它膜融合的小泡)、摻入陽(yáng)離子脂的DNA脂顆粒(如脂轉(zhuǎn)染)、聚賴氨酸介導(dǎo)的DNA轉(zhuǎn)移、DNA的直接注射(如把DNA微注射進(jìn)胚細(xì)胞或體細(xì)胞中)、通過空氣作用施用DNA包衣的顆粒(如用于“基因槍”的金顆粒)以及無機(jī)化學(xué)方法(如磷酸鈣轉(zhuǎn)染)。另一種方法，即配體介導(dǎo)的基因療法，包括把DNA和特異性的配體復(fù)合形成配體-DNA綴合物以指導(dǎo)DNA到特異性的細(xì)胞或組織?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)把質(zhì)粒DNA注射進(jìn)肌肉細(xì)胞產(chǎn)生了高百分比的受轉(zhuǎn)染并可維持標(biāo)記基因表達(dá)的細(xì)胞。質(zhì)粒DNA整合或不整合進(jìn)細(xì)胞的基因組。轉(zhuǎn)染DNA的非整合形式將使得基因產(chǎn)物蛋白質(zhì)在末端不同的非增殖組織中轉(zhuǎn)染和表達(dá)較長(zhǎng)的時(shí)間而不怕在細(xì)胞或線粒體基因組中有突變性插入、缺失或改變。長(zhǎng)期(但不必是永久的)把治療基因轉(zhuǎn)移進(jìn)特異性細(xì)胞可提供基因疾病的治療或用于預(yù)防。DNA可周期性地再次注射以保持基因產(chǎn)物水平而在受體細(xì)胞的基因組之中沒有變化產(chǎn)生。外源DNA的非整合形式使得幾種不同的外源DNA構(gòu)建體可存在于具有所有表達(dá)各種基因產(chǎn)物的構(gòu)建體的一個(gè)細(xì)胞內(nèi)。顆粒介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移方法首先用于轉(zhuǎn)化植物組織。用顆粒轟擊裝置或“基因槍”產(chǎn)生運(yùn)動(dòng)力以加速DNA包衣的高密度顆粒(如金或鎢)至高速度，這種速度使得可以穿透靶器官、組織或細(xì)胞。顆粒轟擊可用于體外系統(tǒng)或與體外(exvivo)或體內(nèi)技術(shù)結(jié)合把DNA導(dǎo)入細(xì)胞、組織或器官。用于基因轉(zhuǎn)移的電穿孔使用電流使細(xì)胞或組織對(duì)電穿孔介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移敏感。給定的場(chǎng)強(qiáng)的簡(jiǎn)短的電沖擊可以以DNA分子可穿透細(xì)胞的方法增加膜的滲透性。這種技術(shù)可用于體外系統(tǒng)或與來自體內(nèi)或體內(nèi)技術(shù)結(jié)合把DNA導(dǎo)入細(xì)胞、組織或器官。體內(nèi)載體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移可用于把外源DNA轉(zhuǎn)染進(jìn)細(xì)胞。載體-DNA復(fù)合物可方便地導(dǎo)入體液或血流中，然后在體內(nèi)位點(diǎn)特異性地指向靶器官或組織?？梢允褂弥|(zhì)體和聚陽(yáng)離子(如聚賴氨酸、脂轉(zhuǎn)染或細(xì)胞轉(zhuǎn)染劑)。可以開發(fā)細(xì)胞特異性或器官特異性的脂質(zhì)體，這樣脂質(zhì)體所攜帶的外源DNA可以被靶細(xì)胞吸收。在某些細(xì)胞中針對(duì)特異性受體的免疫脂質(zhì)體的注射可用作把DNA插入具有受體的細(xì)胞中的方便方法。使用的另一個(gè)載體系統(tǒng)是用于把DNA攜帶進(jìn)肝細(xì)胞以進(jìn)行體內(nèi)基因轉(zhuǎn)移的脫唾液酸糖蛋白/聚賴氨酸綴合物系統(tǒng)。轉(zhuǎn)染的DNA可以與其它各種載體復(fù)合以使DNA攜帶進(jìn)受體細(xì)胞，然后留在細(xì)胞質(zhì)或核質(zhì)中。DNA可以和載體核蛋白質(zhì)在特異性的工程小泡復(fù)合物中進(jìn)行偶聯(lián)以直接進(jìn)入核。血管抑制素的基因調(diào)節(jié)可通過施用這樣的化合物完成，該化合物和血管抑制素基因結(jié)合，或控制與血管抑制素基因有關(guān)的區(qū)或其相應(yīng)的RNA轉(zhuǎn)錄物以修改轉(zhuǎn)錄或翻譯速率。另外，可以把用編碼血管抑制素的DNA序列轉(zhuǎn)染的細(xì)胞施用到患者中以提供血管抑制素的體內(nèi)來源。例如，細(xì)胞可以用包含編碼血管抑制素的核酸序列的載體轉(zhuǎn)染。本文所使用的術(shù)語“載體”這樣的載體，它包含在把特異性的核酸序列轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞之中起作用的特異性核酸序列或與其相關(guān)的載體。載體的例子包括質(zhì)粒和感染性微生物(如病毒)或非病毒載體(如配體-DNA綴合物、脂質(zhì)體、脂-DNA復(fù)合物)。合乎需要的是可以把包含血管抑制素DNA序列的重組DNA分子可操作地連接到表達(dá)控制序列以形成能表達(dá)血管抑制素的表達(dá)載體。轉(zhuǎn)染的細(xì)胞可以是源于患者正常組織、患者有病組織的細(xì)胞，或可以是非患者的細(xì)胞。例如，可以用能夠表達(dá)本發(fā)明的血管抑制素蛋白質(zhì)的載體轉(zhuǎn)染從患者中取下的腫瘤細(xì)胞并再次導(dǎo)入患者中。轉(zhuǎn)染的腫瘤細(xì)胞在患者中產(chǎn)生抑制腫瘤生長(zhǎng)水平的血管抑制素?；颊呖梢允侨嘶蚍侨说膭?dòng)物。細(xì)胞可通過本領(lǐng)域已知的非載體或物理或化學(xué)方法(如電穿孔，離子穿孔(ionoporation))或通過“基因槍”轉(zhuǎn)染。另外，血管抑制素DNA可以不用載體的幫助而直接注射進(jìn)患者。具體地說，可以把血管抑制素DNA注射進(jìn)皮膚、肌肉或血液。關(guān)于把血管抑制素轉(zhuǎn)染進(jìn)患者的基因治療方案可以通過把血管抑制素DNA整合進(jìn)細(xì)胞的基因組、微型染色體或作為在細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)或核質(zhì)中的分離的復(fù)制或非復(fù)制DNA構(gòu)建體。血管抑制素表達(dá)可長(zhǎng)期持續(xù)或周期性地再次注射以保持細(xì)胞、組織或器官中所需的血管抑制素蛋白質(zhì)的水平或確定的血液水平。血管抑制素可以在HPLCC4柱上分離(參見表3)。血管抑制素蛋白質(zhì)在乙腈濃度梯度的30至35％洗脫。在還原條件下的十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)凝膠上，具有活性的蛋白質(zhì)帶作為約38千道爾頓的單峰洗脫。本發(fā)明的發(fā)明人表明增長(zhǎng)的原發(fā)性瘤與內(nèi)皮細(xì)胞增殖的特異性抑制劑釋放進(jìn)血液中有關(guān)，該抑制劑包括血管抑制素(它可抑制轉(zhuǎn)移內(nèi)的血管生成并由此抑制轉(zhuǎn)移的生長(zhǎng))。與原發(fā)性瘤血管抑制素有關(guān)的來源還不了解。該化合物可通過蛋白酶特異性地降解纖溶酶原產(chǎn)生，或者，血管抑制素也可以通過編碼血管抑制素的特異性基因的表達(dá)產(chǎn)生。原發(fā)性瘤的血管生成表型依賴于血管生成蛋白質(zhì)的產(chǎn)生超過內(nèi)皮細(xì)胞抑制劑(它由正常細(xì)胞加工，但被認(rèn)為在轉(zhuǎn)化至瘤形成期間進(jìn)行負(fù)調(diào)節(jié)。當(dāng)血管抑制素的產(chǎn)生可以相對(duì)于其親本細(xì)胞型以單個(gè)腫瘤細(xì)胞負(fù)調(diào)節(jié)時(shí)，通過整個(gè)腫瘤加工的抑制劑總量可足以進(jìn)入循環(huán)并在微轉(zhuǎn)移的較遠(yuǎn)位點(diǎn)抑制內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)。與通過原發(fā)性瘤釋放的血管生成蛋白質(zhì)相比，血管抑制素在循環(huán)中可保持顯著更長(zhǎng)的時(shí)間。這樣，血管生成蛋白質(zhì)看起來是局部作用，而血管抑制素綜合作用并以相當(dāng)長(zhǎng)的半衰期在血液中循環(huán)。血管抑制素的半衰期約是12小時(shí)至5天。雖然不想受下列假說的限制，但人們相信當(dāng)腫瘤進(jìn)行血管生成時(shí)釋放一種或多種血管生成蛋白質(zhì)(例如aFGF、bFGF、VEGF、IL-8、GM-CSF等)，該蛋白質(zhì)局部作用，針對(duì)血管外方向的原發(fā)性瘤附近的內(nèi)皮細(xì)胞，而且不循環(huán)(或以很短的半衰期循環(huán))。這些血管生成蛋白質(zhì)必須以足以克服用于原發(fā)性瘤的內(nèi)皮細(xì)胞抑制劑(血管生成抑制劑)的作用的量產(chǎn)生以持續(xù)擴(kuò)增其群體。一旦這樣的原發(fā)性瘤充分生長(zhǎng)，它持續(xù)把內(nèi)皮細(xì)胞抑制劑釋放進(jìn)循環(huán)。按照這種假說，這些抑制劑以與原發(fā)性瘤一定的距離遠(yuǎn)程作用，針對(duì)血管內(nèi)方向的轉(zhuǎn)移的毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞并持續(xù)循環(huán)。這樣，恰好在遠(yuǎn)程轉(zhuǎn)移可以開始啟動(dòng)血管生成的時(shí)間，在其臨近處的毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞可通過導(dǎo)入血管抑制素抑制。一旦原發(fā)性瘤達(dá)到了足以引起血管抑制素持續(xù)釋放進(jìn)循環(huán)的大小，就難于進(jìn)行繼發(fā)性瘤移植(或微轉(zhuǎn)移)以啟動(dòng)或增加其本身的血管生成。如果繼發(fā)性瘤移植(例如，移植進(jìn)皮下空間或角膜或靜脈內(nèi)施用到肺臟中)在原發(fā)性瘤移植后不久發(fā)生，原發(fā)性瘤將不能夠抑制繼發(fā)性瘤(因?yàn)樵诶^發(fā)性瘤中的血管生成已經(jīng)適當(dāng)?shù)剡M(jìn)行)。如果兩種腫瘤同時(shí)進(jìn)行移植(例如，在相對(duì)的側(cè)面)，抑制劑相互具有等同的抑制作用。本發(fā)明的血管抑制素可以(i)對(duì)患有腫瘤的人或動(dòng)物作為抗血管生成治療劑施用；(ii)在人或動(dòng)物血清中、尿或組織中作為預(yù)測(cè)標(biāo)記監(jiān)測(cè)；(iii)用作分析癌癥患者的血清和尿液中類似的血管抑制分子的基礎(chǔ)。血管抑制素可以從體液(如患者的血液或尿液)中分離，或血管抑制素可通過本領(lǐng)域普通技術(shù)人員熟知的重組DNA方法或合成蛋白質(zhì)化學(xué)方法產(chǎn)生，這些屬于本發(fā)明的一部分。蛋白質(zhì)純化方法在本領(lǐng)域中是熟知的，用于純化血管抑制素并測(cè)定抑制劑活性的方法的特定實(shí)例在下面的實(shí)施例中提供。使用類似的技術(shù)可完成人內(nèi)源血管抑制素的分離。使用重組DNA技術(shù)產(chǎn)生血管抑制素的方法的例子包括以下步驟(1)如上面和下面更完全的描述鑒別和純化血管抑制素，(2)測(cè)定純化的抑制劑的N-末端氨基酸序列，(3)合成產(chǎn)生血管抑制素序列的5和3DNA寡核苷酸引物，(4)使用聚合酶擴(kuò)增血管抑制素基因序列，(5)把擴(kuò)增的序列插入適當(dāng)?shù)妮d體(如表達(dá)載體)中，(6)把包含載體的基因插入到能夠表達(dá)抑制劑基因的微生物或其它表達(dá)系統(tǒng)中，(7)分離重組產(chǎn)生的抑制劑。適當(dāng)?shù)妮d體包括病毒、細(xì)菌和真核(如酵母)表達(dá)載體。上述的技術(shù)在實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)如“分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)”，第二版，Sambrook等，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社，(1989)中有更完全的描述。已發(fā)表了人纖溶酶原的DNA序列(Browne，M.J.等，“在HeLa細(xì)胞中表達(dá)重組人纖溶酶原和糖苷配基纖溶酶原(aglycoplasminogen)”，纖維蛋白溶解，第5卷(4).257-260，1991)，本文一并參考。血管抑制素基因也可通過以下方法從表達(dá)高水平的血管抑制素的細(xì)胞或組織(如腫瘤細(xì)胞)中分離(1)從組織中分離信使RNA，(2)使用逆轉(zhuǎn)錄酶產(chǎn)生相應(yīng)的DNA序列，(3)使用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)和適當(dāng)?shù)囊飻U(kuò)增編碼活性血管抑制素氨基酸序列的DNA序列。另一種產(chǎn)生血管抑制素或其生物活性片段的方法是通過蛋白質(zhì)合成。一旦使用如下更充分描述的測(cè)定系統(tǒng)發(fā)現(xiàn)了血管抑制素的生物學(xué)活性片段，就可以對(duì)其進(jìn)行測(cè)序(例如，通過自動(dòng)蛋白質(zhì)測(cè)序方法)。另外，一旦分離到了編碼血管抑制素的基因或DNA序列(例如，通過以上所述的方法)，就可使用本領(lǐng)域熟知的手工或自動(dòng)測(cè)序方法測(cè)定DNA序列。反過來，核酸序列又提供了關(guān)于氨基酸序列的信息。這樣，如果生物學(xué)活性片段通過特異性的方法(如胰蛋白酶消化)產(chǎn)生，或者如果片段進(jìn)行N-末端測(cè)序，余下的氨基酸序列就可從相應(yīng)的DNA序列測(cè)定。一旦知道了蛋白質(zhì)的氨基酸序列，就可通過本領(lǐng)域熟知的技術(shù)合成該片段，例如“固體蛋白質(zhì)合成一種實(shí)用方法”E.Atherton和R.C.Sheppard，IRL出版社，牛津大學(xué)，英國(guó)。相似地，可以合成多片段并將其先后連接以形成更大的片段。這些合成的蛋白質(zhì)片段在特異性位點(diǎn)進(jìn)行氨基酸取代以試驗(yàn)體外和體內(nèi)的促效和拮抗活性。結(jié)合到組織的具有高親和性的蛋白質(zhì)片段可用于在親和柱中分離血管抑制素受體。血管抑制素受體的分離和純化是闡明血管抑制素的作用機(jī)制的基本步驟。血管抑制素受體的分離和血管抑制素激動(dòng)劑和拮抗劑的鑒別有利于開發(fā)藥物以調(diào)節(jié)血管抑制素受體的活性，這是至生物活性的最后途徑。使用原位和溶液雜交技術(shù)進(jìn)行受體分離使構(gòu)建核苷酸探針以能監(jiān)測(cè)受體的定位和合成成為可能。還可以分離血管抑制素受體的基因并將其摻入表達(dá)載體并轉(zhuǎn)染進(jìn)細(xì)胞(如患者腫瘤細(xì)胞)以增加細(xì)胞型、組織或腫瘤結(jié)合血管抑制素和抑制局部血管生成的能力。血管抑制素在治療血管生成介導(dǎo)的或參與血管生成的疾病或病變時(shí)是有效的。本發(fā)明包括治療血管生成介導(dǎo)的疾病的方法，該方法使用有效量的具有抗血管生成活性的血管抑制素或其生物學(xué)活性片段或血管抑制素片段的組合體或血管抑制素激動(dòng)劑和拮抗劑。血管生成介導(dǎo)的疾病包括但不限于固體腫瘤；血生腫瘤(如白血病)；腫瘤轉(zhuǎn)移；良性腫瘤(例如血管瘤、聽神經(jīng)瘤、神經(jīng)纖維瘤、沙眼、生膿風(fēng)濕性肉芽腫)；風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎；牛皮癬；視覺血管生成疾病(例如，糖尿病的視網(wǎng)膜病、早熟視網(wǎng)膜病、黃斑變性、角膜移植排斥、新血管青光眼、晶狀體后纖維組織形成、rubeosis)；Osler-Webber綜合癥；心肌血管生成；血小板新血管形成；毛細(xì)管擴(kuò)張；血友病性關(guān)節(jié)；血管纖維瘤；創(chuàng)傷肉芽發(fā)生。血管抑制素可用于治療內(nèi)皮細(xì)胞過量或異常刺激的疾病。這些疾病包括但不限于腸粘合、克羅恩氏病、動(dòng)脈粥樣硬化、硬皮馬勃屬和肥大傷疤，即瘢痕。血管抑制素可通過防止胚胎移植所需的血管形成作為生育控制劑。血管抑制素可用于治療這樣的疾病，這些疾病具有作為病理后果的血管生成，如貓抓傷病和潰瘍(幽門螺桿菌(Helicobacterpylori))。血管抑制素的合成蛋白質(zhì)片段有各種用途。以很高的特異性和親和性結(jié)合到血管抑制素受體的蛋白質(zhì)是放射性標(biāo)記的并用于使用放射自顯影和膜結(jié)合技術(shù)使結(jié)合位點(diǎn)可視化并定量測(cè)定。本申請(qǐng)?zhí)峁┝酥匾脑\斷和研究工具。血管抑制素受體的結(jié)合性質(zhì)的知識(shí)有利于研究和受體結(jié)合的轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制。此外，用短放射期的同位素標(biāo)記血管抑制素蛋白質(zhì)可以使得可以在體內(nèi)使用定位發(fā)射斷層攝影術(shù)或其它現(xiàn)代的放射顯影技術(shù)受體結(jié)合位點(diǎn)可視化以定位具有血管抑制素結(jié)合位點(diǎn)的腫瘤。在這些合成蛋白質(zhì)內(nèi)的氨基酸的有系統(tǒng)的取代產(chǎn)生了對(duì)血管抑制素受體的高親和性蛋白質(zhì)激動(dòng)劑和拮抗劑，它們可增強(qiáng)或降低血管抑制素對(duì)其受體的結(jié)合。這樣的激動(dòng)劑用來抑制微轉(zhuǎn)移的生長(zhǎng)，進(jìn)而限制了癌的擴(kuò)散。血管抑制素的拮抗劑在不適當(dāng)?shù)难苄纬汕闆r下運(yùn)用以封閉血管抑制素的抑制作用并促進(jìn)血管生成。例如，這種治療可具有促進(jìn)糖尿病患者中創(chuàng)傷治愈的治療作用。血管抑制素蛋白質(zhì)可用于從培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞中分離血管抑制素受體的親和柱。血管抑制素受體的分離和純化后是氨基酸的測(cè)序。使用此信息可以鑒別和分離基因或編碼血管抑制素受體的基因。其次，開發(fā)了克隆的核酸序列以用于插入能夠表達(dá)受體的載體。這些技術(shù)對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是熟知的。把編碼血管抑制素受體的核酸序列轉(zhuǎn)染進(jìn)腫瘤細(xì)胞并通過轉(zhuǎn)染的腫瘤細(xì)胞表達(dá)受體提高了這些細(xì)胞對(duì)內(nèi)源或外源血管抑制素的響應(yīng)，進(jìn)而減少轉(zhuǎn)移性生長(zhǎng)的速率。細(xì)胞毒素劑(如篦麻毒素)連接到血管抑制素和高親和性的血管抑制素蛋白質(zhì)片段上以提供破壞和血管抑制素結(jié)合的細(xì)胞的工具。這些細(xì)胞可在許多位置發(fā)現(xiàn)，包括但不限于微轉(zhuǎn)移和原發(fā)性瘤。連接到細(xì)胞毒素劑的蛋白質(zhì)以設(shè)計(jì)用于最大施用到所需的位點(diǎn)的方式注入。例如，連接到蓖麻毒素的高親和性血管抑制素片段通過套管施用進(jìn)提供靶位點(diǎn)的血管或直接施用進(jìn)靶。這樣的藥劑也可以通過和注入套管偶聯(lián)的滲透泵以受控制的方式施用。血管抑制素拮抗劑的組合體可以和血管生成刺激劑共同施用以增加組織的血管形成。這種治療用藥制度提供了破壞轉(zhuǎn)移性癌的有效方式。血管抑制素可用于與其它組合物和治療疾病的方法結(jié)合。例如，腫瘤可使用手術(shù)、放射或化療與血管抑制素結(jié)合方便地治療，然后可以把血管抑制素施用到患者中以擴(kuò)大微轉(zhuǎn)移的休眠并穩(wěn)定和抑制任何剩余的原發(fā)性瘤的生長(zhǎng)。另外，血管抑制素、血管抑制素片段、血管抑制素抗血清、血管抑制素受體激動(dòng)劑、血管抑制素受體拮抗劑或它們的組合體可與藥學(xué)上可接受的賦形劑以及可有可無的持久釋放基質(zhì)(如生物可降解的集合物)結(jié)合以形成治療組合物。本文所使用的持久釋放基質(zhì)是由通常是聚合物的材料制成的基質(zhì)，這可通過酶促或酸/堿水解或溶解進(jìn)行降解。一旦將其插入到身體中，基質(zhì)通過酶和體液作用。持久釋放基質(zhì)合乎需要地選自生物相容的材料如脂質(zhì)體、聚交酯類(聚乳酸)、聚乙交酯(乙醇酸聚合物)、聚交酯類共乙交酯(乳酸和乙醇酸的共聚物)、聚酸酐、聚(正)酯、聚蛋白、透明質(zhì)酸、膠原質(zhì)、硫酸軟骨素、羧酸、脂肪酸、磷酸脂、聚糖、核酸、聚氨基酸、氨基酸(如苯丙氨酸、酪氨酸、異亮氨酸)、聚核苷酸、聚乙烯基丙烯、聚乙烯吡咯烷酮、硅氧烷。優(yōu)選的生物可降解的基質(zhì)是下列基質(zhì)之一聚交酯、聚乙交酯或聚交酯共乙交酯(乳酸和乙醇酸的共聚物)。本發(fā)明的調(diào)節(jié)血管生成的治療組合物可以是固體、液體或氣霧劑，可以通過任何已知的施用路線施用。固體治療組合物的例子包括丸劑、乳油和可植入劑量單位。丸劑可以口服施用，治療乳油可以局部施用?？梢浦驳闹踩雴挝豢梢跃植渴┯?，例如在腫瘤位點(diǎn)施用，或者它可以植入以用于治療的調(diào)節(jié)血管生成的組合物的全身釋放(例如皮下施用)。液態(tài)組合物的例子包括適于皮下、靜脈內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)、局部和眼球內(nèi)注射的制劑。氣霧劑的例子包括施用到肺臟的吸入劑。本發(fā)明的血管抑制素也可用于產(chǎn)生對(duì)抑制劑及其受體特異性的抗體?？贵w可以是多克隆抗體或單克隆抗體。這些和血管抑制素或血管抑制素受體特異性結(jié)合的抗體可用于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員熟知的診斷方法和試劑盒以檢測(cè)或定量測(cè)定體液或組織中的血管抑制素或血管抑制素受體。這些試驗(yàn)的結(jié)果可用于診斷或預(yù)測(cè)癌癥和其它血管生成介導(dǎo)的疾病的發(fā)生或復(fù)發(fā)。血管抑制素也可用于檢測(cè)和定量測(cè)定能結(jié)合血管抑制素的抗體的診斷方法和試劑盒。這些試劑盒可進(jìn)行循環(huán)中的血管抑制素抗體的檢測(cè)，這些抗體表明在原發(fā)性瘤原位分泌的血管抑制素存在下微轉(zhuǎn)移的擴(kuò)散。具有這樣的循環(huán)抗血管抑制素抗體的患者更可能患多種腫瘤和癌，更可能在治療后或減輕期間復(fù)發(fā)癌。這些抗血管抑制素抗體的Fab片段可用作抗原以產(chǎn)生可以用于中和抗血管抑制素抗體的抗血管抑制素Fab-片段抗血清。這樣的方法減少了通過抗血管抑制素抗體除去循環(huán)的血管抑制素，由此有效地提高了循環(huán)血管抑制素的水平。本發(fā)明的另一個(gè)方面是封閉過量?jī)?nèi)源血管抑制素的作用的方法。這可以通過由對(duì)在系統(tǒng)中不合乎需要的血管抑制素特異性的抗體被動(dòng)免疫人或動(dòng)物完成。這種處理在治療異常排卵、月經(jīng)和胎盤形成以及血管發(fā)生中是重要的。這提供了檢查在轉(zhuǎn)移過程中血管抑制素除去的效果的有用工具。血管抑制素抗體的Fab片段包含血管抑制素的結(jié)合位點(diǎn)。該片段使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的技術(shù)從血管抑制素抗體分離。血管抑制素抗血清的Fab片段可用作抗原以產(chǎn)生抗Fab片段血清?？寡芤种扑氐腇ab片段的抗血清的注入阻止了血管抑制素和血管抑制素抗體的結(jié)合。治療作用可通過中和內(nèi)源抗血管抑制素抗體以封閉血管抑制素和抗血管抑制素Fab片段的結(jié)合獲得。這種治療的凈作用有利于內(nèi)源循環(huán)的血管抑制素到達(dá)靶細(xì)胞，進(jìn)而減少轉(zhuǎn)移的擴(kuò)散?？梢岳斫獗景l(fā)明包括任何具有內(nèi)皮細(xì)胞抑制活性的血管抑制素衍生物。本發(fā)明包括整個(gè)血管抑制素蛋白質(zhì)、血管抑制素蛋白質(zhì)衍生物和血管抑制素蛋白質(zhì)的生物學(xué)活性片段。它們包括具有血管抑制素活性的蛋白質(zhì)，這些蛋白質(zhì)具有氨基酸取代或具有連接到氨基酸功能基團(tuán)上的糖或其它分子。本發(fā)明也包括編碼血管抑制素和血管抑制素受體的基因，以及這些基因表達(dá)的蛋白質(zhì)。具有如上所述的血管抑制素活性的蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)片段可以用本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的制劑方法以藥學(xué)上可接受的制劑中的分離的和實(shí)質(zhì)上純化的蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)片段提供。這些制劑可通過標(biāo)準(zhǔn)的路線施用。通常，該組合物可通過局部、經(jīng)眼、腹膜內(nèi)、顱內(nèi)、大腦內(nèi)室、大腦內(nèi)、陰道內(nèi)、子宮內(nèi)、口服、直腸或腸胃外(例如，靜脈內(nèi)、脊柱內(nèi)、皮下或肌內(nèi)路線)施用。此外，血管抑制素可摻入使得可以進(jìn)行化合物持久釋放的生物可降解的聚合物，把聚合物移植在需要用藥處附近(例如，施用到腫瘤或移植的位點(diǎn))以使血管抑制素緩慢地釋放到全身。微滲透泵也可用于通過套管向興趣位點(diǎn)提供高濃度的血管抑制素的有控制的施用，如直接施用進(jìn)轉(zhuǎn)移生長(zhǎng)位點(diǎn)或施用進(jìn)供應(yīng)腫瘤的血管。生物可降解的聚合物及其用途在，例如，Brem等，J.Neurosurg.74441-446(1991)中有詳盡描述，本文一并參考了其全部?jī)?nèi)容。本發(fā)明的血管抑制素的劑量取決于所治療的疾病狀態(tài)或病癥以及其它臨床因素，如人或動(dòng)物的體重和病癥以及化合物的施用路線。對(duì)于治療人或動(dòng)物，可以施用約0.5mg/kg至500mg/kg之間的血管抑制素。取決于血管抑制素在特定的動(dòng)物或人中的半衰期，血管抑制素可以每天施用幾次到每周一次。可以理解本發(fā)明包括人和獸醫(yī)兩種用途的應(yīng)用。在可以在同時(shí)或延長(zhǎng)的時(shí)間內(nèi)施用的情況下，本發(fā)明的方法包括單次以及多次施用。血管抑制素制劑包括適合于口服、直腸、經(jīng)眼(包括玻璃體內(nèi)或眼室內(nèi)(intracameral))、鼻、局部(包括頰內(nèi)和舌下)、子宮內(nèi)、陰道或腸胃外(包括皮下、腹膜內(nèi)、肌內(nèi)、靜脈內(nèi)、真皮內(nèi)、顱內(nèi)、氣管內(nèi)、硬膜外施用的制劑。血管抑制素制劑可方便地以單位劑量形式存在并可方便地通過常規(guī)的藥學(xué)技術(shù)制備。這樣的技術(shù)包括使活性成分和藥學(xué)上的載體或賦形劑結(jié)合的步驟。通常，制劑通過使活性成分和液態(tài)載體或精細(xì)分裂的固體載體或上述兩者一致地和緊密地結(jié)合，然后(如果必要)使產(chǎn)物成形來制備。適于腸胃外施用的制劑包括含水的和不含水的無菌注射液，該溶液中包含抗氧化劑、緩沖液、抑菌劑、使制劑等滲的溶質(zhì)以及預(yù)期的接收者的血液；含水的和不含水的無菌懸浮液，該懸浮液包括懸浮劑和增稠劑。制劑可以以單劑量或多劑量容器存在(例如，密封的安瓿和藥水瓶)并在使用之前可保存在僅需要添加無菌液態(tài)載體(例如，注射用水)的凍干的條件下。臨時(shí)注射溶液和懸浮液可以從上述的無菌粉劑、粒劑和片劑中制備。優(yōu)選的單位劑量制劑是包含施用的成分的一日劑量或單位、每日亞劑量或其適當(dāng)?shù)慕M分的制劑?？梢岳斫獬煞?具體地說是上述的)之外，本發(fā)明的制劑可包括其它相對(duì)于所說的制劑類型的本領(lǐng)域常規(guī)的藥劑。細(xì)胞毒素劑可以可有可無地?fù)饺牖蛞云渌绞脚c血管抑制素蛋白質(zhì)或其生物學(xué)功能的蛋白質(zhì)片段結(jié)合以對(duì)患者提供雙重療法。本發(fā)明的血管生成抑制蛋白質(zhì)可以按照標(biāo)準(zhǔn)的微量化學(xué)設(shè)備合成并以HPLC和質(zhì)譜檢查純度。蛋白質(zhì)合成、HPLC純化以及質(zhì)譜法是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的。血管抑制素蛋白質(zhì)和血管抑制素受體蛋白質(zhì)也在重組大腸桿菌或酵母表達(dá)系統(tǒng)中產(chǎn)生，并以柱色譜純化?？梢院铣赏暾难芤种扑胤肿拥牟煌牡鞍踪|(zhì)片段以用于幾種應(yīng)用，這些應(yīng)用包括但不限于下列方面；作為抗原用于開發(fā)特異性的抗血清，作為在血管抑制素結(jié)合位點(diǎn)有活性的激動(dòng)劑和拮抗劑，作為蛋白質(zhì)連接到細(xì)胞毒素劑或與其結(jié)合使用以用于定向殺滅和血管抑制素結(jié)合的細(xì)胞。包含這些蛋白質(zhì)的氨基酸序列基于其在分子的外部區(qū)域的位置的基礎(chǔ)上選擇并可用于和抗血清結(jié)合。血管抑制素的氨基與羧基端以及分子的中間區(qū)域在合成的片段中分開存在。使用蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫(kù)(如GenBank，Brookhaven蛋白質(zhì)，SWISS-PROT和PIR)使這些蛋白質(zhì)序列與已知序列比較以確定潛在的序列同源性。該信息有利于除去和其它分子表現(xiàn)出高度序列同源性的序列，進(jìn)而增強(qiáng)在開發(fā)抗血管抑制素的抗血清、激動(dòng)劑和拮抗劑中高度特異性的潛力。血管抑制素和源于蛋白質(zhì)的血管抑制素可以使用標(biāo)準(zhǔn)方法和其它分子偶聯(lián)。血管抑制素的氨基與羧基端都包含酪氨酸和賴氨酸殘基，并可使用許多技術(shù)進(jìn)行同位素和非同位素標(biāo)記，例如使用常規(guī)技術(shù)放射性標(biāo)記(酪氨酸殘基-氯胺T，碘，乳過氧化物酶；賴氨酸殘基-Bolton-Hunter試劑)。這些偶聯(lián)技術(shù)是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的。另外，把酪氨酸或賴氨酸添加到不具有這些殘基的片段上以促進(jìn)蛋白質(zhì)上的反應(yīng)的氨基和羥基基團(tuán)的標(biāo)記。偶聯(lián)技術(shù)基于氨基酸上可供使用的功能基團(tuán)的基礎(chǔ)上選擇，這些基團(tuán)包括但不限于氨基、巰基、羧基、酰胺基、酚基和咪唑基。實(shí)施這些偶聯(lián)所使用的各種試劑包括戊二醛、重氮化的聯(lián)苯胺、碳化二亞胺和p-苯醌。使血管抑制素蛋白質(zhì)和各種應(yīng)用的同位素、酶、載體蛋白質(zhì)、細(xì)胞毒素劑、熒光素分子、化學(xué)發(fā)光劑、生物發(fā)光劑和其它化合物化學(xué)偶聯(lián)。使用適于特異性反應(yīng)的不同技術(shù)測(cè)定了偶聯(lián)反應(yīng)的效率。例如，血管抑制素蛋白質(zhì)的用125I放射性標(biāo)記使用高比活性的氯胺T和Na125I完成。反應(yīng)以焦亞硫酸鈉終止，混合物在可任意使用的柱上脫鹽。從柱中洗脫標(biāo)記的蛋白質(zhì)并收集片段。從每種片段中取出等分試樣并以γ計(jì)數(shù)器測(cè)定放射性。以這種方式，從標(biāo)記的血管抑制素蛋白質(zhì)分離未反應(yīng)的Na125I。把具有最高的特定放射性的蛋白質(zhì)片段保存待用，如分析結(jié)合血管抑制素抗血清的能力。蛋白質(zhì)綴合的另一個(gè)應(yīng)用是產(chǎn)生多克隆抗血清。