專利名稱：利用酶亞單位制備的藥劑和檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及在預(yù)定的條件下，例如在預(yù)定的位點(diǎn)或在預(yù)定的物質(zhì)存在的條件下釋放一種藥劑的方法，特別是涉及用于治療，診斷或調(diào)查目的釋放一種藥劑的方法。本發(fā)明進(jìn)一步涉及引入到所述方法中的藥物組合物，用于所述方法中的物質(zhì)和試劑盒。
通常在生物科學(xué)領(lǐng)域內(nèi)期望能夠在預(yù)定的條件下例如在生物體內(nèi)的特定位點(diǎn)儲(chǔ)存或釋放一種特定的藥劑，或在檢測(cè)過程中顯示存在或缺乏一種分析物。目前通過使用直接綴合到活性成份的抗體可以達(dá)到所述的特異性。例如已經(jīng)使用腫瘤相關(guān)性單克隆抗體(MABS)來選擇性地將化療藥物攜帶至腫瘤細(xì)胞。臨床研究已經(jīng)調(diào)查了在患者的直腸癌中甲氨喋呤的釋放(Ballantyne等人，1988，Int.J.Cancer，42103-108)并且也使用了阿霉素(參見“癌癥生物治療原理”Ed.Oldham，R.K.，Raven Press，New York，1987)。類似地，也可以將綴合到毒素，例如蓖麻毒蛋白，紅豆毒素，假單胞菌毒素，白喉毒素和其它毒素上的MABS用作為抗癌劑。體內(nèi)和體外研究已經(jīng)表明所述綴合物對(duì)腫瘤細(xì)胞有強(qiáng)烈毒性(Roffler等人，1991。Cancer Res.514001-4007Embleton等人，1991Bir.J.Cancer 63670-674)。
對(duì)于轉(zhuǎn)移性的疾病或輔助性的或原始的背景使用MABS可以選擇性地避免與傳統(tǒng)的癌癥的化療治療相關(guān)的毒副作用問題。但是，由于許多藥劑需要在殺死靶細(xì)胞之前內(nèi)在化，因此出現(xiàn)了大問題。另外由于與非靶細(xì)胞的作用，在傳遞到位點(diǎn)時(shí)免疫毒素通常引起不可接受的毒性。
對(duì)于選定的藥劑可替代的遞送系統(tǒng)是基于合成脂質(zhì)體的使用。脂質(zhì)體最初描述于1974(Bangham等人，Methods Membr.Biol.11-68)。脂質(zhì)體由一種或多種磷脂雙層組成，它們排列于另一個(gè)含水空間的同軸環(huán)。已經(jīng)將許多化合物(它們都是脂和水溶性的)包括癌癥化療劑，抗菌劑，酶，激素和核酸摻入到脂質(zhì)體的水或脂相。在動(dòng)物和人個(gè)體中含藥的脂質(zhì)體的行為已經(jīng)形成了幾種研究課題(Gregoriadis 1990，Immunil.Today 1189-97)。
因此，脂質(zhì)體作為各種各樣的應(yīng)用目的包括生化和免疫測(cè)定，診斷的遞送藥劑的泡囊以及腸的和非腸道的應(yīng)用的藥物遞送系統(tǒng)具有相當(dāng)大的保障。不幸的是，由于在特定的時(shí)間或位點(diǎn)選擇性地釋放其內(nèi)含物帶來的困難而削弱了其應(yīng)用的基礎(chǔ)。
現(xiàn)在本發(fā)明提供了用于在特定的疾病位點(diǎn)或特定的時(shí)間或位點(diǎn)釋放選定的藥劑的方法，以及引入到所述方法的藥物組合物，用于該方法的試劑盒和材料，所有這些為了探究上面提出的一些，優(yōu)選的是所有問題。
根據(jù)本發(fā)明的第一個(gè)方面，提供了在預(yù)定的條件下釋放一種藥劑的方法，該方法包括下列步驟保護(hù)該藥劑在脂質(zhì)結(jié)構(gòu)內(nèi)，導(dǎo)致所構(gòu)成的脂酶活性對(duì)預(yù)定的條件應(yīng)答，將該脂質(zhì)結(jié)構(gòu)與構(gòu)成的脂酶活性接觸以便遞送該藥劑。
脂酶是指水解脂的一種酶，包括但不限于水解復(fù)合脂例如磷脂和糖脂的酶。
本文中使用的術(shù)語“構(gòu)成的”是指定位的，制備的或顯著地增加，即當(dāng)滿足預(yù)定的條件時(shí)脂酶活性開始顯著地提高或增加。
已知有大量的天然存在的脂酶。例如許多革蘭氏陽性和陰性細(xì)菌產(chǎn)生具有磷脂酶C(PLC)活性的酶。這些酶以不同的效率水解磷脂并且具有各種各樣溶血的和致死的特性，通常這些特性使之不適合用于給活的個(gè)體給藥。
一種代表性的酶是產(chǎn)氣莢膜梭菌α-毒素(CPAT)。CPAT促進(jìn)哺乳動(dòng)物細(xì)胞的直接裂解，并且是至今描述的最毒的PLC(參見McDonel，J.L.(1986)pp 617-655“細(xì)胞毒素的藥理學(xué)”Eds.Dorner&Drews，Pub.Pergamon Press，Oxford)。CPAT是含有370個(gè)氨基酸的肽。
