專利名稱：真核生物中原普卟啉原氧化酶酶活力的操作的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明一般涉及一種酶活力的操作，該酶在所有真核生物的普通生物合成途徑中負(fù)責(zé)將原卟啉原IX轉(zhuǎn)化成原啉啉IX。一方面，本發(fā)明可用于發(fā)展植物，植物組織，種子對除草劑的抗性，另一方面，本發(fā)明可用于發(fā)展對動物，尤其是人類缺乏這種酶活力的診斷和治療。
導(dǎo)致產(chǎn)生葉綠素和血紅素的生物合成途徑有許多相同步驟。葉綠素是所有綠色光合生物中的光收集色素。血紅素是血紅蛋白，細(xì)胞色素，P450混合功能單加氧酶、過氧化物酶及過氧化物酶的輔助因子(見如Lehninger，“生物化學(xué)”Wroth出版公司，紐約(1975))，并且是所有需氧生物的必需組份。
葉綠素和血紅素生物合成的最后相同步驟是原卟啉原IX到原卟啉IX的氧化。原卟啉原氧化酶(本文稱為”Protox”)是催化這個(gè)最后步驟的酶(Matringe等人，生物化學(xué)雜志260231(1989))。
這個(gè)原卟啉原氧化酶已從許多種生物中或完全純化，這些生物包括釀酒酵母(Labbe-Bios和Labbe，見“血紅素和葉綠素的合成”，E.H.Dailey ed.McGraw Hill紐約.pp235-285(1990))，大麥白色體(Jacobs和Jacobs，“生物化學(xué)雜志”244219(1987))和小鼠肝臟(Dailey和Karr，生物化學(xué)262697(1987))。編碼原卟啉原氧化酶(Protox)的基因已從兩種原核生物中分離出，這兩種原核生物是大腸桿菌(E.coli)(Sasarman等人，加拿大微生物學(xué)雜志391155(1993))和枯草芽孢桿菌(Dailey等人，生物化學(xué)雜志269813(1994))。這些基因沒有序列相似性，它們推定的蛋白質(zhì)產(chǎn)物也沒有任何氨基酸序列相似性。大腸桿菌的蛋白約21KDa，并與細(xì)胞膜相聯(lián)。枯草芽孢桿菌蛋白為51KDa，是一個(gè)可溶的，細(xì)胞質(zhì)中表現(xiàn)活力的蛋白。
目前，對原卟啉原氧化酶了解太少，因而還不能用已知的方法從較高等的真核生物(也就是動物，植物和其它除了如酵母，單細(xì)胞藻類，原生動物等的低等真核微生物以外的所有多細(xì)胞具核的生物)中分離編碼原卟啉原氧化酶(protox)的基因。
具體的說，一些分離新蛋白和基因的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)是建立在假定它們的初級結(jié)構(gòu)(也就是氨基酸和DNA序列)與具有相同功能的已知蛋白和基因有高度相似性基礎(chǔ)上的。那些標(biāo)準(zhǔn)方法包括核酸雜交和聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增，其中聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)采用與保守的氨基酸序列基序(motif)對應(yīng)的寡聚核苷酸引物。這些技術(shù)如果采用目前局限于原核原卟啉原氧化酶基因的結(jié)構(gòu)信息對真核原卟啉原氧化酶基因的分離是沒有用的。因?yàn)榧词乖谥赖脑嗽策趸富蚝偷鞍字卸紱]有明顯的結(jié)構(gòu)相似性。
另一個(gè)曾經(jīng)用于從高等真核生物的其它代謝途徑中分離生物合成基因的方法是對所需活力缺陷的微生物突變型進(jìn)行互補(bǔ)。對于這個(gè)方法，一個(gè)高等真核生物的cDNA文庫克隆在一個(gè)能在受體微生物中直接表達(dá)該cDNA的載體中。然后將這個(gè)載體轉(zhuǎn)化或?qū)胪蛔兾⑸镏?，選出表型不再是突變型的菌落。
在一些代謝路徑中采用了這種策略從高等真核生物中分離基因，包括組氨酸生物合成(如本文引入其全文作為參考的美國專利5290926和WO94/026909至Ward等人.)，賴氨酸生物合成(如Frisch等人，分子基因遺傳228287(1991))，嘌呤生物合成(如，Aimi等人，生物化學(xué)雜志2659011(1990))，色氨酸生物合成(如Nigogi等人，植物細(xì)胞51011(1993))。然而盡管可以獲得認(rèn)為是原卟啉原氧化酶活力缺陷的微生物突變型(如大腸桿菌(Sasar-man.等人，基因微生物雜志113297(1979)，鼠傷寒沙門氏菌(Xu等人，細(xì)菌學(xué)雜志1743953(1992))和釀酒酵母(Camadro等人，生化生物物理研究通報(bào)106724(1982))，在已知信息基礎(chǔ)上采用這種技術(shù)去分離編碼真核原卟啉原氧化酶活性的cDNA是最不可預(yù)知的。
這樣說是有幾個(gè)原因的，首先真核原卟啉原氧化酶cDNA序列在突變微生物中不能達(dá)到足夠水平的表達(dá)。比如因?yàn)槭褂玫拿艽a子與受體微生物采用的密碼子不一致。第二克隆的真核編碼序列的初始轉(zhuǎn)譯產(chǎn)物可能不能產(chǎn)生有功能的多肽。如如果活力要求一個(gè)轉(zhuǎn)譯后修飾，比如糖基化，而這不能在微生物中進(jìn)行。第三這個(gè)真核蛋白在微生物受體中不能形成其有活力的構(gòu)象。比如如果這個(gè)蛋白通常作用于一個(gè)專一的細(xì)胞器膜系統(tǒng)，而微生物受體專一性缺乏這個(gè)系統(tǒng)。最后一種可能性對于植物原卟啉原氧化酶更為可能，因?yàn)榇嗣冈谥参锛?xì)胞中是與補(bǔ)償測試中微生物受體不具有的細(xì)胞器相聯(lián)的。具體地說，植物原卟啉原氧化酶是與葉綠體膜和類體膜相聯(lián)系的(Matringe等人，生物化學(xué)雜志2674646(1992))，并且可以假定以包括N-末端轉(zhuǎn)譯(transit)序列和成熟多肽內(nèi)部特性轉(zhuǎn)譯后靶向機(jī)制為結(jié)果到達(dá)那些膜(見如Kohorn和Tobin，植物細(xì)胞1159(1989)；Li等人，植物細(xì)胞3709(1991)；Li等人，生物化學(xué)雜志26718999(1992))這些原卟啉原氧化酶已知在一些人類疾病中起作用。在患有雜色卟啉癥，一種以神經(jīng)精神病癥狀和皮膚損傷為特征的常染色體顯性紊亂病的病人中，原卟啉原氧化酶活力水平下降(Brenner和Bloomer，新英格蘭醫(yī)學(xué)雜志302765(1980))。由于缺乏關(guān)于人類原卟啉原氧化酶及其對應(yīng)基因的知識，對這種紊亂的診斷和治療的選擇在目前是很有限的。
采用除草劑控制不想要的的植被，如作物中的雜草或植物，這幾乎已得到廣泛的應(yīng)用。相關(guān)的交易額每年超過了十億美元。盡管廣泛使用除草劑，對于農(nóng)民控制雜草仍是一個(gè)巨大的且耗資的問題。
有效地使用除草劑要求良好的管理。比如施用除草劑的時(shí)間和方法以及雜草植物生長階段對更好的控制雜草是關(guān)鍵的。因?yàn)樵S多種類雜草對除草劑有抗性，生產(chǎn)有效的除草劑變得越來越重要。
不幸的是，那些表現(xiàn)很大潛力，有廣譜除草和在土壤中快速降解的除草劑對作物有較大的植物毒性。一個(gè)解決這個(gè)問題的方法就是建立能夠抵抗或耐受殺草劑的作物。對除草劑有抗性的作物雜交種或變種允許使用除草劑而不會提高破壞作物的危險(xiǎn)。建立抗性可采用對作物施用除草劑的方法，而這種除草劑由于是作物敏感的而事先或有限的施用的(如出現(xiàn)前施用)。如美國專利4,761,373至Anderson等人，教導(dǎo)丁對咪唑啉酮或硫基硫胺類除草劑有抗性的植物。這種抗性可以通過一個(gè)改變了的乙酰羥基酸合成酶(AHAS)證實(shí)。Goodman等人的美國專利No.4,975,374涉及包含一種編碼一個(gè)突變谷胺酰胺合成酶(GS)的基因的植物細(xì)胞和植物能夠?qū)σ阎种艷S的除草劑，如phosphinothrici和蛋氨酸硫氧亞胺的抑制產(chǎn)生抗性Bedbrook等人的美國專利No.5,013,659指導(dǎo)的能夠表達(dá)一種突變乙酰乳酸合成酶的植物對磺酰脲除草劑的抑制有抗性。Somers等人的美國專利No.5,162,602發(fā)現(xiàn)一些植物對環(huán)己二酮和芳基氧基苯氧基丙酸除草劑的抑制能夠耐受，這個(gè)耐受性能通過一個(gè)改變了的乙酰輔酶A羧化酶(Accase)證實(shí)。
原卟啉原氧化酶是多種除草劑類化合物的靶點(diǎn)。除草劑在酶分子的不同結(jié)構(gòu)層次上抑制原卟啉原氧化酶(protox)(Duke等人，雜草科學(xué)(Weed Sci.)39465(1991)；Nandihalli等人，農(nóng)藥生化生理43193(1992)；Matringe等人，F(xiàn)EBS Left.24535(1989)；Yanase和An-doh，農(nóng)藥生化生理3570(1989).這些除草劑類化合物包括二苯醚{如acifluorfen.5-〔2-氯-4-(三氟甲基)苯酚〕-2-硝基苯甲酸；它的甲基酯；或Oxyfluorfen，2-氯-1-(3-乙氧基-4-硝基苯酚)-4-(三氟基苯)}，Oxidiozoles，(如Oxidiazon；3-〔2，4-二氯-5-(1-甲基乙氧基)苯〕-5-(1，1-二甲基乙基)-1，3，4-惡二唑-2-(3H)-one)，環(huán)狀亞胺(如S-23142，N-(4-氯-2-氟-5-炔丙基氧基苯)-3，4，5，6-四氫鄰苯二亞胺；Chlorophthal-im，N-(4-氯苯)-3，4，5，6-四氫鄰苯二亞胺)，苯基吡唑(如TNPP-乙基，乙基2-〔1-(2，3，4-三氯苯)-4-硝基吡唑-5-氧〕丙酸；M&B39279)，吡啶衍生物(如LS82-556)，和phenopy-late和它的O-苯基吡咯烷基-和哌啶氨基甲酸酯類似物。這些化合物中的一些競爭性的抑制催化正常反應(yīng)的酶，可以是以底物類似物作用。
原卟啉原氧化酶抑制型除草劑作用方式的預(yù)測包括葉綠體中原卟啉原IX的積累。這種積累被認(rèn)為導(dǎo)致原卟啉原IX泄漏到細(xì)胞溶質(zhì)，在那兒，原卟啉原被過氧化物酶氧化成原卟啉IX。光照時(shí)，原卟啉IX能導(dǎo)致細(xì)胞溶質(zhì)中單線態(tài)氧的形成，這種單線態(tài)氧能依次導(dǎo)致其他氧化反應(yīng)種類的形成，如能使脂類過氧化和細(xì)胞膜崩潰而導(dǎo)致快速細(xì)胞死亡(Lee等人，植物生理學(xué)102881(1993))并不是所有的原卟啉原氧化酶對抑制植物原卟啉原氧化酶的除草劑敏感。從大腸桿菌(Sasarman等人，加拿大生生物學(xué)雜志391155(1993))和枯草芽孢桿菌(Dailey等人，生物化學(xué)雜志269813(1994))中分離的基因編碼的原卟啉原氧化酶對這些除草劑類抑制物有抗性。另外，也有報(bào)導(dǎo)說單細(xì)胞藻類萊因衣藻(Chlomydomonasreinhardtii)的突變體對苯亞胺除草劑S-23142有抗性(Kataoka等人，農(nóng)藥科學(xué)雜志15449(1990)；Shibata等人，見“光合作用研究”-Vol.111，N.Murata.ed.Kluwer荷蘭，pp.567-570(1992))。這些突變體中至少有一種表現(xiàn)出具有改變了的原卟啉原酶活力，從而不僅對選擇突變體的除草劑類抑制劑有抗性，而且對其他類原卟啉原氧化酶抑制劑有抗性(Oshio等人，Z.Naturforsch.48C339(1993)；Sato等人.見“卟啉農(nóng)藥學(xué)術(shù)討論會”，S.Duke.ed.學(xué)術(shù)評論華盛頓，D.C.(1994))。一個(gè)煙草突變細(xì)胞系也曾被報(bào)導(dǎo)對抑制劑S-21432有抗性(Che等人，Z.Naturforsch.48C350(1993))。
本發(fā)明提供了一類真核生物中分離出的編碼原卟啉原氧化酶(protox)的DNA分子，它的優(yōu)點(diǎn)是來自高等真核生物。具體地說，本發(fā)明提供的編碼原卟啉原氧化酶(protox)的DNA分子來源于植物或人。