例如，包含賴氨酸殘基的血管抑制素蛋白質(zhì)可使用戊二醛和純化的牛血清蛋白連接。反應(yīng)的效率通過測(cè)定放射性標(biāo)記的蛋白質(zhì)的摻入來測(cè)定。未反應(yīng)的戊二醛和蛋白質(zhì)通過透析分離。綴合物保存待用?？梢援a(chǎn)生抗血管抑制素、血管抑制素同系物和血管抑制素蛋白質(zhì)片段以及血管抑制素受體的抗血清。在蛋白質(zhì)合成和純化后，單克隆和多克隆抗血清使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的已建立的技術(shù)產(chǎn)生。例如，多克隆抗血清可在兔、羊、山羊以及其它動(dòng)物中產(chǎn)生。把和載體分子綴合的血管抑制素蛋白質(zhì)(如牛血清蛋白或血管抑制素自身)與佐劑混合物結(jié)合、乳化并在背部、頸項(xiàng)、脅腹、有時(shí)在足墊進(jìn)行多位點(diǎn)皮下注射。促進(jìn)劑注射以有規(guī)則的間隔(如每2至4周)進(jìn)行。血液樣品在每次注射后約7至10天使用擴(kuò)張后的邊際耳靜脈通過靜脈穿刺獲得。使血液樣品在4℃下凝結(jié)過夜，在4℃時(shí)于約2400×g下離心約30分鐘。取下血清，等分試樣，立即使用時(shí)在4℃下保存，用于隨后分析時(shí)在-20至-90℃保存。分析產(chǎn)生多克隆抗血清的所有血清樣品或產(chǎn)生單克隆抗血清的培養(yǎng)基樣品用于抗體滴度的測(cè)定。滴度通過多次平均值建立，例如，使用點(diǎn)印跡和密度分析，也使用蛋白質(zhì)A、次級(jí)抗血清、冷乙醇或炭-葡聚糖用放射性標(biāo)記的蛋白質(zhì)-抗體復(fù)合物的沉淀，其后用γ計(jì)數(shù)器測(cè)定活性進(jìn)行。在商業(yè)上可得到的親和柱上純化最高的滴度抗血清。血管抑制素蛋白質(zhì)和親和柱上的凝膠偶聯(lián)?？寡鍢悠吠ㄟ^柱，抗血管抑制素抗體和柱結(jié)合。隨后洗脫這些抗體，收集并評(píng)價(jià)其滴度和特異性測(cè)定。試驗(yàn)最高滴度的血管抑制素抗血清確定；a)抗原最高特異性結(jié)合和最低的非特異性結(jié)合的最優(yōu)抗血清稀釋倍數(shù)，b)在標(biāo)準(zhǔn)的置換曲線中結(jié)合增加的量的血管抑制素蛋白質(zhì)的能力，c)和有關(guān)的蛋白質(zhì)以及包括纖溶酶原和有關(guān)物種的血管抑制素的蛋白質(zhì)交叉反應(yīng)的潛力，d)用于檢測(cè)在血漿、尿液、組織提取物和細(xì)胞培養(yǎng)基中的血管抑制素蛋白質(zhì)的能力。測(cè)定血管抑制素和血管抑制素受體的試劑盒也是本發(fā)明的一部分。本發(fā)明也檢查了具有最高滴度和特異性的并可檢測(cè)在血漿、尿液、組織提取物和細(xì)胞培養(yǎng)基中的血管抑制素蛋白質(zhì)的抗血清以建立易于使用的血管抑制素的快速、可靠、靈敏和特異性的測(cè)定和定位方法。這些測(cè)定試劑盒包括但不限于下列技術(shù)競(jìng)爭(zhēng)性和非競(jìng)爭(zhēng)性測(cè)定、放射免疫測(cè)定、生物發(fā)光和化學(xué)發(fā)光測(cè)定、熒光測(cè)定、三明治形(sandwich)測(cè)定、免疫放射測(cè)定、點(diǎn)印跡、酶聯(lián)測(cè)定(包括ELISA、微滴定板、抗體包被的帶或用于尿液和血液檢測(cè)的量油計(jì))以及免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)。對(duì)于每種試劑盒，確定了測(cè)定的范圍、靈敏度、精度、可靠性、特異性和再現(xiàn)性。在置換或活性的標(biāo)準(zhǔn)曲線的20％、50％和80％點(diǎn)上建立了測(cè)定間和測(cè)定內(nèi)的變化。通常用于研究和臨床的測(cè)定試劑盒的一個(gè)例子是放射免疫測(cè)定(RIA)試劑盒。血管抑制素RIA說明如下。在對(duì)血管抑制素或血管抑制素蛋白質(zhì)成功地放射性碘化和純化后，具有最高滴度的抗血清以幾種稀釋液添加至包含在適合的緩沖液系統(tǒng)中的相對(duì)恒定量的放射性(如10,000cpm)的試管中。其它試管包含測(cè)定非特異性結(jié)合的緩沖液或預(yù)免疫血清。在4℃下溫育24小時(shí)后，添加蛋白質(zhì)A并使試管渦流、在室溫下溫育約90分鐘并于4℃下在約2000-2500×g離心以沉淀和標(biāo)記的抗原結(jié)合的抗體復(fù)合物。通過抽吸取出上清液并在γ計(jì)數(shù)器上計(jì)算沉淀中的放射性。在減去非特異性結(jié)合后，進(jìn)一步確定了結(jié)合約10至40％標(biāo)記的蛋白質(zhì)的抗血清稀釋液的特征。接著，通過向包含放射性標(biāo)記的蛋白質(zhì)和抗血清的試管添加已知量的蛋白質(zhì)以評(píng)價(jià)用于開發(fā)抗血清的血管抑制素蛋白質(zhì)的稀釋范圍(約0.1pg至10ng)。在再次的溫育期(例如，24至48小時(shí))后，添加蛋白質(zhì)A并使試管離心，取出上清液并計(jì)算沉淀中的放射性。通過未標(biāo)記的血管抑制素蛋白質(zhì)(標(biāo)準(zhǔn)的)置換放射性標(biāo)記的血管抑制素蛋白質(zhì)提供標(biāo)準(zhǔn)曲線。把得自不同物種的幾種其它血管抑制素蛋白質(zhì)片段、纖溶酶原、血管抑制素和同源蛋白質(zhì)的濃度添加到測(cè)定試管中并確定血管抑制素抗血清的特異性。使用成功地用于提取血管抑制素的提取技術(shù)制備不同組織的提取物(包括但不限于原發(fā)性和繼發(fā)性瘤、Lewis肺癌，產(chǎn)生血管抑制素的細(xì)胞的培養(yǎng)物、胎盤、子宮以及其它組織(如腦、肝臟和腸))。在組織提取物的凍干或SpeedVac后，添加測(cè)定緩沖液，把不同的等分試樣置于RIA試管中。已知的產(chǎn)生血管抑制素的細(xì)胞的提取物產(chǎn)生了與標(biāo)準(zhǔn)曲線平行的置換曲線，但是不產(chǎn)生血管抑制素的組織提取物不從血管抑制素抗血清置換放射性標(biāo)記的血管抑制素。此外，把得自患Lewis肺癌的動(dòng)物的尿液、血漿和腦液的提取物以增加的量添加到測(cè)定試管中。平行的置換曲線表明利用了血管抑制素測(cè)定來測(cè)定組織和體液中的血管抑制素。包含血管抑制素的組織提取物另外通過使等分試樣進(jìn)行反相HPLC確定其特征。收集洗脫的片段，在SpeedVac中干燥，在RIA緩沖液中重構(gòu)并在血管抑制素RIA中分析。血管抑制素免疫反應(yīng)性的最大量位于與血管抑制素的洗脫位置相應(yīng)的組分上。測(cè)定試劑盒提供說明書、抗血清、血管抑制素或血管抑制素蛋白質(zhì)以及可能的用于沉淀結(jié)合的血管抑制素-血管抑制素抗體復(fù)合物的放射性標(biāo)記的血管抑制素和/或試劑。試劑盒可用于測(cè)定有或無腫瘤的動(dòng)物和人中的生物體液和組織提取物中的血管抑制素。另一種試劑盒用于組織和細(xì)胞中的血管抑制素的定位。這種血管抑制素免疫組織化學(xué)試劑盒提供說明書、血管抑制素抗血清以及可能的與熒光素分子(如異硫氰酸熒光素)或某些用于使初級(jí)抗血清可視化的其它試劑連接的封閉血清和次級(jí)抗血清。免疫組織化學(xué)技術(shù)對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是熟知的。這種血管抑制素免疫組織化學(xué)試劑盒使得可以使用光學(xué)和電子顯微鏡方法在組織切片和培養(yǎng)細(xì)胞中定位血管抑制素。它用于研究和臨床目的。例如，對(duì)腫瘤進(jìn)行活組織檢查或收集腫瘤，用薄切片機(jī)對(duì)組織進(jìn)行切片以檢查血管抑制素產(chǎn)生的位點(diǎn)。這樣的信息對(duì)于癌的檢測(cè)和治療中的診斷和可能的治療目的是有用的。使血管抑制素生物合成位點(diǎn)可視化的另一種方法在原位雜交中放射性標(biāo)記核酸以探查血管抑制素信使RNA。同樣地，可以使用免疫組織化學(xué)技術(shù)定位、可視化并定量測(cè)定血管抑制素受體。本發(fā)明進(jìn)一步通過下列實(shí)施例說明，這些實(shí)施例無論如何都不能解釋為是對(duì)本發(fā)明的范圍的限制。相反，它可以清楚地理解為在不背離本發(fā)明的精神和/或所附的權(quán)利要求的范圍的情況下，可以將實(shí)施方法用于各種其它實(shí)施方案、修飾的和其等價(jià)的方案中，在閱讀了本文的說明書后，上述這些方法本身可以向本領(lǐng)域技術(shù)人員提出建議。實(shí)施例1選擇其中原發(fā)性瘤抑制轉(zhuǎn)移生長(zhǎng)并在除去原發(fā)性瘤后加速轉(zhuǎn)移生長(zhǎng)的動(dòng)物-腫瘤系統(tǒng)。通過篩選能夠抑制其自身轉(zhuǎn)移的各種鼠腫瘤，選擇其中原發(fā)性瘤最有效地抑制肺臟轉(zhuǎn)移的Lewis肺癌。用1×106個(gè)腫瘤細(xì)胞注射(皮下背)SyngeneicC57BI6/J六周齡的雄性小鼠。在3-4天后首先出現(xiàn)可以觀察到的腫瘤。當(dāng)腫瘤約1500mm3大小時(shí)，把小鼠隨機(jī)化成兩組。完全除去第一組中的原發(fā)性瘤，第二組在一次假(sham)操作后保持完整。雖然從500mm3至3000mm3的腫瘤抑制轉(zhuǎn)移的生長(zhǎng)，但1500mm3是可安全地以高的存活率切除而且無局部復(fù)發(fā)的最大原發(fā)性瘤。在21天后，處死所有小鼠并作尸體解剖。與除去腫瘤的小鼠的五十+5個(gè)轉(zhuǎn)移相比，在具有完整的原發(fā)性瘤的小鼠中，有四+2個(gè)可以觀察到的轉(zhuǎn)移(p＜0.0001)。這些數(shù)據(jù)可通過肺臟重量確證，如上述證明，肺臟重量和腫瘤負(fù)載密切相關(guān)。與腫瘤保持完整的小鼠相比，在除去腫瘤的小鼠中肺臟質(zhì)量增加了400％。這個(gè)試驗(yàn)?zāi)Ｐ徒o出了可重復(fù)的數(shù)據(jù)，所描述的實(shí)驗(yàn)具有可重復(fù)性。該腫瘤標(biāo)記為L(zhǎng)ewis肺癌-低轉(zhuǎn)移性(LLC-低)。腫瘤也抑制在SCID小鼠中幾乎同一方式的轉(zhuǎn)移，這在B和T淋巴細(xì)胞中是缺陷的。實(shí)施例2在原發(fā)性瘤除去或不除去時(shí)高度轉(zhuǎn)移性Lewis肺癌腫瘤變體的分離。從一組小鼠中的實(shí)施例1的LLC-低細(xì)胞系自發(fā)產(chǎn)生Lewis肺癌的高轉(zhuǎn)移性變體，按照實(shí)施例1所述的方法分離并重復(fù)移植。該腫瘤(LLC-高)形成了超過30個(gè)可以觀察到的肺臟轉(zhuǎn)移(不論原發(fā)性瘤是否存在)。實(shí)施例3腫瘤細(xì)胞在其內(nèi)轉(zhuǎn)移和增殖速率的大小。抑制轉(zhuǎn)移的原發(fā)性瘤(LLC-低)的作用。在所有的試驗(yàn)中都使用C57BI6/J小鼠。使用LLC-低細(xì)胞對(duì)小鼠皮下接種，14天后，除去一半小鼠中的原發(fā)性瘤。在除去腫瘤后的5、10和15天時(shí)，處死小鼠。獲得肺臟轉(zhuǎn)移的組織學(xué)切片。具有完整的原發(fā)性瘤的小鼠在沒有新血管形成的肺臟中有微轉(zhuǎn)移。這些轉(zhuǎn)移限制在12-15個(gè)細(xì)胞層的直徑內(nèi)，即使在腫瘤除去15天后也沒有顯示出大小明顯的增加。相對(duì)地，除去原發(fā)性瘤的動(dòng)物早在上述后5天就表現(xiàn)出大的血管形成的轉(zhuǎn)移。在除去腫瘤后15天時(shí)，這些轉(zhuǎn)移在體積上又經(jīng)歷了4-倍的增加(通過肺臟重量和組織學(xué)反映)。除去原發(fā)性瘤的動(dòng)物中有約50％在實(shí)驗(yàn)結(jié)束前死于肺臟轉(zhuǎn)移。具有完整的原發(fā)性瘤的所有動(dòng)物在實(shí)驗(yàn)結(jié)束前均存活。通過計(jì)算以先前注射進(jìn)小鼠的BrdU染色的核確定在轉(zhuǎn)移內(nèi)的腫瘤細(xì)胞的復(fù)制速率。在具有完整的原發(fā)性瘤的動(dòng)物中小的、無血管的轉(zhuǎn)移中摻入BrdU的腫瘤細(xì)胞的高百分比相當(dāng)于除去原發(fā)性瘤的小鼠中大的、血管形成的轉(zhuǎn)移中的腫瘤細(xì)胞的BrdU摻入(圖3)。這一發(fā)現(xiàn)表明原發(fā)性瘤的存在對(duì)在轉(zhuǎn)移內(nèi)的腫瘤細(xì)胞的復(fù)制速率沒有直接作用。在圖3中，左面的圖顯示了在原發(fā)性瘤存在或不存在的肺臟中的腫瘤細(xì)胞的BrdU標(biāo)記指數(shù)。在免疫組織化學(xué)染色前，切片用0.2MTris-HCl浸透10分鐘并以在0.2MTris-HCl、2mMCaCl2中的1μg/ml蛋白酶K(BoehringerMannheimGmbH，Mannheim，德國(guó))于37℃下消化10分鐘。通過在250倍下計(jì)數(shù)陽(yáng)性核的百分比來估計(jì)標(biāo)記指數(shù)。圖3的右圖描述了手術(shù)后原發(fā)性瘤完整或除去5、10和15天時(shí)的腫瘤的總肺臟重量的分析。在腹膜內(nèi)注射BrdU(0.75mg/小鼠)6小時(shí)后處死動(dòng)物。實(shí)施例4在完整的原發(fā)性瘤存在下肺臟轉(zhuǎn)移中的血管生成的抑制。為了測(cè)定在肺臟轉(zhuǎn)移中血管生成的程度，用抗vonWillebrand因子的抗體(內(nèi)皮細(xì)胞特異性的標(biāo)記物，可從Dako公司，Carpenteria，CA得到)對(duì)組織染色。在現(xiàn)存的肺部血管周圍，具有完整的腫瘤的動(dòng)物的轉(zhuǎn)移形成了薄袖口狀物(cuff)(8-12層腫瘤細(xì)胞)。除了血管內(nèi)層的內(nèi)皮細(xì)胞外，沒有或極少有細(xì)胞對(duì)vonWillebrand因子是陽(yáng)性的。相對(duì)地，除去原發(fā)性瘤5天后的動(dòng)物的肺臟轉(zhuǎn)移不僅更大，而且也潛入了包含被vonWillebrand因子強(qiáng)烈染色的內(nèi)皮細(xì)胞的毛細(xì)血管芽(sprouts)。在肺臟轉(zhuǎn)移中內(nèi)皮細(xì)胞存在的免疫組織化學(xué)分析中，在接種19天后的初始肺臟腫瘤保持完整的肺臟轉(zhuǎn)移在肺臟中先前存在的微血管周圍具有袖口狀的腫瘤細(xì)胞。轉(zhuǎn)移限制在8至12層細(xì)胞內(nèi)。在微血管周圍沒有新血管形成的證明，而且它不包含任何新的微血管。這是最大的無血管的前血管生成的轉(zhuǎn)移的典型。在切除原發(fā)性瘤五天后(接種原發(fā)性瘤19天后)收集的組織的免疫組織化學(xué)分析中，在肺臟轉(zhuǎn)移圍繞在先前形成的血管的周圍。相對(duì)地，在沒有切除原發(fā)性瘤的樣品中，腫瘤是新血管化的。這樣，完整的原發(fā)性瘤抑制轉(zhuǎn)移中的新的毛細(xì)血管的形成，但在轉(zhuǎn)移內(nèi)的腫瘤細(xì)胞的增殖不受原發(fā)性瘤的影響。實(shí)施例5原發(fā)性瘤抑制移植在小鼠角膜中的繼發(fā)性瘤的血管生成。這種繼發(fā)性瘤的生長(zhǎng)被抑制。在第0天把0.25至0.5mm2Lewis肺臟腫瘤(LLC-低)移植在小鼠的角膜中(MuthukkaruppanVr.，等，在小鼠角膜中的血管生成，科學(xué)2051416-1418，1979)。在角膜移植之前4或7天時(shí)、或在角膜移植的當(dāng)天、或在角膜移植后的4或7天時(shí)通過在背部皮下接種1×106個(gè)LLC-低細(xì)胞形成原發(fā)性瘤。對(duì)照小鼠接收角膜移植但無皮下腫瘤。其它的對(duì)照小鼠在角膜移植之前4天在背部接收角膜移植和LLC-高腫瘤細(xì)胞的接種。每日通過狹縫光體視顯微鏡評(píng)價(jià)角膜中角膜腫瘤的生長(zhǎng)(通過目鏡測(cè)微尺測(cè)定)和新毛細(xì)血管從角膜緣的生長(zhǎng)。在不患原發(fā)性皮下腫瘤的對(duì)照小鼠中，大多數(shù)角膜(6/8)在角膜移植6至7天后并持續(xù)到10天開始發(fā)育新血管形成。至第10天時(shí)，血管形成的角膜腫瘤達(dá)到了整個(gè)眼睛的約四分之一的體積。在初始皮下LLC-低腫瘤存在下，如果在角膜移植至少4天或更多天之前放置原發(fā)性瘤，角膜移植不形成血管(表1)。在無新血管形成的情況下，角膜腫瘤在角膜內(nèi)以薄、白、無血管的圓盤緩慢生長(zhǎng)。然而，如果直到角膜移植4天后才移植原發(fā)性瘤，角膜形成血管，3/3角膜腫瘤以和沒有腫瘤的對(duì)照相似的速率生長(zhǎng)。在初始皮下LLC-高腫瘤存在下，大多數(shù)角膜(2/3)在角膜移植7天后并持續(xù)到10天開始新血管形成。至第10天時(shí)，血管形成的角膜腫瘤達(dá)到了整個(gè)眼睛的約四分之一的體積。表1通過原發(fā)性皮下腫瘤抑制角膜中的腫瘤血管生成[除了*(其是LLC-高)外，所有原發(fā)性瘤是LLC-低]。</tables>可以預(yù)期到當(dāng)眼睛腫瘤移植之前7天(即-7)初始LLC-低皮下腫瘤移植時(shí)，有0/10的角膜顯示出新血管形成。然而，兩個(gè)腫瘤(2/10)因?yàn)槠涮?＞3cm3)而壞死。實(shí)施例6通過堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)的繼發(fā)性皮下移植誘導(dǎo)原發(fā)性完整腫瘤的血管生成。雖然在實(shí)施例V和VI中描述的實(shí)驗(yàn)顯示原發(fā)性瘤在繼發(fā)性轉(zhuǎn)移中抑制血管生成，這些研究不能表明原發(fā)性瘤是否(i)直接抑制內(nèi)皮細(xì)胞增殖(或血管生成)，或(ii)間接通過負(fù)調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)移腫瘤細(xì)胞的血管生成活性。要區(qū)分這兩種可能性，通過包含堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)的matrigel的移植誘導(dǎo)皮下血管生成的焦點(diǎn)(Passaniti，A等，使用重建的基膜、肝素和成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子評(píng)價(jià)血管生成和抗血管生成劑的簡(jiǎn)單的定量測(cè)定方法，實(shí)驗(yàn)室研究，67519，1992)。把在肝素存在下包含25或50ng/mlbFGF的Matrigel(基膜蛋白質(zhì)的提取物)皮下注射在正常的和患腫瘤的小鼠(LLC-低)的腹側(cè)表面。4天后處死小鼠，測(cè)定在凝膠中的血紅蛋白濃度以量化血管形成。先前曾顯示進(jìn)入matrigel中的新血管的數(shù)量與血紅蛋白濃度相關(guān)(FolkmanJ.，血管生成及其抑制劑，在1985腫瘤學(xué)的重要進(jìn)展，VTDeVita，S.Hellman和S.Rosenberg，編輯，J.B.Lippincott，費(fèi)城1985)。也制備了某些凝膠用于組織學(xué)檢查。在正常小鼠中，包含50ng/mlbFGF的matrigel沉淀完全是紅的。它們受到新的毛細(xì)血管的嚴(yán)重侵入并包含2.4g/dl血紅蛋白。無bFGF的Matrigel是半透明灰色的并僅包含0.4g/DL的血紅蛋白(6倍的差別)。相對(duì)地，具有原發(fā)性瘤的小鼠的matrigel僅包含0.5g/DL(圖4)。在該實(shí)驗(yàn)中的血管生成的幾乎完全抑制表明Lewis肺臟原發(fā)性瘤的存在可直接抑制bFGF-誘導(dǎo)的血管生成。實(shí)施例7把患腫瘤的動(dòng)物的血清轉(zhuǎn)移到除去原發(fā)性瘤的動(dòng)物中抑制了轉(zhuǎn)移。如上所述把Lewis肺癌移植到小鼠中。在15天后，當(dāng)腫瘤約為1500mm3時(shí)，把小鼠隨機(jī)分成四組。三組進(jìn)行原發(fā)性瘤的完全手術(shù)切除；在一組中留下腫瘤(在假手術(shù)過程后)。然后在三個(gè)切除組的小鼠每日接收腹膜內(nèi)注射鹽水、正常的無腫瘤小鼠的血清或具有1500mm3Lewis肺癌小鼠的血清。腫瘤保持完整的小鼠組接收腹膜內(nèi)注射鹽水。所有小鼠處理21天，然后處死動(dòng)物并計(jì)算肺臟轉(zhuǎn)移(表2)。表2這些結(jié)果可通過肺臟重量確證。兩組之間的差異為p＝＜0.0001[(55&amp;50)相對(duì)于(7&amp;3)]。使用得自患腫瘤的動(dòng)物的尿液中的血管抑制素獲得了類似的結(jié)果。實(shí)施例8牛毛細(xì)血管內(nèi)皮(BCE)細(xì)胞測(cè)定僅使用第9和14代的BCE細(xì)胞。在第0天，把BCE細(xì)胞以12,500個(gè)細(xì)胞/孔的濃度平板接種于凝膠化的(在37℃下PBS中的1.5％明膠，在10％CO2中保持24小時(shí)，然后以0.5mlPBS漂洗)24孔平板上。使用血細(xì)胞計(jì)數(shù)器進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。把細(xì)胞平板接種于含10％熱滅活的(56℃下20分鐘)小牛血清和1％谷氨酰胺-pen-strep(GPS)的500μlDMEM中。用BCE細(xì)胞引起免疫反應(yīng)如下除去培養(yǎng)基并以250μlDMEM/5％BCS/1％GPS取代。然后把要試驗(yàn)的樣品添加至孔中(量依賴于試驗(yàn)的樣品變化而變化)。把平板置于37℃10％CO2中約10分鐘。向每個(gè)孔添加250μl含2ng/mlbFGF的DMEM/5％BCS/1％GPS中。最終的培養(yǎng)基是500μl含有1ng/mlbFGF的DMEM/5％BCS/1％GPS。把平板放回37℃/10％CO2的恒溫箱中保持72小時(shí)。在第4天，通過除去培養(yǎng)基并在其后使所有孔受胰蛋白酶作用(0.5ml胰蛋白酶/EDTA)2至3分鐘對(duì)細(xì)胞計(jì)數(shù)。然后把懸浮的細(xì)胞轉(zhuǎn)移到含9.5mlHemetall的閃爍小瓶中并使用Coulter計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)。一個(gè)活性單位是指當(dāng)內(nèi)皮細(xì)胞在bFGF1ng/ml中培養(yǎng)72小時(shí)時(shí)能產(chǎn)生毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖的最大抑制的一半的包含血管抑制素的血清的量。實(shí)施例9得自患低轉(zhuǎn)移性Lewis肺臟腫瘤(LLC-低)的小鼠的血清在體外抑制毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖。在72-小時(shí)增殖測(cè)定中通過堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF1ng/ml)刺激牛毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞。把患腫瘤的小鼠的血清以劑量依賴性和可逆的方式添加到這些抑制內(nèi)皮細(xì)胞增殖的培養(yǎng)物中。正常的血清無抑制作用(圖5)。通過得自患腫瘤的nu/nu小鼠和SCID小鼠的血清以類似的方式(與對(duì)照相比)抑制內(nèi)皮細(xì)胞增殖。在除去原發(fā)性瘤后，血管抑制素活性從血清中消失3-5天?；寄[瘤的血清也抑制牛主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞和源于自發(fā)的小鼠血管內(nèi)皮瘤的內(nèi)皮細(xì)胞(Obeso等，實(shí)驗(yàn)室研究方法，衍生血管內(nèi)皮瘤的細(xì)胞系；其作為內(nèi)皮細(xì)胞生物學(xué)研究模型的用途，實(shí)驗(yàn)室研究，63(2)，259-269，1990)，但不抑制Lewis肺臟腫瘤細(xì)胞、3T3成纖維細(xì)胞、主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞、貂肺臟上皮細(xì)胞或W138人胎肺臟成纖維細(xì)胞。實(shí)施例10不抑制轉(zhuǎn)移的得自患Lewis肺臟腫瘤(LLC-高)的小鼠的血清在體外不抑制毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖。得自患LLC-高的原發(fā)性瘤的小鼠的血清與對(duì)照相比不明顯地抑制bFGF-刺激的牛毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖。同時(shí)，當(dāng)該血清進(jìn)行前兩步的純化(肝素-瓊脂糖凝膠色譜和凝膠過濾)時(shí)，在任何組分中沒有發(fā)現(xiàn)血管抑制素活性。實(shí)施例11得自Lewis肺癌(低轉(zhuǎn)移性)的腹水也產(chǎn)生血管抑制素血清。小鼠接受腹膜內(nèi)注射LLC-低或LLC-高腫瘤細(xì)胞(106)，一周后，從10-20只小鼠的每只中獲得1-2ml含血的腹水。觀察到了腸系膜的腫瘤子瘤。然后處死小鼠。通過心穿孔獲得血清。同時(shí)從正常的、未患腫瘤的小鼠中獲得血清作為對(duì)照。離心血清和腹水以除去細(xì)胞，在受bFGF(1ng/ml)刺激的牛毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞上測(cè)定上層清液(參見實(shí)施例IX)。源于兩種腫瘤類型的腹水在72小時(shí)后比對(duì)照明顯地刺激了毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖(例如，100％增殖)(圖6)。相對(duì)地，得自低轉(zhuǎn)移小鼠的血清抑制內(nèi)皮細(xì)胞增殖(抑制為對(duì)照的79％)。得自高轉(zhuǎn)移系的血清的刺激為200％。這些數(shù)據(jù)顯示得自低轉(zhuǎn)移系的腹水包含比血管抑制素多的內(nèi)皮生長(zhǎng)刺激劑。這種狀況和實(shí)體原發(fā)性瘤是類似的。而且，在血清中出現(xiàn)了血管抑制素活性，盡管它不是預(yù)期的刺激活性。這種方式和固體原發(fā)性瘤(LLC-低)是類似的。得自高轉(zhuǎn)移腫瘤(LLC-高)的腹水看來也包含較多的內(nèi)皮細(xì)胞刺激劑，但是在血清中不能鑒別到血管抑制素。實(shí)施例12通過柱色譜從血清中分級(jí)分離血管抑制素并通過SDS-PAGE分析生長(zhǎng)抑制組分。為了純化血管抑制素，從患腫瘤的小鼠收集血清。使用肝素-瓊脂糖凝膠，BiogelA0.5mm瓊脂糖以及幾次循環(huán)的C4-反相高效液相色譜(HPLC)依次層析分離按照上述體外抑制劑測(cè)定的抑制活性。包含內(nèi)皮細(xì)胞抑制活性的HPLC組分的SDS-PAGE顯示了38,000道爾頓的明顯減少的Mr的離散的帶，將該帶純化約1百萬倍(參見表3)至約2×107的比活性。在純化的不同階段，用特異性抗體試驗(yàn)收集的組分中已知內(nèi)皮細(xì)胞抑制劑存在。在部分純化的或純化的片段中沒有發(fā)現(xiàn)血小板因子-4、糖蛋白G或轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β。表3比活性(單位*/mg)純化倍數(shù)血清1.691肝素瓊脂糖凝膠14.928.8Bio-gelA0.5m69.9641.4HPLC/C42×1071.2×106*一個(gè)活性單位是指當(dāng)內(nèi)皮細(xì)胞在bFGF1ng/ml中培養(yǎng)72小時(shí)時(shí)能產(chǎn)生毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖的最大抑制的一半時(shí)的包含血管抑制素的血清的量。實(shí)施例13通過柱色譜從尿液中分級(jí)分離血管抑制素并通過SDS-PAGE分析生長(zhǎng)抑制組分。通過可以從小鼠中獲得的少量血清和血清中的大量蛋白質(zhì)阻礙從血清中純化內(nèi)皮細(xì)胞抑制劑。分析得自患腫瘤的小鼠的尿液，發(fā)現(xiàn)它包含內(nèi)皮細(xì)胞增殖的抑制劑，這種抑制劑在沒有腫瘤的小鼠和患LLC-高腫瘤患的小鼠的尿液中不存在。通過和用于純化血清的策略相似的策略(以上所述的)進(jìn)行內(nèi)皮細(xì)胞抑制活性的純化(圖7)。圖7顯示了部分純化的血清或得自患腫瘤的動(dòng)物的尿液的C4反相色譜。所有組分以如實(shí)施例IX所述的72-小時(shí)增殖測(cè)定在含有bFGF的牛毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞上測(cè)定。在組分23于30-35％乙腈洗脫的兩種情況下觀察到了抑制的離散峰。從得自患腫瘤動(dòng)物的血清的三個(gè)循環(huán)的C4反相色譜獲得的抑制組分的SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳顯示了約38,000道爾頓的單一帶。實(shí)施例14循環(huán)血管抑制素的特征確定。按照實(shí)施例9中所描述的方法測(cè)定內(nèi)皮細(xì)胞抑制。在SynchropakHPLCC4柱上分離血管抑制素(Synchrom公司，Lafayette，IN)。抑制劑在30至35％乙腈梯度洗脫。在還原條件(β-巰基乙醇(5％v/v)下的十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)凝膠上，具有活性的蛋白質(zhì)帶在38千道爾頓洗脫。在非還原條件下，具有活性的蛋白質(zhì)在28千道爾頓洗脫。不論從尿液中或血清中分離初始樣品，活性都在類似的點(diǎn)發(fā)現(xiàn)。在任何其它的帶中沒有檢測(cè)到活性。當(dāng)加熱(100℃下10分鐘)或使用胰蛋白酶處理時(shí)，與所說的帶有關(guān)的活性失去。當(dāng)具有活性的帶以水/三氯甲烷混合物(1∶1)提取時(shí)，活性僅在水相中發(fā)現(xiàn)。實(shí)施例15從人纖溶酶純化抑制片段從Sigma化學(xué)公司獲得纖溶酶原賴氨酸結(jié)合位點(diǎn)I。制劑是用彈性蛋白酶消化后的純化的人纖溶酶原。以這種方式獲得的賴氨酸結(jié)合位點(diǎn)I是蛋白質(zhì)群，該蛋白質(zhì)群包含集合形式的纖溶酶A-鏈(kringle1+2+3)中的至少前三個(gè)三環(huán)結(jié)構(gòu)(1至3號(hào))(Sotrmp-Jensen，L.等，化學(xué)纖維蛋白溶解和血栓溶解進(jìn)展，第3卷，191，Davidson，J.F.等，eds.Raven出版社，紐約，1978和Wiman，B.等，生物化學(xué)和生物物理學(xué)報(bào)，579，142(1979))。把纖溶酶原賴氨酸結(jié)合位點(diǎn)I(Sigma化學(xué)公司，St.Louis，MO)重新懸浮在水中并施用到以HPLC-級(jí)水/0.1％TFA平衡的C4-反相柱中。以水/0.1％TFA至乙腈/0.1％TFA的梯度洗脫柱。把組分收集進(jìn)聚丙烯試管中。在增殖測(cè)定中，使每種的等分試樣在speedvac中蒸發(fā)，用水重新懸浮，并施用到BCEs中。使用類似的洗脫梯度重復(fù)該方法兩次以洗脫抑制片段。抑制活性在最后進(jìn)行的C4柱中在30-35％乙腈下洗脫。抑制組分的SDS-PAGE顯示了40、42.5和45kd的明顯減少的分子量的3條離散的帶。在非還原條件下的SDS-PAGE顯示了分子量分別為30、32.5和35kd的三條帶。實(shí)施例16從SDS-PAGE提取抑制活性將得自人纖溶酶原為基礎(chǔ)的純化物的純化的抑制組分通過SDS-PAGE在非還原條件下分離。從凝膠上割下相應(yīng)于在以相同樣品裝載的相鄰泳道上通過銀染色所看見的帶的凝膠區(qū)域，于4℃下在聚丙烯試管中的1ml磷酸緩沖鹽水中溫育凝膠12小時(shí)。