優(yōu)選的是，本發(fā)明使用的脂質(zhì)結(jié)構(gòu)包括限定一個(gè)核的磷脂膜。更優(yōu)選的是脂質(zhì)結(jié)構(gòu)是脂質(zhì)體。待釋放的藥劑根據(jù)本發(fā)明所述的精確的應(yīng)用來選擇，但是藥劑的特性必須是可被脂結(jié)構(gòu)保護(hù)的。
優(yōu)選的是用于本發(fā)明的脂酶活性包括PLC活性，更優(yōu)選的是源自于CPAT。以前未曾證明CPAT活性可針對(duì)脂質(zhì)體；但是本發(fā)明的發(fā)明人已經(jīng)證實(shí)CPAT具有顯著的針對(duì)脂質(zhì)體的活性。
優(yōu)選的是本發(fā)明中應(yīng)用的脂酶是通過將兩種或三種成份結(jié)合構(gòu)成的，因此由這些成份形成的產(chǎn)物的脂酶活性大于單個(gè)成份的活性的總和，或另一種可選的情況，憑借脂酶的定位在通常具有較低或沒有脂酶活性的特定的位點(diǎn)構(gòu)成了脂酶活性，脂酶以全酶或兩種或多種成份的結(jié)合的形式存在，對(duì)于任一種情況，都與靶分子結(jié)合。
更優(yōu)選的是，這些成份對(duì)應(yīng)于或源自于一種活性脂酶全酶以便它們結(jié)合可恢復(fù)全酶脂酶的整個(gè)或部分活性，優(yōu)選的是在特定的位點(diǎn)。這些成份可以都是蛋白質(zhì)，但是該發(fā)明包括所有的系統(tǒng)，其中由于兩種或多種成份的結(jié)合而加強(qiáng)，定位，或恢復(fù)脂酶活性，包括非蛋白質(zhì)成份例如輔助因子。
最優(yōu)選的是該成份來自于或包括CPAT。
CPAT的N-末端的三分之二與來自蠟質(zhì)芽孢桿菌的磷脂酰膽堿-PLC共有序列同源性。已經(jīng)證實(shí)N-末端重組的截短的CPAT(aa 1-249)保留了磷脂酰膽堿的水解活性，但是已經(jīng)降低了鞘磷脂酶活性，并且既非溶血也非致死的。(Titball等人，1991.Infect.Immun.591872-1874)。含有CPAT的C-末端的三分之一(aa 247-370)的重組蛋白質(zhì)沒有鞘磷脂酶和溶血活性，并且對(duì)于鼠淋巴細(xì)胞是無毒的(Titball等人，1993，F(xiàn)EMS MicrobiologyLetter 11045-50)。已經(jīng)證實(shí)當(dāng)N-末端和C-末端重組蛋白加到一起時(shí)(“重新構(gòu)建的CPAT”)能夠恢復(fù)溶血活性(由體外鼠紅細(xì)胞裂解檢測(cè)估測(cè))。
本發(fā)明的發(fā)明人已經(jīng)證明重新構(gòu)建的CPAT具有顯著的針對(duì)脂質(zhì)體活性。
本發(fā)明預(yù)定的條件要求該藥劑僅在腫瘤或病原體的附近，或在分析物或DNA序列存在下或在其它合適的可檢測(cè)的條件下被釋放。
優(yōu)選的是預(yù)定的條件的獲得從原因上是指通過將至少一種脂酶成份或全酶綴合到靶分子而在特定位點(diǎn)獲得脂酶活性，所述靶分子能夠在預(yù)定的條件下與預(yù)定的靶特異性結(jié)合。合適的靶分子包括抗體，抗原，受體，配體和核酸探針或引物。
因此，所述條件的獲得便利的是指(借助于特定的抗原-抗體結(jié)合，或核苷酸探針與特定的序列的退火或通過其它一些特定的物理方法)在預(yù)定的靶存在下脂酶活性的構(gòu)成。之后將合適的脂結(jié)構(gòu)例如脂質(zhì)體加入到該系統(tǒng)有效地導(dǎo)致靶誘導(dǎo)的脂質(zhì)體裂解。
因此，用于在預(yù)定的靶位點(diǎn)釋放一種藥劑的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，靶分子是產(chǎn)生用于結(jié)合到靶位點(diǎn)的抗原上的一種抗體。該抗體綴合到第一脂酶成份以便該成份結(jié)合到該位點(diǎn)。將第二脂酶成份加入到該系統(tǒng)，并且結(jié)合到第一脂酶成份，以便在該系統(tǒng)中沒有全部活性脂酶循環(huán)的情況下在該位點(diǎn)獲得脂酶活性。向該系統(tǒng)中加入含有合適藥劑的脂質(zhì)體，以便使它們與構(gòu)成的脂酶接觸而裂解從而在該位點(diǎn)定位釋放藥劑。
應(yīng)該注意到可將第二脂酶成份獨(dú)立地加入，結(jié)合地，或作為脂質(zhì)體的整合部分加入。
用于在預(yù)定的靶位點(diǎn)釋放一種藥劑的另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，靶分子是產(chǎn)生用于結(jié)合到靶位點(diǎn)的抗原上的一種抗體。該抗體綴合到脂酶全酶以便該全酶結(jié)合到該位點(diǎn)。向該系統(tǒng)中加入含有合適藥劑的脂質(zhì)體，以便使它們與構(gòu)成的脂酶接觸而裂解從而在該位點(diǎn)定位釋放藥劑。