本發(fā)明范圍內(nèi)優(yōu)選從雙子葉植物中分離出的編碼原卟啉原氧化酶(protox)的DNA分子，但是尤其是來自擬南芥類植物的，如在SEQ ID NOS1，3和9給出的DNA分子。
也優(yōu)選從單子葉植物中分離出的編碼原卟啉氧化酶(protox)的DNA分子，但是尤其是來自玉米的，如在SEQ ID NOS5和7中給出的。特別在本發(fā)明中優(yōu)選的是一類分離到的DNA分子編碼的雙子葉植物的原卟啉原氧化酶蛋白，其中所說的蛋白質(zhì)包含選自SEDID NOS2.4和10的氨基酸序列。也優(yōu)選一類分離的DNA分子，它編碼單子葉植物原卟啉原氧化酶蛋白質(zhì)，其中所說的蛋白質(zhì)包含選自SEQ ID Nos6和8的氨基酸序列。
采用本發(fā)明提供的信息，任何真核生物的的原卟啉原氧化酶(protox)的DNA編碼序列都可通過標(biāo)準(zhǔn)方法獲得。因此，本發(fā)明的進(jìn)一步實(shí)施方案是提供能與編碼原卟啉原氧化酶的真核DNA序列或各個(gè)mRNA特異性雜交的探針，并且提供了本發(fā)明的探針在真核生物中測定上述DNA序列的方法。
本發(fā)明進(jìn)一步提供了表達(dá)框(Cassetts)和包含上述表達(dá)框的重組載體，而表達(dá)框又包含了一個(gè)必須的啟動子，根據(jù)本發(fā)明這個(gè)啟動子特別是在植物中有活力，而且可與編碼真核生物原卟啉原氧化酶(protox)的DNA分子有效相連。根據(jù)本發(fā)明的表達(dá)框另外還包含一個(gè)可與上述DNA分子有效相連的信號序列，而這個(gè)信號序列能夠?qū)⑸鲜鯠NA分子編碼的蛋白質(zhì)導(dǎo)入葉綠體或線粒體。
另外，本發(fā)明還提供了具有改變了的原卟啉原氧化酶活性的植株，植物細(xì)胞，植物組織和植物種子，它們能對一定水平的除草劑的抑制有抗性或至少有耐受性，在此除草劑水平下植物中自然產(chǎn)生的原卟啉原氧化酶通常受到了抑制。具體的說，本發(fā)明提供的植物其中已改變的的原卟啉原氧化酶可以通過過度表達(dá)野生型原卟啉原氧化酶或通過編碼耐受除草劑的原卟啉原氧化酶的表達(dá)來證實(shí)。上述耐受除草劑的原卟啉原氧化酶可以是真核或原核生物中自然產(chǎn)生的原卟啉原氧化酶的修飾形式，或者是上述植物中自然產(chǎn)生的原卟啉原氧化酶的修飾形式，或者上述耐受除草劑的原卟啉原氧化酶可以是在原核生物中天然產(chǎn)生的。本發(fā)明采用的植物包括單子葉和雙子葉植物，但尤其是雜交植物。優(yōu)選的那些植物是具有能夠抑制原卟啉原氧化酶的除草劑的潛在靶位點(diǎn)的，特別是農(nóng)業(yè)上很重要的作物如玉米和其它谷類作物比如小麥，燕麥，黑麥，高梁，水稻，大麥，小米，turf，和牧草及類似物，以及棉花，煙草，甘蔗，甜菜，油菜和大豆。
本發(fā)明進(jìn)一步包括了根據(jù)本發(fā)明的植物的繁殖材料，較優(yōu)選的為用一種保護(hù)劑膜處理的植物種子，尤其是采用一種從一組包含除草劑，殺蟲劑，殺真菌劑，殺細(xì)菌劑，殺線蟲劑，殺軟體動物劑或其混合物中選出的制品組成的保護(hù)劑膜。
本發(fā)明還指導(dǎo)生產(chǎn)含有能抵抗或耐受一定濃度除草劑抑制的原卟啉原氧化酶的植株，植物細(xì)胞，植物組織，植物種子和其轉(zhuǎn)基團(tuán)后代，而此濃度下的除草劑能抑制自然產(chǎn)生的原卟啉原氧化酶。上述的抗性或耐受性可以通過編碼真核生物中自然產(chǎn)生的原卟啉原氧化酶修飾形式的DNA分子的表達(dá)，或編碼上述植物中自然產(chǎn)生的原卟啉原氧化酶修飾形式的DNA分子的表達(dá)，或通過一種原核生物中自然產(chǎn)生的原卟啉原氧化酶的DNA分子的表達(dá)，或編碼一種原核生物中自然產(chǎn)生的一種蛋白的修飾形式的原卟啉氧化酶的DNA分子的表達(dá)來獲得。
本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方案是指導(dǎo)了被包含合適啟動子的重組DNA分子穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因玉米植株，玉米組織或玉米種子及其轉(zhuǎn)基因后代的制備。這個(gè)在植物中起作用的合適的啟動子與一個(gè)編碼對除草劑有抗性的未修飾的原核原卟啉原氧化酶的結(jié)構(gòu)基因有效相連。
本發(fā)明進(jìn)一步指導(dǎo)了制備被包含與一個(gè)編碼未修飾的真核原卟啉原氧化酶的結(jié)構(gòu)基因有效相連的能在植物中作用的合適啟動子之重組DNA分子穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因植株，植物細(xì)胞，植物組織和植物種子及轉(zhuǎn)基因后代。在這種植物中未修飾原卟啉原氧化酶過度表達(dá)的結(jié)果足以克服除草劑對此酶的抑制作用。
本發(fā)明也提供了能表達(dá)一種對在野生型未改變的原卟啉原氧化酶活力通常有抑制的濃度下的除草劑的抑制作用有耐受性的改變了的原卟啉原氧化酶的植物產(chǎn)物。在這個(gè)實(shí)施方案中，植物可被包含一個(gè)編碼抗性原卟啉原氧化酶的結(jié)構(gòu)基因的重組DNA分子穩(wěn)定轉(zhuǎn)化，或采用直接挑選技術(shù)分離，測定和建立除草劑抗性系來制備。
本發(fā)明進(jìn)一步指導(dǎo)了控制不需要的植物的生長的方法，此方法包括對具有改變的原卟啉原氧化酶的植物群體施用有效量的原卟啉原氧化酶抑制型除草劑，這種改變了的原卟啉原氧化酶能抵抗對上述植物自然產(chǎn)生原卟啉氧化酶有抑制作用水平的除草劑的抑制作用。上述方法中保護(hù)的植物特別是那些對原卟啉原氧化酶型除草劑有潛在靶位點(diǎn)的，具體的是農(nóng)業(yè)重要作物如玉米和其它谷物作物，如小麥，燕麥，黑麥，高梁，水稻，大麥，小米，turf和牧草等以及棉花，甘蔗，甜菜，油菜和大豆。原卟啉原氧化酶抑制劑型除草劑選自ary-luracil，二苯醚，oxidiazole，亞胺，苯吡唑，吡啶衍生物，phenopylate和O-苯吡咯烷-和呱啶氨基甲酸酯的所謂phenopylate類似物。
本發(fā)明也提供了原卟啉原氧化酶的重組生產(chǎn)和重組產(chǎn)生的原卟啉原氧化酶的使用方法。本發(fā)明進(jìn)一步提供了受體細(xì)胞，尤其那些選自植物細(xì)胞，動物細(xì)胞，細(xì)菌細(xì)胞，酵母細(xì)胞和昆蟲細(xì)胞的細(xì)胞，它們都被包含能在各受體細(xì)胞中作用并與修飾或未修飾的真核原卟啉原氧化酶的結(jié)構(gòu)基因有效相連的合適的啟動子的重組DNA分子穩(wěn)定轉(zhuǎn)化；其中所述受體細(xì)胞能夠表達(dá)上述DNA分子。
本發(fā)明進(jìn)一步提供了使用純化的原卟啉原氧化酶篩選影響原卟啉原氧化酶活力的新型除草劑的方法，以及鑒定抗除草劑的原卟啉原氧化酶的突變型的方法。
具體地說，此發(fā)明指導(dǎo)了一個(gè)測試一種化學(xué)物質(zhì)能否抑制植物中原卟啉原氧化酶活力的方法，包括(a)在上述原卟啉原氧化酶能催化原卟啉原IX轉(zhuǎn)化為原卟啉IX條件下，將上述原卟啉原氧化酶與原卟啉原IX在第一反應(yīng)混合物中混合。
(b)在與上述第一反應(yīng)混合物相同的條件下，將所述化學(xué)物質(zhì)，上述原卟啉原氧化酶和原卟啉原IX在第二反應(yīng)混合物中混合。
(c)在約395-410nM處激發(fā)上述第一和第二反應(yīng)混合物。
(d)比較上述第一和第二反應(yīng)混合物在約622-635nM處的熒光。
其中如果上述第二反應(yīng)混合物的熒光遠(yuǎn)小于上述第一反應(yīng)混合物熒光，那么上述化學(xué)物質(zhì)有抑制上述原卟啉原氧化酶活力的能力。
本發(fā)明進(jìn)一步提供了鑒定在細(xì)胞群體中能夠抵抗原卟啉原氧化酶抑制劑的修飾原卟啉原氧化酶的方法，包括以下步驟(a)將上述群體培養(yǎng)在含量能夠抑制上述原卟啉原氧化酶未修飾形式的上述原卟啉原氧化酶抑制劑中；
(b)選擇步驟(a)中生長未受抑制的細(xì)胞。
(c)分離和鑒定步驟(b)中選出細(xì)胞中的原卟啉原氧化酶。
在植物細(xì)胞轉(zhuǎn)化方法中，編碼改變了的原卟啉原氧化酶的基因可以用作可選擇的標(biāo)記。本發(fā)明進(jìn)一步提供了一個(gè)從非轉(zhuǎn)化植物中挑選用所需轉(zhuǎn)移基因轉(zhuǎn)化的植株，植物組織或植物細(xì)胞的方法，包括以下步驟。
(a)用一個(gè)此植物能表達(dá)的所需轉(zhuǎn)移基因和一個(gè)編碼對原卟啉原氧化酶抑制劑有抗性的改變了的原卟啉原氧化酶的基因轉(zhuǎn)化一類植株、植物組織或植物細(xì)胞。
(b)將這些轉(zhuǎn)化了的植物或植物細(xì)胞轉(zhuǎn)移到含原卟啉原氧化酶抑制劑的培養(yǎng)基上。
(c)挑選出在培養(yǎng)基上存活的植物或植物細(xì)胞。
本發(fā)明進(jìn)一步提供了測定生物中原卟啉原氧化酶的存在和形式以及原卟啉原氧化酶轉(zhuǎn)錄的數(shù)量水平的探針和方法，這些方法可用于對與原卟啉原氧化酶改變了的形式或原卟啉原氧化酶改變了的表達(dá)水平相聯(lián)的疾病條件的診斷。
一方面，本發(fā)明提供了編碼一類真核型原卟啉原氧化酶(本文稱為protox)已分離的DNA分子，此酶能催化原卟啉原IX轉(zhuǎn)化成原卟啉IX。擬南芥菜(Arobidopsis thaliana)的原卟啉原氧化酶的DNA編碼序列和對應(yīng)氨基酸序列已在SEQID Nos.1-4和9-10提供。玉米的原卟啉原氧化酶的DNA編碼序列和對應(yīng)氨基酸序列在SEQID Nos 5-8中提供。
根據(jù)本發(fā)明，任何需要的編碼原卟啉原氧化酶的真核DNA都可分離到。一個(gè)提供分離真核原卟啉原氧化酶編碼序列的方法以實(shí)施例1為代表。在此方法中能將編碼原卟啉原氧化酶的cDNA克隆從感興趣的真核生物cDNA文庫克隆中鑒定出來。該方法基于對原卟啉原氧化酶缺陷型突變受體生物提供原卟啉原氧化酶的能力。用于本方法的合適的受體生物是那些能用于篩選cDNA表達(dá)文庫和可以采用或可正常繁殖的原卟啉原氧化酶缺陷型突變的生物。這樣的受體生物包括大腸桿菌(Sasarman等人，基因遺傳微生物學(xué)雜志113297(1979))，鼠傷寒沙門氏菌(Xu等人，細(xì)菌學(xué)雜志1743953(1992))和釀酒酵母(Camadro等人，生化生物物理研究通報(bào)106724(1982))，但不只限于這些。
作為選擇，真核生物原卟啉原氧化酶編碼序列可以按眾所周知的方法以它們序列與本發(fā)明提供的擬南芥菜SEQ ID Nos.1，3和9)和Eea mays SEQ ID Nos5和7)原卟啉原氧化酶編碼序列的同源性來分離。在這些技術(shù)中，全部或部分已知原卟啉原氧化酶編碼序列可用于能與所選生物的基因組DNA片段或cDNA片段(即基因組或cDNA文庫)種群中其它原卟啉原氧化酶編碼序列選擇性雜交的探針。那些技術(shù)包括雜交篩選平板DNA文庫(噬菌斑或菌落；見，如Sambrook等人，分子克隆，eds.冷泉港實(shí)驗(yàn)室報(bào)導(dǎo)(1989))和以與已知原卟啉原氧化酶氨基酸序列保守區(qū)域?qū)?yīng)的寡聚核苷酸為引物的PCR擴(kuò)增(見如Innis，等人.PCR方案方法與應(yīng)用指南eds.學(xué)術(shù)指導(dǎo)(1990))。這些方法特別適于從與獲得探針序列的生物相關(guān)的生物中分離原卟啉原氧化酶編碼序列，比如采用本方法并以擬南芥(Arabidopsis)或玉米(Zeamays)編碼序列為探針將特別適于從其他植物種類中分離原卟啉原氧化酶編碼序列。