取出上清液，對(duì)鹽水透析兩次，每次6小時(shí)(MWCO＝6-8000)，再對(duì)蒸餾水透析兩次，每次6小時(shí)。通過真空離心蒸發(fā)透析液。在72小時(shí)測(cè)定中，把產(chǎn)物重新懸浮在鹽水中并施用于用1ng/ml堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子刺激的牛毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞上。從三條帶的每條提取的蛋白質(zhì)可抑制毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞。實(shí)施例17纖溶酶原片段處理研究把Lewis肺癌移植到小鼠中，當(dāng)腫瘤為1500-2000mm3時(shí)進(jìn)行切除。在手術(shù)當(dāng)天，把小鼠隨機(jī)分成6個(gè)組，每組6只小鼠。小鼠每日接收腹膜內(nèi)注射人纖溶酶原的三次純化的抑制片段、完整的人纖溶酶原、患腫瘤動(dòng)物的尿液、正常小鼠的尿液或鹽水。使用鹽水注射處理僅進(jìn)行假過程的一組患腫瘤的動(dòng)物。在除去原發(fā)性瘤后，使小鼠立即接收作為裝載劑量的24μg(1.2mg/kg/天/小鼠)腹膜內(nèi)注射的抑制纖溶酶原片段。然后使這些小鼠在實(shí)驗(yàn)期間每日接收12μg(0.6mg/kg/天/小鼠)腹膜內(nèi)注射的抑制片段。在腫瘤除去后，使對(duì)照小鼠接收相同劑量的完整纖溶酶原分子。對(duì)于尿液處理，過濾正?；蚧寄[瘤小鼠的尿液，充分透析，凍干，然后懸浮在無菌水中以獲得250倍的濃度。在除去原發(fā)性瘤的當(dāng)天，對(duì)小鼠兩次腹膜內(nèi)注射施用作為裝載劑量的得自患腫瘤小鼠或正常小鼠的0.8ml透析尿濃縮液。然后在實(shí)驗(yàn)過程中使這些小鼠每日腹膜內(nèi)注射接收0.4m1透析并濃縮的尿液。處理持續(xù)13天，此時(shí)處死所有小鼠并作尸體解剖。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖8和9所示。圖8顯示了在13天處理后的表面肺臟轉(zhuǎn)移。表面肺臟轉(zhuǎn)移是指在尸體解剖時(shí)在小鼠肺臟中看到的轉(zhuǎn)移的數(shù)量。使用體視顯微鏡來對(duì)轉(zhuǎn)移進(jìn)行計(jì)數(shù)。圖8顯示了計(jì)數(shù)的表面肺臟轉(zhuǎn)移的平均數(shù)量和平均值的標(biāo)準(zhǔn)誤差。如圖所示，具有原發(fā)性瘤的小鼠組沒有顯示出轉(zhuǎn)移。切除原發(fā)性瘤并用鹽水處理的小鼠組顯示了大量的轉(zhuǎn)移。用源于人的纖溶酶原片段處理的小鼠沒有顯示出轉(zhuǎn)移。用完整的纖溶酶原處理的小鼠顯示出了大量的轉(zhuǎn)移，這表明完整的纖溶酶原分子沒有內(nèi)皮細(xì)胞抑制活性。那些用得自患腫瘤的小鼠的透析并濃縮的尿液處理的小鼠沒有顯示出轉(zhuǎn)移。用得自正常小鼠的濃縮的尿液處理顯示了大量的轉(zhuǎn)移。當(dāng)測(cè)定肺臟重量時(shí)，獲得了類似的結(jié)果(圖9)。實(shí)施例18鼠和人血管抑制素的氨基酸序列在AppliedBiosystem477A型蛋白質(zhì)測(cè)序儀上測(cè)定分離自小鼠尿液的血管抑制素和分離自人賴氨酸結(jié)合位點(diǎn)I片段制劑的血管抑制素的氨基酸序列。用聯(lián)機(jī)ABI120A型HPLC鑒別苯基硫代乙內(nèi)酰脲氨基酸片段。從N-末端序列測(cè)定的氨基酸序列與鼠和人血管抑制素的胰蛋白酶消化表明血管抑制素序列類似于鼠纖溶酶原第98個(gè)氨基酸開始的序列。這樣，血管抑制素的氨基酸序列是這樣的分子，該分子通過還原聚丙烯酰胺凝膠電泳測(cè)定具有約45至65千道爾頓的分子量并具有與從完整的鼠纖溶酶原分子的第98個(gè)氨基酸開始的鼠纖溶酶原片段的序列實(shí)質(zhì)上類似的氨基酸序列。鼠血管抑制素的開始氨基酸序列(SEQIDNO2)如圖1所示。該氨基酸序列的長(zhǎng)度可以比圖1所示的序列稍長(zhǎng)或稍短。人賴氨酸結(jié)合位點(diǎn)I(參見實(shí)施例15)的活性片段的N末端氨基酸和胰蛋白酶消化顯示該片段的序列在人血管抑制素的約第97或99個(gè)氨基酸開始，人纖溶酶原和鼠血管抑制素是同源的。人血管抑制素的開始氨基酸序列(在氨基酸98開始)如圖2(SEQIDNO3)所示。在圖2中，比較了鼠和人血管抑制素的氨基酸序列和得自其它物種的纖溶酶原(包括豬、牛和恒河猴纖溶酶原)的相應(yīng)內(nèi)部氨基酸序列。這表明在這些物種中存在血管抑制素。實(shí)施例19人血管抑制素在大腸桿菌中的表達(dá)。使用pTrcHisA載體(Invltrogen)(圖10)獲得高水平的、可調(diào)節(jié)的從用于在大腸桿菌中增強(qiáng)真核基因翻譯效率的trc啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄。使用金屬親和性樹脂把血管抑制素融合到用于一步純化的N-末端鎳-結(jié)合聚組氨酸尾部表達(dá)。在融合蛋白中的腸激酶裂解識(shí)別位點(diǎn)使得可以在隨后從純化的重組蛋白質(zhì)除去N-末端組氨酸融合蛋白。發(fā)現(xiàn)重組人血管抑制素蛋白質(zhì)結(jié)合賴氨酸；和對(duì)kringle1、2和3區(qū)的單克隆抗體特異性有交叉反應(yīng)并在體外抑制bFGF-驅(qū)動(dòng)的內(nèi)皮細(xì)胞增殖。要構(gòu)建插入序列，從使用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)和特異性引物逆轉(zhuǎn)錄和擴(kuò)增的人肝臟mRNA獲得了編碼人血管抑制素的基因片段。1131個(gè)堿基對(duì)的產(chǎn)物編碼人纖溶酶原的93至470氨基酸。把擴(kuò)增的片段克隆進(jìn)pTrcHisA的XhoI/KpnI位點(diǎn)，并把產(chǎn)生的構(gòu)建體轉(zhuǎn)化進(jìn)XL-1B(可從Stratagene得到)大腸桿菌宿主細(xì)胞。把僅包含質(zhì)粒載體pTrcHisA的對(duì)照克隆也轉(zhuǎn)化進(jìn)XL-1B大腸桿菌宿主細(xì)胞。該克隆作為載體對(duì)照克隆。兩種克隆用如下所述的相同的方法純化。以下列方式選擇表達(dá)菌落。用編碼血管抑制素的基因轉(zhuǎn)化的菌落轉(zhuǎn)移在IPTG飽和的硝酸纖維素濾膜上生長(zhǎng)并在LB瓊脂平板上覆蓋。在IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后，將菌落在硝酸纖維素濾膜上溶解。封閉硝酸纖維素轉(zhuǎn)移、漂洗并以兩種分離的單克隆抗體(mAbsDcd和Vap；S.G.McCance和F.J.Castellino所贈(zèng)，NotreDame大學(xué))探查，該單克隆抗體識(shí)別血管抑制素的特異性構(gòu)象。選擇了mAbs識(shí)別的強(qiáng)烈表達(dá)的菌落。要鑒別最大表達(dá)的最優(yōu)時(shí)間，在IPTG誘導(dǎo)前和后的不同時(shí)間收集細(xì)胞并進(jìn)行重復(fù)凍結(jié)-解凍循環(huán)，然后用SDS-PAGE分析，以mAbsDcd和Vap進(jìn)行免疫印跡與探查。從這些細(xì)胞中選擇克隆pTrcHisA/HAsH4。以IPTG誘導(dǎo)4小時(shí)，其后收集細(xì)胞沉淀并重新懸浮在50mMTrispH8.0、2mMEDTA、5％甘油和200mg/ml溶菌酶中并在4℃下攪拌30分鐘。使?jié){狀物在14,000rpm下離心25分鐘。把沉淀重新懸浮在50mMTrispH8.O、2mMEDTA、5％甘油和0.1％DOC中。在4℃下攪拌懸浮液1小時(shí)，然后在14,000rpm下離心25分鐘。在此步驟的上清液組分包含表達(dá)的血管抑制素。發(fā)現(xiàn)大腸桿菌表達(dá)的人血管抑制素具有天然血管抑制素的物理性質(zhì)，即結(jié)合賴氨酸的能力。這樣大腸桿菌表達(dá)的血管抑制素以單一步驟在賴氨酸-瓊脂糖凝膠(Pharmacia或Sigma)柱中純化。用0.2Mε-氨基-n-己酸pH7.5從柱中洗脫血管抑制素。在這些實(shí)驗(yàn)后，進(jìn)行了克隆pTrcHisA/HAsH4的放大的10L發(fā)酵。沉淀從放大誘導(dǎo)中獲得的細(xì)胞并重新懸浮在50mMTrispH7.5中，在過程中于10℃冷卻下在10,000psi時(shí)裂開三次。獲得的裂解物通過4℃下10,000rpm離心30分鐘澄清，表達(dá)的血管抑制素在賴氨酸-瓊脂糖凝膠中分離(圖11)。使純化的大腸桿菌表達(dá)的人血管抑制素對(duì)水充分透析并凍干。把表達(dá)的人血管抑制素重新懸浮在培養(yǎng)基(DMEM，5％BCS，1％慶大霉素/青霉素/鏈霉素)中至3μg/ml的估計(jì)的濃度，在體外用于牛毛細(xì)血管內(nèi)皮(BCE)細(xì)胞測(cè)定(如實(shí)施例8中所述，第39頁(yè))。同樣地，以和克隆pTrcHisA/HAsH4相同的方式處理僅包含載體的對(duì)照克隆。這些克隆以IPTG同等誘導(dǎo)，使用細(xì)菌裂解物結(jié)合賴氨酸，用0.2M氨基己酸洗脫，充分透析并凍干。把這種對(duì)照制劑也以3μg/ml的估計(jì)的濃度重新懸浮在培養(yǎng)基中。從不同的誘導(dǎo)物和發(fā)酵批以及不同的純化步驟中獲得重組血管抑制素和對(duì)照的樣品，并使所有樣品在EntreMed，Maryland編碼。用這些編碼的樣品以隨機(jī)的方式在Children′sHospital，波士頓進(jìn)行BCE測(cè)定。重組人血管抑制素的BCE測(cè)定結(jié)果表明在大腸桿菌中表達(dá)的人血管抑制素抑制了由于bFGF(以1ng/ml使用)的BCE細(xì)胞的增殖(圖12)。在培養(yǎng)基中的重組血管抑制素母液(約3μg/ml)以1∶5、1∶10和1∶20的稀釋液使用。抑制百分率計(jì)算如下BCE細(xì)胞增殖的抑制百分率與相似濃度的源于纖溶酶原的血管抑制素的抑制百分率是可比較的或較高。BCE測(cè)定重復(fù)進(jìn)行的結(jié)果在圖13中描述，在母液的1∶5稀釋倍數(shù)時(shí)，重組血管抑制素產(chǎn)生和源于纖溶酶原的血管抑制素獲得的抑制百分率相似的抑制百分率。圖13顯示了驚人的結(jié)果人重組血管抑制素蛋白質(zhì)抑制超過60％；在培養(yǎng)基中多達(dá)75％以上的BCE增殖。實(shí)施例20血管抑制素以增加編程性細(xì)胞死亡速率保持微轉(zhuǎn)移的休眠。在皮下接種具有Lewis肺癌細(xì)胞(1×106)的C57BL6/J小鼠后，發(fā)育了約1.5cm3的原發(fā)性瘤。使動(dòng)物進(jìn)行原發(fā)性瘤的外科切除或假手術(shù)。在手術(shù)后5、10和15天時(shí)處死小鼠，準(zhǔn)備其肺臟以用于組織學(xué)檢查。切除了原發(fā)性瘤的動(dòng)物與假手術(shù)的對(duì)照相比顯示了微轉(zhuǎn)移的大量增殖(圖14)。這些變化伴隨著肺臟重量的明顯增加。通過攝取溴-脫氧尿苷(BrdU)測(cè)定的腫瘤細(xì)胞增殖的分析和具有完整的原發(fā)性瘤的動(dòng)物或在5、9、13天切除腫瘤的動(dòng)物之間沒有顯示出區(qū)別，這表明在腫瘤質(zhì)量的增加不能通過增加的增殖(圖15)解釋。因此，在這些動(dòng)物中可檢查到細(xì)胞死亡。通過免疫組織化學(xué)標(biāo)記的片段化的DNA用末端脫氧核苷轉(zhuǎn)移酶(TdT)技術(shù)檢查編程性細(xì)胞死亡(依賴于基因表達(dá)變化的細(xì)胞死亡過程，它可解釋在發(fā)育過程中和迅速增殖的組織(如小腸)中細(xì)胞的消除)。在每次處死時(shí)測(cè)定編程性細(xì)胞死亡指數(shù)。除去原發(fā)性瘤在所有檢查中造成編程性細(xì)胞死亡指數(shù)的統(tǒng)計(jì)學(xué)上明顯的增加(約3至4倍)(圖15)。通過用除去的具有血管生成的外源抑制劑的原發(fā)性瘤處理小鼠獲得支持證據(jù)。這種物質(zhì)TNP-1470(O-氯乙酰甲氨酰夫馬霉醇，以前命名為AGM-1470)是具有報(bào)道的抗血管生成活性的夫馬霉素的同系物。TNP-1470的皮下注射(30mg/kg)產(chǎn)生了和以上所述的具有完整的原發(fā)性瘤的動(dòng)物的結(jié)果驚人地類似的結(jié)果。這些動(dòng)物與注射鹽水的對(duì)照相比顯示了更低的肺臟重量，相當(dāng)?shù)脑鲋持笖?shù)和增加的編程性細(xì)胞死亡指數(shù)(圖16)。這些數(shù)據(jù)表明當(dāng)腫瘤細(xì)胞增殖通過相當(dāng)數(shù)量的細(xì)胞死亡平衡時(shí)轉(zhuǎn)移保持休眠。除去原發(fā)性瘤造成轉(zhuǎn)移生長(zhǎng)的迅速增加，這可能是因?yàn)槌チ送ㄟ^增加腫瘤細(xì)胞中的編程性細(xì)胞死亡控制轉(zhuǎn)移生長(zhǎng)的血管生成抑制劑(血管抑制素)。這些作用類似于除去原發(fā)性瘤并施用血管生成的外源抑制劑后所觀察到的作用。這些數(shù)據(jù)共同表明原發(fā)性瘤釋放保持轉(zhuǎn)移休眠的血管抑制素。實(shí)施例21在體內(nèi)用血管抑制素處理原發(fā)性瘤。如以上實(shí)施例15所述通過有限的彈性蛋白酶消化從人纖溶酶原純化血管抑制素。把血管抑制素重新懸浮在磷酸緩沖鹽水中以施用進(jìn)六周齡的雄性C57B/16J小鼠中。以Lewis肺癌或T241纖維肉瘤的1×106腫瘤細(xì)胞對(duì)動(dòng)物皮下移植。在四天后當(dāng)腫瘤為80-160mm3大小時(shí)開始用血管抑制素處理。通過腹膜內(nèi)(ip)或皮下(sc)路線小鼠接受40mg/kg血管抑制素的一次注射或80mg/kg血管抑制素的兩次注射。在處理后延長(zhǎng)至19天的不同時(shí)間處死動(dòng)物。以40mg/kg的每日劑量ip施用血管抑制素產(chǎn)生了對(duì)T241原發(fā)性瘤生長(zhǎng)的高度明顯抑制(圖17)。這種對(duì)生長(zhǎng)的抑制作用在2天內(nèi)明顯可見，在整個(gè)研究的時(shí)程中在數(shù)量增加。至第18天時(shí)，血管抑制素處理的小鼠具有注射鹽水對(duì)照的體積的約38％的腫瘤。這種差異在統(tǒng)計(jì)學(xué)上是顯著的(P＜0.001，t-檢驗(yàn))。血管抑制素處理(80mg/kg/天的總劑量，以40mg/kgip或sc每日兩次施用)也明顯地減少LLC-LM原發(fā)性瘤的生長(zhǎng)速率(圖17)。這種抑制作用在4天時(shí)是明顯的，在爾后檢查的次數(shù)中數(shù)量增加。在實(shí)驗(yàn)的最后一天(第19天)，血管抑制素處理的小鼠僅具有僅為注射鹽水的對(duì)照20％的平均腫瘤體積，它們之間的差異是明顯的(P＜0.001，t-檢驗(yàn))。在另一個(gè)系列的實(shí)驗(yàn)中，對(duì)以T241纖維肉瘤、Lewis肺癌(LM)或網(wǎng)狀組織細(xì)胞肉瘤細(xì)胞移植的小鼠施用血管抑制素(50mg/kgq12小時(shí))。對(duì)于每種腫瘤細(xì)胞類型，接收血管抑制素的小鼠具有實(shí)質(zhì)上減小的腫瘤大小。圖19證明了對(duì)于T241纖維肉瘤，血管抑制素處理的小鼠具有平均的腫瘤體積，該體積在第24天時(shí)僅為未處理小鼠的15％。圖20證明了對(duì)于Lewis肺癌(LM)，血管抑制素處理的小鼠具有平均的腫瘤體積，該體積在第24天時(shí)僅為未處理小鼠的13％。圖21證明了對(duì)于網(wǎng)狀組織肉瘤，血管抑制素處理的小鼠具有平均的腫瘤體積，該體積在第24天時(shí)僅為未處理小鼠的19％。每點(diǎn)的數(shù)據(jù)代表4只小鼠的平均值。這些結(jié)果表明在體內(nèi)血管抑制素是三種不同的原發(fā)性瘤生長(zhǎng)的極有效的抑制劑。實(shí)施例22在小鼠中以血管抑制素體內(nèi)處理源于人細(xì)胞的原發(fā)性瘤。研究了血管抑制素對(duì)兩種人腫瘤細(xì)胞系(人前列腺癌PC-3和人胸部癌MDA-MB)的作用。用人腫瘤細(xì)胞移植免疫缺陷的SCID小鼠，小鼠如實(shí)施例21所述基本上每12小時(shí)以50mg/kg血管抑制素處理。結(jié)果證明本發(fā)明的血管抑制素蛋白質(zhì)是人腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的有效抑制劑。圖22顯示了對(duì)于人前列腺癌PC-3，在第24天時(shí)與未處理的對(duì)照小鼠相比血管抑制素處理的小鼠僅有平均腫瘤體積的2％。圖23顯示了對(duì)于人胸部癌MDA-MB，在第24天時(shí)與未處理的對(duì)照小鼠相比血管抑制素處理的小鼠僅有平均腫瘤體積的8％。實(shí)施例23基因治療-血管抑制素基因?qū)δ[瘤體積的轉(zhuǎn)染作用。使用PCR產(chǎn)生編碼小鼠纖溶酶原氨基酸1-460的源于小鼠纖溶酶原cDNA(從美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)獲得)的血管抑制素的1380堿基對(duì)DNA序列，并將其插入到表達(dá)載體中。把表達(dá)載體轉(zhuǎn)染進(jìn)T241纖維肉瘤細(xì)胞并把轉(zhuǎn)染的細(xì)胞移植進(jìn)小鼠。對(duì)照小鼠接收非轉(zhuǎn)染的T241細(xì)胞，或T241細(xì)胞僅用載體轉(zhuǎn)染(即非血管抑制素表達(dá)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞)。在實(shí)驗(yàn)中使用了三種表達(dá)血管抑制素的轉(zhuǎn)染的細(xì)胞克隆。從頭到尾測(cè)定平均腫瘤體積。結(jié)果顯示出與非轉(zhuǎn)染的和非表達(dá)的對(duì)照細(xì)胞相比，在表達(dá)血管抑制素的細(xì)胞克隆的小鼠中平均腫瘤體積驚人地和劇烈地減小。編碼小鼠血管抑制素蛋白質(zhì)的小鼠DNA序列源于小鼠纖溶酶原cDNA。小鼠血管抑制素包括小鼠纖溶酶原kringle區(qū)1-4。構(gòu)建該克隆的圖解在圖24中顯示。使用LIPOFECTIN轉(zhuǎn)染系統(tǒng)(可從生命技術(shù)，Gaithersburg，MD購(gòu)得)把小鼠血管抑制素蛋白質(zhì)克隆轉(zhuǎn)染進(jìn)T241纖維肉瘤細(xì)胞。LIPOFECTIN試劑是在膜過濾的水中的1∶1(w/w)陽(yáng)離子脂N-[1-(2，3-二油酰氧)丙基]-n，n，n-三甲基氯化銨(DOTMA)和二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)的脂質(zhì)體制劑。細(xì)胞的瞬時(shí)轉(zhuǎn)染步驟如下1.在60cm2的組織培養(yǎng)皿中培養(yǎng)T241細(xì)胞，接種量≈在2ml補(bǔ)充有血清的適當(dāng)?shù)纳L(zhǎng)培養(yǎng)基中的1-2×105細(xì)胞。2.于37℃下在CO2恒溫箱中培養(yǎng)細(xì)胞直到細(xì)胞40-70％融合。這通常需要18-24小時(shí)，但是時(shí)間隨細(xì)胞類型的不同而不同。T241腫瘤細(xì)胞融合約是70％。3.在12×75mm無菌試管中制備下列溶液溶液A對(duì)于每次轉(zhuǎn)染，以100μl無血清的OPTI-MEMI減少的血清培養(yǎng)基(可從生命技術(shù)得到)(也可以使用組織培養(yǎng)級(jí)的去離子水)稀釋5μgDNA。溶液B對(duì)于每次轉(zhuǎn)染，以100μlOPTI-MEM培養(yǎng)基稀釋30μgLIPOFECTIN。4.在室溫下合并兩種溶液，輕輕混合并在室溫下溫育10-15分鐘。5.以無血清培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞兩次。6.對(duì)于每次轉(zhuǎn)染，把0.8ml無血清的培養(yǎng)基添加至每個(gè)包含LIPOFECTIN試劑-DNA復(fù)合物的試管中。輕輕混合并把復(fù)合物覆蓋在細(xì)胞上。7.于37℃下在CO2恒溫箱中培養(yǎng)細(xì)胞約12小時(shí)。8.用1mg/ml包含血清的選擇培養(yǎng)基取代包含DNA的培養(yǎng)基，并于37℃下在CO2恒溫箱中培養(yǎng)細(xì)胞總共48-72小時(shí)。9.在48-72小時(shí)轉(zhuǎn)染后測(cè)定細(xì)胞提取物的基因活性?？梢允褂醚芤种扑靥禺愋缘目贵w測(cè)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞的血管抑制素蛋白質(zhì)的表達(dá)。另外，在約10-14天后，G418抗性菌落出現(xiàn)于CMV-血管抑制素轉(zhuǎn)染的T241細(xì)胞中。同時(shí)，僅在轉(zhuǎn)染克隆的載體中觀察到了許多克隆，但在未轉(zhuǎn)染的克隆中沒有觀察到。使用免疫熒光法選擇G418抗性克隆的血管抑制素的表達(dá)。令人感興趣的是，用血管抑制素轉(zhuǎn)染的241細(xì)胞和Lewis肺臟細(xì)胞的體外細(xì)胞生長(zhǎng)沒有受到抑制或其它的如圖25和26所顯示的負(fù)作用。圖27描述了轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。所有表達(dá)血管抑制素的T241轉(zhuǎn)染的三個(gè)克隆在小鼠中產(chǎn)生相對(duì)于對(duì)照小鼠的腫瘤體積有實(shí)質(zhì)上減少的平均腫瘤體積。用克隆37移植的小鼠的平均腫瘤體積僅為對(duì)照小鼠的13％，而用克隆31和克隆25移植的小鼠的平均腫瘤體積僅分別為對(duì)照的21％和34％。這些結(jié)果表明可以把編碼血管抑制素的DNA序列轉(zhuǎn)染進(jìn)細(xì)胞，該轉(zhuǎn)染的DNA序列能夠通過移植的細(xì)胞表達(dá)血管抑制素蛋白質(zhì)，表達(dá)的血管抑制素在體內(nèi)起作用以降低腫瘤生長(zhǎng)。實(shí)施例24血管抑制素表達(dá)的體內(nèi)位點(diǎn)的定位為了確定血管抑制素蛋白質(zhì)的表達(dá)的體內(nèi)位點(diǎn)，分析了得自新鮮腫瘤或多次繼代移植后的細(xì)胞培養(yǎng)物的各種細(xì)胞類型(Lewis肺癌細(xì)胞(小鼠)，T241纖維肉瘤(小鼠)和Burkitt淋巴組織瘤細(xì)胞(人))的總RNA以確定血管抑制素轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的存在。樣品的Northern分析表明，除正常小鼠肝臟RNA顯示出相應(yīng)于小鼠纖溶酶原的約2.4kb的單一信號(hào)外，不存在任何與所有樣品的序列雜交的信號(hào)。人樣品的Northern分析表明，除正常人肝臟RNA顯示出相應(yīng)于人纖溶酶原的約2.4kb的單一信號(hào)外，不存在任何與所有樣品的人血管抑制素序列雜交的信號(hào)。逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)分析顯示，除了正常小鼠肝臟的外，不存在用小鼠血管抑制素序列探查的所有樣品的任何產(chǎn)物。RT-PCR分析顯示，除正常人肝臟的外，不存在用人血管抑制素序列探查的所有人樣品的任何產(chǎn)物(小鼠的預(yù)期大小為1050bp，人的預(yù)期的大小為1134bp)。這樣看起來小鼠血管抑制素轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物(假設(shè)和小鼠纖溶酶原的97到450氨基酸相同)不是由所有上述的小鼠的樣品產(chǎn)生，人血管抑制素轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物(假設(shè)和人纖溶酶原的97到470氨基酸相同)不是由所有上述的人的樣品產(chǎn)生。在正常小鼠/人肝臟中所獲得的陽(yáng)性信號(hào)來源于和纖溶酶原的雜交。實(shí)施例25酵母中血管抑制素的表達(dá)把編碼人纖溶酶原的93至470氨基酸的基因片段克隆進(jìn)使得可以在巴斯德畢赤酵母中使用PHO1分泌信號(hào)表達(dá)分泌蛋白質(zhì)的pHIL-SI(Invitrogen)的Xhol/EcoRI位點(diǎn)。同樣地，把編碼人纖溶酶原的93至470氨基酸的基因片段克隆進(jìn)使得可以在巴斯德畢赤酵母中使用a-因子分泌信號(hào)表達(dá)分泌蛋白質(zhì)的pPIC9(Invitrogen)的SnaBI/EcoRI位點(diǎn)。在這些系統(tǒng)中表達(dá)的人血管抑制素蛋白質(zhì)比在大腸桿菌中表達(dá)的血管抑制素蛋白質(zhì)有許多優(yōu)勢(shì)，如蛋白質(zhì)加工、蛋白質(zhì)折疊和包括葡基化的翻譯后修飾。在巴斯德畢赤酵母中的基因表達(dá)在以下文獻(xiàn)中有描述，本文一并參考Sreekrishna，K.等(1988)，在甲基營(yíng)養(yǎng)巴斯德畢赤酵母中異源蛋白質(zhì)的高水平表達(dá)，基礎(chǔ)微生物學(xué)雜志29(4)265-278和Clare，J.J.等(1991)，酵母中表皮生長(zhǎng)因子的產(chǎn)生使用包含多個(gè)基因拷貝的巴斯德畢赤酵母菌株的高水平分泌，基因105205-212。實(shí)施例26在轉(zhuǎn)基因動(dòng)物和植物中血管抑制素蛋白質(zhì)的表達(dá)創(chuàng)造表達(dá)血管抑制素基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物(如牛或豬家族的)。轉(zhuǎn)基因動(dòng)物表達(dá)血管抑制素蛋白質(zhì)(例如在這些動(dòng)物的奶中表達(dá))。另外構(gòu)建了表達(dá)血管抑制素基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的可食用的轉(zhuǎn)基因植物。構(gòu)建表達(dá)外源DNA的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物在以下文獻(xiàn)中有描述，本文一并參考SmithH.植物色素轉(zhuǎn)基因功能、生態(tài)和生物技術(shù)的應(yīng)用，細(xì)胞生物學(xué)研究，19945(5)315-325。實(shí)施例27抑制血管抑制素片段的內(nèi)皮細(xì)胞增殖的特征下列實(shí)施例確定單獨(dú)的和組合的血管抑制素片段活性的特征。數(shù)據(jù)表明在單獨(dú)的kringle結(jié)構(gòu)和有效的抗內(nèi)皮細(xì)胞中存在功能上的差別，因而可以從這類血管抑制素的蛋白質(zhì)片段中得到抗血管生成的活性。本文所使用的血管抑制素片段指具有內(nèi)皮細(xì)胞增殖抑制活性的血管抑制素或纖溶酶原的蛋白質(zhì)衍生物。血管抑制素片段可用于治療血管生成介導(dǎo)的疾病或病癥。例如，血管抑制素片段可用于抑制或降低腫瘤生長(zhǎng)。例如，除非在其使用的上下文中特別指出，這類血管抑制素片段的氨基酸序列可以從鼠纖溶酶原(SEQIDNO1)、鼠血管抑制素(SEQIDNO2)的部分；人血管抑制素(SEQIDNO3)、恒河猴血管抑制素(SEQIDNO4)、豬血管抑制素(SEQIDNO5)和牛血管抑制素(SEQIDNO6)的部分中選擇。除非在其所使用的上下文中特別指出，本文中所使用的kringle1指具有內(nèi)皮細(xì)胞增殖抑制活性或抗血管生成活性并具有包含同源于kringle1之序列的氨基酸序列的纖溶酶原的蛋白質(zhì)衍生物，例如(但不限于)，鼠kringle1(SEQIDNO7)、人kringle1(SEQIDNO8)、恒河猴kringle1(SEQIDNO9)、豬kringle1(SEQIDNO10)和牛kringle1(SEQIDNO11)。鼠kringle1(SEQIDNO7)相應(yīng)于SEQIDNO1的鼠纖溶酶原的氨基酸位置103至181(包含)，并相應(yīng)于SEQIDNO2的鼠血管抑制素的氨基酸位置6至84(包含)。人kringle1(SEQIDNO8)、恒河猴kringle1(SEQIDNO9)、豬kringle1(sEQIDNO10)和牛kringle1(sEQIDNO11)分別相應(yīng)于SEQIDNO3、SEQIDNO4、SEQIDNO5和SEQIDNO6的血管抑制素的氨基酸位置6至84(包含)。除非在其所使用的上下文中特別指出，本文中所使用的kringle2指具有內(nèi)皮細(xì)胞增殖抑制活性或抗血管生成活性并具有包含同源于kringle2之序列的氨基酸序列的纖溶酶原的蛋白質(zhì)衍生物，例如(但不限于)，鼠kringle2(SEQIDNO12)、人kringle2(SEQIDNO13)、恒河猴kringle2(SEQIDNO14)、豬kringle2(SEQIDNO15)和牛kringle2(SEQIDNO16)。鼠kringle2(SEQIDNO12)相應(yīng)于SEQIDNO1的鼠纖溶酶原的氨基酸位置185至262(包含)，并相應(yīng)于SEQIDNO2的鼠血管抑制素的氨基酸位置88至165(包含)。人kringle2(SEQIDNO13)、恒河猴kringle2(SEQIDNO14)、豬kringle2(SEQIDNO15)和牛kringle2(SEQIDNO16)分別相應(yīng)于SEQIDNO3、SEQIDNO4、SEQIDNO5和SEQIDNO6的血管抑制素的氨基酸位置88至165(包含)。本文中所使用的kringle3指具有內(nèi)皮細(xì)胞增殖抑制活性或抗血管生成活性并具有包含同源于kringle3之序列的氨基酸序列的纖溶酶原的蛋白質(zhì)衍生物，例如(但不限于)，鼠kringle3(SEQIDNO17)、人kringle3(SEQIDNO18)、恒河猴kringle3(SEQIDNO19)、豬kringle3(SEQIDNO20)和牛kringle3(SEQIDNO21)。鼠kringle3(SEQIDNO17)相應(yīng)于SEQIDNO1的鼠纖溶酶原的氨基酸位置275至352(包含)，并相應(yīng)于SEQIDNO2的鼠血管抑制素的氨基酸位置178至255(包含)。人kringle3(SEQIDNO18)、恒河猴kringle3(SEQIDNO19)、豬kringle3(SEQIDNO20)和牛kringle3(SEQIDNO21)分別相應(yīng)于SEQIDNO3、SEQIDNO4、SEQIDNO5和SEQIDNO6的血管抑制素的氨基酸位置178至255(包含)。除非在其所使用的上下文中特別指出，本文中所使用的kringle4指具有內(nèi)皮細(xì)胞增殖抑制活性或抗血管生成活性并具有包含同源于kringle4之序列的氨基酸序列的纖溶酶原的蛋白質(zhì)衍生物，例如(但不限于)，鼠kringle4(SEQIDNO22)和人kringle4(SEQIDNO23)。鼠kringle4(SEQIDNO22)相應(yīng)于SEQIDNO1的鼠纖溶酶原的氨基酸位置377至454(包含)。除非在其所使用的上下文中特別指出，本文中所使用的kringle2-3指具有內(nèi)皮細(xì)胞增殖抑制活性或抗血管生成活性并具有包含同源于kringle2-3之序列的氨基酸序列的纖溶酶原的蛋白質(zhì)衍生物，例如(但不限于)，鼠kringle2-3(SEQIDNO24)、人kringle2-3(SEQIDNO25)、恒河猴kringle2-3(SEQIDNO26)、豬kringle2-3(SEQIDNO27)和牛kringle2-3(SEQIDNO28)。鼠kringle2-3(SEQIDNO24)相應(yīng)于SEQIDNO1的鼠纖溶酶原的氨基酸位置185至352(包含)，并相應(yīng)于SEQIDNO2的鼠血管抑制素的氨基酸位置88至255(包含)。人kringle2-3(SEQIDNO25)、恒河猴kringle2-3(SEQIDNO26)、豬kringle2-3(SEQIDNO27)和牛kringle2-3(SEQIDNO28)分別相應(yīng)于SEQIDNO3、SEQIDNO4、SEQIDNO5和SEQIDNO6的血管抑制素的氨基酸位置88至255(包含)。