因此這些實(shí)施方案已經(jīng)用于通過膜裂解酶活性的靶擊遞送而體內(nèi)治療疾病或確定疾病的位置。未結(jié)合的抗體成份綴合物可在加入第二成份之前從系統(tǒng)中清除，以便僅確保局部構(gòu)成脂酶活性。然后可以通過加入含有調(diào)節(jié)疾病的化合物的脂質(zhì)體獲得特定的疾病細(xì)胞或生物體的切除。因此由于能夠在腫瘤釋放局部濃度高的化合物本發(fā)明在抗腫瘤中的應(yīng)用提供了改善的致死指數(shù)，而且也可能提供有利的旁觀者效應(yīng)，其中在最接近腫瘤的位置攜帶非抗原的癌細(xì)胞也是化療致死的對(duì)象。
合適的化合物包括報(bào)道分子，細(xì)胞毒性藥物，淋巴因子，消炎劑，抗真菌劑，抗瘧劑和抗擊疾病感染的其它藥劑，合成的寡核苷酸，核酸(例如質(zhì)粒)等等，作為免疫毒素的其它的抗體，用于將非活性轉(zhuǎn)化為活性的藥物化合物的酶等等。根據(jù)待解決的問題，這些所使用的精確的化合物對(duì)本領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員而言是顯而易見的。
在本發(fā)明的用于檢測(cè)一個(gè)系統(tǒng)中抗原存在的第二個(gè)實(shí)施方案中，靶分子是綴合到第一脂酶成份上的一種抗原。將該抗原第一成份綴合物與抗真正的抗原的抗體混合，以便該抗體與綴合的抗原結(jié)合。結(jié)合的抗體的存在在空間上阻止了在第二脂酶成份存在下脂酶活性的構(gòu)成。當(dāng)在真正的抗原存在下形成抗體/抗原成份復(fù)合物時(shí)，抗體被真正的抗原隔離開并且與之結(jié)合。這意味著在第二脂酶成份存在下構(gòu)成了脂酶活性。通過將含有合適的標(biāo)記例如染料的脂質(zhì)體加入到該系統(tǒng)可檢測(cè)到脂酶活性(因此存在真正的抗原)。
因此該實(shí)施方案在體外具有作為用于檢測(cè)生物學(xué)或其它分析物的同源性檢測(cè)系統(tǒng)的用途。通過重組或生物學(xué)技術(shù)可將該抗原綴合到脂酶構(gòu)成成份之一。
在本發(fā)明的用于檢測(cè)一個(gè)系統(tǒng)中抗原存在的另一個(gè)實(shí)施方案中，靶分子是結(jié)合到第一脂酶成份或全酶上的一種抗體。將該抗體-脂酶綴合物結(jié)合到特定的抗原上，所述抗原已經(jīng)通過直接結(jié)合到固相或通過借助于一種抗體或其它中間體分子與固相結(jié)合。在綴合物結(jié)合，并且在洗滌或洗脫過量的綴合物之后，通過加入含有合適的標(biāo)記例如染料的脂質(zhì)體檢測(cè)抗原的存在。
另一種可用于檢測(cè)一個(gè)系統(tǒng)中抗原存在的方法，也可以直接通過吸附或化學(xué)鍵合或借助于另一種抗體或結(jié)合劑間接地吸附到一種固相而將抗原吸附到該固相。然后加入含有整個(gè)脂酶或一種脂酶成份的抗體脂酶綴合物，如果需要隨后加入第二脂酶成份，再加入含有合適的化合物的脂質(zhì)體。
在可用于檢測(cè)一個(gè)系統(tǒng)中特定的核苷酸序列存在或確定其位置的第三個(gè)實(shí)施方案中，將合適的互補(bǔ)探針吸附到一種或兩種脂酶成份上，以便將一種或幾種探針退火到該序列，引起在該位點(diǎn)形成脂酶活性。通過將含有合適的標(biāo)記例如染料的脂質(zhì)體加入到該系統(tǒng)可檢測(cè)到脂酶活性(因此存在該序列)。
在可用于檢測(cè)一個(gè)系統(tǒng)中特定的核苷酸序列的另一種方案中，可以直接通過吸附或化學(xué)鍵合或借助于互補(bǔ)的核苷酸序列或另一種抗體或結(jié)合劑間接地吸附到一種固相而將該核苷酸序列吸附到該固相。然后加入含有整個(gè)脂酶或一種脂酶成份的探針-脂酶綴合物，如果需要，隨后加入第二脂酶成份，再加入含有合適的化合物的脂質(zhì)體。
本發(fā)明也包括用于上述方法的材料。
在本發(fā)明的第二個(gè)方面，提供了能夠與第二脂酶成份結(jié)合的第一脂酶成份，以便由所述成份形成的產(chǎn)物的脂酶活性大于單個(gè)成份的活性的總和。所述第一脂酶成份綴合到能夠與預(yù)定的靶特異性結(jié)合的靶分子。
本發(fā)明也包括含有綴合到脂酶全酶或脂酶成份的靶分子，以及含有藥物學(xué)活性化合物或能夠轉(zhuǎn)化為藥物學(xué)活性分子的脂質(zhì)體藥物制劑。
本發(fā)明也包括用于上述方法的試劑盒。