本發(fā)明教導(dǎo)的已分離的真核原卟啉原氧化酶序列可以按照標(biāo)準(zhǔn)基因工程技術(shù)適合任何目的操作。比如完整或部分原卟啉原氧化酶序列可用作與原卟啉原氧化酶編碼序列和信使RNA專一性雜交的探針。為了在各種條件下得到專一性雜交，那些包含原卟啉原氧化酶編碼序列中唯一序列的探針優(yōu)選至少10個(gè)核苷酸長度，最優(yōu)選的是至少20個(gè)核苷酸長度。這些探針可采用熟知的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)方法從選定的生物中擴(kuò)增和分析原卟啉原氧化酶編碼序列。這項(xiàng)技術(shù)可用于從一個(gè)需要的生物中分離另外的原卟啉原氧化酶，或作為測定一種生物中是否存在原卟啉原氧化酶編碼序列和與改變的編碼序列相聯(lián)的不利條件如，以神經(jīng)生理癥狀和皮膚損傷為特征的原卟啉原氧化酶活力下降的人類常染色體顯性紊亂疾病的診斷測試(Brenner和Bloomer，新英格蘭醫(yī)學(xué)雜志302765(1980))。
原卟啉原氧化酶的專一性雜交探針可用于使用以與原卟啉原氧化酶基因組序列選擇性雜交探針為基礎(chǔ)的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)決定選定的生物的基因組中自然真核原卟啉原氧化酶基因的位置。這些技術(shù)包括同等或包含在原卟啉原氧化酶探針序列中DNA多態(tài)性的鑒定和使用這些多態(tài)性去跟蹤來自兩個(gè)多態(tài)性親本系雜交的自受精圖譜種群中與其他已知圖譜位置標(biāo)記相關(guān)的原卟啉原氧化酶基因的分離(見如Helentjaris等人，植物分子生物學(xué)(Plant Mol.Biol.)5109(1985)，Sommer等人，生物技術(shù)1282(1992)D’Ovidio等人，植物分子生物學(xué)15169(1990))，盡管任何真核原卟啉原氧化酶序列可考慮用作測定任何真核生物原卟啉原氧化酶基因圖譜的探針，優(yōu)選的探針是從與選定生物親緩較近的生物的那些原卟啉原氧化酶序列，最優(yōu)選的探針是選定的生物中的那些原卟啉原氧化酶序列。這種形式的原卟啉原氧化酶圖譜被認(rèn)為在用于養(yǎng)殖目的植物中特別有用，比如知道了一個(gè)導(dǎo)致除草劑抗性的原卟啉原氧化酶突變基因的基因圖譜位置，側(cè)向DNA標(biāo)計(jì)可從參考基因圖譜中鑒定出(見如Helent-jaris，趨勢遺傳學(xué)，3217(1987)。在除草劑抗性特征進(jìn)入新的培養(yǎng)系時(shí)，這些標(biāo)記可用于監(jiān)測在每輪回交后現(xiàn)在親本中原卟啉原氧化酶相關(guān)染色體DNA仍存在的程度。
原卟啉原氧化酶專一性雜交探針也可用于通過Northern印跡(Nothern blot)分析等標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)測定生物中原卟啉原氧化酶mRNA的量的水平。這項(xiàng)技術(shù)可用于可能與具體不良狀況有關(guān)的原卟啉原氧化酶表達(dá)水平改變測定的診斷測試。比如對以神經(jīng)生理癥狀和皮膚損傷為特征，原卟啉原氧化酶活力下降為特征的人類常染色體顯性病的診斷測試。(Brenner和Bloomer，新英格蘭醫(yī)學(xué)雜志302765(1980))。
對于在一個(gè)受體生物中酶的重組生產(chǎn)，原卟啉原氧化酶編碼序列可插入到一個(gè)為選定的受體設(shè)計(jì)的表達(dá)框中，并導(dǎo)入受體，在那兒重組產(chǎn)物產(chǎn)生。專一性調(diào)控序列如啟動子，信號序列；5′和3′非轉(zhuǎn)譯序列，增強(qiáng)的選擇是本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員已知的。包含連接在合適閱讀框中的各個(gè)元件的分子產(chǎn)物可插入到能被轉(zhuǎn)化到受體細(xì)胞中的載體中。合適的表達(dá)載體和蛋白質(zhì)的重組生產(chǎn)方法對于受體生物如大腸桿菌(見如Studier和Moffatt，分子生物學(xué)雜志J.Mol.Biol.189113(1986)；Brosius，DNA8759(1989))，酵母(見，如Schneider和Guarente，酶學(xué)方法(Meth，Enzynol.)199373(1991))和昆蟲細(xì)胞(見，如Luckow和Summers，生物技術(shù)647(1988))是眾所周知的。具體的例子包括質(zhì)粒如pBluescript(stratagene.LaJolla，(A)，pFLAG(國際生物技術(shù)公司，New Haven，CT)，pTrcHis(Invitrogen，La Jolla，CA)和桿狀病毒(baculovirus)表達(dá)載體，如那些來自Autographica californica核多角體病毒(AcMNPV)基因組的載體。優(yōu)選的桿狀病毒/昆蟲系統(tǒng)是pVl11392/sf21細(xì)胞(Invitro-gen，La Jolla，CA)。
重組產(chǎn)生的真核原卟啉原氧化酶可用于多種目的。比如它可以體外提供原卟啉原氧化酶，它也可用于篩選靶點(diǎn)未知的已知除草劑化學(xué)物質(zhì)是否抑制原卟啉原氧化酶的體外測試。這樣的體外測試也可用于更常規(guī)的篩選化學(xué)物質(zhì)是否抑制原卟啉原氧化酶和是否能成為除草劑候選者。作為選擇，重組產(chǎn)生的原卟啉原氧化酶可用于進(jìn)一步確定與已知抑制的聯(lián)系，以便有效地設(shè)計(jì)新的抑制型除草劑以及酶的除草劑耐受型。
典型的，原卟啉原氧化酶的抑制作用是通過測定在約395-410nM激發(fā)后，約622-635nM處的熒光來測定的。(見，如Jacobs和Jacobs，酶28206(1982)；Sherman等人，植物生理學(xué)97280(1991)).這個(gè)測試是基于這個(gè)事實(shí)原卟啉IX是熒光色素，原卟啉原是非熒光的。從選出的亞細(xì)胞部分如白色體，線粒體，微粒體或質(zhì)膜通過差速離心制備蛋白提取物(見如Lee等人.植物生理學(xué).102881(1993)；Prado等人.植物生理學(xué).65956(1979)；Jackson和Moore見“植物細(xì)胞器”.Reid.ed.pp1-12；Jacobs和Jacobs，植物生理學(xué)10l1181(1993))。原卟啉原通過Jacobs和Jacobs(1982)描述的用鈉汞齊還原原卟啉制備。典型的反應(yīng)混合物包括100mM Hep-es(pH7.5)，5mM EDTA，2mM DTT，約2M原卟啉原1X，和約1mg/ml蛋白提取物。各種濃度的抑制溶液如1mM，100uM，10uM，1uM，100nM，10nM，1nM，100pM，在酶反應(yīng)開始前加入到酶提取液中。一旦蛋白提取液加入，熒光要監(jiān)測幾分鐘，從斜線的線性區(qū)計(jì)算斜率(反應(yīng)速度)。通過比較抑制反應(yīng)的斜率與對照反應(yīng)的斜率測試IC50。
本發(fā)明的另一方案包括在鑒定抑制抗性原卟啉原氧化酶突變體的測定中使用原卟啉原氧化酶。典型的測試如下(a)將原卟啉原氧化酶第一份樣品和它的底物原卟啉原IX在含有原卟啉原氧化酶抑制劑的第二份樣品存在條件下保溫；(b)測定步驟(a)中原卟啉原氧化酶的酶活力；(c)將突變的原卟啉原氧化酶第一份樣品和它的底物在含有相同原卟啉原氧化酶抑制劑的第二份樣品存在條件下保溫。
(d)測試步驟(c)中突變原卟啉原氧化酶的酶活力。
(e)將突變原卟啉原氧化酶酶活力與未突變原卟啉原氧化酶活力比較。
在以下改進(jìn)中，反應(yīng)混合物和反應(yīng)條件與鑒定原卟啉原氧化酶抑制劑(抑制劑測定)的測定相同。首先，一種按上述方法得到的突變原卟啉原氧化酶代替抑制劑測試反應(yīng)混合物中野生型原卟啉原氧化酶，第二在兩個(gè)反應(yīng)混合物中都加入野生型原卟啉原氧化酶的抑制劑。第三突變酶活力(有抑制劑和突變原卟啉原氧化酶的酶活力)和未突變酶活力(抑制劑和野生型原卟啉原氧化酶存在下酶活力)相比較以決定突變酶活力與未突變酶活力相比酶活是否觀察到有很大提高。突變酶活力就是在合適底物和抑制劑存在下任何測到的突變原卟啉原氧化酶酶活力，未突變酶活力就是在合適底物和抑制劑存在下任何測到的野生型原卟啉原氧化酶酶活力。一個(gè)大于測定技術(shù)的內(nèi)在誤差的百上上升可定為酶活力提高，優(yōu)選的是比抑制劑存在下野生型酶活力提高2倍。更優(yōu)選的是提高約5倍，最優(yōu)的是提高大于10倍。
抑制原卟啉原氧化酶的除草劑包括許多不同結(jié)構(gòu)層次的分子(Duke等人，雜草科學(xué)39465(1991)；Nandihalli等人，農(nóng)藥生化生理學(xué)Resticide Biochem.physiol.43193(1992)；Natringe等人，F(xiàn)EBS Left 24535(1989)；Yanase和Andoh，農(nóng)藥生化生理學(xué)3570(1989))。包括二苯醚{如acifluorifen，5-〔2-氯-4-(三氟甲基)苯酚〕-2-硝基苯甲酸；它的甲酯；或oxyfluorfen 2-氯-1-(3-乙氧基-4-硝基苯酚)-4-(三氟苯)}，Oxidiazoles(如oxcliazon，3-〔2，4-二氯-5-(1-甲基乙氧基)苯〕-5-(1，1-二甲基乙基)-1，3，4-oxadiozol-2-(3H)-one)，環(huán)亞胺(如S-23142，N-(4-氯-2-氟-5-炔丙基苯)-3，4，5，6-四氫鄰苯二酰亞胺；chlorophthalim，N-(4-氯苯)-3，4，5，6-四氫鄰苯二酰亞胺)，苯吡唑(如TNPP-乙基，乙基2-〔1-(2，3，4-三氯苯)-4-硝基吡唑基-5-氧〕丙酸鹽；MQB39279)；吡啶衍生物(如LS82-556)，和phenopylate及其O-苯吡咯烷和呱啶氨基甲酸酯類似物。
二苯醚特別標(biāo)志是那些具有下面通式的分子 其中R為-COONa(結(jié)構(gòu)式II)，-CONHSO2CH3(結(jié)構(gòu)式III)或-COOCH2COOC2H5(結(jié)構(gòu)式IV；見Maigrot等人，布賴頓公司植保會議-雜草47-51(1989))另外一些有興趣的二苯醚是那些R為 (結(jié)構(gòu)式IVa見Hayashi等人，布賴頓公司植保會議-雜草53-58(1989)).另外一類有興趣的二苯醚有結(jié)構(gòu)式 (結(jié)構(gòu)式VIbbifenox，見Dest等人，東北雜草科學(xué)會議匯編2731(1973))已知的亞胺類除草劑也有意義，具有一般結(jié)構(gòu)式 (結(jié)構(gòu)式V)其中Q可為 或 或 或 (結(jié)構(gòu)式VI) (結(jié)構(gòu)式VII)(結(jié)構(gòu)式VIII)(結(jié)構(gòu)式IX)或 或 (結(jié)構(gòu)式IXa) (結(jié)構(gòu)式IXb)(見Hemper等人(1995)見“第8屆國際農(nóng)藥化學(xué)會議匯編”，Rag-dale，等人.，eds.美國化學(xué)學(xué)會華盛頓，D.C.pp42-48(1994))。
而R1為H，Cl或F，R2為Cl，R3可被醚，硫醚，酯，氨基或烷基任意取代。并且R2和R3可形成一個(gè)5或6元雜環(huán)。特別有益的亞胺類除草劑例子有 (結(jié)構(gòu)式X) (結(jié)構(gòu)式XI) (結(jié)構(gòu)式XII)(見Miura等人，布賴頓作物保護(hù)會議-雜草35-40(1993)) (結(jié)構(gòu)式XIII) (結(jié)構(gòu)式XIV) (結(jié)構(gòu)式XV) (結(jié)構(gòu)式XVI)