除非在其所使用的上下文中特別指出，本文中所使用的kringle1-3指具有內(nèi)皮細(xì)胞增殖抑制活性或抗血管生成活性并具有包含同源于kringle1-3之序列的氨基酸序列的纖溶酶原的蛋白質(zhì)衍生物，例如(但不限于)，鼠kringle1-3(SEQIDNO29)、人kringle1-3(SEQIDNO30)、恒河猴kringle1-3(SEQIDNO31)、豬kringle1-3(SEQIDNO32)和牛kringle1-3(SEQIDNO33)。鼠kringle1-3(SEQIDNO29)相應(yīng)于SEQIDNO1的鼠纖溶酶原的氨基酸位置103至352(包含)，并相應(yīng)于SEQIDNO2的鼠血管抑制素的氨基酸位置6至255(包含)。人kringle1-3(SEQIDNO30)、恒河猴kringle1-3(SEQIDNO31)、豬kringle1-3(SEQIDNO32)和牛kringle1-3(SEQIDNO33)分別相應(yīng)于SEQIDNO3、SEQIDNO4、SEQIDNO5和SEQIDNO6的血管抑制素的氨基酸位置6至255(包含)。除非在其所使用的上下文中特別指出，本文中所使用的kringle1-2指具有內(nèi)皮細(xì)胞增殖抑制活性或抗血管生成活性并具有包含同源于kringle1-2之序列的氨基酸序列的纖溶酶原的蛋白質(zhì)衍生物，例如(但不限于)，鼠kringle1-2(SEQIDNO34)、人kringle1-2(SEQIDNO35)、恒河猴kringle1-2(SEQIDNO36)、豬kringle1-2(SEQIDNO37)和牛kringle1-2(SEQIDNO38)。鼠kringle1-2(SEQIDNO34)相應(yīng)于SEQIDNO1的鼠纖溶酶原的氨基酸位置103至262(包含)，并相應(yīng)于SEQIDNO2的鼠血管抑制素的氨基酸位置6至165(包含)。人kringle1-2(SEQIDNO35)、恒河猴kringle1-2(SEQIDNO36)、豬kringle1-2(SEQIDNO37)和牛kringle1-2(SEQIDNO38)分別相應(yīng)于SEQIDNO3、SEQIDNO4、SEQIDNO5和SEQIDNO6的血管抑制素的氨基酸位置6至165(包含)。除非在其所使用的上下文中特別指出，本文中所使用的kringle1-4指具有內(nèi)皮細(xì)胞增殖抑制活性或抗血管生成活性并具有包含同源于kringle1-4之序列的氨基酸序列的纖溶酶原的蛋白質(zhì)衍生物，例如(但不限于)，鼠kringle1-4(SEQIDNO39)和人kringle1-4(SEQIDNO40)。鼠kringle1-4(SEQIDNO39)相應(yīng)于SEQIDNO1的鼠纖溶酶原的氨基酸位置103至454(包含)。kringle1、kringle2、kringle3、kringle4、kringle2-3、kringle1-3、kringle1-2和kringle1-4氨基酸序列分別與以上鑒定的特異性kringle序列同源。優(yōu)選地，氨基酸序列和公開的序列有至少60％、更優(yōu)選地為至少70％、更優(yōu)選地至少為80％的同源性程度。應(yīng)該理解對(duì)上述所列片段可以進(jìn)行各種氨基酸取代、添加、缺失或其它修飾以改進(jìn)或修飾血管抑制素片段的內(nèi)皮細(xì)胞增殖抑制活性或抗血管生成活性。術(shù)語功能性同系物指可以按照本發(fā)明使用改變的序列，該改變包括產(chǎn)生編碼相同或功能等同的基因產(chǎn)物的序列的不同殘基的缺失、添加或取代。基因產(chǎn)物自身可以在血管抑制素序列內(nèi)包含氨基酸殘基的缺失、添加或取代，這導(dǎo)致靜態(tài)變化以產(chǎn)生功能等同的血管抑制素蛋白質(zhì)。這類氨基酸取代可以在涉及的殘基的極性、電荷、溶解性、疏水性、親水性和/或兩親性(既親水又親油)相似的基礎(chǔ)上進(jìn)行。例如，帶負(fù)電的氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸；帶正電的氨基酸包括賴氨酸、組氨酸和精氨酸；具有相似的親水性值的具有不帶電極性頭部基團(tuán)的氨基酸包括下列氨基酸甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸；具有非極性頭部基團(tuán)的氨基酸包括丙氨酸、纈氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、蛋氨酸、色氨酸。這樣的修飾不超出權(quán)利要求的范圍和精神。例如，要避免通過形成中間kringle二硫橋的同二聚作用，將在重組人kringle2(SEQIDNO13)中的半胱氨酸殘基C4和在重組kringle3(SEQIDNO18)中的C42突變?yōu)榻z氨酸，而且，可以理解在上述鑒定的血管抑制素片段中可以進(jìn)行各種氨基酸取代、添加、缺失或其它修飾，這不顯著地改變片段的內(nèi)皮細(xì)胞增殖抑制活性，因此這不超出權(quán)利要求的范圍。不顯著地改變是指與本文公開的最密切的同源血管抑制素片段的內(nèi)皮細(xì)胞增殖抑制活性相比，血管抑制素片段有至少60％、更優(yōu)選地至少70％、更優(yōu)選地至少80％的內(nèi)皮細(xì)胞增殖抑制活性?；驑?gòu)建和表達(dá)使用基于PCR的方法產(chǎn)生編碼人纖溶酶原(HPg)的kringle1(K1)、kringle2(K2)、kringle3(K3)、kringle4(K4)和kringle2-3(K2-3)的cDNA片段。如上所述在大腸桿菌中表達(dá)重組kringle1(rK1)、kringle2(rK2)、kringle3(rK3)、kringle2-4(rK4)和kringle2-3(rK2-3)(Menhart，N.，Shel，L.C.，Kelly，R.F.和Castellino，F(xiàn).J.(1991)生物化學(xué)30，1948-1957；Marti，D.，Schaller，J.，Ochensberger，B.和Rickli，E.E.(1994)歐洲生物化學(xué)雜志219，455-462；Sijhndel，S.，Hu，C.-K.，Marti，D.，Affolter，M.，Schaller，J.，Llinas，M.和Rickli，E.E.(1996)生物化學(xué)待出版；Rejante，M.R.，Byeon，I.-J.L.和Llinas，M.(1991)生物化學(xué)30，11081-11092)。要避免通過形成如圖32B所示的通過形成中間kringle二硫橋的同二聚作用，分別在位置4和42，如在SEQIDNO.13和18中觀察到的，把rK2中的半胱氨酸殘基C169和rK3中的C297突變?yōu)榻z氨酸(SiShndel，S.，Hu，C.-K.，Marti，D.，Affolter，M.，Schaller，J.，Llinas，M.和Rickli，E.E.(1996)生物化學(xué)待出版)。rK3和rK2-3包含用于蛋白質(zhì)純化的N-末端的六個(gè)組氨酸尾巴(未顯示)。蛋白酶解消化如前所述通過用豬彈性蛋白酶(Sigma)消化Lys-HPg(AbbottLabs)制備K1-3、K1-4和K4片段(Powell，J.R.和Castellino，F(xiàn).J.(1983)生物化學(xué)22，923-927)。簡(jiǎn)言之，將1.5mg彈性蛋白酶在室溫下與200mg人纖溶酶原在50mMpH8.0的Tris-HCl中振蕩溫育過夜。通過添加異丙氟磷(DFP)(Sigma)至1mM的最終濃度終止反應(yīng)?；旌衔镌僭谑覝叵抡袷?0分鐘，并對(duì)50mMpH8.0的Tris-HCl透析過夜。蛋白質(zhì)純化使用pSTII質(zhì)粒載體在DH5α大腸桿菌中表達(dá)重組體K1。使用賴氨酸-瓊脂糖凝膠4B(Pharmacia)和色譜MonoQ(BioRad)柱通過色譜法把蛋白質(zhì)純化至均一。把表達(dá)rK2和rK3的大腸桿菌細(xì)菌細(xì)胞(菌株HB101)于3℃下在包含100mg/ml氨芐青霉素和25mg/ml卡那霉素的2×YT培養(yǎng)基中培養(yǎng)到OD600為約0.8。添加IPTG(異丙基-b-D-硫代乳吡喃糖苷)至1mM的最終濃度，把細(xì)胞在37℃下再培養(yǎng)4.5小時(shí)以誘導(dǎo)重組體蛋白質(zhì)的產(chǎn)生。通過離心收集細(xì)胞，并在-80℃下保存沉淀。把解凍的細(xì)胞溶解產(chǎn)物重新懸浮在抽取的緩沖液中(在0.1M磷酸鈉中的6M鹽酸胍，pH8.0)。以15,000×g離心懸浮液30分鐘，并向上清液添加b-巰基乙醇至10mM的最終濃度。然后把上清液裝載在用抽取緩沖液預(yù)平衡的Ni2+-NTA瓊脂糖柱(1.5cm×5cm)上。分別以抽取緩沖液在pH8.0和pH6.3連續(xù)洗滌柱。用抽取緩沖液在pH5.0洗脫重組K2和K3。使用50mMTris-HCl(pH8.0)平衡的賴氨酸-瓊脂糖凝膠4B柱(2.5cm×15cm)純化蛋白酶解的裂解的K1-3、K1-4和K4片段，直到在180nm的吸光度達(dá)到0.005。用包含200mMε-氨基己酸的Tris緩沖液、pH8.0洗脫吸收的kringle片段。洗脫的樣品對(duì)20mMTris-HClpH5.0透析過夜，并施用于用相同緩沖液平衡的BioRadMono-S柱中。用20mM磷酸鹽/1MKClpH5.0的0-20％、20-50％和50-70％的逐步梯度洗脫K4、K1-3和K1-4的片段。如通過SDS-PAGE測(cè)定用0.5MKCl從柱中洗脫大多數(shù)K1-3和K1-4片段。將所有的片段對(duì)20mMTris-HClpH8.0透析過夜。透析后，使用以20mMTris-HCl緩沖液pH8.0預(yù)平衡的肝素-瓊脂糖凝膠柱(5cm×10cm)(Sigma)進(jìn)一步純化K1-3和K1-4片段。用350mMKCl洗脫K1-3片段并從柱流通回收K1-4。在SDS-凝膠、銀染、用抗人K4和K1-3多克隆抗體的Western免疫印跡分析以及氨基末端測(cè)序分析來分析純化的kringle片段。體外重新折疊按照標(biāo)準(zhǔn)方案進(jìn)行rK2、rK3和rK2-3的重新折疊(Cleary，S.，Mulkerrin，M.G.和Kelley，R.R.(1989)生物化學(xué)28，1884-1891)。將純化的蛋白質(zhì)調(diào)整至pH8.0并添加谷胱甘肽(DTT)至5mM的最終濃度。在過夜培養(yǎng)后，以4倍體積的包含1.25mM的還原谷胱甘肽的50mMTris-HClpH8.0稀釋溶液。在培養(yǎng)1小時(shí)后，添加氧化的谷胱甘肽至1.25mM的最終濃度并在4℃下培養(yǎng)6小時(shí)。使復(fù)性的蛋白質(zhì)首先對(duì)H2O透析兩天，再對(duì)50mM磷酸鹽緩沖鹽水pH8.0透析2天。然后把溶液裝載在用相同的磷酸鹽緩沖鹽水平衡的賴氨酸-Bio-Gel柱(2cm×13cm)柱中。以磷酸鹽緩沖鹽水洗滌柱，以包含50mM6-AHA(6-氨基己酸)的磷酸鹽緩沖液洗脫蛋白質(zhì)。在AquaporeButyl柱(2.1×100mM，孔寬30nm，7mM，應(yīng)用生物系統(tǒng))中進(jìn)行反相HPLC，使用乙腈梯度的HewlettPackard液相色譜。還原和烷基化按照標(biāo)準(zhǔn)方案進(jìn)行kringle片段的還原和烷基化(Cao，Y.和Pettersson，R.F.，(1990)生長(zhǎng)因子3，1013)。使在無血清的300-500mlDME培養(yǎng)基中的約20-80mg純化的蛋白質(zhì)與15ml0.5MDTT在室溫下培養(yǎng)15分鐘。在培養(yǎng)后，向反應(yīng)物添加30ml的0.5M碘乙酰胺。蛋白質(zhì)溶液首先在4℃下對(duì)20體積的DMEM透析過夜。然后溶液再在4℃下對(duì)20體積的DMEM透析4小時(shí)。透析后，在SDS-凝膠上分析樣品并測(cè)定其對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞增殖的抑制活性。內(nèi)皮細(xì)胞增殖測(cè)定如上所述分離牛毛細(xì)血管內(nèi)皮(BCE)細(xì)胞(Follunan，J.，Haudenschild，C.C.和Zetter，B.R.(1979)美國(guó)科學(xué)院學(xué)報(bào)76，5217-5121)并保持在以10％熱滅活的小牛血清(BCS)、抗生素和3ng/ml重組人bFGF補(bǔ)充的DMEM中(SciosNova，Mountainview，CA)。把在6-孔平板上培養(yǎng)的單層BCE細(xì)胞散布在0.05％胰蛋白酶溶液中。用包含10％BCS的DMEM重新懸浮細(xì)胞。把在0.5ml中的約12,500個(gè)細(xì)胞添加到凝膠化的24-孔組織培養(yǎng)板上并于37℃下(在10％CO2中)培養(yǎng)24小時(shí)。用包含5％BCS的500ml的新鮮DMEM代替培養(yǎng)基，把三次重復(fù)的單個(gè)和組合kringle片段的樣品添加至每個(gè)孔中。30分鐘培養(yǎng)后，添加bFGF至1ng/ml的最終濃度。培養(yǎng)72小時(shí)后，細(xì)胞受胰蛋白酶作用、重新懸浮在Hematall中(FisherScientific，Pittsburg，PA)并用Coulter計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)。人纖溶酶原的Kringle片段的純化和特征確定通過基于PCR的方法擴(kuò)增編碼人纖溶酶原的單個(gè)kringles(K1，K2，K3和K4)與kringles2-3(K2-3)的cDNA片段(圖28)。把PCR-擴(kuò)增的cDNA片段克隆進(jìn)細(xì)菌表達(dá)載體中。把從大腸桿菌表達(dá)的重組蛋白質(zhì)在體外重新折疊并使用HPLC-偶聯(lián)的色譜純化至＞98％的均一性(圖29)。在還原條件下，重組K2、K3和K4以12-13kDa的分子量遷移(圖29A，泳道2-4)，這相應(yīng)于每種kringle片段的預(yù)期分子量。通過SDS-凝膠電泳鑒別以17kDa的更高分子量遷移的重組K1。如上所述通過用彈性蛋白酶蛋白酶解消化人賴氨酸-纖溶酶原(Lys-HPg)獲得K1-4和K1-3片段(Powell，J.R.和Castellino，F(xiàn).J.(1983)生物化學(xué)22，923-927；Brockway，W.J.和Castellino，F(xiàn).J.(1972)Arch.Biachem.Biophys)。將分別具有43kDa和35kDa的預(yù)期分子量的這兩個(gè)片段(圖29B，泳道1和2)純化至均一。純化的片段N-末端氨基酸序列分析產(chǎn)生相同的序列，-YLSE-，其后分別為K1-3和K1-4的SEQIDNO30和SEQIDNO40。K4的N-末端序列產(chǎn)生具有約20％-VQD-的-VVQD-，其后為SEQIDNO23，預(yù)期其中每種序列得自人血管抑制素的纈氨酸176和纈氨酸177開始的預(yù)期的序列(SEQIDNO3)。單個(gè)Kringles的抗內(nèi)皮細(xì)胞增殖活性測(cè)定血管抑制素的單個(gè)重組kringle片段對(duì)bFGF刺激的牛毛細(xì)血管內(nèi)皮(BCE)細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制活性。如圖30A所示，rK1以劑量依賴性方式抑制BCE細(xì)胞增殖。達(dá)到50％抑制率(ED50)所需的rK1的濃度約是320nM(表4)。相反，rK4對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞增殖表現(xiàn)出極少或沒有抑制效應(yīng)。重組K2和rK3(兩種無賴氨酸組合的kringle片段)也產(chǎn)生內(nèi)皮細(xì)胞增殖的劑量依賴性抑制(圖30B)。然而，rK2的抑制效應(yīng)實(shí)質(zhì)上遠(yuǎn)低于rK1和rK3(ED50＝460)(圖30和表4)。即使和高濃度這些kringle片段培養(yǎng)后，也可以檢測(cè)到無細(xì)胞毒素或與編程性內(nèi)皮細(xì)胞相關(guān)的明顯的形態(tài)學(xué)(如細(xì)胞的倒圓、分離和斷裂)。這些數(shù)據(jù)表明K1、K2和K3的片段可以共有血管抑制素的抗內(nèi)皮生長(zhǎng)活性，K4片段具有的活性較小。表4對(duì)毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖的抑制活性片段ED50(nM)Kringle1320Kringle2Kringle3460Kringle4Kringle2-3-Kringle1-370Kringle1-4(血管抑制素)135K1-3和K1-4片段的抗內(nèi)皮細(xì)胞增殖活性為評(píng)價(jià)組合的kringle片段的抗內(nèi)皮細(xì)胞增殖作用，在BCE細(xì)胞上測(cè)定了純化的人K1-4、K1-3和rK2-3的蛋白酶解片段。與以前的研究結(jié)果(OReilly，M.S.，Holmgren，L.，Shing，Y.，Chen，C.，Rosenthal，R.A.，Moses，J.，Lane，W.S.，Cao，Y.，Sage，E.H.和Folkman，J.(1994)細(xì)胞79，315-328)一致，如圖31顯示的BCE細(xì)胞增殖明顯地受到了類似血管抑制素的片段K1-4(ED50＝135nM)(表4)的抑制。用K1-3片段獲得了抗內(nèi)皮生長(zhǎng)活性的增加(ED50＝70nM)(表4)。內(nèi)皮細(xì)胞增殖的抑制以劑量依賴性方式發(fā)生。這些結(jié)果表明從血管抑制素中除去K4加強(qiáng)了抗內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)活性。通過rK2和rK3的其它抑制rK2-3的片段僅顯示出類似于僅rK2片段的活性的微弱的抑制活性(圖31)。然而，rK2和rK3兩者都能夠抑制內(nèi)皮細(xì)胞增殖(圖30B)。這個(gè)研究結(jié)果表明K3的抑制作用隱藏在K2-3的結(jié)構(gòu)中。以前的結(jié)構(gòu)研究顯示中間kringle二硫鍵存在于人纖溶酶原的相應(yīng)于SEQIDNO3的半胱氨酸91和半胱氨酸219的K2(半胱氨酸169)和K3(半胱氨酸297)之間(Sohndel，S.，Hu，C.-K.，Marti，D.，Affolter，M.，Schaller，J.，Llinas，M.和Rickli，E.E.(1996)生物化學(xué)，待出版)參見圖32B。試驗(yàn)了組合的rK2和rK3的抑制作用。令人感興趣的是，當(dāng)把單個(gè)的rK2和rK3片段和BCE細(xì)胞添加到一起時(shí)可看到另外的抑制作用。參見圖32A。這些結(jié)果意味著為了獲得K2-3的最大抑制作用，優(yōu)選的是打開K2和K3之間的中間二硫橋。血管抑制素的抗內(nèi)皮細(xì)胞增殖活性需要Kringle結(jié)構(gòu)的適當(dāng)折疊為了研究抗內(nèi)皮細(xì)胞增殖活性是否需要kringle結(jié)構(gòu)的折疊，用DTT還原天然血管抑制素并在牛毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞上測(cè)定。還原后，血管抑制素用碘乙酰胺進(jìn)一步烷基化并通過SDS凝膠電泳分析。如圖34A所示，與具有33kDa的分子量的天然血管抑制素(泳道1)相比，DTT-處理的蛋白質(zhì)以以約42kDa的分子量在更高的位置遷移(泳道2)，這表明了血管抑制素被完全還原。還原后在很大程度上取消了血管抑制素的抗增殖活性(圖34B)。從這些結(jié)果中我們可以得出結(jié)論通過內(nèi)部kringle二硫鍵的血管抑制素的正確折疊對(duì)保持其內(nèi)皮細(xì)胞增殖的抑制的有效作用是優(yōu)選的。人纖溶酶原的kringle區(qū)的氨基酸序列對(duì)比表明K1、K2、K3和K4顯示了如圖35中所觀察到的相同的大體結(jié)構(gòu)和顯著的序列同源性(56-82％相同)。在這些結(jié)構(gòu)中，高親和性賴氨酸結(jié)合kringle(K1)最有效的內(nèi)皮細(xì)胞增殖的抑制片段。令人感興趣的是，中等親和性的賴氨酸結(jié)合片段(K4)缺乏抑制活性。這些數(shù)據(jù)表明kringle結(jié)構(gòu)的賴氨酸結(jié)合位點(diǎn)不直接涉及抑制活性。這些kringle結(jié)構(gòu)的氨基酸保守和功能不同提供了研究在進(jìn)化期間通過DNA復(fù)制造成的作用突變的理想系統(tǒng)。通過一組結(jié)構(gòu)有關(guān)的蛋白質(zhì)表現(xiàn)出的相對(duì)于血管生成調(diào)節(jié)的類似的不同活性在-C-X-C-化學(xué)促活和催乳激素生長(zhǎng)激素族中發(fā)現(xiàn)(Maione，T.E.，Gray，G.S.，Petro，A.J.，Hunt，A.L.和Donner，S.I.(1990)科學(xué)247，77-79.；Koch，A.E.，Polverini，P.J.，Kunkel，S.L.，Harlow，L.A.，DiPietro，L.A.，F(xiàn)iner，V.M.，F(xiàn)iner，S.J.和Strieter，R.M.(1992)科學(xué)258，1798-1801.；Cao，Y.，Chen，C.，Weatherbee，J.A.，Tsang，M.，和Folkman，J.(1995)J.Exp.Med.182，2069-2077.；Strieter，R.M.，Polverini，P.J.，Arenberg，D.A.和Kunkel，S.L.(1995)Shock4，155-160.；Jackson，D.，Volpert，O.V.，Bouck，N.和Linter，D.I.H.(1994)科學(xué)266，1581-1584)。進(jìn)一步的序列分析表明K4包含與半胱氨酸22和78鄰近的帶兩個(gè)正電荷的賴氨酸殘基(圖35)。1H核磁共振(NMR)分析顯示這4個(gè)賴氨酸和賴氨酸57一起形成K4的帶正電的結(jié)構(gòu)域的核心(LlinasM，未發(fā)表的數(shù)據(jù))，而其它的kringle結(jié)構(gòu)缺乏這樣的帶正電的結(jié)構(gòu)域。這類富含賴氨酸的結(jié)構(gòu)域是否有助于人纖溶酶原的kringle4失去抑制活性仍在研究中。以前報(bào)導(dǎo)K4可刺激其它細(xì)胞類型的增殖并增加胞內(nèi)鈣的釋放(Donate，L.E.，Gherardi，E.，Srinivasan，N.，Sowdhamini，R.，Aporicio，S.和Blundell，T.L.(1994)蛋白質(zhì)科學(xué)3，2378-2394)。從血管抑制素除去K4加強(qiáng)其對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞抑制活性的事實(shí)表明這種結(jié)構(gòu)可以防止K1-3的某些抑制作用。血管抑制素及其有關(guān)的kringle片段如何特異性地抑制內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)的機(jī)理的特征仍未確定。抑制是否是由在增殖內(nèi)皮細(xì)胞中特異性表達(dá)的受體介導(dǎo)，或血管抑制素是否通過內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)部化并隨后抑制細(xì)胞增殖在目前仍不清楚。另外，血管抑制素可以與內(nèi)皮細(xì)胞粘著受體(如整聯(lián)蛋白avb3)相互作用，封閉整聯(lián)蛋白介導(dǎo)的血管生成(Brooks，P.C.，Montgomery，A.M.，Rosenfeld，M.，ReisfeldR.A.，Hu，T.Klier，G.和Cheresh，D.A.(1994)細(xì)胞79，1157-1164)。令人感興趣的是，F(xiàn)riedlander等(Friedlander，M.，Brooks，P.C.，Shaffer，R.W.，Kincaid，C.M.，Varner，J.A.和Cheresh，D.A.(1995)270，1502)不久前報(bào)導(dǎo)體內(nèi)角膜的血管生成或絨毛膜尿囊膜模型(受bFGF和腫瘤壞死因子誘導(dǎo))是avb3整聯(lián)蛋白依賴性的。然而，通過VEGF、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子a或佛波醇酯刺激的血管生成對(duì)avb5是依賴性的。對(duì)單獨(dú)整聯(lián)蛋白特異性的抗體封閉這些途徑之一，兩種整聯(lián)蛋白的循環(huán)蛋白質(zhì)拮抗劑封閉了受每種細(xì)胞因子誘導(dǎo)的血管生成(Friedlander，M.，Brooks，P.C.，Shaffer，R.W.，Kincaid，C.M.，Varner，J.A.和Cheresh，D.A.(1995)270，1502)。因?yàn)閎FGF-和VEGF-誘導(dǎo)的血管生成受血管抑制素抑制，它可以封閉這些整聯(lián)蛋白-介導(dǎo)的血管生成的通常途徑。在最近十年中鑒定了越來越多的內(nèi)源血管生成抑制劑(Folkman，J.(1995)N.Engl.J.Med.333，1757-1763)。在九個(gè)已確定特征的內(nèi)皮細(xì)胞抑制劑中，有幾個(gè)抑制劑是蛋白酶解的片段。例如，人催乳激素的16kDaN-末端片段抑制內(nèi)皮細(xì)胞增殖并封閉體內(nèi)的血管生成(Clapp，C.，Martial，J.A.，Guzman，R.C.，Rentierdelrue，F(xiàn).和Weiner，R.I.(1993)Endorinology133，1292)。在最近的論文中，DAngelo等報(bào)道抗血管生成的16kDaN-末端片段在毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞中抑制由VEGF和bFGF引起的促細(xì)胞分裂劑活化的蛋白質(zhì)激酶(MAPK)的活化(DAngelo，G.，Struman，I.，Martial，J.和Weiner，R.(1995)美國(guó)科學(xué)院學(xué)報(bào)92，6374-6378)。類似于血管抑制素，催乳激素的完整親本分子不抑制內(nèi)皮細(xì)胞增殖，它也不是血管生成抑制劑。血小板因子(PF-4)在高濃度下抑制血管生成(Maione，T.E.，Gray，G.S.，Petro，A.J.，Hunt，A.L.和Donner，S.I.(1990)科學(xué)247，77；Cao，Y.，Chen，C.，Weatherbee，J.A.，Tsang，M.和Folkman，J.(1995)J.ExP.Med.182，2069-2077)。然而，N-末端截短的蛋白酶解裂解的PF-4片段在其抗增殖活性上相對(duì)于完整的PF-4分子顯示出30-至50-倍的增長(zhǎng)(Gupta，S.K.，Hassel，T.和Singh，J.P.(1995)美國(guó)科學(xué)院學(xué)報(bào)92，7799-7803)。纖連蛋白、鼠表皮生長(zhǎng)因子和糖蛋白G的更小蛋白質(zhì)片段也顯示出特異性地抑制內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)(Homandberg，G.A.，Wiliiams，J.E.，Grant，D.，Schumacher，B.和Eisenstein，R.(1985)Am.J.Bathol.120，327-332；Nelson，J.，Alien，W.E.，Scott，W.N.，Bailie，J.R.，Walker，B.，McFerran，N.V.和Wilson，D.J.(1995)癌癥研究55，3772-3776；Tolsma，S.S.，Volpert，O.V.，Good，D.J.，F(xiàn)razer，W.A.，Polverini，P.J.和Bouck，N.(1993)細(xì)胞生物學(xué)雜志122，497-511)。大蛋白質(zhì)的蛋白酶解加工可以改變?cè)瓉矸肿拥臉?gòu)象結(jié)構(gòu)或使抗血管生成的新的表位暴露出來。這樣，在血管生成的調(diào)節(jié)中蛋白酶可能起關(guān)鍵作用。到目前為止，對(duì)于這些蛋白酶活性在體內(nèi)的調(diào)節(jié)知道的很少。數(shù)據(jù)也表明在血管抑制素中二硫鍵介導(dǎo)的kringle結(jié)構(gòu)的折疊對(duì)保持其對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制活性的優(yōu)選的。在纖溶酶原中類似于這些結(jié)構(gòu)的Kringle結(jié)構(gòu)也在各種其它的蛋白質(zhì)中發(fā)現(xiàn)。例如，載脂蛋白(a)具有多達(dá)37個(gè)的纖溶酶原kringle4的重復(fù)序列(McLean，J.W.，Tomlinson，J.E.，Kuang，W.-J.，Eaten，D.L.，Chen，E.Y.，F(xiàn)less，G.M.，Scanu，A.M.和Lawn，R.M.(1987)自然330，132-137)。凝血酶原的氨基末端也包含和纖溶酶原的kringles同源的兩個(gè)kringles(Walt，D.A.，Hewett-Emmett，D.和Seegers，W.H.(1977)美國(guó)科學(xué)院學(xué)報(bào)，74，1969-1973)。曾表明尿激酶具有和纖溶酶原有廣泛同源性的kringle結(jié)構(gòu)(Gunzler，W.A.，J.，S.A.，J.，Otting，F(xiàn).，Kim，S.-M.A.，F(xiàn)rankus，E.，andFlohe，L.(1982)Hoppe-SeylerSA.生理化學(xué)363，1155-1165)。此外，表面活性劑蛋白質(zhì)B和肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(HGF)也具有kringle結(jié)構(gòu)(Johansson，J.，Curstedt，T.和Jiirnvall.，H.(1991)生物化學(xué)30，6917-6921；Lukker，N.A.，Presta，L.G.，andGodowski，P.J.(1994)Prot.Engin.7，895-903)。實(shí)施例28通過血管抑制素片段抑制轉(zhuǎn)移和內(nèi)皮細(xì)胞增殖下列實(shí)施例確定了其它的血管抑制素片段活性的特征。數(shù)據(jù)表明可以從血管抑制素的這樣的蛋白質(zhì)片段獲得有效的抗內(nèi)皮和腫瘤抑制活性。除非在其所使用的上下文中特別指出，本文所使用的kringle1-4BKLS指具有內(nèi)皮細(xì)胞抑制活性并具有包含同源于kringle1-4BKLS之序列的氨基酸序列的纖溶酶原的蛋白質(zhì)衍生物，例如(但不限于)，鼠kringle1-4BKLS(SEQIDNO41)和人kringle1-4BKLS(SEQIDNO42)。鼠kringle1-4BKLS(SEQIDNO41)相應(yīng)于SEQIDNO1的鼠纖溶酶原的氨基酸位置93至470(包含)。本實(shí)施例證明血管抑制素片段可以是纖溶酶原片段并包含比在SEQIDNO3(例如)中提出的血管抑制素更大的氨基酸序列，并具有治療內(nèi)皮細(xì)胞增殖的抑制活性或抗血管生成活性。kringle1-4BLKS氨基酸序列和上面鑒定的特異性kringle1-4BLKS序列同源。優(yōu)選地，氨基酸序列和公開的序列具有至少60％、更優(yōu)選地有至少70％、更優(yōu)選地有至少80％的同源性程度。應(yīng)該理解對(duì)上述所列片段可以進(jìn)行各種氨基酸的取代、添加、缺失或其它修飾以改進(jìn)或修飾片段的內(nèi)皮細(xì)胞抑制活性。這樣的修飾無意于超出權(quán)利要求的范圍和精神。