因此在本發(fā)明的第三個(gè)方面，提供了用于上述方法的試劑盒，它包括能夠與第二脂酶成份結(jié)合的第一脂酶成份，從而由該成份形成的產(chǎn)物的脂酶活性大于單個(gè)成份的活性的總和，所述的第一脂酶成份綴合到能夠與預(yù)定的靶特異性結(jié)合的靶分子上，并且該試劑盒進(jìn)一步包括第二脂酶成份。
優(yōu)選的是該試劑盒進(jìn)一步包括含有用于上述方法的合適的藥劑的脂質(zhì)體。
優(yōu)選的是，該脂酶成份是上文中描述的CPAT全酶或N-末端重組CPAT和C-末端重組CPAT。
其它各種脂酶替代物可適用于本發(fā)明。這些替代物包括來自于牛和豬胰，蜜蜂毒液，Crotalus毒液的脂酶，以及包括來自于紫紅鏈霉菌的磷脂酶B和來自于弧菌屬和蠟質(zhì)芽孢桿菌的磷脂酶C。本領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員也將明白作為本發(fā)明的藥物制劑中的非人脂酶的替代物，可用人來源的脂酶可由或可選的，通過遺傳工程技術(shù)改造的或修飾的類似于CPAT的非人的脂酶替代，以便逃脫被人免疫系統(tǒng)識(shí)別。
將兩種或多種脂酶成份用于本發(fā)明的方法，或用于本發(fā)明的物質(zhì)和材料中，可以改善這些脂酶成份的結(jié)合強(qiáng)度以便更快或更全面地重新構(gòu)成酶活性。例如通過遺傳工程手段或通過使用其本身相互結(jié)合的輔助成份而將脂酶成份連在一起可以達(dá)到上述目的。
因此可利用CPAT或重新構(gòu)成的CPAT活性指導(dǎo)含有生物學(xué)活性制劑或可檢測(cè)分子例如染料的合成脂質(zhì)體的裂解，從而提供了用于靶擊藥物體內(nèi)釋放的原理或提供了用于體外同源性和不連續(xù)的檢測(cè)系統(tǒng)的報(bào)道系統(tǒng)。
其它各種脂質(zhì)體替代物可適用于本發(fā)明。本發(fā)明包括各種類型的脂質(zhì)體。
現(xiàn)在僅為了說明的目的，參考下面實(shí)施例和附圖描述本發(fā)明的方法。根據(jù)這些內(nèi)容對(duì)本領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員而言其它實(shí)施方案也在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
附圖附

圖1證實(shí)在實(shí)施例1描述的試驗(yàn)中純化的重組CPAT(全酶)可以誘導(dǎo)脂質(zhì)體的裂解。
附圖2證實(shí)i)純化的重組CPAT(全酶)，ii)重組N-CPAT；iii)重組C-CPAT和vi)混合的重組N-和C-CPAT抗脂質(zhì)體的比較活性。試驗(yàn)是按照實(shí)施例2描述進(jìn)行的。
附圖3圖解顯示說明實(shí)施例3中體內(nèi)抗癌方法。
附圖3b圖解顯示類似于實(shí)施例3的體內(nèi)抗癌方法，其中全酶與抗體綴合。
附圖4圖解顯示在實(shí)施例5中描述的體外抗體介導(dǎo)的抗原檢測(cè)方法。
附圖5圖解顯示在實(shí)施例6中描述的體外核酸雜交檢測(cè)方法。
附圖6圖解顯示抗體脂酶與抗原在固相上的結(jié)合，隨后脂質(zhì)體裂解。
附圖7圖解顯示抗體脂酶與核苷酸在固相上的結(jié)合，隨后脂質(zhì)體裂解。
實(shí)施例實(shí)施例1-通過重組CPAT全酶的脂質(zhì)體的裂解利用含有羧基熒光素物質(zhì)的脂質(zhì)體檢測(cè)純化的重組CPAT(全酶)誘導(dǎo)脂質(zhì)體裂解的能力，利用熒光測(cè)定方法評(píng)估裂解。利用濃度在1pM和1μM之間的CPAT在60分鐘內(nèi)檢測(cè)羧基熒光素的釋放。
結(jié)果顯示于附圖1，清楚地證明CPAT抗原誘導(dǎo)脂質(zhì)體的裂解。
利用由Senior和Gregoriadis(1983)在脂質(zhì)體技術(shù)上描述的方法制備含有5-(6)-羧基熒光素的鞘磷脂酶脂質(zhì)體((Gregoriadis ed.)vol pp263-82，CRCPress，BocaRaton，F(xiàn)lorida.)。將溶于氯仿中的鞘磷脂酶和β-油?；?γ-膽固醇的混合物的一薄層(1∶1w/w，總量35.5毫克)在氮?dú)庵懈稍锊⑶壹尤媵然鶡晒馑?20毫克)。將該混合物置于40℃水浴超聲處理器中，于22℃保留1小時(shí)，然后超聲處理(10×1分鐘處理，循環(huán)之間0.5分鐘，40℃；Heatsystems XL-200超聲處理器，用19毫米的探針)，以便產(chǎn)生小的單層泡囊。利用凝膠過濾層析技術(shù)(Sephadex G-25；Pharmacia PD 10柱)，硼酸鹽緩沖的鹽水(BBS；0.2M偏硼酸鈉，7.5g/l NaCl，1.8g/lCaCl2.2H2O，用硼酸鹽將pH調(diào)節(jié)到7.5)作為洗脫緩沖液將游離的羧基熒光素與脂質(zhì)體分離。收集含有脂質(zhì)體的組分，并儲(chǔ)存與4℃。