以上化合物的除草劑活力在以下文獻(xiàn)中有描述1991布賴頓作物保護(hù)會議-雜草(英國作物保護(hù)委員會)(結(jié)構(gòu)式X和XVI)，1993布賴頓作物保護(hù)會議-雜草(英國作物保護(hù)委員會)(結(jié)構(gòu)式XII和XIII)。美國專利No.4,746,352(結(jié)構(gòu)式XI)和Abstracts of美國雜草科學(xué)協(xié)會vol.33pg9(1993)(結(jié)構(gòu)式XIV)。
最優(yōu)選的亞胺類除草劑是那些稱為aryluracils并具有下面通式的分子 (結(jié)構(gòu)式XVII)其中R表示基團(tuán)(C2-6-烷氧基)羰基-C1-4-烷基。正如在美國專利No.5,183,492中所公開的，本文引入作為參考。
具有結(jié)構(gòu)通式如下的除草劑也具意義 (結(jié)構(gòu)式XVIII，thiadiazimin)(見Weileretal，布賴頓作物保護(hù)會議-雜草pp.29-34(1993))； (結(jié)構(gòu)式XIXCarfentrazone)(見Van Saun等人，布賴頓作物保護(hù)會議-雜草pp.19-22(1993))；N-取代S的吡唑的通式 (結(jié)構(gòu)式XX)(見國際專利出版物94/08999，WO93/10100，和美國專利No.5,405,829轉(zhuǎn)讓給Schering)；N-苯基吡唑，如
(結(jié)構(gòu)式XXI，nipyraclofen)(見農(nóng)藥手冊第621頁，9thed.ed.by C.P.Worthing，英國作物保護(hù)委員會，Surrey(1991))；和3-取代-2-芳基-4，5，6，7-四氫吲哚(Lyga等人，PesticideSci4229-36(1994))。
一般對原卟啉原氧化酶活性有抑制的除草劑水平包括本領(lǐng)域中已知的使用比利，并且依賴于外部因子如環(huán)境、時(shí)間和使用方法。比如對于結(jié)構(gòu)式V～I(xiàn)X代表的亞胺類除草劑，更具體的那些結(jié)構(gòu)式X～XVII代表的除草劑，施用比例范圍為0.0001～10kg/na，優(yōu)選的為0.005～2kg/na.除草劑的劑量比例或濃度可以不同，這依賴于需要的作用和具體所用的化合物，并且可用本領(lǐng)域中已知的方法來確定。
本發(fā)明進(jìn)一步提供能耐受除草劑的植株，植物組織和植物種子，而這些植物中自然產(chǎn)生的原卟啉原氧化酶可被除草劑抑制，并且這種耐受作用是通過改變了的原卟啉原氧化酶而獲得。代表性的植物包括按一般目的的施用除草劑的任何植物。優(yōu)選的是在農(nóng)業(yè)上較重要的作物，即重要的被子植物和裸子植物如棉花，大豆，油菜，甜菜，玉米，水稻，小麥，大麥，燕麥，黑麥，高梁，小米，turf，牧草，turf草等。
改變了的原卟啉原氧化酶活性表示一種與植物自然產(chǎn)生的(即沒有人直接或間接對此酶進(jìn)行操作的自然產(chǎn)生的原卟啉原氧化酶)原卟啉原氧化酶不同的原卟啉原氧化酶，這種酶對能抑制自然產(chǎn)生的酶的除草劑有抗性。改變了的原卟啉原氧化酶可通過本發(fā)明的以下方法在植物中獲得，提高野生型，對除草劑敏感的原卟啉原氧化酶的表達(dá)，在此植物中表達(dá)一類改變了的耐受除草劑的真核原卟啉原氧化酶，表達(dá)在植物中抗除草劑的修飾或未修飾的細(xì)菌原卟啉原氧化酶，或?qū)⒁陨霞夹g(shù)聯(lián)合使用。
通過提高植物細(xì)胞中原卟啉原氧化酶表達(dá)水平而獲得改變的原卟啉原氧化酶活力足以克服除草劑引起的生長抑制。這樣的原卟啉原氧化酶表達(dá)水平通常為自然表達(dá)的2倍，優(yōu)選的為5倍，更優(yōu)選的為至少10倍。表達(dá)的提高可能因?yàn)樵策趸富蚍輸?shù)增加，基因增加可發(fā)生在原卟啉原氧化酶基因內(nèi)編碼序列(即基因擴(kuò)增)或植物細(xì)胞中內(nèi)生原卟啉原氧化酶基因的非編碼，調(diào)節(jié)序列的突變。包含這樣原卟啉原氧化酶的植物可直接從植物中選擇而獲得。此方法在本領(lǐng)域中是已知的。見，如Somers等人，見美國專利5,162,602和Anderson等人，見美國專利4,761,373及其中引用的參考文獻(xiàn)。這些植物亦可采用本領(lǐng)域已知的基因工程方法獲得。
除草劑敏感型原卟啉原氧化酶表達(dá)的提高也可通過重組或嵌合DNA分子穩(wěn)定轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞而獲得。重組或嵌合DNA分子包含一個(gè)與同源或異源的原卟啉原氧化酶結(jié)構(gòu)基因相連并能使與之相聯(lián)結(jié)構(gòu)基因表達(dá)的啟動子?！巴葱浴北硎敬嗽策趸富蚴菑呐c靶植物細(xì)胞分類學(xué)上相同的生物中分離的。“非同源性”表示此原卟啉原氧化酶基因是從與靶植物細(xì)胞分類學(xué)上不同的生物中分離的。同源原卟啉原氧化酶基因可通過細(xì)菌或酵母的缺陷型突變體與靶植物的cDNA文庫互補(bǔ)而獲得。見，如實(shí)施例1和Snustad等人，遺傳學(xué)1201111-1114(1988)(玉米谷氨酸合成酶)；Delauney等人，分子遺傳學(xué)221299-305(1990)(大豆-二氫吡咯-5-碳酸還原酶)，F(xiàn)rish等人，Mol Gen.Genet.228287-293(1991)(玉米二氫吡啶二羧酸合成酶)；Eller等人.植物分子生物學(xué).18557-566(1992)(油菜葉綠體3-異丙基蘋果酸脫氫酶)；美國自然科學(xué)研究匯編881731-1735(1991)；Minet等人，植物雜志2417-422(1992)(二氫乳清酸脫氫酶)和其中引用的參考文獻(xiàn)。其他已知方法包括在高等植物的基因組或cDNA文庫中篩選，如可以與特異核酸探針雜交的序列，或在表達(dá)文庫篩選能與特異性抗體探針交叉反應(yīng)的原卟啉原氧化酶。一個(gè)優(yōu)選的方法包括將大腸桿菌hemG缺陷型突變體與玉米或擬南芥(Arabidopsis thaliana)cDNA文庫進(jìn)行互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)。
能在植物或植物細(xì)胞中作用的啟動子，即那些能使與之相聯(lián)的結(jié)構(gòu)基因如原卟啉原氧化酶基因在植物中表達(dá)的啟動子實(shí)例包括花椰菜花葉病毒(CaMV)的19S或35S啟動子和CaMV的雙重啟動子，核酮糖二磷酸羧化酶小亞基(ssuRUBISO)啟動子等，優(yōu)選的有水稻肌動蛋白啟動子(McElroy等人，分子基因遺傳學(xué)231150(1991))，玉米泛素啟動子(EP 0342 926；Taylor等人，植物細(xì)胞繁殖12491(1993))，及煙草，Arabidopsis或玉米的Pr-1啟動子(見Ryds等人.的國際專利申請No.PCT/IB95/00002，本文引入其全文作為參考)，優(yōu)選的還有Koy等人，科學(xué)2361299-1302(1987)中描述35S啟動子和一個(gè)增強(qiáng)的或雙重35S啟動子，此雙重35S啟動子克隆在pCGN2113中，以ATCC40587保存，在EP-A0392225中公開，相關(guān)說明書以其全文在本文中引用作為參考。啟動子本身可按技術(shù)可行步驟被修飾以增強(qiáng)啟動子提高原卟啉原氧化酶表達(dá)的強(qiáng)度。
信號或轉(zhuǎn)移肽可與本發(fā)明嵌合DNA結(jié)構(gòu)中原卟啉原氧化酶編碼序列融合以指導(dǎo)表達(dá)的原卟啉原氧化酶到要作用的位點(diǎn)。信號肽的實(shí)例包括那些與植物的致病相關(guān)蛋白相連系的，如PR-1，PR-2等，見如Payne等人，植物分子生物學(xué).1189-94(1988)。轉(zhuǎn)移肽的實(shí)例包括Von Heijne等人，植物分子生物學(xué)Rep.9104-126(1991)；Mazur等人，植物生理學(xué)851110(1987).Vorst等人，基因6559(1988)中描述的葉綠體轉(zhuǎn)移肽和Boutry等人，自然328340-342(1987)中描述的線粒體轉(zhuǎn)移肽。對于本發(fā)明，葉綠體和線粒體轉(zhuǎn)移肽被認(rèn)為對線粒體和葉綠體內(nèi)典型的原卟啉原氧化酶的產(chǎn)生特別有用。最優(yōu)選的是采用葉綠體轉(zhuǎn)移肽，因?yàn)槿~綠體中原卟啉原氧化酶的抑制被認(rèn)為是原卟啉原氧化酶抑制型除草劑作用的最初基礎(chǔ)(Witkowski和Halling植物生理學(xué)，87632(1988)；Lehnen等人，農(nóng)藥生化生理37239(1990)Duke等人.野草科學(xué).39465(1991).也包括導(dǎo)致編碼的蛋白定位于如液泡等各種細(xì)胞組分的序列，見例如Neuhaus等人，美國自然科學(xué)研究匯編8810362-10366(1991)和Chrispeels.Ann.Rev.植物生理、植物分子生物學(xué)，4221-53(1991).相關(guān)的公開出版物在此引入作為參考。
本發(fā)明的嵌合DNA結(jié)構(gòu)可包含多拷貝的啟動子和多拷貝的原卟啉原氧化酶結(jié)構(gòu)基因。另外，此結(jié)構(gòu)中可包括標(biāo)記的編碼序列，以及其他如信號或轉(zhuǎn)移肽；在合適閱讀框中與其他作用原件一起在DNA分子中的序列。制備這樣的構(gòu)建體是本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員已知的。
有用的標(biāo)記包括提供除草劑，抗生素或藥物抗性的肽，例如對潮霉素、卡納霉素、G418、慶大霉素、林肯霉素、氨甲蝶呤，glyphosate，phosphinothricin等抗性。這些標(biāo)記可用于從未轉(zhuǎn)化細(xì)胞中選擇用本發(fā)明嵌合DNA構(gòu)建體轉(zhuǎn)化的細(xì)胞。其它有用的標(biāo)記為可通過如顏色反應(yīng)等可見反應(yīng)觀測到的多肽酶，如熒蟲素酶，β-葡萄糖醛酸酶，或β-半乳糖苷酶。
改變了的原卟啉原氧化酶也可通過分離了的真核原卟啉原氧化酶編碼序列修飾形式的產(chǎn)生和鑒定而獲得。此編碼序列至少有一個(gè)氨基酸取代，增加或刪除，且編碼對能抑制未改變自然產(chǎn)生形式(即沒有直接通過基因重組方法或間接選擇培育方法等操作過在真核生物中自發(fā)產(chǎn)生的形式)的除草劑有抗性的改變了的原卟啉原氧化酶。編碼那些酶的基因可通過本領(lǐng)域中已知的多種方案獲得。第一個(gè)普通方法包括直接或間接對微生物進(jìn)行突變。如一種基因可操作的微生物如大腸桿菌和釀酒酵母用如紫外光.乙基或甲基甲烷硫酸隨機(jī)誘變。誘變步驟在以下文獻(xiàn)中有描述如Miller分子遺傳學(xué)實(shí)驗(yàn)，冷泉港實(shí)驗(yàn)室，紐約冷泉港(1972).Davis等人，高等細(xì)菌遺傳學(xué)，冷泉港實(shí)驗(yàn)室紐約冷泉港(1980)；Sherman等人，酵母遺傳學(xué)方法，冷泉港實(shí)驗(yàn)室，紐約冷泉港(1983)；和U-S.Patent No.4,975,374(Goodman等人)。被選用誘變的微生物包含正常除草劑敏感真核原卟啉原氧化酶基因，并且依賴于由此基因而獲得到卟啉原氧化酶。誘變后細(xì)胞培養(yǎng)在能抑制未改變原卟啉原氧化酶濃度的除草劑中，誘變微生物菌落在除草劑存在下長得比未誘變微生物好的(即表現(xiàn)對抑制抗性)選出來進(jìn)一步分析。這些菌落中原卟啉原氧化酶基因通過克隆或PCR擴(kuò)增而分離并且測序。編碼已改變了的原卟啉氧化酶的序列再克隆回微生物以證實(shí)它們能產(chǎn)生抑制劑抗性的能力。
第二個(gè)獲得真核原卟啉原氧化酶除草劑抗性等位突變基因的方法包括直接從植物中選取，如，上面描述的原卟啉原氧化酶抑制劑對植物生長(如Arabidopsis，大豆、玉米)的抑制作用可采用技術(shù)可行的方法將種子接種到含抑制劑濃度不斷上升的簡單基本鹽培養(yǎng)基平板中進(jìn)行測定，這些濃度包括，0.001，0.003，0.01，0.03，0.1，0.3，1，3，10.30，110.300，1000，3000ppm。在最低劑量有顯著生長抑制的用于以后試驗(yàn)。