而且，可以理解在上述鑒定的kringle片段中可以進(jìn)行各種氨基酸的取代、添加、缺失或其它修飾，這不顯著地改變片段的內(nèi)皮細(xì)胞增殖抑制活性，因此這無意于超出權(quán)利要求的范圍。在巴斯德畢赤酵母中克隆血管抑制素使用Vent聚合酶(NewEnglandBiolabs)、分別包含接頭Xhol和EcoR1的引物#154(5-ATCGCTCGAGCGTTATTTGAAAAGAAAGTG-3′)(SEQIDNO43)和#151(5-ATCGGAATTCAAGCAGGACAACAGGCGG-3)(SEQIDNO44)并使用質(zhì)粒pTrcHis/HAs作為模板通過PCR擴(kuò)增編碼血管抑制素的序列。該質(zhì)粒包含編碼人纖溶酶原的氨基酸93至470的序列(SEQIDNO42)，使用巴斯德畢赤酵母天然分泌信號(hào)PHO1將該序列克隆進(jìn)pHIL-S1表達(dá)載體的XhoI/ECoR1位點(diǎn)。以相同的方式使用分別包含接頭SnaB1和EcoRI的引物#156(5-ATCGTACGTATTATTTGAAAAGAAAGTG-3(SEQIDNO45)和#151擴(kuò)增相同的序列，用α-因子分泌信號(hào)將該序列克隆進(jìn)表達(dá)載體pP1C9的SnaB1/EcoR1位點(diǎn)中。凝膠純化擴(kuò)增的產(chǎn)物，以適當(dāng)?shù)拿赶宇^，再次使用基因洗滌物(gene-clean)(Bio101)純化。把這些基因片段連接進(jìn)適當(dāng)?shù)妮d體中。選擇形成的克隆，獲得克隆的和質(zhì)粒制劑，當(dāng)轉(zhuǎn)化進(jìn)巴斯德畢赤酵母宿主菌株GS115中時(shí)線性化以產(chǎn)生His+Muts和His+Mut+重組菌株。通過PCR確認(rèn)整合。用甲醇誘導(dǎo)His+Muts和His+Mut+重組體并使用考馬斯染色的SDS-PAGE凝膠和使用抗kringles1至3小鼠單克隆抗體的免疫印跡篩選血管抑制素的高度表達(dá)的重組體(Castellino，酶研究實(shí)驗(yàn)室公司，SouthBend，IN)。從這些重組體中，選擇GS115轉(zhuǎn)化的巴斯德畢赤酵母克隆pHIL-S1/HAs18并通過表型確定其特征為His+Muts。pHIL-S1/HAs18的表達(dá)對(duì)于His+Muts克隆，從PHIL-S1/HAs18表達(dá)血管抑制素是典型的。在擋板振蕩的培養(yǎng)瓶中誘導(dǎo)時(shí)，在1L的擋板培養(yǎng)瓶中于150ml緩沖metanol復(fù)合物培養(yǎng)基(包含1％酵母提取物、2％胨、100mM磷酸鉀pH6.0、具有硫酸銨的1.34％酵母氮堿、0.00004％生物素和0.5％甲醇)中培養(yǎng)1L的OD600細(xì)胞。細(xì)胞在30℃、250rpm下恒定振蕩。通過添加甲醇至最終0.5％在24小時(shí)間隔內(nèi)分批加入無水甲醇。120小時(shí)后，以5,000rpm旋轉(zhuǎn)離心細(xì)胞10分鐘，把上清液保存在70℃待用。通過賴氨酸-瓊脂糖凝膠色譜從巴斯德畢赤酵母發(fā)酵肉湯純化血管抑制素所有步驟在4℃下進(jìn)行。通過以14,000×g離心澄清包含血管抑制素的粗發(fā)酵肉湯(典型地是200ml)，并通過Centriprep30(amicon)濃縮30kDa的分子量，切掉(cutoff)膜至原來體積的約四分之一。一體積的50mM磷酸鹽緩沖液pH7.5添加至濃縮的樣品中，該樣品再通過Centriprep濃縮至原來樣品體積的四分之一。用50mM磷酸鈉緩沖液pH7.5以體積體積再次稀釋樣品。把60g的賴氨酸-瓊脂糖凝膠4B(Pharmacia)重新懸浮在500ml冰冷的50mM磷酸鹽緩沖液pH7.5中并用于填充48×100mm柱(～180ml填充的體積)。柱用7.5倍柱體積(CV)的50mM磷酸鈉緩沖液(pH7.5)以1.5ml/分鐘的流速洗滌過夜。把樣品以1.5ml/分鐘的流速泵入柱中，并以1.5CV的50mM磷酸鈉(pH7.5)以3ml/分鐘的流速洗滌柱。然后用1.5CV磷酸鹽緩沖鹽水(pH7.4)以3ml/分鐘的流速洗滌柱然后用0.2Mε-氨基-N-己酸pH7.4以3ml/分鐘的流速洗脫血管抑制素。收集包含明顯的吸光度的片段、對(duì)去離子水透析24-48小時(shí)并凍干。100mg總蛋白質(zhì)裝載量典型地回收到10mg血管抑制素。使用5倍柱體積的50mM磷酸鈉/1MNaCl(pH7.5)再生柱。牛毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖測(cè)定如上所述獲得牛毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞。把細(xì)胞保持在75cm2細(xì)胞-培養(yǎng)瓶中的用10％加熱滅活的小牛血清、100U/ml青霉素、100mg/ml鏈霉素以及0.25mg/ml二性霉素B(BioWhittaker)補(bǔ)加的包含3mg/ml的重組人bFGF(SciosNova，Mountainview，CA)的DMEM中。如上所述進(jìn)行測(cè)定。動(dòng)物研究用鼠Lewis肺癌低轉(zhuǎn)移性(LLC-LM)細(xì)胞系(1×106個(gè)細(xì)胞/注射)皮下接種六至八周齡的雄性C57BI/6J小鼠(Jackson實(shí)驗(yàn)室)。在移植后約14天，當(dāng)原發(fā)性瘤達(dá)到1.5cm3時(shí)，用甲氧氟烷麻醉動(dòng)物并手術(shù)切除原發(fā)性瘤。以簡(jiǎn)單的切斷縫線縫合切割位點(diǎn)。在手術(shù)后該組中的一半動(dòng)物立即接收裝載劑量(通過皮下路線施用3mg/kg)的重組體或源于纖溶酶原的血管抑制素，其后每日接種1.5mg/kg，進(jìn)行14天。對(duì)照組小鼠在手術(shù)后14天內(nèi)每天接收相等體積的PBS。在原發(fā)性瘤除去后14天處死所有小鼠(在腫瘤移植后28天)，切下肺臟并稱重，以體視顯微鏡計(jì)數(shù)表面轉(zhuǎn)移。重組人血管抑制素片段的特征在巴斯德畢赤酵母(甲基營(yíng)養(yǎng)酵母)中表達(dá)編碼人血管抑制素的基因片段(包括人纖溶酶原的kringles1至4，總共包含26個(gè)半胱氨酸)。巴斯德畢赤酵母表達(dá)的血管抑制素結(jié)合賴氨酸瓊脂糖凝膠并可以由ε-氨基己酸特異性地洗脫。這表明全功能性的ε-氨基己酸結(jié)合的kringle(s)(這是纖溶酶原的kringle1和4的物理性質(zhì))(Sottrup-Jensen，L.等，化學(xué)纖維蛋白溶解和血栓溶解進(jìn)展，第3卷(1978)Ravens出版社，N.Y.191)可以通過巴斯德畢赤酵母表達(dá)并分泌，并可以通過不需重新折疊的技術(shù)純化(圖36A和B)。通過抗kringle1至3構(gòu)象依賴性的單克隆抗體(Castellino，酶研究實(shí)驗(yàn)室公司，SouthBend，IN)(圖36B)可識(shí)別巴斯德畢赤酵母表達(dá)的血管抑制素以及通過用彈性蛋白酶裂解纖溶酶原純化的血管抑制素。這種抗體不能識(shí)別還原形式的纖溶酶原或血管抑制素。觀察到巴斯德畢赤酵母表達(dá)的血管抑制素為雙重線，其在變性的非還原SDS-PAGE考馬斯染色的凝膠上遷移到49kDa和51.5kDa。巴斯德畢赤酵母表達(dá)的蛋白質(zhì)以多數(shù)高-甘露糖型的N-連接的葡基化和不明顯的O-連接的葡基化翻譯后修飾。為了評(píng)價(jià)在巴斯德畢赤酵母表達(dá)的血管抑制素中葡基化的可能性，用對(duì)高甘露糖結(jié)構(gòu)特異性的內(nèi)糖苷酶H消化重組血管抑制素，這造成51.5kDa帶和49kDa帶遷移相同(圖37A和B)。用預(yù)先的神經(jīng)氨酸苷酶處理O-聚糖酶消化物以除去唾液酸殘基不改變雙重線遷移的方式(數(shù)據(jù)未顯示)。這些結(jié)果表明巴斯德畢赤酵母以兩種形式表達(dá)血管抑制素(1)具有N-連接的復(fù)合物鏈，其可能的結(jié)構(gòu)(Man)2-150-ManMan-GlcNAc---GlcNAc-Asn-(Man)1-2-Man(2)沒有任何葡基化。體外牛毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的抑制為了確定重組表達(dá)的血管抑制素是否具有抗血管生成活性的潛力，在bFGF存在下培養(yǎng)BCEs以確定純化的重組血管抑制素的添加是否抑制BCEs的增殖。純化的巴斯德畢赤酵母表達(dá)的血管抑制素在體外以劑量依賴性方式(圖38C)抑制牛內(nèi)皮細(xì)胞bFGF-驅(qū)動(dòng)的增殖(圖38B)。在1μg/ml的重組血管抑制素時(shí)，抑制率是80％。50％的抑制率等同于用源于人纖溶酶原的彈性蛋白酶裂解的血管抑制素獲得的抑制率。體內(nèi)轉(zhuǎn)移的抑制使用可移植的鼠LLC(LM)細(xì)胞系(從該細(xì)胞系中首先鑒定出血管抑制素)。當(dāng)皮下移植進(jìn)同基因的C57B1/6J小鼠中時(shí)，這些腫瘤生長(zhǎng)迅速，在14天內(nèi)產(chǎn)生＞1.5cm3的腫瘤。在切除原發(fā)性瘤后，肺臟中的微轉(zhuǎn)移指數(shù)生長(zhǎng)，直到完全覆蓋肺臟表面。這些轉(zhuǎn)移到切除原發(fā)性瘤后第14天時(shí)高度血管形成。如果留下原發(fā)性瘤，微轉(zhuǎn)移保持潛伏，肉眼不能觀察到。在原發(fā)性瘤切除后對(duì)小鼠全身施用重組血管抑制素以試驗(yàn)轉(zhuǎn)移生長(zhǎng)的抑制。以30μg/小鼠/天全身施用巴斯德畢赤酵母表達(dá)的血管抑制素抑制了轉(zhuǎn)移的生長(zhǎng)，這可以通過表面轉(zhuǎn)移的擦傷(圖39A)和總肺臟重量(圖39B)定量測(cè)定。切除了原發(fā)性瘤并接收每日劑量的重組血管抑制素或血管抑制素(從纖溶酶原的彈性蛋白酶裂解獲得)的小鼠的肺臟重量和正常小鼠的肺臟重量(190至200mg)是可比較的。切除了原發(fā)性瘤并在隨后使用每日劑量的重組血管抑制素處理的小鼠的肺臟是粉紅色的，具有最小的未血管形成的微轉(zhuǎn)移數(shù)量(圖40)。相反，切除了原發(fā)性瘤并使用鹽水處理的小鼠的肺臟被血管形成的轉(zhuǎn)移覆蓋(圖41)。同時(shí)值得注意的重要性是無由巴斯德畢赤酵母表達(dá)的血管抑制素在以用于本研究的劑量與用藥制度時(shí)造成的全身或局部毒性。在所有處理的小鼠中沒有發(fā)炎或流血的證據(jù)。由巴斯德畢赤酵母表達(dá)的血管抑制素蛋白質(zhì)具有天然蛋白質(zhì)的兩個(gè)重要的物理特征(1)它可被抗人纖溶酶原的kringle1至3產(chǎn)生的構(gòu)象依賴性的單克隆抗體識(shí)別(圖36B)，(2)它結(jié)合賴氨酸(圖36A和B)。這些性質(zhì)表明重組血管抑制素蛋白質(zhì)以模仿天然分子的構(gòu)象表達(dá)。巴斯德畢赤酵母表達(dá)的血管抑制素蛋白質(zhì)在體外抑制由bFGF刺激的牛毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖(圖38)。當(dāng)全身施用時(shí)，重組血管抑制素使其它致死的轉(zhuǎn)移性Lewis肺癌保持在抑制狀態(tài)(圖39A和B與圖40)。初步的數(shù)據(jù)顯示在從小鼠中新切除的Lewis肺臟腫瘤或4次繼代培養(yǎng)的LLC細(xì)胞的體外培養(yǎng)物中無可檢測(cè)的血管抑制素的轉(zhuǎn)錄物。通過肝臟產(chǎn)生的纖溶酶原以1.6±0.2μM的穩(wěn)定的血漿濃度保持在循環(huán)中。可能的是LLC-LM腫瘤產(chǎn)生裂解纖溶酶原的酶(結(jié)合或在循環(huán)中)以產(chǎn)生血管抑制素。另外吸引至腫瘤位點(diǎn)的發(fā)炎細(xì)胞可以產(chǎn)生這樣的酶。有趣的是巴斯德畢赤酵母和天然的人纖溶酶原以葡基化和非葡基化的形式產(chǎn)生。在人纖溶酶原的情況下，單個(gè)基因的單個(gè)轉(zhuǎn)錄物可以產(chǎn)生兩種形式。人纖溶酶原的有差別的翻譯后修飾以及在TPA中所觀察到的分子機(jī)制是未知的。巴斯德畢赤酵母可高度表達(dá)血管抑制素。上清液包含100mg/L的蛋白質(zhì)。因此，臨床試驗(yàn)所需的數(shù)量應(yīng)該可以簡(jiǎn)單地用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)產(chǎn)生和純化。這個(gè)表達(dá)系統(tǒng)的開發(fā)和純化的重組血管抑制素在體外和體內(nèi)抗轉(zhuǎn)移活性的證明提供了評(píng)價(jià)這些片段的能力，以抑制腫瘤生長(zhǎng)并延長(zhǎng)癌癥患者和其它患血管生成介導(dǎo)的疾病患者的生命的基礎(chǔ)。實(shí)施例29集合血管抑制素的產(chǎn)生和施用本實(shí)施例證明了集合血管抑制素的產(chǎn)生與施用抑制內(nèi)皮細(xì)胞增殖和腫瘤生長(zhǎng)。通常假定從大腸桿菌產(chǎn)生的重組蛋白質(zhì)需要凍干并重新折疊(復(fù)性、還原并烷基化)以完成體內(nèi)活性。在該過程中，常失去顯著數(shù)量的蛋白質(zhì)。在本實(shí)施例中，在純化后產(chǎn)生集合重組血管抑制素并直接使用(不進(jìn)一步復(fù)性、還原和烷基化)以抑制血管生成和腫瘤生長(zhǎng)。因此，本實(shí)施例提供了令人驚奇地有效的產(chǎn)生和使用血管抑制素的方法。這種集合血管抑制素和施用方法也提供了血管抑制素的持久釋放方式，進(jìn)而優(yōu)化了其效率。本文所使用的集合血管抑制素指實(shí)質(zhì)上純化的但不是人工重新折疊的血管抑制素，這在下面更詳細(xì)地描述。血管抑制素的表達(dá)使用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)(有快、多產(chǎn)和廉價(jià)的優(yōu)勢(shì))表達(dá)小鼠血管抑制素。設(shè)計(jì)兩種寡核苷酸引物(在纖溶酶原kringles1-4(纖溶酶原cDNA從ATCC購(gòu)得)的cDNA序列的側(cè)翼)用于基于PCR的構(gòu)建血管抑制素表達(dá)系統(tǒng)的策略(參見，例如，Menhart，N.，Shel，L.C.，Kelly，R.F.，andCastellino，F(xiàn).J.(1991)生物化學(xué)30，1948-1957)；Marti，D.，Schaller，J.，Ochensberger，B.，andRickli，E.E.(1994)歐洲生物化學(xué)雜志219，455-462；Sijhndel，S.，Hu，C.-K.，Marti，D.，Affolter，M.，Schaller，J.，Llinas，M.，andRickli，E.E.(1996)生物化學(xué)待出版；Rejante，M.R.，Byeon，I.-J.L.，andLlinas，M.(1991)生物化學(xué)30，11081-11092)。把PCR產(chǎn)物插入到包含T7lac啟動(dòng)子和寡組氨酸序列的pET22載體(Novegen)的NcoI和XhoI位點(diǎn)中。然后把cDNA轉(zhuǎn)化進(jìn)包含lacUV5控制下的T7RNA聚合酶基因的染色體拷貝的大腸桿菌(菌株BL21(DE3))。通過添加IPTG誘導(dǎo)重組血管抑制素的表達(dá)。表達(dá)的血管抑制素作為包含體在宿主細(xì)胞中積聚并典型地由40％以上的總細(xì)胞蛋白質(zhì)組成(通過考馬斯藍(lán)染色估計(jì))。本發(fā)明包括可以在本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的各種載體和宿主系統(tǒng)中表達(dá)的源于任何適當(dāng)物種的重組血管抑制素或其片段。血管抑制素的純化和集合通過以9,000rpm離心25分鐘并重復(fù)洗滌純化含有包含體的聲處理的宿主細(xì)胞的不溶性片段。形成的產(chǎn)物通過考馬斯藍(lán)染色估計(jì)包含約80％血管抑制素。融合蛋白的N-末端寡組氨酸結(jié)構(gòu)域使得在變性條件下，通過把包含體溶解于6M尿素中，用Ni2+-NTA瓊脂糖柱(1.5cm×5cm)上的螯合親和性色譜方便和經(jīng)濟(jì)地純化重組血管抑制素成為可能。如圖41泳道7所觀察到的，純化的血管抑制素通過考馬斯藍(lán)染色在SDS-PAGE上顯示出單帶，其具有約45kD至65kD，更優(yōu)選地是約55kD的遷移率。這一步的色譜可以把蛋白質(zhì)純化至實(shí)質(zhì)上均一，然而，本發(fā)明包括可以使用各種其它本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的純化技術(shù)產(chǎn)生這種產(chǎn)物。然后使在洗脫緩沖液中的蛋白質(zhì)于4℃下對(duì)磷酸緩沖鹽水(PBS)透析(15,000MWCO)24小時(shí)，更換3次透析液。在透析期間可以觀察到白色沉淀。然后從透析袋中取出樣品并通過離心除去沉淀。使用渦流把沉淀重新懸浮在PBS中以形成在動(dòng)物模型中使用的良好懸浮液或在-20℃下保存。這種沉淀提供了集合血管抑制素。另外，例如，可以使用20mMtris-HClpH7.9/150mMNaCl作為透析緩沖液。本發(fā)明涉及或多或少的透析，并且其它各種透析緩沖液可以用于產(chǎn)生相應(yīng)量的集合血管抑制素(基于本發(fā)明的說明書，在本領(lǐng)域技術(shù)人員通?？纱_定的限制內(nèi))。集合血管抑制素的體外試驗(yàn)在如實(shí)施例8概述的測(cè)定中使用牛毛細(xì)血管內(nèi)皮(BCE)細(xì)胞。用如本實(shí)施例所述制備的集合重組人血管抑制素刺激細(xì)胞以激發(fā)免疫反應(yīng)。結(jié)果在圖42中顯示，該圖表明接觸集合血管抑制素的內(nèi)皮細(xì)胞的明顯抑制。集合血管抑制素的體內(nèi)試驗(yàn)所有的動(dòng)物工作按照制訂的指標(biāo)在兒童醫(yī)院的動(dòng)物設(shè)備上進(jìn)行。A.如本實(shí)施例中所述制備的集合重組小鼠血管抑制素用雞CAM測(cè)定試驗(yàn)。(O′Reilly，M.S.，Holmgren，L.，Shing，Y.，Chen，C.，Rosenthal，R.A.，Moses，M.，Lane，W.S.，Cao，Y.，Sage，E.H.，andFolkman，細(xì)胞雜志(1994)79315-328)。以25μg的劑量，毛細(xì)血管形成的抑制率是100％(試驗(yàn)的所有五只雞CAM產(chǎn)生2-3+抑制區(qū))。以100μg的劑量，毛細(xì)血管形成的抑制持續(xù)96小時(shí)。已知其它血管生成抑制劑和源于纖溶酶原的血管抑制素持續(xù)約48小時(shí)。這表明集合血管抑制素提供了持久釋放的優(yōu)勢(shì)。B.把Lewis肺癌接種進(jìn)C57B16小鼠的皮下背部中間。把在0.1mlPBS中的如上所述制備的1×106細(xì)胞移植進(jìn)小鼠中，并以6或更少的組籠養(yǎng)。以圓盤測(cè)徑器測(cè)定腫瘤，使用公式寬度×寬度×長(zhǎng)度×0.52測(cè)定腫瘤體積，在最后一次的點(diǎn)上測(cè)定處理和對(duì)照腫瘤體積的比(T/C)。在腫瘤體積是100-200mm3后(這在3-5天內(nèi)發(fā)生)，把小鼠隨機(jī)化進(jìn)行兩個(gè)不同的實(shí)驗(yàn)。在第一個(gè)實(shí)驗(yàn)中，小鼠接收2-3mg/kg在PBS中的集合重組小鼠血管抑制素懸浮液(每24小時(shí)在遠(yuǎn)離腫瘤的位點(diǎn)皮下注射(n＝3只小鼠/組))。對(duì)照組接收可比較的鹽水注射。在第二個(gè)不同的實(shí)驗(yàn)中(n＝6只小鼠/組)，試驗(yàn)小鼠接收10mg/kg在PBS中的集合重組小鼠血管抑制素懸浮液(每24小時(shí)在遠(yuǎn)離腫瘤的位點(diǎn)皮下注射)。對(duì)照組接收可比較的鹽水注射。在任何使用集合重組血管抑制素懸浮液處理的小鼠中都沒有觀察到毒性或重量損耗。在小鼠中，注射后觀察到集合血管抑制素在皮下聚集，血管抑制素在幾小時(shí)的時(shí)期內(nèi)吸收。這表明它逐漸溶解，也表明集合血管抑制素是持久釋放的有效的方式。在兩種劑量下，在處理的小鼠中有明顯的Lewis肺癌原發(fā)性瘤的生長(zhǎng)抑制。參見圖43和44。通過給出10mg/kg/天作為19天的單一注射獲得的T/C(當(dāng)鹽水對(duì)照動(dòng)物開始死亡和被處死時(shí))是0.06，據(jù)本發(fā)明的發(fā)明人所知這是以前從未達(dá)到的腫瘤體積減小。本實(shí)施例的體外和體內(nèi)結(jié)果為預(yù)期成功地使用所述的在人中的內(nèi)皮細(xì)胞增殖、血管生成和腫瘤生長(zhǎng)的抑制的產(chǎn)物與方法提供了合理的基礎(chǔ)。不希望受到理論的束縛，本發(fā)明的方法產(chǎn)生的集合重組血管抑制素可以具有與通常復(fù)性的彈性蛋白酶產(chǎn)生的血管抑制素或其它純化的蛋白質(zhì)不同的構(gòu)象，因此具有不同的物理性質(zhì)。通過使蛋白質(zhì)溶液對(duì)較大體積的緩沖液或水透析，沉淀純化的重組血管抑制素以形成集合懸浮液。相信這發(fā)生是由于不適當(dāng)折疊的蛋白質(zhì)成為不溶性的和集合的。以前沒有預(yù)料到變性的集合蛋白質(zhì)在體內(nèi)有如此顯著的效果。所說明的有效的抗腫瘤活性也被認(rèn)為是由于集合蛋白質(zhì)從皮下位點(diǎn)緩慢但恒定地溶解和釋放。本發(fā)明還包括在所述的純化方法中可以使用天然產(chǎn)生的或重組血管抑制素以及血管抑制素片段以產(chǎn)生集合的天然或重組血管抑制素或血管抑制素的集合片段，它們可以不需要復(fù)性而用于成功地抑制內(nèi)皮細(xì)胞增殖和腫瘤生長(zhǎng)。應(yīng)該理解上面僅涉及本發(fā)明的優(yōu)選的實(shí)施方案，在不背離所附的權(quán)利要求的本發(fā)明的精神和范圍時(shí)可以進(jìn)行許多修飾或改變。本文一并參考了本文所提到的各種參考文獻(xiàn)。序列表(1)一般信息(i)申請(qǐng)人Folkman，M.JudahOReilly，MichealYihaiCaoSim.B.KimLee(ii)發(fā)明名稱血管抑制素片段及其使用方法(iii)序列數(shù)45(iv)通訊地址(A)收信人JonesAskew(B)街道191Peachtree街，第37層(C)城市亞特蘭大(D)州佐治亞(E)國(guó)家美國(guó)(F)郵區(qū)代碼30303-1769(v)計(jì)算機(jī)可讀形式(A)介質(zhì)類型軟盤(B)計(jì)算機(jī)IBMPC兼容機(jī)(C)操作系統(tǒng)PC-DOSMS-DOS(D)軟件第1.0PatentlnRelease#，1.30版#(vi)當(dāng)前申請(qǐng)數(shù)據(jù)(A)申請(qǐng)?zhí)柮绹?guó)(B)申請(qǐng)日(C)分類號(hào)(viii)律師/代理人信息(A)姓名Warren，WilliamL.(B)登記號(hào)36，714(C)參考/檔案號(hào)05213-0126(ix)電信信息(A)電話404-818-3700(B)傳真404-818-3799(2)SEQIDNO1的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度812個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(iii)假設(shè)否(iv)反義否(v)片段類型N-末端(vi)原始來源(A)有機(jī)體鼠(vii)現(xiàn)在來源(B)克隆纖溶酶原(xi)序列描述SEQIDNO1MetAspHisLysGluValIleLeuLeuPheLeuLeuLeuLeuLysPro151015GlyGlnGlyAspSerLeuAspGlyTyrIleSerThrGlnGlyAlaSer202530LeuPheSerLeuThrLysLysGlnLeuAlaAlaG1yGlyValSerAsp354045CysLeuAlaLysCysGluGlyGluThrAspPheValCysArgSerPhe505560GlnTyrHisSerLysGluGlnGlnCysValIleMetAlaGluAsnSer65707580LysThrSerSerIleIleArgMetArgAspValIleLeuPheGluLys859095ArgValTyrLeuSerGluCysLysThrGlyIleGlyAsnGlyTyrArg100105110GlyThrMetSerArgThrLysSerGlyValAlaCysGlnLysTrpGly115120125AlaThrPheProHisValProAsnTyrSerProSerThrHisProAsn130135140GluGlyLeuGluGluAsnTyrCysArgAsnProAspAsnAspGluGln145150155160GlyProTrpCysTyrThrThrAspProAspLysArgTyrAspTyrCys165170175AsnIleProGluCysGluGluGluCysMetTyrCysSerGlyGluLys180185190TyrGluGlyLysIleSerLysThrMetSerGlyLeuAspCysGlnAla195200205TrpAspSerGlnSerProHisAlaHisGlyTyrIleProAlaLysPhe210215220ProSerLysAsnLeuLysMetAsnTyrCysHisAsnProAspGlyGlu225230235240ProArgProTrpCysPheThrThrAspProThrLysArgTrpGluTyr245250255CysAspIleProArgCysThrThrProProProProProSerProThr260265270TyrGlnCysLeuLysGlyArgGlyGluAsnTyrArgGlyThrValSer275280285ValThrValSerGlyLysThrCysGlnArgTrpSerGluGlnThrPro290295300HisArgHisAsnArgThrProGluAsnPheProCysLysAsnLeuGlu305310315320GluAsnTyrCysArgAsnProAspGlyGluThrAlaProTrpCysTyr325330335ThrThrAspSerGlnLeuArgTrpGluTyrCysGluIleProSerCys340345350GluSerSerAlaSerProAspGlnSerAspSerSerValProProGlu355360365GluGlnThrProValValGlnGluCysTyrGlnSerAspGlyGlnSer370375380TyrArgGlyThrSerSerThrThrIleThrGlyLysLysCysGlnSer385390395400TrpAlaAlaMetPheProHisArgHisSerLysThrProGluAsnPhe405410415ProAspAlaGlyLeuGluMetAsnTyrCysArgAsnProAspGlyAsp420425430LysGlyProTrpCysTyrThrThrAspProSerValArgTrpGluTyr435440445CysAsnLeuLysArgCysSerGluThrGlyGlySerValValGluLeu450455460ProThrValSerGlnGluProSerGlyProSerAspSerGluThrAsp465470475480CysMetTyrGlyAsnGlyLysAspTyrArgGlyLysThrAlaValThr485490495AlaAlaGlyThrProCysGlnGlyTrpAlaAlaGlnGluProHisArg500505510HisSerIlePheThrProGlnThrAsnProArgAlaAspLeuGluLys515520525AsnTyrCysArgAsnProAspGlyAspValAsnGlyProTrpCysTyr530535540ThrThrAsnProArgLysLeuTyrAspTyrCysAspIleProLeuCys545550555560AlaSerAlaSerSerPheGluCysGlyLysProGlnValGluProLys565570575LysCysProGlyArgValValGlyGlyCysValAlaAsnProHisSer580585590TrpProTrpGlnIleSerLeuArgThrArgPheThrGlyGlnHisPhe595600605CysGlyGlyThrLeuIleAlaProGluTrpValLeuThrAlaAlaHis610615620CysLeuGluLysSerSerArgProGluPheTyrLysValIleLeuGly625630635640AlaHisGluGluTyrIleArgGlyLeuAspValGlnGluIleSerVal645650655AlaLysLeuIleLeuGluProAsnAsnArgAspIleAlaLeuLeuLys660665670LeuSerArgProAlaThrIleThrAspLysValIleProAlaCysLeu675680685ProSerProAsnTyrMetValAlaAspArgThrIleCysTyrIleThr690695700GlyTrpGlyGluThrGlnGlyThrPheGlyAlaGlyArgLeuLysGlu705710715720AlaGlnLeuProValIleGluAsnLysValCysAsnArgValGluTyr725730735LeuAsnAsnArgValLysSerThrGluLeuCysAlaGlyGlnLeuAla740745750GlyGlyValAspSerCysGlnGlyAspSerGlyGlyProLeuValCys755760765PheGluLysAspLysTyrIleLeuGlnGlyValThrSerTrpGlyLeu770775780GlyCysAlaArgProAsnLysProGlyValTyrValArgValSerArg785790795800PheValAspTrpIleGluArgGluMetArgAsnAsn805810(2)SEQIDNO2的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度339個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(iii)假設(shè)否(iv)反義否(v)片段類型N-末端(vi)原始來源(A)有機(jī)體鼠(vii)現(xiàn)在來源(B)克隆血管生成素片段(xi)序列描述SEQIDNO2ValTyrLeuSerGluCysLysThrGlyIleGlyAsnGlyTyrArgGly151015ThrMetSerArgThrLysSerGlyValAlaCysGlnLysTrpGlyAla202530ThrPheProHisValProAsnTyrSerProSerThrHisProAsnGlu354045GlyLeuGluGluAsnTyrCysArgAsnProAspAsnAspGluGlnGly505560ProTrpCysTyrThrThrAspProAspLysArgTyrAspTyrCysAsn65707580IleProGluCysGluGluGluCysMetTyrCysSerGlyGluLysTyr859095GluGlyLysIleSerLysThrMetSerGlyLeuAspCysGlnAlaTrp100105110AspSerGlnSerProHisAlaHisGlyTyrIleProAlaLysPhePro115120125SerLysAsnLeuLysMetAsnTyrCysHisAsnProAspGlyGluPro130135140ArgProTrpCysPheThrThrAspProThrLysArgTrpGluTyrCys145150155160AspIleProArgCysThrThrProProProProProSerProThrTyr165170175GlnCysLeuLysGlyArgGlyGluAsnTyrArgGlyThrValSerVal180185190ThrValSerGlyLysThrCysGlnArgTrpSerGluGlnThrProHis195200205ArgHisAsnArgThrProGluAsnPheProCysLysAsnLeuGluGlu210215220AsnTyrCysArgAsnProAspGlyGluThrAlaProTrpCysTyrThr225230235240ThrAspSerGlnLeuArgTrpGluTyrCysGluIleProSerCysGlu245250255SerSerAlaSerProAspGlnSerAspSerSerValProProGluGlu260265270GlnThrProValValGlnGluCysTyrGlnSerAspGlyGlnSerTyr275280285ArgGlyThrSerSerThrThrIleThrGlyLysLysCysGlnSerTrp290295300AlaAlaMetPheProHisArgHisSerLysThrProGluAsnPhePro305310315320AspAlaGlyLeuGluMetAsnTyrCysArgAsnProAspGlyAspLys325330335GlyProTrp(2)SEQIDNO3的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度339個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(iii)假設(shè)否(iv)反義否(v)片段類型N-末端(vi)原始來源(A)有機(jī)體Homosapiens(vii)現(xiàn)在來源(B)克隆血管生成素片段(xi)序列描述SEQIDNO3ValTyrLeuSerGluCysLysThrGlyAsnGlyLysAsnTyrArgGly151015ThrMetSerLysThrLysAsnGlyIleThrCysGlnLysTrpSerSer202530ThrSerProHisArgProArgPheSerProAlaThrHisProSerGlu354045GlyLeuGluGluAsnTyrCysArgAsnProAspAsnAspProGlnGly505560ProTrpCysTyrThrThrAspProGluLysArgTyrAspTyrCysAsp65707580IleLeuGluCysGluGluGluCysMetHisCysSerGlyGluAsnTyr859095AspGlyLysIleSerLysThrMetSerGlyLeuGluCysGlnAlaTrp100105110AspSerGlnSerproHisAlaHisGlyTyrIleProSerLysPhePro115120125AsnLysAsnLeuLysLysAsnTyrCysArgAsnProAspArgGluLeu130135140ArgProTrpCysPheThrThrAspProAsnLysArgTrpGluLeuCys145150155160AspIleProArgCysThrThrProProProSerSerGlyProThrTyr165170175GlnCysLeuLysGlyThrGlyGluAsnTyrArgGlyAsnValAlaVal180185190ThrValSerGlyHisTnrCysGlnHisTrpSerAlaGlnThrProHis195200205ThrHisAsnArgThrProGluAsnPheProCysLysAsnLeuAspGlu210215220AsnTyrCysArgAsnProAspGlyLysArgAlaProTrpCysHisThr225230235240ThrAsnSerGlnValArgTrpGluTyrCysLysIleProSerCysAsp245250255SerSerProValSerThrGluGlnLeuAlaProThrAlaProProGlu260265270LeuThrProValValGlnAspCysTyrHisGlyAspGlyGlnSerTyr275280285ArgGlyThrSerSerThrThrThrThrGlyLysLysCysGlnSerTrp290295300SerSerMetThrProHisArgHisGlnLysThrProGluAsnTyrPro305310315320AsnAlaGlyLeuThrMetAsnTyrCysArgAsnProAspAlaAspLys325330335GlyProTrp(2)SEQIDNO4的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度339個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(iii)假設(shè)否(vi)原始來源(A)有機(jī)體恒河猴(vii)現(xiàn)在來源(B)克隆血管生成素片段(xi)序列描述SEQIDNO4ValTyrLeuSerGluCysLysThrGlyAsnGlyLysAsnTyrArgGly151015ThrMetSerLysThrArgThrGlyIleThrCysGlnLysTrpSerSer202530ThrSerProHisArgProThrPheSerProAlaThrHisProSerGlu354045GlyLeuGluGluAshTyrCysArgAsnProAspAsnAspGlyGlnGly505560ProTrpCysTyrThrThrAspProGluGluArgPheAspTyrCysAsp65707580IleProGluCysGluAspGluCysMetHisCysSerGlyGluAsnTyr859095AspGlyLysIleSerLysThrMetSerGlyLeuGluCysGlnAlaTrp100105110AspSerGlnSerProHisAlaHisGlyTyrIleProSerLysPhePro115120125AsnLysAsnLeuLysLysAsnTyrCysArgAsnProAspGlyGluPro130135140ArgProTrpCysPheThrThrAspProAsnLysArgTrpGluLeuCys145150155160AspIleProArgCysThrThrProProProSerSerGlyProThrTyr165170175GlnCysLeuLysGlyThrGlyGluAsnTyrArgGlyAspValAlaVal180185190ThrValSerGlyHisThrCysHisGlyTrpSerAlaGlnThrProHis195200205ThrHisAsnArgThrProGluAsnPheProCysLysAsnLeuAspGlu210215220AsnTyrCysArgAsnProAspGlyGluLysAlaProTrpCysTyrThr225230235240ThrAsnSerGlnValArgTrpGluTyrCysLysIleProSerCysGlu245250255SerSerProValSerThrGluProLeuAspProThrAlaProProGlu260265270LeuThrProValValGlnGluCysTyrHisGlyAspGlyGlnSerTyr275280285ArgGlyThrSerSerThrThrThrThrGlyLysLysCysGlnSerTrp290295300SerSerMetThrProHisTrpHisGluLysThrProGluAsnPhePro305310315320AsnAlaGlyLeuThrMetAsnTyrCysArgAsnProAspAlaAspLys325330335GlyProTrp(2)SEQIDNO5的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度339個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(iii)假設(shè)否(vi)原始來源(A)有機(jī)體豬(vii)現(xiàn)在來源(B)克隆血管生成素片段(xi)序列描述SEQIDNO5IleTyrLeuSerGluCysLysThrGlyAsnGlyLysAsnTyrArgGly151015ThrThrSerLysThrLysSerGlyValIleCysGlnLysTrpSerVal202530SerSerProHisIleProLysTyrSerProGluLysPheProLeuAla354045GlyLeuGluGluAsnTyrCysArgAsnProAspAsnAspGluLysGly505560ProTrpCysTyrThrThrAspProGluThrArgPheAspTyrCysAsp65707580IleProGluCysGluAspGluCysMetHisCysSerGlyGluHisTyr859095GluGlyLysIleSerLysThrMetSerGlyIleGluCysGlnSerTrp100105110GlySerGlnSerProHisAlaHisGlyTyrLeuProSerLysPhePro115120125AsnLysAsnLeuLysMetAsnTyrCysArgAsnProAspGlyGluPro130135140ArgProTrpCysPheThrThrAspProAsnLysArgTrpGluPheCys145150155160AspIleProArgCysThrThrProProProThrSerGlyProThrTyr165170175GlnCysLeuLysGlyArgGlyGluAsnTyrArgGlyThrValSerVal180185190ThrAlaSerGlyHisThrCysGlnArgTrpSerAlaGlnSerProHis195200205LysHisAsnArgThrProGluAsnPheProCysLysAsnLeuGluGlu210215220AsnTyrCysArgAsnProAspGlyGluThrAlaProTrpCysTyrThr225230235240ThrAspSerGluValArgTrpAspTyrCysLysIleProSerCysGly245250255SerSerThrThrSerThrGluHisLeuAspAlaProValProProGlu260265270GlnThrProValAlaGlnAspCysTyrArgGlyAsnGlyGluSerTyr275280285ArgGlyThrSerSerThrThrIleThrGlyArgLysCysGlnSerTrp290295300ValSerMetThrProHisArgHisGluLysThrProGlyAsnPhePro305310315320AsnAlaGlyLeuThrMetAsnTyrCysArgAsnProAspAlaAspLys325330335SerProTrp(2)SEQIDNO6的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度339個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(iii)假設(shè)否(vi)原始來源(A)有機(jī)體牛(vii)現(xiàn)在來源(B)克隆血管生成素片段(xi)序列描述SEQIDNO6IleTyrLeuLeuGluCysLysThrGlyAsnGlyGlnThrTyrArgGly151015ThrThrAlaGluThrLysSerGlyValThrCysGlnLysTrpSerAla202530ThrSerProHisValProLysPheSerProGluLysPheProLeuAla354045GlyLeuGluGluAsnTyrCysArgAsnProAspAsnAspGluAsnGly505560ProTrpCysTyrThrThrAspProAspLysArgTyrAspTyrCysAsp65707580IleProGluCysGluAspLysCysMetHisCysSerGlyGluAsnTyr859095GluGlyLysIleAlaLysThrMetSerGlyArgAspCysGlnAlaTrp100105110AspSerGlnSerProHisAlaHisGlyTyrIleProSerLysPhePro115120125AsnLysAsnLeuLysMetAsnTyrCysArgAsnProAspGlyGluPro130135140ArgProTrpCysPheThrThrAspProGlnLysArgTrpGluPheCys145150155160AspIleProArgCysThrThrProProProSerSerGlyProLysTyr165170175GlnCysLeuLysGlyThrGlyLysAsnTyrGlyGlyThrValAlaVal180185190ThrGluSerGlyHisThrCysGlnArgTrpSerGluGlnThrProHis195200205LysHisAsnArgThrProGluAsnPheProCysLysAsnLeuGluGlu210215220AsnTyrCysArgAsnProAspGlyGluLysAlaProTrpCysTyrThr225230235240ThrAsnSerGluValArgTrpGluTyrCysThrIleProSerCysGlu245250255SerSerProLeuSerThrGluArgMetAspValProValProProGlu260265270GlnThrProValProGlnAspCysTyrHisGlyAsnGlyGlnSerTyr275280285ArgGlyThrSerSerThrThrIleThrGlyArgLysCysGlnSerTrp290295300SerSerMetThrProHisArgHisLeuLysThrProGluAsnTyrPro305310315320AsnAlaGlyLeuThrMetAsnTyrCysArgAsnProAspAlaAspLys325330335SerProTrp(2)SEQIDNO7的信息(i)序列特征:(A)長(zhǎng)度79個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(iii)假設(shè)否(iv)反義否(v)片段類型N-末端(vi)原始來源(A)有機(jī)體鼠(vii)現(xiàn)在來源(B)克隆K1(xi)序列描述SEQIDNO7CysLysThrGlyIleGlyAsnGlyTyrArgGlyThrMetSerArgThr151015LysSerGlyValAlaCysGlnLysTrpGlyAlaThrPheProHisVal202530ProAsnTyrSerProSerThrHisProAsnGluGlyLeuGluGluAsn354045TyrCysArgAsnProAspAsnAspGluGlnGlyProTrpCysTyrThr505560ThrAspProAspLysArgTyrAspTyrCysAsnIleProGluCys657075(2)SEQIDNO8的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度79個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(iii)假設(shè)否(iv)反義否(v)片段類型N-末端(vi)原始來源(A)有機(jī)體Homosapiens(vii)現(xiàn)在來源(B)克隆K1(xi)序列描述SEQIDNO8CysLysThrGlyAsnGlyLysAsnTyrArgGlyThrMetSerLysThr151015LysAsnGlyIleThrCysGlnLysTrpSerSerThrSerProHisArg202530ProArgPheSerProAlaThrHisProSerGluGlyLeuGluGluAsn354045TyrCysArgAsnProAspAsnAspProGlnGlyProTrpCysTyrThr505560ThrAspProGluLysArgTyrAspTyrCysAspIleLeuGluCys657075(2)SEQIDNO9的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度79個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(iii)假設(shè)否(iv)反義否(v)片段類型N-末端(vi)原始來源(A)有機(jī)體恒河猴(vii)現(xiàn)在來源(B)克隆K1(xi)序列描述SEQIDNO9CysLysThrGlyAsnGlyLysAsnTyrArgGlyThrMetSerLysThr151015ArgThrGlyIleThrCysGlnLysTrpSerSerThrSerProHisArg202530ProThrPheSerproAlaThrHisProSerGluGlyLeuGluGluAsn354045TyrCysArgAsnProAspAsnAspGlyGlnGlyProTrpCysTyrThr505560ThrAspProGluGluArgPheAspTyrCysAspIleProGluCys657075(2)SEQIDNO10的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度79個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(iii)假設(shè)否(iv)反義否(v)片段類型N-末端(vi)原始來源(A)有機(jī)體豬(vii)現(xiàn)在來源(B)克隆K1(xi)序列描述SEQIDNO10CysLysThrGlyAsnGlyLysAsnTyrArgGlyThrThrSerLysThr151015LysSerGlyValIleCysGlnLysTrpSerValSerSerProHisIle202530ProLysTyrSerProGluLysPheProLeuAlaGlyLeuGluGluAsn354045TyrCysArgAsnProAspAsnAspGluLysGlyProTrpCysTyrThr505560ThrAspProGluThrArgPheAspTyrCysAspIleProGluCys657075(2)SEQIDNO11的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度79個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(iii)假設(shè)否(iv)反義否(v)片段類型N-末端(vi)原始來源(A)有機(jī)體牛(vii)現(xiàn)在來源(B)克隆K1(xi)序列描述SEQIDNO11CysLysThrGlyAsnGlyGlnThrTyrArgGlyThrThrAlaGluThr151015LysSerGlyValThrCysGlnLysTrpSerAlaThrSerProHisVal202530ProLysPheSerProGluLysPheProLeuAlaGlyLeuGluGluAsn354045TyrCysArgAsnProAspAsnAspGluAsnGlyProTrpCysTyrThr505560ThrAspProAspLysArgTyrAspTyrCysAspIleProGluCys657075(2)SEQIDNO12的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度78個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(iii)假設(shè)否(iv)反義否(v)片段類型N-末端(vi)原始來源(A)有機(jī)體鼠(vii)現(xiàn)在來源(B)克隆K2(xi)序列描述SEQIDNO12CysMetTyrCysSerGlyGluLysTyrGluGlyLysIleSerLysThr151015MetSerGlyLeuAspCysGlnAlaTrpAspSerGlnSerProHisAla202530HisGlyTyrIleProAlaLysPheProSerLysAsnLeuLysMetAsn354045TyrCysHisAsnProAspGlyGluProArgProTrpCysPheThrThr505560AspProThrLysArgTrpGluTyrCysAspIleProArgCys657075(2)SEQIDNO13的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度78個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(iii)假設(shè)否(iv)反義否(v)片段類型N-末端(vi)原始來源(A)有機(jī)體Homosapiens(vii)現(xiàn)在來源(B)克隆K2(xi)序列描述SEQIDNO13CysMetHisSerSerGlyGluAsnTyrAspGlyLysIleSerLysThr151015MetSerGlyLeuGluCysGlnAlaTrpAspSerGlnSerProHisAla202530HisGlyTyrIleProSerLysPheProAsnLysAsnLeuLysLysAsn354045TyrCysArgAsnProAspArgGluLeuArgProTrpCysPheThrThr505560AspProAsnLysArgTrpGluLeuCysAspIleProArgCys657075(2)SEQIDNO14的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度78個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(iii)假設(shè)否(iv)反義否(v)片段類型N-末端(vi)原始來源(A)有機(jī)體恒河猴(vii)現(xiàn)在來源(B)克隆K2(xi)序列描述SEQIDNO14CysMetHisCysSerGlyGluAsnTyrAspGlyLysIleSerLysThr151015MetSerGlyLeuGluCysGlnAlaTrpAspSerGlnSerProHisAla202530HisGlyTyrIleProSerLysPheProAsnLysAsnLeuLysLysAsn354045TyrCysArgAsnProAspGlyGluProArgProTrpCysPheThrThr505560AspProAsnLysArgTrpGluLeuCysAspIleProArgCys657075(2)SEQIDNO15的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度78個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(iii)假設(shè)否(iv)反義否(v)片段類型N-末端(vi)原始來源(A)有機(jī)體豬(vii)現(xiàn)在來源(B)克隆K2(xi)序列描述SEQIDNO15CysMetHisCysSerGlyGluHisTyrGluGlyLysIleSerLysThr151015MetSerGlyIleGluCysGlnSerTrpGlySerGlnSerProHisAla202530HisGlyTyrLeuProSerLysPheProAsnLysAsnLeuLysMetAsn354045TyrCysArgAsnProAspGlyGluProArgProTrpCysPheThrThr505560AspProAsnLysArgTrpGluPheCysAspIleProArgCys657075(2)SEQIDNO16的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度78個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(iii)假設(shè)否(iv)反義否(v)片段類型N-末端(vi)原始來源(A)有機(jī)體牛(vii)現(xiàn)在來源(B)克隆K2(xi)序列描述SEQIDNO16CysMetHisCysSerGlyGluAsnTyrGluGlyLysIleAlaLysThr151015MetSerGlyArgAspCysGlnAlaTrpAspSerGlnSerProHisAla202530HisGlyTyrIleProSerLysPheProAsnLysAsnLeuLysMetAsn354045TyrCysArgAsnProAspGlyGluProArgProTrpCysPheThrThr505560AspProGlnLysArgTrpGluPheCysAspIleProArgCys657075(2)SEQIDNO17的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度78個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(iii)假設(shè)否(iv)反義否(v)片段類型N-末端(vi)原始來源(A)有機(jī)體鼠(vii)現(xiàn)在來源(B)克隆K3(xi)序列描述SEQIDNO17CysLeuLysGlyArgGlyGluAsnTyrArgGlyThrValSerValThr151015ValSerGlyLysThrCysGlnArgTrpSerGluGlnThrProHisArg202530HisAsnArgThrProGluAsnPheProCysLysAsnLeuGluGluAsn354045TyrCysArgAsnProAspGlyGluThrAlaProTrpCysTyrThrThr505560AspSerGlnLeuArgTrpGluTyrCysGluIleProSerCys657075(2)SEQIDNO18的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度78個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(iii)假設(shè)否(iv)反義否(v)片段類型N-末端(vi)原始來源(A)有機(jī)體Homosapiens(vii)現(xiàn)在來源(B)克隆K3(xi)序列描述SEQIDNO18CysLeuLysGlyThrGlyGluAsnTyrArgGlyAsnValAlaValThr151015ValSerGlyHisThrCysGlnHisTrpSerAlaGlnThrProHisThr202530HisAsnArgThrProGluAsnPheProSerLysAsnLeuAspGluAsn354045TyrCysArgAsnProAspGlyLysArgAlaProTrpCysHisThrThr505560AsnSerGlnValArgTrpGluTyrCysLysIleProSerCys657075(2)SEQIDNO19的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度78個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(iii)假設(shè)否(iv)反義否(v)片段類型N-末端(vi)原始來源(A)有機(jī)體恒河猴(vii)現(xiàn)在來源(B)克隆K3(xi)序列描述SEQIDNO19CysLeuLysGlyThrGlyGluAsnTyrArgGlyAspValAlaValThr151015ValSerGlyHisThrCysHisGlyTrpSerAlaGlnThrProHisThr202530HisAsnArgThrProGluAsnPheProCysLysAsnLeuAspGluAsn354045TyrCysArgAsnProAspGlyGluLysAlaProTrpCysTyrThrThr505560AsnSerGlnValArgTrpGluTyrCysLysIleProSerCys657075(2)SEQIDNO20的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度78個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(iii)假設(shè)否(iv)反義否(v)片段類型N-末端(vi)原始來源(A)有機(jī)體豬(vii)現(xiàn)在來源(B)克隆K3(xi)序列描述SEQIDNO20CysLeuLysGlyArgGlyGluAsnTyrArgGlyThrValSerValThr151015AlaSerGlyHisThrCysGlnArgTrpSerAlaGlnSerProHisLys202530HisAsnArgThrProGluAsnPheProCysLysAsnLeuGluGluAsn354045TyrCysArgAsnProAspGlyGluThrAlaProTrpCysTyrThrThr505560AspSerGluValArgTrpAspTyrCysLysIleProSerCys657075(2)SEQIDNO21的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度78個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(iii)假設(shè)否(iv)反義否(v)片段類型N-末端(vi)原始來源(A)有機(jī)體牛(vii)現(xiàn)在來源(B)克隆K3(xi)序列描述SEQIDNO21CysLeuLysGlyThrGlyLysAsnTyrGlyGlyThrValAlaValThr151015GluSerGlyHisThrCysGlnArgTrpSerGluGlnThrProHisLys202530HisAsnArgThrProGluAsnPheProCysLysAsnLeuGluGluAsn354045TyrCysArgAsnProAspGlyGluLysAlaProTrpCysTyrThrThr505560AsnSerGluValArgTrpGluTyrCysThrIleProSerCys657075(2)SEQIDNO22的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度78個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(iii)假設(shè)否(iv)反義否(v)片段類型N-末端(vi)原始來源(A)有機(jī)體鼠(vii)現(xiàn)在來源(B)克隆K4(xi)序列描述SEQIDNO22CysTyrGlnSerAspGlyGlnSerTyrArgGlyThrSerSerThrThr151015IleThrGlyLysLysCysGlnSerTrpAlaAlaMetPheProHisArg202530HisSerLysThrProGluAsnPheProAspAlaGlyLeuGluMetAsn354045TyrCysArgAsnProAspGlyAspLysGlyProTrpCysTyrThrThr505560AspProSerValArgTrpGluTyrCysAsnLeuLysArgCys657075(2)SEQIDNO23的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度78個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(iii)假設(shè)否(iv)反義否(v)片段類型N-末端(vi)原始來源(A)有機(jī)體Homosapiens(vii)現(xiàn)在來源(B)克隆K4(xi)序列描述SEQIDNO23CysTyrHisGlyAspGlyGlnSerTyrArgGlyThrSerSerThrThr151015ThrThrGlyLysLysCysGlnSerTrpSerSerMetThrProHisArg202530HisGlnLysThrProGluAsnTyrProAsnAlaGlyLeuThrMetAsn354045TyrCysArgAsnProAspAlaAspLysGlyProTrpCysPheThrThr505560AspProSerValArgTrpGluTyrCysAsnLeuLysLysCys657075(2)SEQIDNO24的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度168個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(iii)假設(shè)否(iv)反義否(v)片段類型N-末端(vi)原始來源(A)有機(jī)體鼠(vii)現(xiàn)在來源(B)克隆K2-3(xi)序列描述SEQIDNO24CysMetTyrCysSerGlyGluLysTyrGluGlyLysIleSerLysThr151015MetSerGlyLeuAspCysGlnAlaTrpAspSerGlnSerProHisAla202530HisGlyTyrIleProAlaLysPheProSerLysAsnLeuLysMetAsn354045TyrCysHisAsnproAspGlyGluProArgProTrpCysPheThrThr505560AspProThrLysArgTrpGluTyrCysAspIleProArgCysThrThr65707580ProProProProProSerProThrTyrGlnCysLeuLysGlyArgGly859095GluAsnTyrArgGlyThrValSerValThrValSerGlyLysThrCys100105110GlnArgTrpSerGluGlnThrProHisArgHisAsnArgThrProGlu115120125AsnPheProCysLysAsnLeuGluGluAsnTyrCysArgAsnProAsp130135140GlyGluThrAlaProTrpCysTyrThrThrAspSerGlnLeuArgTrp145150155160GluTyrCysGluIleProSerCys165(2)SEQIDNO25的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度168個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(iii)假設(shè)否(iv)反義否(v)片段類型N-末端(vi)原始來源(A)有機(jī)體Homosapiens(vii)現(xiàn)在來源(B)克隆K2-3(xi)序列描述SEQIDNO25CysMetHisCysSerGlyGluAsnTyrAspGlyLysIleSerLysThr151015MetSerGlyLeuGluCysGlnAlaTrpAspSerGlnSerProHisAla202530HisGlyTyrIleProSerLysPheProAsnLysAsnLeuLysLysAsn354045TyrCysArgAsnProAspArgGluLeuArgProTrpCysPheThrThr505560AspProAsnLysArgTrpGluLeuCysAspIleProArgCysThrThr65707580ProProProSerSerGlyProThrTyrGlnCysLeuLysGlyThrGly859095GluAsnTyrArgGlyAsnValAlaValThrValSerGlyHisThrCys100105110GlnHisTrpSerAlaGlnThrProHisThrHisAsnArgThrProGlu115120125AsnPheProCysLysAsnLeuAspGluAsnTyrCysArgAsnProAsp130135140GlyLysArgAlaProTrpCysHisThrThrAsnSerGlnValArgTrp145150155160GluTyrCysLysIleProSerCys165(2)SEQIDNO26的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度168個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(iii)假設(shè)否(iv)反義否(v)片段類型N-末端(vi)原始來源(A)有機(jī)體恒河猴(vii)現(xiàn)在來源(B)克隆K2-3(xi)序列描述SEQIDNO26CysMetHisCysSerGlyGluAsnTyrAspGlyLysIleSerLysThr151015MetSerGlyLeuGluCysGlnAlaTrpAspSerGlnSerProHisAla202530HisGlyTyrIleProSerLysPheProAsnLysAsnLeuLysLysAsn354045TyrCysArgAsnProAspGlyGluProArgProTrpCysPheThrThr505560AspProAsnLysArgTrpGluLeuCysAspIleProArgCysThrThr65707580ProProProSerSerGlyProThrTyrGlnCysLeuLysGlyThrGly859095GluAsnTyrArgGlyAspValAlaValThrValSerGlyHisThrCys100105110HisGlyTrpSerAlaGlnThrProHisThrHisAsnArgThrProGlu115120125AsnPheProCysLysAsnLeuAspGluAsnTyrCysArgAsnProAsp130135140GlyGluLysAlaProTrpCysTyrThrThrAsnSerGlnValArgTrp145150155160GluTyrCysLysIleProSerCys165(2)SEQIDNO27的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度168個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(iii)假設(shè)否(iv)反義否(v)片段類型N-末端(vi)原始來源(A)有機(jī)體豬(vii)現(xiàn)在來源(B)克隆K2-3(xi)序列描述SEQIDNO27CysMetHisCysSerGlyGluHisTyrGluGlyLysIleSerLysThr151015MetSerGlyIleGluCysGlnSerTrpGlySerGlnSerProHisAla202530HisGlyTyrLeuProSerLysPheProAsnLysAsnLeuLysMetAsn354045TyrCysArgAsnProAspGlyGluProArgProTrpCysPheThrThr505560AspProAsnLysArgTrpGluPheCysAspIleProArgCysThrThr65707580ProProProThrSerGlyProThrTyrGlnCysLeuLysGlyArgGly859095GluAsnTyrArgGlyThrValSerValThrAlaSerGlyHisThrCys100105110GlnArgTrpSerAlaGlnSerProHisLysHisAsnArgThrProGlu115120125AsnPheProCysLysAsnLeuGluGluAsnTyrCysArgAsnProAsp130135140GlyGluThrAlaProTrpCysTyrThrThrAspSerGluValArgTrp145150155160AspTyrCysLysIleProSerCys165(2)SEQIDNO28的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度168個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(iii)假設(shè)否(iv)反義否(v)片段類型N-末端(vi)原始來源(A)有機(jī)體牛(vii)現(xiàn)在來源(B)克隆K2-3(xi)序列描述SEQIDNO28CysMetHisCysSerGlyGluAsnTyrGluGlyLysIleAlaLysThr151015MetSerGlyArgAspCysGlnAlaTrpAspSerGlnSerProHisAla202530HisGlyTyrIleProSerLysPheProAsnLysAsnLeuLysMetAsn354045TyrCysArgAsnProAspGlyGluProArgProTrpCysPheThrThr505560AspProGlnLysArgTrpGluPheCysAspIleProArgCysThrThr65707580ProProProSerSerGlyProLysTyrGlnCysLeuLysGlyThrGly859095LysAsnTyrGlyGlyThrValAlaValThrGluSerGlyHisThrCys100105110GlnArgTrpSerGluGlnThrProHisLysHisAsnArgThrProGlu115120125AsnPheProCysLysAshLeuGluGluAsnTyrCysArgAsnProAsp130135140GlyGluLysAlaProTrpCysTyrThrThrAsnSerGluValArgTrp145150155160GluTyrCysThrIleProSerCys165(2)SEQIDNO29的信息(i)序列特征:(A)長(zhǎng)度168個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(iii)假設(shè)否(iv)反義否(v)片段類型N-末端(vi)原始來源(A)有機(jī)體鼠(vii)現(xiàn)在來源(B)克隆K1-3(xi)序列描述SEQIDNO29CysLysThrGlyIleGlyAsnGlyTyrArgGlyThrMetSerArgThr151015LysSerGlyValAlaCysGlnLysTrpGlyAlaThrPheProHisVal202530ProAsnTyrSerProSerThrHisProAsnGluGlyLeuGluGluAsn354045TyrCysArgAsnProAspAsnAspGluGlnGlyProTrpCysTyrThr505560ThrAspProAspLysArgTyrAspTyrCysAsnIleProGluCysGlu65707580GluGluCysMetTyrCysSerGlyGluLysTyrGluGlyLysIleSer859095LysThrMetSerGlyLeuAspCysGlnAlaTrpAspSerGlnSerPro100105110HisAlaHisGlyTyrIleProAlaLysPheProSerLysAsnLeuLys115120125MetAsnTyrCysHisAsnProAspGlyGluProArgProTrpCysPhe130135140ThrThrAspProThrLysArgTrpGluTyrCysAspIleProArgCys145150155160ThrThrProProProProProSerProThrTyrGlnCysLeuLysGly165170175ArgGlyGluAsnTyrArgGlyThrValSerValThrValSerGlyLys180185190ThrCysGlnArgTrpSerGluGlnThrProHisArgHisAsnArgThr195200205ProGluAsnPheProCysLysAsnLeuGluGluAsnTyrCysArgAsn210215220ProAspGlyGluThrAlaProTrpCysTyrThrThrAspSerGlnLeu225230235240ArgTrpGluTyrCysGluIleProSerCys245250(2)SEQIDNO30的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度250個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(iii)假設(shè)否(iv)反義否(v)片段類型N-末端(vi)原始來源(A)有機(jī)體Homosapiens(vii)現(xiàn)在來源(B)克隆K1-3(xi)序列描述SEQIDNO30CysLysThrGlyAsnGlyLysAsnTyrArgGlyThrMetSerLysThr151015LysAsnGlyIleThrCysGlnLysTrpSerSerThrSerProHisArg202530ProArgPheSerProAlaThrHisProSerGluGlyLeuGluGluAsn354045TyrCysArgAsnProAspAsnAspProGlnGlyProTrpCysTyrThr505560ThrAspProGluLysArgTyrAspTyrCysAspIleLeuGluCysGlu65707580GluGluCysMetHisCysSerGlyGluAsnTyrAspGlyLysIleSer859095LysThrMetSerGlyLeuGluCysGlnAlaTrpAspSerGlnSerPro100105110HisAlaHisGlyTyrIleProSerLysPheProAsnLysAsnLeuLys115120125LysAsnTyrCysArgAsnProAspArgGluLeuArgProTrpCysPhe130135140ThrThrAspProAsnLysArgTrpGluLeuCysAspIleProArgCys145150155160ThrThrProProProSerSerGlyProThrTyrGlnCysLeuLysGly165170175ThrGlyGluAsnTyrArgGlyAsnValAlaValThrValSerGlyHis180185190ThrCysGlnHisTrpSerAlaGlnThrProHisThrHisAsnArgThr195200205ProGluAsnPheProCysLysAsnLeuAspGluAsnTyrCysArgAsn210215220ProAspGlyLysArgAlaProTrpCysHisThrThrAsnSerGlnVal225230235240ArgTrpGluTyrCysLysIleProSerCys245250(2)SEQIDNO31的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度250個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(iii)假設(shè)否(iv)反義否(v)片段類型N-末端(vi)原始來源(A)有機(jī)體恒河猴(vii)現(xiàn)在來源(B)克隆K1-3(xi)序列描述SEQIDNO31CysLysThrGlyAsnGlyLysAsnTyrArgGlyThrMetSerLysThr151015ArgThrGlyIleThrCysGlnLysTrpSerSerThrSerProHisArg202530ProThrPheSerProAlaThrHisProSerGluGlyLeuGluGluAsn354045TyrCysArgAsnProAspAsnAspGlyGlnGlyProTrpCysTyrThr505560ThrAspProGluGluArgPheAspTyrCysAspIleProGluCysGlu65707580AspGluCysMetHisCysSerGlyGluAsnTyrAspGlyLysIleSer859095LysThrMetSerGlyLeuGluCysGlnAlaTrpAspSerGlnSerPro100105110HisAlaHisGlyTyrIleProSerLysPheProAsnLysAsnLeuLys115120125LysAsnTyrCysArgAsnProAspGlyGluProArgProTrpCysPhe130135140ThrThrAspProAsnLysArgTrpGluLeuCysAspIleProArgCys145150155160ThrThrProProProSerSerGlyProThrTyrGlnCysLeuLysGly165170175ThrGlyGluAsnTyrArgGlyAspValAlaValThrValSerGlyHis180185190ThrCysHisGlyTrpSerAlaGlnThrProHisThrHisAsnArgThr195200205ProGluAsnPheProCysLysAsnLeuAspGluAsnTyrCysArgAsn210215220ProAspGlyGluLysAlaProTrpCysTyrThrThrAsnSerGlnVal225230235240ArgTrpGluTyrCysLysIleProSerCys245250(2)SEQIDNO32的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度250個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(iii)假設(shè)否(iv)反義否(v)片段類型N-末端(vi)原始來源(A)有機(jī)體豬(vii)現(xiàn)在來源(B)克隆K1-3(xi)序列描述SEQIDNO32CysLysThrGlyAsnGlyLysAsnTyrArgGlyThrThrSerLysThr151015LysSerGlyValIleCysGlnLysTrpSerValSerSerProHisIle202530ProLysTyrSerProGluLysPheProLeuAlaGlyLeuGluGluAsn354045TyrCysArgAsnProAspAsnAspGluLysGlyProTrpCysTyrThr505560ThrAspProGluThrArgPheAspTyrCysAspIleProGluCysGlu65707580AspGluCysMetHisCysSerGlyGluHisTyrGluGlyLysIleSer859095LysThrMetSerGlyIleGluCysGlnSerTrpGlySerGlnSerPro100105110HisAlaHisGlyTyrLeuProSerLysPheProAsnLysAsnLeuLys115120125MetAsnTyrCysArgAsnProAspGlyGluProArgProTrpCysPhe130135140ThrThrAspProAsnLysArgTrpGluPheCysAspIleProArgCys145150155160ThrThrProProProThrSerGlyProThrTyrGlnCysLeuLysGly165170175ArgGlyGluAsnTyrArgGlyThrValSerValThrAlaSerGlyHis180185190ThrCysGlnArgTrpSerAlaGlnSerProHisLysHisAsnArgThr195200205ProGluAsnPheProCysLysAsnLeuGluGluAsnTyrCysArgAsn210215220ProAspGlyGluThrAlaProTrpCysTyrThrThrAspSerGluVal225230235240ArgTrpAspTyrCysLysIleProSerCys245250(2)SEQIDNO33的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度250個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(iii)假設(shè)否(iv)反義否(v)片段類型N-末端(vi)原始來源(A)有機(jī)體牛(vii)現(xiàn)在來源(B)克隆K1-3(xi)序列描述SEQIDNO33CysLysThrGlyAsnGlyGlnThrTyrArgGlyThrThrAlaGluThr151015LysSerGlyValThrCysGlnLysTrpSerAlaThrSerProHisVal202530ProLysPheSerProGluLysPheProLeuAlaGlyLeuGluGluAsn354045TyrCysArgAsnProAspAsnAspGluAsnGlyProTrpCysTyrThr505560ThrAspProAspLysArgTyrAspTyrCysAspIleProGluCysGlu65707580AspLysCysMetHisCysSerGlyGluAsnTyrGluGlyLysIleAla859095LysThrMetSerGlyArgAspCysGlnAlaTrpAspSerGlnSerPro100105110HisAlaHisGlyTyrIleProSerLysPheProAsnLysAsnLeuLys115120125MetAsnTyrCysArgAsnProAspGlyGluProArgProTrpCysPhe130135140ThrThrAspProGlnLysArgTrpGluPheCysAspIleProArgCys145150155160ThrThrProProProSerSerGlyProLysTyrGlnCysLeuLysGly165170175ThrGlyLysAsnTyrGlyGlyThrValAlaValThrGluSerGlyHis180185190ThrCysGlnArgTrpSerGluGlnThrProHisLysHisAsnArgThr195200205ProGluAsnPheProCysLysAsnLeuGluGluAsnTyrCysArgAsn210215220ProAspGlyGluLysAlaProTrpCysTyrThrThrAsnSerGluVal225230235240ArgTrpGluTyrCysThrIleProSerCys245250(2)SEQIDNO34的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度160個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(iii)假設(shè)否(iv)反義否(v)片段類型N-末端(vi)原始來源(A)有機(jī)體鼠(vii)現(xiàn)在來源(B)克隆K1-2(xi)序列描述SEQIDNO34CysLysThrGlyIleGlyAsnGlyTyrArgGlyThrMetSerArgThr151015LysSerGlyValAlaCysGlnLysTrpGlyAlaThrPheProHisVal202530ProAsnTyrSerProSerThrHisProAsnGluGlyLeuGluGluAsn354045TyrCysArgAsnProAspAsnAspGluGlnGlyProTrpCysTyrThr505560ThrAspProAspLysArgTyrAspTyrCysAsnIleProGluCysGlu65707580GluGluCysMetTyrCysSerGlyGluLysTyrGluGlyLysIleSer859095LysThrMetSerGlyLeuAspCysGlnAlaTrpAspSerGlnSerPro100105110HisAlaHisGlyTyrIleProAlaLysPheProSerLysAsnLeuLys115120125MetAsnTyrCysHisAsnProAspGlyGluProArgProTrpCysPhe130135140ThrThrAspProThrLysArgTrpGluTyrCysAspIleProArgCys145150155160(2)SEQIDNO35的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度160個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(iii)假設(shè)否(iv)反義否(v)片段類型N-末端(vi)原始來源(A)有機(jī)體Homosapiens(vii)現(xiàn)在來源(B)克隆K1-2(xi)序列描述SEQIDNO35CysLysThrGlyAsnGlyLysAsnTyrArgGlyThrMetSerLysThr151015LysAsnGlyIleThrCysGlnLysTrpSerSerThrSerProHisArg202530ProArgPheSerProAlaThrHisProSerGluGlyLeuGluGluAsn354045TyrCysArgAsnProAspAsnAspProGlnGlyProTrpCysTyrThr505560ThrAspProGluLysArgTyrAspTyrCysAspIleLeuGluCysGlu65707580GluGluCysMetHisCysSerGlyGluAsnTyrAspGlyLysIleSer859095LysThrMetSerGlyLeuGluCysGlnAlaTrpAspSerGlnSerPro100105110HisAlaHisGlyTyrIleProSerLysPheProAsnLysAsnLeuLys115120125LysAsnTyrCysArgAsnProAspArgGluLeuArgProTrpCysPhe130135140ThrThrAspProAsnLysArgTrpGluLeuCysAspIleProArgCys145150155160(2)SEQIDNO36的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度160個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(iii)假設(shè)否(iv)反義否(v)片段類型N-末端(vi)原始來源(A)有機(jī)體恒河猴(vii)現(xiàn)在來源(B)克隆K1-2(xi)序列描述SEQIDNO36CysLysThrGlyAsnGlyLysAsnTyrArgGlyThrMetSerLysThr151015ArgThrGlyIleThrCysGlnLysTrpSerSerThrSerProHisArg202530ProThrPheSerProAlaThrHisProSerGluGlyLeuGluGluAsn354045TyrCysArgAsnProAspAsnAspGlyGlnGlyProTrpCysTyrThr505560ThrAspProGluGluArgPheAspTyrCysAspIleProGluCysGlu65707580AspGluCysMetHisCysSerGlyGluAsnTyrAspGlyLysIleSer859095LysThrMetSerGlyLeuGluCysGlnAlaTrpAspSerGlnSerPro100105110HisAlaHisGlyTyrIleProSerLysPheProAsnLysAsnLeuLys115120125LysAsnTyrCysArgAsnProAspGlyGluProArgProTrpCysPhe130135140ThrThrAspProAsnLysArgTrpGluLeuCysAspIleProArgCys145150155160(2)SEQIDNO37的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度160個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(iii)假設(shè)否(iv)反義否(v)片段類型N-末端(vi)原始來源(A)有機(jī)體豬(vii)現(xiàn)在來源(B)克隆K1-2(xi)序列描述SEQIDNO37CysLysThrGlyAsnGlyLysAsnTyrArgGlyThrThrSerLysThr151015LysSerGlyValIleCysGlnLysTrpSerValSerSerProHisIle202530ProLysTyrSerProG1uLysPheProLeuAlaGlyLeuGluGluAsn354045TyrCysArgAsnProAspAsnAspGluLysGlyProTrpCysTyrThr505560ThrAspProGluThrArgPheAspTyrCysAspIleProGluCysGlu65707580AspGluCysMetHisCysSerGlyGluHisTyrGluGlyLysIleSer859095LysThrMetSerGlyIleGluCysGlnSerTrpGlySerGlnSerPro100105110HisAlaHisGlyTyrLeuProSerLysPheProAsnLysAsnLeuLys115120125MetAsnTyrCysArgAsnProAspGlyGluProArgProTrpCysPhe130135140ThrThrAspProAsnLysArgTrpGluPheCysAspIleProArgCys145150155160(2)SEQIDNO38的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度160個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(iii)假設(shè)否(iv)反義否(v)片段類型N-末端(vi)原始來源(A)有機(jī)體牛(vii)現(xiàn)在來源(B)克隆K1-2(xi)序列描述SEQIDNO38CysLysThrGlyAsnGlyGlnThrTyrArgGlyThrThrAlaGluThr151015LysSerGlyValThrCysGlnLysTrpSerAlaThrSerProHisVal202530ProLysPheSerProGluLysPheProLeuAlaGlyLeuGluGluAsn354045TyrCysArgAsnProAspAsnAspGluAsnGlyProTrpCysTyrThr505560ThrAspProAspLysArgTyrAspTyrCysAspIleProGluCysGlu65707580AspLysCysMetHisCysSerGlyGluAsnTyrGluGlyLysIleAla859095LysThrMetSerGlyArgAspCysGlnAlaTrpAspSerGlnSerPro100105110HisAlaHisGlyTyrIleProSerLysPheProAsnLysAsnLeuLys115120125MetAsnTyrCysArgAsnProAspGlyGluProArgProTrpCysPhe130135140ThrThrAspProGlnLysArgTrpGluPheCysAspIleProArgCys145150155160(2)SEQIDNO39的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度352個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(iii)假設(shè)否(iv)反義否(v)片段類型N-末端(vi)原始來源(A)有機(jī)體鼠(vii)現(xiàn)在來源(B)克隆K1-4(xi)序列描述SEQIDNO39CysLysThrGlyIleGlyAsnGlyTyrArgGlyThrMetSerArgThr151015LysserGlyValAlaCysGlnLysTrpGlyAlaThrPheProHisVal202530ProAsnTyrSerProSerThrHisProAsnGluGlyLeuGluGluAsn354045TyrCysArgAsnProAspAsnAspGluGlnGlyProTrpCysTyrThr505560ThrAspProAspLysArgTyrAspTyrCysAsnIleProGluCysGlu65707580GluGluCysMetTyrCysSerGlyGluLysTyrGluGlyLysIleSer859095LysThrMetSerGlyLeuAspCysGlnAlaTrpAspSerGlnSerPro100105110HisAlaHisGlyTyrIleProAlaLysPheProSerLysAsnLeuLys115120125MetAsnTyrCysHisAsnProAspGlyGluProArgProTrpCysPhe130135140ThrThrAspProThrLysArgTrpGluTyrCysAspIleProArgCys145150155160ThrThrProProProProProSerProThrTyrGlnCysLeuLysGly165170175ArgGlyGluAsnTyrArgGlyThrValSerValThrValSerGlyLys180185190ThrCysGlnArgTrpSerGluGlnThrProHisArgHisAsnArgThr195200205ProGluAsnPheProCysLysAsnLeuGluGluAsnTyrCysArgAsn210215220ProAspGlyGluThrAlaProTrpCysTyrThrThrAspSerGlnLeu225230235240ArgTrpGluTyrCysGluIleProSerCysGluSerSerAlaSerPro245250255AspGlnSerAspSerSerValProProGluGluGlnThrProValVal260265270GlnGluCysTyrGlnSerAspGlyGlnSerTyrArgGlyThrSerSer275280285ThrThrIleThrGlyLysLysCysGlnSerTrpAlaAlaMetPhePro290295300HisArgHisSerLysThrProGluAsnPheProAspAlaGlyLeuGlu305310315320MetAsnTyrCysArgAsnProAspGlyAspLysGlyProTrpCysTyr325330335ThrThrAspProSerValArgTrpGluTyrCysAsnLeuLysArgCys340345350(2)SEQIDNO40的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度352個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(iii)假設(shè)否(iv)反義否(v)片段類型N-末端(vi)原始來源(A)有機(jī)體Homosapiens(vii)現(xiàn)在來源(B)克隆K1-4(xi)序列描述SEQIDNO40CysLysThrGlyAsnGlyLysAsnTyrArgGlyThrMetSerLysThr151015LysAsnGlyIleThrCysGlnLysTrpSerSerThrSerProHisArg202530ProArgPheSerProAlaThrHisProSerGluGlyLeuGluGluAsn354045TyrCysArgAsnProAspAsnAspProGlnGlyProTrpCysTyrThr505560ThrAspProGluLysArgTyrAspTyrCysAspIleLeuGluCysGlu65707580GluGluCysMetHisCysSerGlyGluAsnTyrAspGlyLysIleSer859095LysThrMetSerGlyLeuGluCysGlnAlaTrpAspSerGlnSerPro100105110HisAlaHisGlyTyrIleProSerLysPheProAsnLysAsnLeuLys115120125LysAsnTyrCysArgAsnProAspArgGluLeuArgProTrpCysPhe130135140ThrThrAspProAsnLysArgTrpGluLeuCysAspIleProArgCys145150155160ThrThrProProProSerSerGlyProThrTyrGlnCysLeuLysGly165170175ThrGlyGluAsnTyrArgGlyAsnValAlaValThrValSerGlyHis180185190ThrCysGlnHisTrpSerAlaGlnThrProHisThrHisAsnArgThr195200205ProGluAsnPheProCysLysAsnLeuAspGluAsnTyrCysArgAsn210215220ProAspGlyLysArgAlaProTrpCysHisThrThrAsnSerGlnVal225230235240ArgTrpGluTyrCysLysIleProSerCysAspSerSerProValSer245250255ThrGluGlnLeuAlaProThrAlaProProGluLeuThrProValVal260265270GlnAspCysTyrHisGlyAspGlyGlnSerTyrArgGlyThrSerSer275280285ThrThrThrThrGlyLysLysCysGlnSerTrpSerSerMetThrPro290295300HisArgHisGlnLysThrProGluAsnTyrProAsnAlaGlyLeuThr305310315320MetAsnTyrCysArgAsnProAspAlaAspLysGlyProTrpCysPhe325330335ThrThrAspProSerValArgTrpGluTyrCysAsnLeuLysLysCys340345350(2)SEQIDNO41的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度378個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(iii)假設(shè)否(iv)反義否(v)片段類型N-末端(vi)原始來源(A)有機(jī)體鼠(vii)現(xiàn)在來源(B)克隆K1-4BKLS(xi)序列描述SEQIDNO41LeuPheGluLysArgValTyrLeuSerGluCysLysThrGlyIleGly151015AsnGlyTyrArgGlyThrMetSerArgThrLysSerGlyValAlaCys202530GlnLysTrpGlyAlaThrPheProHisValProAsnTyrSerProSer354045ThrHisProAsnGluGlyLeuGluGluAsnTyrCysArgAsnProAsp505560AsnAspGluGlnGlyProTrpCysTyrThrThrAspProAspLysArg65707580TyrAspTyrCysAsnIleProGluCysGluGluGluCysMetTyrCys859095SerGlyGluLysTyrGluGlyLysIleSerLysThrMetSerGlyLeu100105110AspCysGlnAlaTrpAspSerGlnSerProHisAlaHisGlyTyrIle115120125ProAlaLysPheProSerLysAsnLeuLysMetAsnTyrCysHisAsn130135140ProAspGlyGluProArgProTrpCysPheThrThrAspProThrLys145150155160ArgTrpGluTyrCysAspIleProArgCysThrThrProProProPro165170175ProSerProThrTyrGlnCysLeuLysGlyArgGlyGluAsnTyrArg180185190GlyThrValSerValThrValSerGlyLysThrCysGlnArgTrpSer195200205GluGlnThrProHisArgHisAsnArgThrProGluAsnPheProCys210215220LysAsnLeuGluGluAsnTyrCysArgAsnProAspGlyGluThrAla225230235240ProTrpCysTyrThrThrAspSerGlnLeuArgTrpGluTyrCysGlu245250255IleProSerCysGluSerSerAlaSerProAspGlnSerAspSerSer260265270ValProProGluGluGlnThrProValValGlnGluCysTyrGlnSer275280285AspGlyGlnSerTyrArgGlyThrSerSerThrThrIleThrGlyLys290295300LysCysGlnSerTrpAlaAlaMetPheProHisArgHisSerLysThr305310315320ProGluAsnPheProAspAlaGlyLeuGluMetAsnTyrCysArgAsn325330335ProAspGlyAspLysGlyProTrpCysTyrThrThrAspProSerVal340345350ArgTrpGluTyrCysAsnLeuLysArgCysSerGluThrGlyGlySer355360365ValValGluLeuProThrValSerGlnGlu370375(2)SEQIDNO42的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度378個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(iii)假設(shè)否(iv)反義否(v)片段類型N-末端(vi)原始來源(A)有機(jī)體Homosapiens(vii)現(xiàn)在來源(B)克隆K1-4BKLS(xi)序列描述SEQIDNO42LeuPheGluLysLysValTyrLeuSerGluCysLysThrGlyAsnGly151015LysAsnTyrArgGlyThrMetSerLysThrLysAsnGlyIleThrCys202530GlnLysTrpSerSerThrSerProHisArgProArgPheSerProAla354045ThrHisProSerGluGlyLeuGluGluAsnTyrCysArgAsnProAsp505560AsnAspProGlnGlyProTrpCysTyrThrThrAspProGluLysArg65707580TyrAspTyrCysAspIleLeuGluCysGluGluGluCysMetHisCys859095SerGlyGluAsnTyrAspGlyLysIleSerLysThrMetSerGlyLeu100105110GluCysGlnAlaTrpAspSerGlnSerProHisAlaHisGlyTyrIle115120125ProSerLysPheProAsnLysAsnLeuLysLysAsnTyrCysArgAsn130135140ProAspArgGluLeuArgProTrpCysPheThrThrAspProAsnLys145150155160ArgTrpGluLeuCysAspIleProArgCysThrThrProProProSer165170175SerGlyProThrTyrGlnCysLeuLysGlyThrGlyGluAsnTyrArg180185190GlyAsnValAlaValThrValSerGlyHisThrCysGlnHisTrpSer195200205AlaGlnThrProHisThrHisAsnArgThrProGluAsnPheProCys210215220LysAsnLeuAspGluAsnTyrCysArgAsnProAspGlyLysArgAla225230235240ProTrpCysHisThrThrAsnSerGlnValArgTrpGluTyrCysLys245250255IleProSerCysAspSerSerProValSerThrGluGlnLeuAlaPro260265270ThrAlaProProGluLeuThrProValVaiGlnAspCysTyrHisGly275280285AspGlyGlnSerTyrArgGlyThrSerSerThrThrThrThrGlyLys290295300LysCysGlnSerTrpSerSerMetThrProHisArgHisGlnLysThr305310315320ProGluAsnTyrProAsnAlaGlyLeuThrMetAsnTyrCysArgAsn325330335ProAspAlaAspLysGlyProTrpCysPheThrThrAspProServal340345350ArgTrpGluTyrCysAsnLeuLysLysCysSerGlyThrGluAlaSer355360365ValValAlaProProProvalValLeuLeu370375(2)SEQIDNO43的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度30個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(iii)假設(shè)否(iv)反義否(v)片段類型N-末端(vi)原始來源(A)有機(jī)體Homosapiens(vii)現(xiàn)在來源(B)克隆引物154(xi)序列描述SEQIDNO43ATCGCTCGAGCGTTATTTGAAAAGAAAGTG30(2)SEQIDNO44的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度28個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(iii)假設(shè)否(iv)反義否(v)片段類型N-末端(vi)原始來源(A)有機(jī)體Homosapiens(vii)現(xiàn)在來源(B)克隆引物151(xi)序列描述SEQIDNO44ATCGGAATTCAAGCAGGACAACAGGCGG28(2)SEQIDNO45的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度28個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(iii)假設(shè)否(iv)反義否(v)片段類型N-末端(vi)原始來源(A)有機(jī)體Homosapiens(vii)現(xiàn)在來源(B)克隆引物156(xi)序列描述SEQIDNO45ATCGTACGTATTATTTGAAAAGAAAGTG28權(quán)利要求1.一種抑制內(nèi)皮細(xì)胞增殖的方法，該方法包括對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞施用增殖抑制量的血管抑制素片段。2.權(quán)利要求1的方法，其中所說的血管抑制素片段具有小于約500nM的內(nèi)皮細(xì)胞ED50。3.權(quán)利要求1的方法，其中所說的血管抑制素片段源于鼠纖溶酶原、人纖溶酶原、恒河猴纖溶酶原、豬纖溶酶原或牛纖溶酶原。4.權(quán)利要求1的方法，其中所說的血管抑制素片段包含選自由下列序列組成的組的氨基酸序列或者它們的組合體或功能性同系物SEQIDNO7；SEQIDNO8；SEQIDNO9；SEQIDNO10；SEQIDNO11；SEQIDNO12；SEQIDNO13；SEQIDNO14；SEQIDNO15；SEQIDNO16；SEQIDNO17；SEQIDNO18；SEQIDNO19；SEQIDNO20；SEQIDNO21；SEQIDNO22；SEQIDNO23；SEQIDNO24；SEQIDNO25；SEQIDNO26；SEQIDNO27；SEQIDNO28；SEQIDNO29；SEQIDNO30；SEQIDNO31；SEQIDNO32；SEQIDNO33；SEQIDNO34；SEQIDNO35；SEQIDNO36；SEQIDNO37；SEQIDNO38；SEQIDNO39；SEQIDNO40；SEQIDNO41和SEQIDNO42。5.權(quán)利要求1的方法，其中所說的血管抑制素片段是kringle1蛋白質(zhì)。6.權(quán)利要求5的方法，其中所說的kringle1蛋白質(zhì)具有小于約350nM的內(nèi)皮細(xì)胞ED50。7.權(quán)利要求5的方法，其中所說的kringle1蛋白質(zhì)包含SEQIDNO8的氨基酸序列或其功能性同系物。8.權(quán)利要求1的方法，其中所說的血管抑制素片段是kringle2蛋白質(zhì)。9.權(quán)利要求8的方法，其中所說的kringle2蛋白質(zhì)包含SEQIDNO13的氨基酸序列或其功能性同系物。10.權(quán)利要求1的方法，其中所說的血管抑制素片段是kringle3蛋白質(zhì)。11.權(quán)利要求10的方法，其中所說的kringle3蛋白質(zhì)具有小于約475nM內(nèi)皮細(xì)胞ED50。12.權(quán)利要求10的方法，其中所說的kringle3蛋白質(zhì)包含SEQIDNO18的氨基酸序列或其功能性同系物。13.權(quán)利要求1的方法，其中所說的血管抑制素片段是kringle2-3蛋白質(zhì)。14.權(quán)利要求13的方法，其中所說的kringle2-3蛋白質(zhì)包含SEQIDNO25的氨基酸序列或其功能性同系物。15.權(quán)利要求1的方法，其中所說的血管抑制素片段是kringle1-3蛋白質(zhì)。16.權(quán)利要求15的方法，其中所說的kringle1-3蛋白質(zhì)具有小于約100nM的內(nèi)皮細(xì)胞ED50。17.權(quán)利要求15的方法，其中所說的kringle1-3蛋白質(zhì)包含SEQIDNO30的氨基酸序列或其功能性同系物。18.權(quán)利要求1的方法，其中所說的血管抑制素片段是kringle1-2蛋白質(zhì)。19.權(quán)利要求18的方法，其中所說的kringle1-2蛋白質(zhì)包含SEQIDNO35的氨基酸序列或其功能性同系物。20.權(quán)利要求1的方法，其中所說的血管抑制素片段是kringle1-4蛋白質(zhì)。21.權(quán)利要求20的方法，其中所說的kringle1-4蛋白質(zhì)具有小于約150nM的內(nèi)皮細(xì)胞ED50。22.權(quán)利要求20的方法，其中所說的kringle1-4蛋白質(zhì)包含選自由SEQIDNO39和SEQIDNO40組成的組的氨基酸序列或它們的功能性同系物。23.權(quán)利要求1的方法，其中所說的血管抑制素片段是kringle1-4BKLS蛋白質(zhì)。24.權(quán)利要求23的方法，其中所說的kringle1-4BKLS蛋白質(zhì)包含SEQIDNO42的氨基酸序列或其功能性同系物。25.權(quán)利要求1的方法，其中所說的施用步驟包括施用兩種或多種血管抑制素片段的組合體。26.權(quán)利要求25的方法，其中所說的血管抑制素片段的組合體包含kringle1蛋白質(zhì)和kringle2蛋白質(zhì)。27.權(quán)利要求26的方法，其中所說的kringle1蛋白質(zhì)包含SEQIDNO8的氨基酸序列或其功能性同系物，所說的kringle2蛋白質(zhì)包含SEQIDNO13的氨基酸序列或其功能性同系物。28.權(quán)利要求25的方法，其中所說的血管抑制素片段的組合體包含kringle1蛋白質(zhì)和kringle2-3蛋白質(zhì)。29.權(quán)利要求28的方法，其中所說的kringle1蛋白質(zhì)包含SEQIDNO8的氨基酸序列或其功能性同系物，所說的kringle2-3蛋白質(zhì)包含SEQIDNO25的氨基酸序列或其功能性同系物。30.權(quán)利要求25的方法，其中所說的血管抑制素片段的組合體包含kringle1蛋白質(zhì)、kringle2蛋白質(zhì)和kringle3蛋白質(zhì)。31.權(quán)利要求30的方法，其中所說的kringle1蛋白質(zhì)包含SEQIDNO8的氨基酸序列或其功能性同系物，所說的kringle2蛋白質(zhì)包含SEQIDNO13的氨基酸序列或其功能性同系物，所說的kringle3蛋白質(zhì)包含SEQIDNO18的氨基酸序列或其功能性同系物。32.權(quán)利要求25的方法，其中所說的血管抑制素片段的組合體包含kringle2蛋白質(zhì)和kringle3蛋白質(zhì)。33.權(quán)利要求32的方法，其中所說的kringle2蛋白質(zhì)包含SEQIDNO13的氨基酸序列或其功能性同系物，所說的kringle3蛋白質(zhì)包含SEQIDNO18的氨基酸序列或其功能性同系物。34.一種治療哺乳動(dòng)物血管生成介導(dǎo)的疾病的方法，該方法包括對(duì)哺乳動(dòng)物施用治療有效量的血管抑制素片段。35.權(quán)利要求34的方法，其中所說的哺乳動(dòng)物是人。36.權(quán)利要求34的方法，其中所說的血管生成介導(dǎo)的疾病選自癌、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、黃斑變性和糖尿病視網(wǎng)膜病組成的組。37.權(quán)利要求34的方法，其中所說的血管抑制素片段選自由kringle1蛋白質(zhì)、kringle2蛋白質(zhì)、kringle3蛋白質(zhì)、kringle2-3蛋白質(zhì)、kringle1-3蛋白質(zhì)、kringle1-2蛋白質(zhì)、kringle1-4蛋白質(zhì)和kringle1-4BKLS蛋白質(zhì)組成的組或它們的組合體。38.權(quán)利要求34的方法，其中所說的血管抑制素片段包含選自由下列序列組成的組的氨基酸序列或者它們的組合體或功能性同系物SEQIDNO7；SEQIDNO8；SEQIDNO9；SEQIDNO10；SEQIDNO11；SEQIDNO12；SEQIDNO13；SEQIDNO14；SEQIDNO15；SEQIDNO16；SEQIDNO17；SEQIDNO18；SEQIDNO19；SEQIDNO20；SEQIDNO21；SEQIDNO24；SEQIDNO25；SEQIDNO26；SEQIDNO27；SEQIDNO28；SEQIDNO29；SEQIDNO30；SEQIDNO31；SEQIDNO32；SEQIDNO33；SEQIDNO34；SEQIDNO35；SEQIDNO36；SEQIDNO37；SEQIDNO38；SEQIDNO39；SEQIDNO40；SEQIDNO41和SEQIDNO42。39.權(quán)利要求34的方法，其中所說的血管抑制素片段具有小于約500nM的內(nèi)皮細(xì)胞ED50。40.血管抑制素片段在制造供抑制血管生成之治療應(yīng)用的藥物上的用途。41.權(quán)利要求40的用途，其中所說的血管抑制素片段具有小于約500nM的內(nèi)皮細(xì)胞ED50。42.權(quán)利要求40的用途，其中所說的血管抑制素片段源于鼠纖溶酶原、人纖溶酶原、恒河猴纖溶酶原、豬纖溶酶原或牛纖溶酶原。43.權(quán)利要求40的用途，其中所說的血管抑制素片段包含選自由下列序列組成的組的氨基酸序列或者它們的組合體或功能性同系物SEQIDNO7；SEQIDNO8；SEQIDNO9；SEQIDNO10；SEQIDNO11；SEQIDNO12；SEQIDNO13；SEQIDNO14；SEQIDNO15；SEQIDNO16；SEQIDNO17；SEQIDNO18；SEQIDNO19；SEQIDNO20；SEQIDNO21；SEQIDNO22；SEQIDNO23；SEQIDNO24；SEQIDNO25；SEQIDNO26；SEQIDNO27；SEQIDNO28；SEQIDNO29；SEQIDNO30；SEQIDNO31；SEQIDNO32；SEQIDNO33；SEQIDNO34；SEQIDNO35；SEQIDNO36；SEQIDNO37；SEQIDNO38；SEQIDNO39；SEQIDNO40；SEQIDNO41和SEQIDNO42。44.一種抑制內(nèi)皮細(xì)胞增殖的治療組合物，該組合物包含實(shí)質(zhì)上分離的血管抑制素片段和藥學(xué)上可接受的賦形劑。45.權(quán)利要求44的組合物，其中所說的血管抑制素片段源于鼠纖溶酶原、人纖溶酶原、恒河猴纖溶酶原、豬纖溶酶原或牛纖溶酶原。46.權(quán)利要求44的組合物，其中所說的血管抑制素片段選自由kringle1蛋白質(zhì)、kringle2蛋白質(zhì)、kringle3蛋白質(zhì)、kringle2-3蛋白質(zhì)、kringle1-3蛋白質(zhì)、kringle1-2蛋白質(zhì)、kringle1-4蛋白質(zhì)和kringle1-4BKLS組成的組或它們的組合體。47.權(quán)利要求44的組合物，其中所說的血管抑制素片段包含選自由下列序列組成的組的氨基酸序列的部分或者它們的組合體或功能性同系物SEQIDNO7；SEQIDNO8；SEQIDNO9；SEQIDNO10；SEQIDNO11；SEQIDNO12；SEQIDNO13；SEQIDNO14；SEQIDNO15；SEQIDNO16；SEQIDNO17；SEQIDNO18；SEQIDNO19；SEQIDNO20；SEQIDNO21；SEQIDNO24；SEQIDNO25；SEQIDNO26；SEQIDNO27；SEQIDNO28；SEQIDNO29；SEQIDNO30；SEQIDNO31；SEQIDNO32；SEQIDNO33；SEQIDNO34；SEQIDNO35；SEQIDNO36；SEQIDNO37；SEQIDNO38；SEQIDNO39；SEQIDNO40；SEQIDNO41和SEQIDNO42。48.一種包含分離的DNA序列的組合物，所說DNA序列編碼具有內(nèi)皮細(xì)胞增殖抑制活性的血管抑制素片段。49.權(quán)利要求48的組合物，其中所說的血管抑制素片段選自由kringle1蛋白質(zhì)、kringle2蛋白質(zhì)、kringle3蛋白質(zhì)、kringle2-3蛋白質(zhì)、kringle1-3蛋白質(zhì)、kringle1-2蛋白質(zhì)、kringle1-4蛋白質(zhì)和kringle1-4BKLS組成的組或它們的組合體。50.權(quán)利要求48的組合物，其中所說的DNA序列編碼選自由下列序列組成的組的氨基酸序列或者它們的組合體或功能性同系物SEQIDNO7；SEQIDNO8；SEQIDNO9；SEQIDNO10；SEQIDNO11；SEQIDNO12；SEQIDNO13；SEQIDNO14；SEQIDNO15；SEQIDNO16；SEQIDNO17；SEQIDNO18；SEQIDNO19；SEQIDNO20；SEQIDNO21；SEQIDNO22；SEQIDNO23；SEQIDNO24；SEQIDNO25；SEQIDNO26；SEQIDNO27；SEQIDNO28；SEQIDNO29；SEQIDNO30；SEQIDNO31；SEQIDNO32；SEQIDNO33；SEQIDNO34；SEQIDNO35；SEQIDNO36；SEQIDNO37；SEQIDNO38；SEQIDNO39；SEQIDNO40；SEQIDNO41和SEQIDNO42。51.權(quán)利要求48的組合物，該組合物還包含與編碼血管抑制素片段的DNA序列有關(guān)的載體，其中所說的載體當(dāng)存在于細(xì)胞中時(shí)能表達(dá)血管抑制素片段。52.權(quán)利要求51的組合物，該組合物還包含含有所說載體的細(xì)胞。53.一種表達(dá)具有內(nèi)皮細(xì)胞增殖抑制活性的血管抑制素片段的方法，該方法包括把載體轉(zhuǎn)染進(jìn)細(xì)胞，其中所說的載體包含編碼所說的血管抑制素片段的DNA序列，其中所說的載體當(dāng)存在于細(xì)胞中時(shí)能表達(dá)血管抑制素片段。54.權(quán)利要求53的方法，其中所說的血管抑制素片段選自由kringle1蛋白質(zhì)、kringle2蛋白質(zhì)、kringle3蛋白質(zhì)、kringle2-3蛋白質(zhì)、kringle1-3蛋白質(zhì)、kringle1-2蛋白質(zhì)、kringle1-4蛋白質(zhì)和kringle1-4BKLS組成的組或它們的組合體。55.權(quán)利要求53的方法，其中所說的編碼包含氨基酸序列的血管抑制素片段的DNA序列選自由下列序列組成的組或者它們的組合體或功能性同系物SEQIDNO7；SEQIDNO8；SEQIDNO9；SEQIDNO10；SEQIDNO11；SEQIDNO12；SEQIDNO13；SEQIDNO14；SEQIDNO15；SEQIDNO16；SEQIDNO17；SEQIDNO18；SEQIDNO19；SEQIDNO20；SEQIDNO21；SEQIDNO22；SEQIDNO23；SEQIDNO24；SEQIDNO25；SEQIDNO26；SEQIDNO27；SEQIDNO28；SEQIDNO29；SEQIDNO30；SEQIDNO31；SEQIDNO32；SEQIDNO33；SEQIDNO34；SEQIDNO35；SEQIDNO36；SEQIDNO37；SEQIDNO38；SEQIDNO39；SEQIDNO40；SEQIDNO41和SEQIDNO42。56.一種抑制內(nèi)皮細(xì)胞增殖的組合物，該組合物包含集合血管抑制素。57.權(quán)利要求56的組合物，其中所說的集合血管抑制素通過還原聚丙烯酰胺凝膠電泳測(cè)定具有約45至65千道爾頓的分子量。58.權(quán)利要求56的組合物，其中所說的集合血管抑制素源于在約第98個(gè)氨基酸開始的纖溶酶原片段，這些纖溶酶原片段源于人纖溶酶、鼠纖溶酶原、牛纖溶酶原、恒河猴纖溶酶原或豬纖溶酶原。59.權(quán)利要求58的組合物，其中所說的集合血管抑制素包含選自由SEQIDNO2，SEQIDNO3，SEQIDNO4，SEQIDNO5和SEQIDNO6組成的組的氨基酸序列或它們的功能性同系物。60.權(quán)利要求56的組合物，其中所說的集合血管抑制素源于重組血管抑制素。61.權(quán)利要求56的組合物，其中所說的集合血管抑制素能抑制血管生成介導(dǎo)的疾病。62.權(quán)利要求61的組合物，其中所說的疾病選自由癌、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、黃斑變性和糖尿病視網(wǎng)膜病組成的組。63.一種抑制內(nèi)皮細(xì)胞增殖的方法，該方法包括對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞施用增殖抑制量的集合血管抑制素。64.權(quán)利要求63的方法，其中所說的集合血管抑制素通過還原聚丙烯酰胺凝膠電泳測(cè)定具有約45至65千道爾頓的分子量。65.權(quán)利要求63的方法，其中所說氨基集合血管抑制素源于在約第98個(gè)氨基酸開始的纖溶酶原片段，這些纖溶酶原片段源于人纖溶酶、鼠纖溶酶原、牛纖溶酶原、恒河猴纖溶酶原或豬纖溶酶原。66.權(quán)利要求63的方法，其中所說的集合血管抑制素包含選自由SEQIDNO2，SEQIDNO3，SEQIDNO4，SEQIDNO5和SEQIDNO6組成的組的氨基酸序列或它們的功能性同系物。67.權(quán)利要求63的方法，其中所說的集合血管抑制素源于重組血管抑制素。68.權(quán)利要求63的方法，其中所說的集合血管抑制素能抑制血管生成介導(dǎo)的疾病。69.權(quán)利要求68的方法，其中所說的血管生成介導(dǎo)的疾病選自由癌、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、黃斑變性和糖尿病視網(wǎng)膜病組成的組。70.一種治療患有血管生成介導(dǎo)的疾病的哺乳動(dòng)物的方法，該方法包括對(duì)哺乳動(dòng)物施用血管生成介導(dǎo)的疾病治療有效量的集合血管抑制素。71.集合血管抑制素在制造供抑制血管生成之治療應(yīng)用的藥物上的用途。72.權(quán)利要求71的用途，其中所說的集合血管抑制素通過還原聚丙烯酰胺凝膠電泳測(cè)定具有約45至65千道爾頓的分子量。73.權(quán)利要求71的方法，其中所說集合血管抑制素源于在約第98個(gè)氨基酸開始的纖溶酶原片段，這些纖溶酶原片段源于人纖溶酶、鼠纖溶酶原、牛纖溶酶原、恒河猴纖溶酶原或豬纖溶酶原。74.權(quán)利要求71的方法，其中所說的集合血管抑制素包含選自由SEQIDNO2，SEQIDNO3，SEQIDNO4，SEQIDNO5和SEQIDNO6組成的組的氨基酸序列或它們的功能性同系物。75.一種產(chǎn)生用于抑制內(nèi)皮細(xì)胞增殖的集合血管抑制素的方法，該方法包括純化血管抑制素，和集合純化的血管抑制素。76.權(quán)利要求75的方法，其中所說的集合步驟通過透析血管抑制素進(jìn)行。77.權(quán)利要求76的方法，其中所說的透析步驟進(jìn)行約24小時(shí)，并至少改變?nèi)瓮肝鲆骸?8.權(quán)利要求77的方法，其中所說的透析步驟在約4℃下進(jìn)行。79.權(quán)利要求75的方法，其中所說的集合血管抑制素源于重組血管抑制素。80.權(quán)利要求79的方法，其中所說的重組血管抑制素包含寡組氨酸部分，所說的純化步驟使用鎳親和性色譜柱進(jìn)行。81.權(quán)利要求75的方法，其中所說的集合血管抑制素通過還原聚丙烯酰胺凝膠電泳測(cè)定具有約45至65千道爾頓的分子量。82.由權(quán)利要求75的方法制備的產(chǎn)物。83.一種組合物，該組合物包含集合血管抑制素和藥學(xué)上可接受的賦形劑。84.權(quán)利要求83的組合物，該組合物還包含持久釋放基質(zhì)。85.權(quán)利要求83的組合物，其中所說的集合血管抑制素通過還原聚丙烯酰胺凝膠電泳測(cè)定具有約45至65千道爾頓的分子量。全文摘要本發(fā)明提供了內(nèi)皮細(xì)胞增殖抑制劑的片段和集合形式及使用它們的方法。內(nèi)皮細(xì)胞增殖抑制劑是源于纖溶酶原的蛋白質(zhì),或者更具體地說是一種血管抑制素片段。血管抑制素片段通常相應(yīng)于內(nèi)皮細(xì)胞增殖抑制劑內(nèi)的krinkle結(jié)構(gòu)。血管抑制素也以集合形式制備。血管抑制素片段和集合血管抑制素的內(nèi)皮細(xì)胞抑制活性給出了抑制腫瘤的血管生成和治療血管生成介導(dǎo)的疾病的方法。文檔編號(hào)A61K48/00GK1195375SQ96194077公開日1998年10月7日申請(qǐng)日期1996年4月26日優(yōu)先權(quán)日1995年4月26日發(fā)明者M(jìn)·J·?？寺?M·S·奧賴?yán)?Y·曹,林杰申請(qǐng)人:兒童醫(yī)學(xué)中心公司