在BBS中洗脫脂質(zhì)體，向2.5毫升體積的稀釋的脂質(zhì)體中加入25微升的酶。在37℃保溫該混合物，利用在485nm處(10nm狹縫寬)發(fā)出光并且在520nm處(5nm狹縫寬)檢測(cè)到發(fā)射的Perkin-Eimer L5-5B分光熒光測(cè)定計(jì)檢測(cè)熒光。
向6-羧基熒光素包裹的鞘磷脂酶脂質(zhì)體中加入產(chǎn)氣莢膜梭菌α-毒素(磷脂酶C)導(dǎo)致6-羧基熒光素?zé)晒庖蕾囉跁r(shí)間增加。在檢測(cè)的濃度范圍內(nèi)(參見附圖1，10pM-10nm終濃度)熒光增加的速率與酶的濃度相關(guān)。在沒有Ca2+的情況下，α-毒素(100pM)抗鞘磷脂酶脂質(zhì)體的活性降低了4倍。
Cpa1-249(N-區(qū)域)和Cpa247-370(C-區(qū)域)對(duì)羧基熒光素遞送的影響是單個(gè)區(qū)域的α-毒素(Cpa1-249和Cpa247-370)單個(gè)地保溫和與含有6-羧基熒光素的脂質(zhì)體一起保溫。結(jié)果顯示既不是單個(gè)的Cpa1-249也不是單個(gè)的Cpa247-370能夠誘導(dǎo)鞘磷脂酶脂質(zhì)體產(chǎn)生6-羧基熒光素?zé)晒?。但是，?dāng)Cpa1-249和Cpa247-370和鞘磷脂酶脂質(zhì)體一起保溫時(shí)，檢測(cè)到熒光的增加。
實(shí)施例2-CPAT全酶和N-和C-片段的比較活性利用熒光測(cè)定術(shù)檢測(cè)方法檢測(cè)純化的重組CPAT(全酶)，獨(dú)立的重組N-和C-CPAT，和混合的重組N-和C-CPAT抗脂質(zhì)體的比較活性。在各種情況下每種蛋白質(zhì)的濃度是100pM。
顯示于附圖2的結(jié)果清楚地證明由結(jié)合的N-和C-CPAT降低脂質(zhì)體的能力增強(qiáng)到相當(dāng)于其各種單獨(dú)的活性的總和。
實(shí)施例3-體內(nèi)遞送化療劑的方法附圖3所述提供了體內(nèi)抗癌癥方法。在該方法中將發(fā)明用于將化療劑靶擊到癌癥細(xì)胞。將C-CPAT(較小的CPAT片段)綴合到一種特異于腫瘤(A)的抗體，進(jìn)行體內(nèi)給藥。將綴合的抗體結(jié)合到腫瘤位點(diǎn)(B)，以互補(bǔ)(N-CPAT)片段給藥，從而導(dǎo)致在靶細(xì)胞表面(C)形成脂酶活性。將含有化療劑(阿霉素)的脂質(zhì)體與N-CPAT同時(shí)，或在其之后給藥。在腫瘤處保留的CPAT活性介導(dǎo)脂質(zhì)體的裂解，從而獲得高局部濃度的化療劑(E)。
在另一種可選的方法，將脂質(zhì)體用于將消炎藥或生物學(xué)應(yīng)答調(diào)節(jié)劑遞送到提供抗原的細(xì)胞，或者含有反應(yīng)性的滲濾疾病淋巴細(xì)胞的損壞的組織。
將會(huì)認(rèn)識(shí)的實(shí)施例3的通用方法在治療劑領(lǐng)域內(nèi)具有廣泛的用途。
實(shí)施例4-體內(nèi)遺傳修飾細(xì)胞的方法下面提供用于修飾細(xì)胞的遺傳特性的體內(nèi)方法。該方法類似于實(shí)施例3描述的方法，不同的是用脂質(zhì)體將抗增殖的合成寡核苷酸遞送到增殖細(xì)胞(內(nèi)容表皮細(xì)胞)。
將會(huì)認(rèn)識(shí)到實(shí)施例4的方法可用于治療許多遺傳基礎(chǔ)上的失調(diào)例如，cardiorestinosis，并且對(duì)許多依賴于將新遺傳信息遞送到各種疾病的細(xì)胞的治療或試驗(yàn)方案也是有價(jià)值的。
實(shí)施例5-體外同系物分析物檢測(cè)方法附圖4提供了顯示抗體介導(dǎo)的體外分析物檢測(cè)方法。
首先將分析物綴合到N-CPAT，將分析物/N-CPAT綴合物與抗結(jié)合到其上的分析物的抗體混合。將該復(fù)合物與C-CPAT和在懷疑含有分析物的系統(tǒng)中的含有報(bào)道分子的脂質(zhì)體混合。在沒有分析物的情況下，抗體從空間上阻止了CPAT活性的構(gòu)成，脂質(zhì)體保持完整(A)。在分析物存在的情況下，將抗體與N-CPAT復(fù)合物隔離，因此允許構(gòu)成CPAT活性和脂質(zhì)體裂解，從而釋放報(bào)道分子(B)。
將會(huì)認(rèn)識(shí)到所述檢測(cè)系統(tǒng)可廣泛地應(yīng)用于診斷和研究領(lǐng)域。
實(shí)施例6-體外核酸雜交檢測(cè)應(yīng)用顯示于附圖5所示的探針，提供了體外核酸序列檢測(cè)方法。