植物材料的誘變可用于提高選定種群中抗性等位基因發(fā)生的頻率。誘變的種子材料可從各個(gè)來源獲得包括化學(xué)或物質(zhì)誘變或種子，或化學(xué)或物質(zhì)誘變花粉(Neutter，見“進(jìn)行生物研究的玉米”Sheridan，ed.Univ.Press.Grand Forks.ND.pp61-64(1982)；此花粉可用于植物受精而收集到M1代突變種子，對于擬南芥(Arabidop-sis)M2種子(Lehle Seeds.Tusson.AZ)即采用如EMS等化學(xué)物質(zhì)或γ射線或快中子等物理方法誘變的種子長出的植物的后代種子以高達(dá)10,000個(gè)/平皿(直徑10cm)的密度放在包含合適濃度的用于選擇抗性的抑制劑的基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基中。在平皿中植物被轉(zhuǎn)移到土壤并生長至成熟和產(chǎn)生種子仍要繼續(xù)生長和保持綠色7-21天。這些種子的后代要測試對除草劑的抗性。如果抗性特征為顯性，種子抗性與敏感以3∶1分離的植物可假定在M2代抗性是雜合的，產(chǎn)生種子全為抗性的植物可假定M2代抗性是純合的。作用在相關(guān)種子上的那引些誘變劑和M2后代種子的篩選亦可在其他種類上使用，如大豆(見，如U.S.Pat.No.5.084.082(Sebastian))，篩選的對除草劑有抗性的種子也可由物理或化學(xué)方法誘變的花粉受精而獲得。
有兩種方法可用于證實(shí)抗性的遺傳基礎(chǔ)是改變了的原卟啉原氧化酶基因。首先，將對抑制劑表現(xiàn)抗性的原卟啉原氧化酶等位基因通過DCR分離，引物是以SEQ ID，NOS1，3，5，7中Arabidopsis和玉米原卟啉原氧化酶cDNA序列保守區(qū)域或更優(yōu)選的是以用于產(chǎn)生抗性等位基因的植物中未改變原卟啉原氧化酶基因的序列為基礎(chǔ)。在對等位基因進(jìn)行測序以決定編碼序列中存在的突變后，等位基因用于測試采用推斷為提供抗性等位基因轉(zhuǎn)化的植物中提供對抑制劑抗性的能力。這些植物可以是Arabidopsis或任何其他生產(chǎn)對抑制劑敏感的植物。第二，原卟啉原氧化酶基因可以建立已知限制性片段長度多態(tài)性(RFLPS)相關(guān)的圖譜(見，如Chang等人，美國自然科學(xué)匯編85；6856-6860(1988)；Nam等人，植物細(xì)胞1699-705(1989).抗性特征可用相同標(biāo)記獨(dú)立地建立圖譜。如果抗性是由于原卟啉原氧化酶中的突變，抗性特征圖譜將標(biāo)在與原卟啉原氧化酶相同位置。
第三個(gè)獲得原卟啉原氧化酶除草劑抗性的等位基因的方法是從植物細(xì)胞培養(yǎng)中選擇，植物組織如胚胎，葉片，等外植體或快速生長愈傷組織或感興趣植物的懸浮培養(yǎng)物在無血紅素，有濃度不斷上升的除草劑性抑制物或適用于實(shí)驗(yàn)室環(huán)境的抑制劑類似物的有限培養(yǎng)基上生長。在不同培養(yǎng)物中有不同生長程度的記錄，在一些培養(yǎng)物中，產(chǎn)生的快速生長克隆即使在一般抑制濃度的抑制劑中繼續(xù)生長。這樣快速生長改變株發(fā)生的頻率在將植物組織或細(xì)胞加入除草劑前用物理或化學(xué)誘變劑處理會得到提高。推論為原卟啉原氧化酶基因提供抗性的等位基因按前面各段描述的方法分離和測試。那些肯定為提供除草劑抗性的等位基因可通過工程學(xué)達(dá)最佳表達(dá)并轉(zhuǎn)化入植物。另外，植物可由包含這些等位基因的組織或細(xì)胞培養(yǎng)再生形成。
第四種方法包括對細(xì)菌或酵母中野生型，除草劑敏感的原卟啉原氧化酶基因的誘變，接著將此微生物在缺乏血紅素但包含抑制濃度的抑制劑的培養(yǎng)基上培養(yǎng)，挑選在抑制劑存在下生長的那些克隆。更具體地說，編碼原卟啉原氧化酶的植物cDNA.，如Arabidopsis或玉米cDNA克隆到否則缺乏原卟啉原氧化酶活性的微生物中。這類微生物的實(shí)例包括大腸桿菌，鼠傷寒沙門氏菌和釀酒酵母的缺陷型突變，包括大腸桿菌菌株SAS×38(Sasarman等人，遺傳微生物學(xué)雜志113297(1979)，鼠傷寒沙門氏菌菌株TE2483.或TT13680(Xu等人，細(xì)菌學(xué)雜志1743953(1992))和hem14-1酵母突變株(Ca-madro.等人，生化生理研究通報(bào)106724(1982))。轉(zhuǎn)化的微生物用如上面剛描述的體內(nèi)誘變處理，或者用各種本領(lǐng)域中已知的化學(xué)或酶學(xué)方法的體外誘變處理，如二硫化鈉(Shortle等人.酶學(xué)方法100457-468(1983))；甲氧基胺(Kadonaga等人，核酸研究131733-1745(1985))；寡聚核苷酸直接飽和誘變(Hutchinson等人，美國自然科學(xué)研究匯編83710-714(1986))；或各種不聯(lián)合種類的聚合酶(見，如Shortle等人，美國自然科學(xué)研究匯編791588-1592(1982)Shiraishi等人，基因64313-319(1988)和Leung等人，技術(shù)111-15(1989)。在有一般抑制濃度的抑制劑中生長的菌落被挑選出與用重復(fù)劃線純化。它們的質(zhì)粒進(jìn)行純化并且轉(zhuǎn)化到缺乏原卟啉原氧化酶的微生物中以測試提供對抑制劑抗性的能力。通過這個(gè)測試的質(zhì)粒中原卟啉原氧化酶cDNA插入的DNA序列進(jìn)行測序。
一但一個(gè)除草劑抗性原卟啉原氧化酶等位基因鑒定了，它可用基因工程方法在作物植物中達(dá)最適表達(dá)。這可包括改變抗性等位基因編碼序列使之在感興趣作物種類中最適表達(dá)，修飾編碼序列以獲得在特定作物中的最適表達(dá)的方法是眾所周知的(見，如Perlak等人，美國自然科學(xué)研究匯編883324(1991)；Koziel等人，生物技術(shù)11194(1993))。原卟啉原氧化酶等位基因最適表達(dá)的基因工程也包括聯(lián)上合適的調(diào)控基因序列(即容動子，信號序列，轉(zhuǎn)錄終止子)。優(yōu)選的啟動子是那些能高水平組成型表達(dá)的啟動子或更優(yōu)選的是那些在除草劑可能破壞的組織中特異性高水平表達(dá)的啟動子。
重組DNA分子可用許多技術(shù)上可行的方法導(dǎo)入植物細(xì)胞。本領(lǐng)域的技術(shù)人員可預(yù)料到方法的選擇取決于所要轉(zhuǎn)化的植物類型即單子葉或雙子葉。轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞的合適方法包括顯微注射(Crossway等人，生物技術(shù)4320-334(1986))、電穿孔(Riggs等人.美國自然科學(xué)匯編USA835602-5606(1986))、土壤桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化(Hinchee.等人，生物技術(shù)6915-921(1988))，直接基因轉(zhuǎn)移(Paszkowski等人，EMBO雜志J.32717-2722(1984))和使用來自Agracetus公司，Madison.Wisconsin和Dupont公司.Wilm-ington.Delaware的設(shè)備進(jìn)行導(dǎo)道微粒加速(見，如Sanford等人，Datent.4,945,050.和McCobe等人，生物技術(shù)6923-926(1988))。也可見，Weissinger等人，遺傳學(xué)年鑒22421-477(1988)；Sanford等人，顆?？茖W(xué)及技術(shù)527-37(1987)(洋蔥)；Christou等人.植物生理.87671-674(1988)(大豆)；Mc Cabe等人，生物/技術(shù)6923-926(1988)(大豆)；Datta等人，生物/技術(shù)8736-740(1990)(水稻)；Klein等人.美國自然科學(xué)研究匯編，854305-4309(1988)(玉米)，Klein等人，生物/技術(shù)6559-563(1988)(玉米)；Kleim等人，植物生理91440-444(1988)(玉米)；Fromm等人，生物/技術(shù)8833-839(1990)，和Gordon-Kamm等人，植物細(xì)胞2603-618(1990)(玉米)。
本發(fā)明的范圍還包括轉(zhuǎn)基因植物，具體的轉(zhuǎn)基因可育植物為用上述方法轉(zhuǎn)化的植物及其無性和/或有性后代，它們?nèi)匀粚σ种浦参镏凶匀划a(chǎn)生原卟啉原氧化酶抑制的除草劑的抑制有抗性，至少有耐受性。尤其較優(yōu)的是對植物中自然產(chǎn)生的原卟啉原氧化酶抑制水平的除草劑的抑制有抗性，至少有耐受性的雜交植物。
根據(jù)本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因植物可以是雙子葉或單子葉植物。優(yōu)選的單子葉植物是禾本科植物，包括黑麥草、玉米，小麥，Triticale，高梁，甘蔗，雀麥，稻，燕麥，大麥和黑麥。
特別優(yōu)選的有轉(zhuǎn)基因玉米、小麥、大麥、高梁、黑麥、燕麥、苔草(turf)和水稻。
在雙子葉植物中，本文特別優(yōu)選大豆，棉花，煙草，甜菜，油菜和向日葵。
“后代”表達(dá)意思為包括轉(zhuǎn)基因植物產(chǎn)生的無性或有性后代。這個(gè)定義也意味著包括所有通過已知方法獲得的突變體或變種，如通過仍表現(xiàn)初始轉(zhuǎn)化植物特征的細(xì)胞融合與突變體選擇，以及所有轉(zhuǎn)化植物材料的雜交或融合產(chǎn)物。
本發(fā)明的另一涉及轉(zhuǎn)基因植物的繁植材料。
轉(zhuǎn)基因植物的繁殖材料對于本發(fā)明定義為任何可在體外或體內(nèi)有性或無性繁殖的植物材料。在本發(fā)明范圍中較優(yōu)的為原生質(zhì)體，細(xì)胞，愈傷組織，組織，器官，種子，胚胎，花粉，卵細(xì)胞，合子及其他任何轉(zhuǎn)基因植物來源的繁殖材料。
植物的部分，如來源于轉(zhuǎn)基因植物或通過本發(fā)明方法轉(zhuǎn)化的后代花、莖、果實(shí)、葉、根，并至少包含部分轉(zhuǎn)基因細(xì)胞，也是本發(fā)明的一個(gè)主題。
在植物繁殖材料[果實(shí)、塊莖、谷粒、種子]，尤其是種子在作為商業(yè)產(chǎn)品出售前，它們要用一種包含除草劑，殺蟲劑，殺真菌劑、殺細(xì)菌劑、殺線蟲劑，殺軟體動物劑或這幾種物質(zhì)混合物的保護(hù)劑覆蓋物處理，如要需要與其它載體一起，保護(hù)使免受細(xì)菌、真菌或害獸破壞的工藝中還采用表面活性劑和使用增高配料。
為了處理這些種子，保護(hù)劑覆蓋物可通過用液體配方處理塊莖和谷?；蚵?lián)合的濕或干的配方覆蓋而使用于種子。另外，在一些特殊例子中，其他用于植物的方法也是可行的，如直接處理花蕾和果實(shí)。
根據(jù)本發(fā)明包含編碼一類真核的具有根據(jù)本發(fā)明原卟啉原氧化酶(protox)活力的蛋白質(zhì)的DNA序列的植物種子常用包含一類種子處理化合物的種子保護(hù)劑覆蓋物處理，這些種子處理化合物包括如Captan，Carboxin，二硫化四甲秋蘭姆(TMTD)，methalaxyl(Apron)和pirimiphos-methyl(Actellic)及其他常用于種子處理的復(fù)合物。
本發(fā)明還有一個(gè)目的是提供種植植物的植物繁殖材料，但尤其是常用于種子處理的種子保護(hù)劑覆蓋物處理的植物種子。
一旦一個(gè)除草劑抗性原卟啉原氧化酶等位基因在作物植物或能再生成作物植物的植物細(xì)胞培養(yǎng)物中通過直接選擇獲得，它能夠采用傳統(tǒng)培養(yǎng)技術(shù)移入商業(yè)變種中建立除草劑耐受性作物而無需對等位基因進(jìn)行基因工程處理并轉(zhuǎn)化入植物。也就是，除草劑抗性等位基因可以分離，并通過遺傳工程達(dá)最適表達(dá)并轉(zhuǎn)化到所需變種。
編碼抵抗原卟啉原氧化酶抑制劑的改變了的原卟啉原氧化酶基因而作為植物細(xì)胞轉(zhuǎn)化方法中可選擇的標(biāo)記。如用轉(zhuǎn)移基因轉(zhuǎn)化的植物，植物組織或植物細(xì)胞也可用編碼能夠在植物中表達(dá)的改變了的原卟啉原氧化酶的基因轉(zhuǎn)化，然后轉(zhuǎn)化的細(xì)胞轉(zhuǎn)移到包含原卟啉原氧化酶的抑制劑的培養(yǎng)基上，只有轉(zhuǎn)化了的細(xì)胞才能存活。原卟啉原氧化酶抑制劑中作為特別有用的選擇性試劑的有二苯醚{如acifluorfen，5-〔2-氯-4-(三氟甲基)苯酚〕-2-硝基苯甲酸；其甲基酯，或Oxyfluorfen，2-氯-1-(3-2氧基-4-硝基苯氧基)-4-(三氟基苯)}，Oxidiazoles，(如Oxidiazon，3-〔2，4-二氯-5-(1-甲基乙氧基)苯基〕-5-(1，1-二甲基乙基-1，3，4-Oxadiazol-2-(3H)-one)，環(huán)亞胺(如S-23142，N-(4-氯-2-氟)-5-炔丙基苯)-3，4，5，6-四氫鄰苯二酰胺；Chlorophthalim，N-(4-氯苯)-3，4，5，6-四氫鄰苯二酰胺)，苯吡唑(如TNPP-乙基，乙基2-〔1-(2，3，4-三氯苯)-4-硝基吡唑-5-氧〕丙酸；M&B 39279)，吡啶衍生物(如LS82-556)，和phenopylate和它的O-苯吡咯烷一和呱啶氨基甲酸酯類似物。這個(gè)方法可以用于任何被編碼改變了的原卟啉原氧化酶基因轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞，可使用任何感興趣的轉(zhuǎn)移基因。轉(zhuǎn)移基因和原卟啉原氧化酶基因的表達(dá)可使用在植物細(xì)胞中起作用的同一啟動子或分開的啟動子。
本發(fā)明通過參考以下詳細(xì)的實(shí)施例進(jìn)一步描述。這些實(shí)施例只是用于舉例目的，而不是用于限制，除非另有。
保存以下的載體分子保存在Agricultural Research Service，PatentCulture Collection(NRRL)，Northern Regional Research Center，1815 North University Street.Peoria，Illinas 61604，U.S.A，日期如下原卟啉原氧化酶-1采用pBluescript SK載體，1994，4，5以pWDC-2(#B-21238)保存。
原卟啉原氧化酶-2采用pFL61載體，1994，4，5作為pWDC-1(NRRL#B-21237)保存。
M2Protox-1，以pBluescript SK為載體，1994，5，20以pWDC-4(NRRL#B-21260)保存，在SEQ ID No5中表示。
MZProtox-1，以pBluescriptSK為載體，1994，7，11作為SEQID NO5表示的pWDC-4以NRRL(#B-21260N)保存。
MZProtox-2，以pBluescript SK為載體，1994，5，20作為SEQID NO7表示的pWDC-3以NRRL(#B-21259)保存。
原卟啉原氧化酶-3以pFL61為載體，1994.6.10.以pWDC-5(NRRL#B-21280)保存。
pMzC-1Val，以pBluescript SK為載體，1994.9.30以命名為pWDC-8的形式以給定的保藏號NRRL#21340保存。
pAraC-2Cys，以pFL61為載體，1994.11.14以pWDC-7形式以給定的保藏號NRRL#21339N保存。
實(shí)施例這兒使用的標(biāo)準(zhǔn)重組DNA和分子克隆技術(shù)是本領(lǐng)域所熟知的，并在以下文獻(xiàn)T.Maniatis，E.F.Fritsch和J.Sambrook，“分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊”，冷泉港實(shí)驗(yàn)室，紐約冷泉港(1982)和T.J.Sil-hary.M.L.Berman和L.W.Enquist.“基因融合試驗(yàn)”冷泉港實(shí)驗(yàn)室，紐約冷泉港(1984)中進(jìn)行了描述。
實(shí)施例1通過一個(gè)大腸桿菌突變體的功能互補(bǔ)分離擬南芥編碼原卟啉原氧化酶基因的cDNA。
一個(gè)以pFL61為質(zhì)粒載體(Minet等人，植物雜志J.2417-422(1992))的擬南芥菜(Landsberg)cDNA文庫已獲得并擴(kuò)增。購買了第二個(gè)以Unizapλ為載體的擬南芥(Columbia)cDNA文庫，并通過體內(nèi)噬菌體外切以pBluescript質(zhì)粒擴(kuò)增。獲得大腸桿菌hemG突變體SAS×38(Sasarman等人.遺傳微生物雜志113279(1979))并在含20g/ml正鐵血紅素(美國生化物質(zhì))的L培養(yǎng)基上保存。質(zhì)粒文庫通過電穿孔采用Bio-Rad Gene Pulser和制造者建議的條件轉(zhuǎn)化到SAS×38中。這些細(xì)胞以大約500,000個(gè)轉(zhuǎn)化子/10cm平皿的密度平板接種到包含100mg/ml的氨芐青霉素的L瓊脂上。這些細(xì)胞在低亮度下37℃培養(yǎng)40小時(shí)，選擇其在無外源血紅素下生長能力。血紅素原養(yǎng)微生物的恢復(fù)頻率在pFL61文庫約400/107，在pBluescriprt文庫約2/107。從24個(gè)克隆中分離的質(zhì)粒DNA進(jìn)行了序列分析，24個(gè)中的每一個(gè)都再轉(zhuǎn)化到SAS×38以證實(shí)其互補(bǔ)能力。
序列分析顯示出兩類推定的原卟啉原氧化酶克隆。9個(gè)命名為“Protox-1”型。每一個(gè)都來自同一基因，兩個(gè)為全長克隆。此cD-NA為17196bp長，編碼蛋白分子量為57.7KDa。N-末端肽序列約60個(gè)氨基酸具葉綠體轉(zhuǎn)移肽的特征。用GAP程序(Deveraux等人，核酸研究12387-395(1984))搜尋的數(shù)據(jù)庫顯示出與枯草芽孢桿菌hemY(protox)蛋白有同源性(Hansson和Hederstedt1992，Dailey等人，生物化學(xué)雜志269813(1994))。這兩種蛋白有53％相似，31％與高同源區(qū)相同，包括hemY蛋白可能的二核苷酸結(jié)合域(Dai-ley等人，J.Biol.Chem.269813(1994))。
其它15個(gè)命名為”Protox-2”型。這些也表現(xiàn)為由一個(gè)基因產(chǎn)生。大約全長的cDNA是1738bp，編碼的蛋白質(zhì)分子量為55.6KD。氨基末端具有線粒體轉(zhuǎn)移肽的某種特征。原卟啉原氧化酶-2(pro-tox-2)蛋白與protox-1(53％相似，28％相同)和枯草芽孢桿菌原卟啉原氧化酶(50％相似，27％相同)有有限的同源性。
原卟啉原氧化酶-1(protox-1)以pBluescript SK為載體，1994.4.5以pWDC-2保存(NRRL#B-21238)。
原卟啉原氧化酶-2(protox-2)以pFL61為載體，1994.4.5以pWDC-1保存(NRRL#B-21237)。
在pWDC-2中編碼原卟啉原氧化酶-1和在pWDC-1中編碼原卟啉原氧化酶-2的擬南芥cDNA分別在以下SEQ ID NOS1和3中表示。實(shí)施例2通過大腸桿菌突變體的功能互補(bǔ)作用分離玉米編碼原卟啉原氧化酶基因的cDNA從Stratagene購買了一個(gè)在λUnizap中的玉米(B73 inbred)cDNA文庫，并且通過群體外切轉(zhuǎn)到pBluescript文庫中。第二個(gè)商業(yè)制造Unizap玉米cDNA文庫購自Clontech，并類似地轉(zhuǎn)變到pBluescript質(zhì)粒上。從玉米中選擇有功能的原卟啉原氧化酶基因的方法按上面實(shí)施例1.中描述的制擬南芥文庫方法進(jìn)行。
兩個(gè)血紅素原養(yǎng)型從Stratagene文庫107個(gè)轉(zhuǎn)化子中分離出，并表現(xiàn)互補(bǔ)性，且測了序。這些cDNA是相同的并與擬南芥原卟啉原氧化酶-1有同源性。這個(gè)玉米克隆，命名為MZProtox-1是不完全的。此cDNA長度為1698bp，僅編碼可能的成熟原卟啉原氧化酶，沒有轉(zhuǎn)移肽序列，也沒有甲硫氨酸啟始密碼子。此基因在核苷酸水平與擬南芥protox-1有68％相同，在氨基酸水平有78％相同(87％相似)(在表1表示)。
從Clontech文庫107個(gè)轉(zhuǎn)化子中得到一個(gè)血紅素原養(yǎng)型，表現(xiàn)有互補(bǔ)作用，并測了序。此cDNA似乎是完整的，長2061bp，編碼59KDa的蛋白。此克隆是一個(gè)與擬南芥Protox-2同源的玉米克隆，命名為MZProtox-2。此基因在核酸水平有58％與擬南芥Pro-tox-2相同，在氨基酸水平有58％相同(76％相似)(表2中表示)。此玉米克隆只一個(gè)比擬南芥克隆長30個(gè)氨基酸的N-未端序列。與擬南芥克隆相比，兩個(gè)玉米原卟啉原氧化酶基因間同源性很低，兩個(gè)蛋白的序列之間僅31％相同。
MZProtox-1以pBluescript SK為載體，1994.5.20以在SEQID NO5中表示的pWDC-4以NRRL(#B-21260)保存。
MZProtox-1以pBluescript SK為載體，1994.7.11以在SEQID NO5中表示的pWDC-4在NRRL(#B-21260N)中再保存。
MZProtox-2以pBluescriptSK為載體，1994.5.20以在SEQID NO7中表示的pWDC-3在NRRL(#B-21259)保存。實(shí)施例3以與已知原卟啉原氧化酶編碼序列的序列同源性為基礎(chǔ)分離另外的原卟啉原氧化酶基因一個(gè)噬菌體或質(zhì)粒文庫以約10,000個(gè)噬菌斑每次10cm陪氏平皿的密度平板接種，在將植物在37℃生長過夜后制備噬菌斑的濾膜轉(zhuǎn)移。噬菌斑的轉(zhuǎn)移物以SEQ ID Nos1，3，5或7所述的cDNA為探針，以32P-dCTP標(biāo)記，借助于Prime Time試劑盒(國際生物技術(shù)公司，New Haren，CT)以隨機(jī)引物方法進(jìn)行探針雜交。雜交條件為7％+＝烷基硫酸鈉(SDS)，0.5M Na3sPO4pH7.01mM ED-TA，50℃。雜交過夜后，濾膜用1％SDS，2×SSC沖洗。陽性雜交噬菌斑通過放射自顯影檢測。在純化到單個(gè)噬菌斑后，分離cDNA插入序列，采用熒光染料標(biāo)記的雙脫氧終止子以鏈終止法測定它們的序列(應(yīng)用生物系統(tǒng)公司，F(xiàn)oster城，CA)。
上面描述的標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)方案可由本領(lǐng)域的技術(shù)人員使用以獲得來自其它真核生物，尤其高等植物種類與已知原卟啉原氧化酶編碼序列有高度同源性的原卟啉原氧化酶基因序列。
被SEQ ID Nos2和6中表示的序列編碼的各個(gè)蛋白質(zhì)的推定的氨基酸序列的比較在表1中表示。被SEQ ID Nos4和8中表示的序列編碼的各個(gè)蛋白質(zhì)的推定的氨基酸序列的比較在表2中表示。
表1擬南芥(SEQ ID No.2)和玉米(SEQ ID No.6)原卟啉原氧化酶氨基酸序列的比較相似百分比87.137相同百分比78.00851 GGTTITTDCVIVGGGISGLCIAQALATKHPDAAPNLIVTEAKDRVGGNII 100..|||:|||||||||.||||||:| :..:::||||:.|.||||.