能夠與待檢測(cè)的序列雜交，以致于它們互相鄰接的核酸分子(探針)綴合到N-CPAT和C-CPAT。將該綴合物加入到被懷疑含有所述序列的系統(tǒng)中。在該序列存在下，出現(xiàn)探針的雜交，從而使N-CPAT和C-CPAT趨向于接近并且恢復(fù)CPAT活性。脂質(zhì)體的裂解標(biāo)志著活性的恢復(fù)，并且釋放可檢測(cè)的分子例如染料。
將會(huì)認(rèn)識(shí)到所述檢測(cè)系統(tǒng)可用于同源性檢測(cè)分析(沒有固相或分離步驟)和間斷檢測(cè)分析(其中靶序列與固相結(jié)合)。
附圖7說明體外核酸檢測(cè)分析。核苷酸序列1直接或間接吸附到固相2。然后將含有脂酶4(是整個(gè)脂酶或一個(gè)成份)的探針脂酶成份3加入，如果需要隨后加入第二脂酶成份。探針脂酶成份3也含有一個(gè)短的核苷酸序列5，它與核苷酸序列1的一部分互補(bǔ)。將脂質(zhì)體6加入到該系統(tǒng)，與探針脂酶成份3接觸而裂解，從而釋放脂質(zhì)體的內(nèi)含物。
含有產(chǎn)氣莢膜梭菌α-毒素N-末端區(qū)域的脂酶對(duì)應(yīng)于具有磷脂酶活性的區(qū)域，通常它可以包括1-260的殘基，它依次包括該范圍內(nèi)的一些或所有氨基酸，C-末端提供脂質(zhì)體裂解活性，通常可以包括240-370的殘基，它依次包括該范圍內(nèi)的一些或所有氨基酸。
下面的試驗(yàn)方法說明了利用脂酶綴合的抗體結(jié)合脂質(zhì)體包裹的藥物殺死癌癥細(xì)胞。
將抗-CEA抗體與綴合的產(chǎn)氣莢膜梭菌磷脂酶C全酶一起體外靶擊到HeLa細(xì)胞。在抗體脂酶綴合物結(jié)合到細(xì)胞之后，去除過量的綴合物，加入藥物脂質(zhì)體?？贵w-綴合物磷脂酶C打破脂質(zhì)體，釋放胞毒性藥物，導(dǎo)致殺死癌癥細(xì)胞的功能增強(qiáng)。設(shè)置合適的對(duì)照以便識(shí)別由于藥物脂質(zhì)體的非特異性細(xì)胞內(nèi)吞作用或脂酶活性直接作用于癌癥細(xì)胞引起的背景細(xì)胞死亡。
磷脂酶與抗-CEA抗體的綴合從Scottish抗體生產(chǎn)單位(Carluke，Scotland)獲得抗-CEA抗體。按照文獻(xiàn)描述生產(chǎn)重組產(chǎn)氣莢膜梭菌磷脂酶C。利用Sulfo-MBS(Pieco和Warriner，Chester，England)按照制造商的指示，將抗-CEA抗體綴合到磷脂酶C。采用透析方法去除未綴合的抗體或磷脂酶C。
利用抗-CEA磷脂酶C綴合物與藥物脂質(zhì)體一起給藥增強(qiáng)了殺死HeLa細(xì)胞的能力將溶于DMEM+10％胎牛血清中的HeLa細(xì)胞100毫升置于96孔組織培養(yǎng)平板的各個(gè)孔中，使細(xì)胞生長(zhǎng)到半融合。去除生長(zhǎng)培養(yǎng)基，用100毫升的于DMEM+10％FCS中稀釋的各種濃度的抗體-酶綴合物替換。在37℃使綴合物與細(xì)胞結(jié)合3小時(shí)。在該保溫之后，通過用DMEM+10％FCS洗滌三次去除未結(jié)合的抗體-酶綴合物。洗滌之后將于DMEM+10％FCS中稀釋的各種濃度的DaunoXomes(Nexstar藥物有限公司，英國(guó)，劍橋)加入到孔中，在37℃連續(xù)保溫16-24小時(shí)。利用Cellititer 96孔細(xì)胞增殖檢測(cè)方法(Promega，Southampton，英國(guó))估測(cè)存活的細(xì)胞數(shù)。
以1∶100稀釋的脂質(zhì)體，沒有磷脂酶C或綴合的抗體時(shí)存活的細(xì)胞數(shù)降低小于50％。加入約10ug/ml綴合物導(dǎo)致存活的細(xì)胞數(shù)降低了大于50％，而加入磷脂酶C沒有影響脂質(zhì)體誘導(dǎo)的存活細(xì)胞數(shù)的降低。如果將脂質(zhì)體與磷脂酶C或綴合的抗體一起加入到細(xì)胞，那么沒有獲得存活細(xì)胞數(shù)降低，表明溶液中脂質(zhì)體被破壞。
權(quán)利要求
1.在預(yù)定的條件下釋放一種藥劑的方法，包括下列步驟保護(hù)該藥劑在脂結(jié)構(gòu)內(nèi)，導(dǎo)致應(yīng)答預(yù)定的條件而構(gòu)成脂酶活性，將該脂結(jié)構(gòu)暴露于構(gòu)成的脂酶活性，以便釋放該藥劑。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中通過將兩種或多種成分結(jié)合構(gòu)成酯酶活性，從而由這些成分形成的產(chǎn)物的酯酶活性大于單個(gè)成分的活性的總和。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其中至少酯酶成分之一綴合到能夠特異性結(jié)合到預(yù)定的靶的具靶擊力的分子上。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)所述的方法，其中通過特定的抗原-抗體的結(jié)合或核苷酸探針與特定的核苷酸序列退火而檢測(cè)所述條件的獲得。
5.用于在一個(gè)系統(tǒng)中釋放藥劑到靶位點(diǎn)的方法，它包括權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)所述的方法，其中將至少一種酯酶成分綴合到具靶擊力的分子，加入到所述系統(tǒng)，以便結(jié)合到靶位點(diǎn)，將第二酯酶成分加入到該系統(tǒng)，并且與第一成分結(jié)合以便在該位點(diǎn)構(gòu)成酯酶活性，將含有合適藥劑的脂質(zhì)結(jié)構(gòu)加入到該系統(tǒng)以便它們通過接觸構(gòu)成的酯酶活性而裂解，從而在該位點(diǎn)局部釋放藥劑。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其中在加入第二成分之前從該系統(tǒng)中清除未結(jié)合的靶分子-成分綴合物。
7.根據(jù)權(quán)利要求5或6所述的方法，其中具靶擊力的分子是一種抗體。
8.根據(jù)權(quán)利要求5-7任一項(xiàng)所述的方法，其中靶位點(diǎn)是腫瘤，患病細(xì)胞或病源生物體。
9.根據(jù)權(quán)利要求5-8任一項(xiàng)所述的方法，其中藥劑含有下列的一種或多種報(bào)道分子，化療細(xì)胞毒性藥物，淋巴因子，消炎劑，抗真菌劑，抗瘧疾藥，合成寡核苷酸或質(zhì)粒
10.包括根據(jù)權(quán)利要求5-9任一項(xiàng)所述的方法的體內(nèi)遞送化療劑的方法，其中藥劑是化療劑。
11.包括根據(jù)權(quán)利要求5-9任一項(xiàng)所述的方法的體內(nèi)遞送消炎劑的方法，其中藥劑是消范劑。
12.包括根據(jù)權(quán)利要求5-9任一項(xiàng)所述的方法的修飾細(xì)胞遺傳特性的方法，其中藥劑是合成寡核苷酸或質(zhì)粒。
13.包括根據(jù)權(quán)利要求2-4任一項(xiàng)所述的方法的用于檢測(cè)一個(gè)系統(tǒng)中特定的核苷酸序列存在或確定其位置的方法，其中將與所述序列互補(bǔ)的探針吸附到脂酶成份之一上，向該系統(tǒng)中加入該酯酶成分以便在該序列存在下將一種或幾種探針退火到該序列，引起在該位點(diǎn)構(gòu)成脂酶活性，通過將含有脂質(zhì)結(jié)構(gòu)的藥劑加入到該系統(tǒng)并且裂解可檢測(cè)到脂酶活性。
14.包括根據(jù)權(quán)利要求2-4任一項(xiàng)所述的方法的用于檢測(cè)一個(gè)系統(tǒng)中抗原存在的方法，其中將該抗原與至少一種酯酶成分綴合，該綴合物與制備用于抗該抗原的抗體混合，以便結(jié)合，向該系統(tǒng)中加入該酯酶成分以便存在真正的抗原時(shí)抗體被真正的抗原隔離開，以便構(gòu)成酯酶活性，通過加入并且裂解含有藥劑的脂質(zhì)結(jié)構(gòu)可檢測(cè)到構(gòu)成的脂酶活性。
15.根據(jù)權(quán)利要求1-14任一項(xiàng)所述的方法，其中脂質(zhì)結(jié)構(gòu)包括限定一個(gè)核的磷脂膜。
16.根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，其中酯酶結(jié)構(gòu)是脂質(zhì)體。
17.根據(jù)權(quán)利要求1-16任一項(xiàng)所述的方法，其中酯酶活性包括磷脂酶C活性。
18.根據(jù)權(quán)利要求17所述的方法，其中酯酶活性包括上文中描述的CPAT。
19.根據(jù)權(quán)利要求2-18任一項(xiàng)所述的方法，其中酯酶成分對(duì)應(yīng)于或來自于一種活性酯酶全酶。
20.根據(jù)權(quán)利要求19所述的方法，其中酯酶成分是上文中描述的N-末端重組CPAT和C-末端重組CPAT。
21.用于權(quán)利要求2-20任一項(xiàng)所述的方法中所用的酯酶成分，能夠與第二酯酶成分結(jié)合，以便由這些成分形成的產(chǎn)物的酯酶活性大于單個(gè)成分的活性的總和，將所述的第一酯酶成分綴合到能夠特異性結(jié)合到預(yù)定的靶的具靶擊力的分子。
22.用于權(quán)利要求2-20任一項(xiàng)所述的方法的試劑盒，含有能夠與第二脂酶成份結(jié)合的第一脂酶成份，從而由這些成分形成的產(chǎn)物的酯酶活性大于單個(gè)成分的活性的總和，所述第一脂酶成份綴合到能夠特異性結(jié)合到預(yù)定的靶的具靶擊力的分子，并且進(jìn)一步含有第二脂酶成份。
23.根據(jù)權(quán)利要求22所述的試劑盒，進(jìn)一步包括含有藥劑的脂質(zhì)結(jié)構(gòu)，
24.CPAT在裂解脂質(zhì)體中的應(yīng)用。
25.如上所述N-末端重組CPAT，和C-末端重組CPAT在裂解脂質(zhì)體中的應(yīng)用。
26.基本上如上所述以及參照附圖3和實(shí)施例3所述的體內(nèi)抗癌癥方法。
27.基本上如上所述以及參照附圖4和實(shí)施例5所述的體外抗體介導(dǎo)的抗原檢測(cè)方法。
28.基本上如上所述以及參照附圖5和實(shí)施例6所述的體外核酸雜交檢測(cè)方法。
29.一種組合物，包括與脂酶全酶或脂酶成份綴合的具靶擊力的分子；一種或多種包含于脂質(zhì)結(jié)構(gòu)中的藥劑。
30.根據(jù)權(quán)利要求29所述的組合物，其中脂質(zhì)結(jié)構(gòu)是脂質(zhì)體。
31.根據(jù)權(quán)利要求29和30任一項(xiàng)所述的組合物，其中該藥劑是一種藥物學(xué)活性化合物或幾種藥物學(xué)活性化合物。
32.根據(jù)權(quán)利要求29和30任一項(xiàng)所述的組合物，其中該藥劑能夠轉(zhuǎn)化為一種或幾種藥物學(xué)活性化合物的化合物。
33.包括權(quán)利要求1所述方法的用于在一個(gè)系統(tǒng)中的靶位點(diǎn)釋放一種藥劑的方法，其中將脂酶全酶綴合到具靶擊力的分子，加入到所述系統(tǒng)，以便結(jié)合到靶位點(diǎn)，將含有合適藥劑的脂質(zhì)結(jié)構(gòu)加入到該系統(tǒng)以便它們通過接觸構(gòu)成的酯酶活性而裂解，從而在該位點(diǎn)局部釋放藥劑。
34.根據(jù)權(quán)利要求33所述的方法，其中脂質(zhì)結(jié)構(gòu)是脂質(zhì)體，
35.根據(jù)權(quán)利要求33或34所述的方法，其中藥劑含有下列的一種或多種報(bào)道分子，化療細(xì)胞毒性藥物，淋巴因子，消炎劑，抗真菌劑，抗瘧疾藥，合成寡核苷酸或質(zhì)粒，其它的活性抗體如免疫毒素，用于將轉(zhuǎn)化非活性藥物化合物為活性藥物化合物的酶。
36.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其中所述藥劑還含有下列的一種或多種其它的活性抗體如免疫毒素，用于將轉(zhuǎn)化非活性藥物化合物為活性藥物化合物的酶。
37.用于權(quán)利要求33-35任一項(xiàng)所述的方法中的試劑盒。
38.基本上如上所述以及參照附圖6所述的體外抗體介導(dǎo)的檢測(cè)方法。
39.基本上如上所述以及參照附圖7所述的體外核酸檢測(cè)方法。
40.包括根據(jù)權(quán)利要求2-4任一項(xiàng)所述的方法的用于檢測(cè)一個(gè)系統(tǒng)中特定的核苷酸序列存在或確定其位置的方法，其中核苷酸序列直接或間接吸附到固相，將與所述序列互補(bǔ)的探針吸附到至少一種脂酶成份上，向該系統(tǒng)中加入該酯酶成分以便在該序列存在下將一種或幾種探針退火到該序列，引起在該位點(diǎn)構(gòu)成脂酶活性，通過加入并且裂解含有藥劑的脂質(zhì)結(jié)構(gòu)檢測(cè)到構(gòu)成的脂酶活性。
41.包括根據(jù)權(quán)利要求2-4任一項(xiàng)所述的方法的用于檢測(cè)一個(gè)系統(tǒng)中抗原存在的方法，其中將該抗原直接或間接吸附到固相，將至少一種脂酶成份綴合到抗體；將該綴合物加入到所述系統(tǒng)，隨后加入含有藥劑的脂質(zhì)結(jié)構(gòu)。
全文摘要
在預(yù)定的條件下釋放一種藥劑(例如化療劑)的方法,包括下列步驟:保護(hù)該藥劑在脂質(zhì)結(jié)構(gòu)(例如脂質(zhì)體)內(nèi),通過兩種或多種成分(例如重組N－或C－末端產(chǎn)氣莢膜梭菌α－毒素片段)的結(jié)合導(dǎo)致構(gòu)成脂酶活性,在預(yù)定的條件下將這些成分之一綴合到與靶(例如腫瘤抗原)結(jié)合的具靶擊力的分子(例如抗體)。將該脂質(zhì)結(jié)構(gòu)與構(gòu)成的脂酶活性接觸以便釋放該藥劑。也公開了用于該方法的材料和試劑盒。
文檔編號(hào)A61K9/127GK1182372SQ9619343
公開日1998年5月20日 申請(qǐng)日期1996年2月21日 優(yōu)先權(quán)日1995年2月22日
發(fā)明者R·W·蒂巴爾, F·J·卡爾 申請(qǐng)人:英國(guó)國(guó)防部