1 ....NSADCVVVGGGISGLCTAQALATRH..GVGDVLVTEARARPGGNIT 44101 T..REENGFLWEEGPNSFQPSDPMLTMVVDSGLKDDLVLGDPTAPRFVLW 148| |.|:|:||||||||||||||:|||.||||||||||:|||.|||||||45 TVERPEEGYLWEEGPNSFQPSDPVLTMAVDSGLKDDLVFGDPNAPRFVLW 94149 NGKLRPVPSKLTDLPFFDLMSIGGKIRAGFGALGIRPSPPGREESVEEFV 198:||||||||| .||||||||||.||:|||:|||||||.||||||||||||95 EGKLRPVPSKPADLPFFDLMSIPGKLRAGLGALGIRPPPPGREESVEEFV 144199 RRNLGDEVFERLIEPFCSGVYAGDPSKLSMKAAFGKVWKLEQNGGSIIGG 248|||||.||||||||||||||||||||||||||||||||:||:.|||||||145 RRNLGAEVFERLIEPFCSGVYAGDPSKLSMKAAFGKVWRLEETGGSIIGG 194249 TFKAIQERKNAPKAERDPRLPKPQGQTVGSFRKGLRMLPEAISARLGSKV 298|:|.||||...||:.||:|||||.||||:|||||| |||:||...|||||195 TIKTIQERSKNPKPPRDARLPKPKGQTVASFRKGLAMLPNAITSSLGSKV 244299 KLSWKLSGITKLESGGYNLTYETPDGLVSVQSKSVVMTVPSHVASGLLRP 348||||||.:||| :. || |.||||:|:||||.|||:||:||.|||.:|||245 KLSWKLTSITKSDDKGYVLEYETPEGVVSVQAKSVIMTIPSYVASNILRP 294349 LSESAANALSKLYYPPVAAVSISYPKEAIRTECLIDGELKGFGQLHPRTQ 398||..||:|||::||||||||.:||||||||.||||||||.||||||||.|295 LSSDAADALSRFYYPPVAAVTVSYPKEAIRKECLIDGELQGFGQLHPRSQ 344399 GVETLGTIYSSSLFPNRAPPGRILLLNYIGGSTNTGILSKSEGELVEAVD 448|||||||||||||||||||.||:||||||||.|||||:||.|:|||||||345 GVETLGTIYSSSLFPNRAPDGRVLLLNYIGGATNTGIVSKTESELVEAVD 394449 RDLRKMLIKPNSTDPLKLGVRVWPQAIPQFLVGHFDILDTAKSSLTSSGY 498||||||||.....||| |||||||||||||||||:|:|:.||..|..:||395 RDLRKMLINSTAVDPLVLGVRVWPQAIPQFLVGHLDLLEAAKAALDRGGY 444499 EGLFLGGNYVAGVALGRCVEGAYETAIEVNNFMSRYAYK* 538:|||||||||||||||||||||||.| ::.:|:.:|||||445 DGLFLGGNYVAGVALGRCVEGAYESASQISDFLTKYAYK* 484
相同的殘基以兩序列間垂直桿表示。采用Deveraux等入，核酸研究12387-395(1984)中描述的GAP方法進(jìn)行序列比較。
表2擬南芥(SEQ ID No.4)和玉米(SEQ ID No.8)原卟啉原氧化酶-2氨基酸序列的比較相似百分比75.889相同百分比57.9051 ............................MASGAVAD.HQIEAVSGKRVAV 21.| |:|: .: |..::.|||1 MLALTASASSASSHPYRHASAHTRRPRLRAVLAMAGSDDPRAAPARSVAV 5022 VGAGVSGLAAAYKLKSRGLNVTVFEADGRVGGKLRSVMQNGLIWDEGANT 71||||||||||||:|: .|:|||||||.:|.|||:|. :.|::|||||||51 VGAGVSGLAAAYRLRQSGVNVTVFEAADRAGGKIRTNSEGGFVWDEGANT 10072 MTEAEPEVGSLLDDLGLREKQQFPISQKKRYIVRNGVPVMLPTNPIELVT 121|||:| |.:.|:|||||.:|||:| ||.|||||::|.|.::|.:||.|:.101 MTEGEWEASRLIDDLGLQDKQQYPNSQHKRYIVKDGAPALIPSDPISLMK 150122 SSVLSTQSKFQILLEPFLWKK....KSSKVSDASAEESVSEFFQRHFGQE 167||||||.||:.:::||||:||.|:|||:. .|||:.| :||||.|151 SSVLSTKSKIALFFEPFLYKKANTRNSGKVSEEHLSESVGSFCERHFGRE 200168 VVDYLIDPFVGGTSAADPDSLSMKHSFPDLWNVEKSFGSIIVGAIRTKFA 217||||::||||:||||:||:|||::|.||.|||:|:.:||:||||| .|:|201 VVDYFVDPFVAGTSAGDPESLSIRHAFPALWNLERKYGSVIVGAILSKLA 250218 AKGGKSRDTKSSPGTKKGSRGSFSFKGGMQILPDTLCKSLSHDEINLDSK 267|||:. :. ..|.|.::..|.||||.|||| | :.| ..::.|::.|:..251 AKGDPVKTRHDSSGKRRNRRVSFSFHGGMQSLINALHNEVGDDNVKLGTE 300268 VLSLS..YNSGSRQENWSLSCVSHNETQRQ...NPHYDAVIMTAPLCNVK 312||||. :::.. :.||:|. |.:..::: |. :|||||||||:||:301 VLSLACTFDGVPALGRWSISVDSKDSGDKDLASNQTFDAVIMTAPLSNVR 350313 EMKVMKGGQPFQLNFLPEINYMPLSVLITTFTKEKVKRPLEGFGVLIPSK 362||. |||.|. |:|||.::|:|||:::|.|.|:.||:|||||||||| |351 RMKFTKGGAPVVLDFLPKMDYLPLSLMVTAFKKDDVKKPLEGFGVLIPYK 400363 E.QKHGFKTLGTLFSSMMFPDRSPSDVHLYTTFIGGSRNQELAKASTDEL 411| ||||:|||||||||||||||.|.| .|||||:|||:|.:|| |.|. |401 EQQKHGLKTLGTLFSSMMFPDRAPDDQYLYTTFVGGSHNRDLAGAPTSIL 450412 KQVVTSDLQRLLGVEGEPVSVNHYYWRKAFPLYDSSYDSVMEAIDKMEND 461||:|||||.:||||||:|. |.| || .|||||: .|.||:|||:|||.:451 KQLVTSDLKKLLGVEGQPTFVKHVYWGNAFPLYGHDYSSVLEAIEKMEKN 500462 LPGFFYAGNHRGGLSVGKSIASGCKAADLVISYLESCSNDKKPNDSL* 509||||||||| ::||.||. ||||:|||||.|||||| ......:501 LPGFFYAGNSKDGLAVGSVIASGSKAADLAISYLESHTKHNNSH*... 545實(shí)施例4從擬南芥cDNA文庫分離污染的酵母原卟啉原氧化酶克隆為了鑒定具有原卟啉原氧化酶活性的少數(shù)cDNA，對pFL61擬南芥文庫按以上方法進(jìn)行了第二次篩選，再次產(chǎn)生數(shù)百個(gè)互補(bǔ)克隆。大約600個(gè)被各自接種到網(wǎng)格平皿，并在28℃培養(yǎng)18h.。復(fù)制的濾膜轉(zhuǎn)移物按制造商說明在菌落/噬菌斑篩選(NEN)膜上制備。分別用EcoRI/xhol和NotI消化，將Protox-1和Protox-2cDNA從它們的載體上移出。插入序列在1.0％。Seaplaque GTP(FMC)瓊脂糖上凝膠電泳分離，切下并用隨機(jī)引物法以32P標(biāo)記。每一份轉(zhuǎn)移物用一種探針雜交。雜交和沖洗條件按Church和Gilkert1984所述進(jìn)行。
不能顯示與Protox-1或Protox-2清晰雜交的克隆(約20個(gè))在液體培養(yǎng)基中擴(kuò)增，并制備質(zhì)粒DNA。此DNA用Not1消化，重復(fù)的樣品走1.0％瓊脂糖膠，再Southern印跡到Gene Screen Plus(NEN)濾膜上[New England Nuclear]。這兩種已知原卟啉原氧化酶的探針按以前標(biāo)記和雜交。有兩個(gè)不是Protox-1或Protox-2的相同克隆。此克隆表現(xiàn)出雖然生長很慢，但能與SAS×38突變體互補(bǔ)，命名為原卟啉原氧化酶-3(protox-3)。
Protox-3以pFL61為載體，1994.6.8以pWDC-5保存(NR-RL#B-21280)。這些編碼序列測定后是來自擬南芥cDNA文庫中少量污染的酵母DNA。包含在pWDC-5中編碼原卟啉原氧化酶-3(Protox-3)的酵母DNA在下面SEQ ID No9中描述。實(shí)施例5在細(xì)菌系統(tǒng)中植物原卟啉原氧化酶克隆對原卟啉原氧化酶抑制型除草劑的敏感性的證實(shí)Protox-1/SASX38，Protox-2/SASX38和pBluescript/XL1-Blue的液體培養(yǎng)物在Lamp100上生長，每種培養(yǎng)物分成100ml等分平板接種到含各種濃度(1.0nM-10mM的具結(jié)構(gòu)式XVII原卟啉原氧化酶抑制型aryluracil除草劑的Lamp100培養(yǎng)基。雙套平皿在37℃下培養(yǎng)18h.，要在弱光或完全黑暗中培養(yǎng)。
表現(xiàn)出對任何濃度除草劑都不敏感的protox+大腸桿菌菌株XL1-Blue包含對類似除草劑有抗性的自然細(xì)菌酶。Protox-1/SAS×38明顯是敏感的，它的菌膜在10nM低的濃度的抑制劑下就幾乎完全消失。Protox-2/SAS×38.也是敏感的，但要在較高的除草劑濃度(10m下)。除草劑對兩個(gè)植物原卟啉原氧化酶株的作用在弱光下最有效，在黑暗的平皿也顯然也完全存在。除草劑的毒性可通過外加20mg/ml的正鐵血紅素到平皿中而完全消除。
這兩個(gè)植物原卟啉原氧化酶對除草劑的不同耐受性可能是這兩個(gè)質(zhì)粒不同表達(dá)的結(jié)果，而非此兩種酶有內(nèi)在差別。Protox-1/SAS×38在任何缺血紅素的培養(yǎng)基上都比Protox-2/SAS×38長得慢。另外，MZProtox-2/SAS×38株，與擬南芥Protox-1/SAS×38有相當(dāng)?shù)纳L速率，也對較低濃度(10-100nM)的除草劑很敏感。酵母Protox-3克隆的初始特征也表現(xiàn)對除草劑敏感。實(shí)施例6在大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)中選擇對原卟啉原氧化酶抑制型除草劑有抗性的植物原卟啉原氧化酶基因細(xì)菌系統(tǒng)中對植物原卟啉原氧化酶的抑制在大規(guī)模篩選植物基因中除草劑抗性突變是很有用的。在將液體培養(yǎng)物平板接種的初始劑量反應(yīng)測試中，甚至在高濃度的除草劑中也產(chǎn)生高頻的抗性克隆。這種抗性不是以再轉(zhuǎn)化/除草劑敏感測試為基礎(chǔ)的質(zhì)粒造成的。轉(zhuǎn)化原卟啉原氧化酶質(zhì)粒到SAS×38突變株中并直接接種到含除草劑平皿可以幾乎完全減少此背景問題。
植物原卟啉原氧化酶質(zhì)?？赏ㄟ^各種方法誘變；采用已公開的化學(xué)物質(zhì)方法，(如二硫化鈉(Shortle等人酶學(xué)方法.100457-468(1983)；甲氧胺(Kadonaga等人.核酸研究.131733-1745(1985)；寡聚核苷酸指導(dǎo)的飽和誘變(Hutchinson等人，美國自然科學(xué)研究匯編.83710-714(1986)；或各種聚合酶錯(cuò)誤聯(lián)合方法(見如Shortle等人，美國自然科學(xué)研究匯編791588-1592(1982)；Shi-raishi等人，基因64313-319(1988)和Leung等人，技術(shù)111-15(1989)。在整個(gè)質(zhì)粒誘變中的可能啟動子上升突變可通過將編碼序列再克隆到野生型載體并重新測試而消除。較高的表達(dá)可能導(dǎo)致在無除草劑條件下更好的生長，目測篩選編碼序列突變株也是可能的。
任何在細(xì)菌系統(tǒng)中表達(dá)除草劑抗性的植物原卟啉原氧化酶基因可采用此處描述的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)通過基因工程達(dá)到最適表達(dá)并轉(zhuǎn)化進(jìn)入植物。得到的植物可用除草劑處理也證實(shí)和定量測定引入的原卟啉原氧化酶基因產(chǎn)生的抗生水平。實(shí)施例7在植物中除草劑抗性微生物原卟啉原氧化酶基因表達(dá)的構(gòu)建編碼枯草芽孢桿菌原卟啉原氧化酶基因hemY的序列(Hansson和Hederstedt，細(xì)菌雜志，1748081(1992)；Dailey等人，生化雜志269813(1994)和編碼大腸桿菌原卟啉原氧化酶基因hemG的序列(Sasarman等人，加拿大微生物雜志391155(1993))通過采用標(biāo)準(zhǔn)條件和按公開序列設(shè)計(jì)的側(cè)面引物的PCR擴(kuò)增從實(shí)驗(yàn)室菌株中分離。這些基因是已知編碼除草劑抗性形式的原卟啉原氧化酶的。
采用重疊PCR融合的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)(Ausubel等人.分子生物學(xué)的現(xiàn)行方案.John Wiley & Sons.公司.(1994))，將兩細(xì)菌基因融入兩個(gè)不同擬南芥葉綠體轉(zhuǎn)移肽序列(CTPS)。首先是來自乙酰羥基酸合成酶的CTP(AHAS.Mazur等人，植物生理851110(1987))，此轉(zhuǎn)移肽容許進(jìn)入葉綠體的基質(zhì)。第二個(gè)來自擬南芥質(zhì)體藍(lán)素基因(Vorst等人，基因6559(1988))，它具有一個(gè)二等分的轉(zhuǎn)移肽。CTP的氨基末端部分指導(dǎo)蛋白質(zhì)進(jìn)入葉綠體，而羧基末端指導(dǎo)它進(jìn)入類囊體膜。所有四個(gè)融合基因克隆在2×355啟動子之后，而且是在為用土壤細(xì)菌轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因植物產(chǎn)物設(shè)計(jì)的雙向表達(dá)載體中。
在擬南芥和玉米原卟啉原氧化酶cDNAs的分離之后，來自Pro-tox-1或MZProtox-1的葉綠體轉(zhuǎn)移肽也按上述方法融合到兩個(gè)細(xì)菌原卟啉原氧化酶蛋白中。
上述載體可轉(zhuǎn)化到需要的植物種類，所得的轉(zhuǎn)化子可測試其對除草抗性的提高。實(shí)施例8擬南芥/枯草芽孢桿菌基因間結(jié)構(gòu)域的轉(zhuǎn)變以產(chǎn)生嵌合的，抗除草劑的原卟啉原氧化酶一個(gè)能用于產(chǎn)生具有在植物中對除草劑抗性和能提供有效的原卟啉原氧化酶活力的原卟啉原氧化酶基因的方法是將細(xì)菌和植物原卟啉原氧化酶基因部分融合。產(chǎn)生的嵌合基因可用于篩選那些在植物細(xì)胞中能提供除草劑抗性的原卟啉原氧化酶。如擬南芥和枯草芽孢桿菌(hemY)原卟啉原氧化酶肽序列在高同源區(qū)有合理的線性對應(yīng)。hemY編碼序列克隆到pBluescript并測試了其在SAS×38中表達(dá)除草劑抗性原卟啉原氧化酶。Protox-1/hemY嵌合基因用融合PCR技術(shù)構(gòu)建，接著接回pBluescript載體。初始交換約在蛋白質(zhì)的中間。產(chǎn)生的融合蛋白用互補(bǔ)法測試其原卟啉原氧化酶功能，然后經(jīng)過平板接種到含完整Protox-1和hemY對照的除草劑上測試其除草劑抗性。實(shí)施例9通過過度表達(dá)植物原卟啉原氧化酶基因產(chǎn)生除草劑耐受性植物為了在轉(zhuǎn)基因植物中表達(dá)擬南芥或玉米蛋白質(zhì)，合適的全長cDNA插入到按以下方法以pCGN1761中來的表達(dá)載體pCGN1761ENX。pCGN1761在其唯一的EcoR1位點(diǎn)消化，再連接到包含以下兩寡聚核苷酸序列的雙鏈DNA片段中，5′AAT TATQAC GTA ACG，TAG，GAA，TTA，GCG，GCCC，GCT，CTC，GAG，T3′(SEQ ID NO.11)和5′AAT TAC TCG，AGA GCG GCC GCGAAT TCC TAC GTT ACG TCA T3′(SEQ ID NO.12)。得到的質(zhì)粒pCGN1761ENX包含在來自花椰菜花葉病毒重復(fù)35S啟動子(Kay等人，科學(xué)2361299-1302(1987))中的唯一EcoR1.Not1和Xho1位點(diǎn)及來自土壤細(xì)菌tml基因的3′非轉(zhuǎn)譯序列。此質(zhì)粒酶切后與由一個(gè)具原卟啉原氧化酶cDNA的質(zhì)粒限制酶切產(chǎn)生的片段連結(jié)，這樣它就帶有完整原卟啉原氧化酶cDNA。從此質(zhì)?？赏馇谐鲆粋€(gè)包含擬南芥原卟啉原氧化酶cDNA，側(cè)面接重復(fù)35S啟動子和土壤細(xì)菌tml基因3′非轉(zhuǎn)譯序列的Xba1片段。此Xba1片段以位于T-DNA邊界序列之間唯一的Xba1位點(diǎn)插入到雙向載體pCIB200。產(chǎn)生的質(zhì)粒，命名為pCIB200 protox，轉(zhuǎn)化到根瘤土壤細(xì)菌菌株CIB542中，見如UKnes等人，植物細(xì)胞5159-169(1993)。
菸草CV.Xanthinc的葉子小園片用具pCIB2001GPD的根瘤土壤桿菌CIB542按Horsch等人.科學(xué)2271229(1985)描述的方法感染。來自15個(gè)獨(dú)立葉片的卡那霉素抗性芽轉(zhuǎn)移到生根培養(yǎng)基，進(jìn)一步轉(zhuǎn)移到土壤并且得到的植物在溫室中長成熟。這些植物的種子收集后，在包含卡那霉素的MS瓊脂培養(yǎng)基上萌發(fā)。從各個(gè)單獨(dú)初始轉(zhuǎn)化物來的多個(gè)單獨(dú)對卡那霉素抗性的嫩芽在溫室中長至成熟，收集它們的種子。這些種子再含卡那霉素的MS瓊脂培養(yǎng)基上萌芽。具有額外卡那霉素抗性嫩芽的植物系純化后用于插入基因并用以進(jìn)一步分析。用紙打孔器將15個(gè)單獨(dú)的轉(zhuǎn)基因植物系切小園葉片并放在含有各種不斷上升濃度的原卟啉原氧化酶抑制型除草劑的MS瓊脂培養(yǎng)基上。
在三周后，將每個(gè)株系的兩套中10個(gè)園片稱重記下結(jié)果。轉(zhuǎn)基因株系對抑制劑抗性比野生型高，非轉(zhuǎn)化植物選出進(jìn)一步分析。
從各個(gè)株系葉片中提取RNA。來自各獨(dú)立純化系和來自非轉(zhuǎn)基因?qū)φ罩参镏锌俁NA用含有甲醛的瓊脂糖凝膠電泳分離。(Ausubel等人，分子生物學(xué)的現(xiàn)行方案，Wiley & Sons，New York(1987)。此膠印跡到尼龍膜上(Ausubel等人，Supra)并用放射性標(biāo)記的擬南芥原卟啉原氧化酶cDNA雜交。雜交和沖洗條件按Church和Gilbert，美國自然科學(xué)研究匯編811991-1995(1984)描述的條件進(jìn)行。濾膜放射自顯影，密集的對應(yīng)原卟啉原氧化酶轉(zhuǎn)移基因的RNA帶在所有除草劑耐受性轉(zhuǎn)基因植物系中觀測到。
為進(jìn)一步提高原卟啉原氧化酶過表達(dá)性的抗性，植物種在溫室中，并用各種濃度的原卟啉原抑制型除草劑處理。實(shí)施例10煙草細(xì)胞懸浮培養(yǎng)物的生長培養(yǎng)基MX1此培養(yǎng)基包含Murashige和Skoog(“MS”，T.Murashige等人，植物生理15473-496，1962)主要鹽類，微量鹽類和Fe-ED-TA(Gibco#500-1117；4.3g/L)，100mg/L肌醇，1mg/L尼克酸，1mg/L吡哆醇-HCl，10mg/L VB1-HCl，2-3g/L蔗糖，0.4mg/L2，4-二氯苯氧乙酸，和0.04mg/L激動素，pH5.8。此培養(yǎng)基高壓滅菌。N6此培養(yǎng)基包含多量元素，微量元素和Fe-EDTA，這在C-C，Chu等人，中國科學(xué)18659(1975)中有描述，以及下列有機(jī)化合物吡哆醇-HCl(0.5mg/L)，VB1-HCl(0.1mg/L)，尼克酸(0.5mg/L)，甘氨酸(2.0mg/L)和蔗糖(30.0g/l)。溶液高壓滅菌，最終pH5.6。注多量元素以10X濃度貯備液制備，微量元素以1000X貯備液制備，維生素貯備液一般以100X濃度制備。
菸草的懸浮培養(yǎng)細(xì)胞系S3[Harms和Di Maio，植物生理雜志137，513-519，1991]在液體培養(yǎng)基MX1上生長。含有25mlMX1培養(yǎng)基的錐形瓶接種10ml已生長10天的細(xì)胞培養(yǎng)物。細(xì)胞在25℃，黑暗下，在軌道搖床上以100rpm(2cm幅度)培養(yǎng)。每隔7天接種等分的樣品到新鮮培養(yǎng)基，傾倒或移出約90％細(xì)胞懸浮物，接著注入新鮮培養(yǎng)基到所需懸浮體積，這樣進(jìn)行傳代培養(yǎng)。250-350mg細(xì)胞接種物生長10天能產(chǎn)生5-8g重新鮮細(xì)胞物質(zhì)。實(shí)施例11通過將細(xì)胞平板接種固體選擇培養(yǎng)基生長對原卟啉原氧化酶除草劑型抑制劑有耐受性的煙草細(xì)胞培養(yǎng)物按實(shí)施例10生長的細(xì)胞通過允許細(xì)胞沉淀或在500xg短暫離心進(jìn)行收獲，并除去已用過的培養(yǎng)基。細(xì)胞再用新鮮培養(yǎng)基稀釋至適合平板接種的細(xì)胞密度，每毫升約10,000集落形成單位。在接種時(shí)，在少量體積的培養(yǎng)基(約1ml)中的細(xì)胞平整地鋪到含所需濃度的抑制劑的固體培養(yǎng)基(MX1，0.8％瓊脂)上部。每10cm陪氏平皿約用20～30ml培養(yǎng)基。合適的抑制劑濃度由劑量反應(yīng)曲線(實(shí)施例14)決定，且至少是敏感野生型細(xì)胞IC50的兩倍高。
包含擴(kuò)散到選擇培養(yǎng)基細(xì)胞的培養(yǎng)平板在25～28℃黑暗中普通生長條件下培養(yǎng)，直至細(xì)胞克隆形成。出現(xiàn)的細(xì)胞克隆轉(zhuǎn)移至包含所需濃度抑制劑的新鮮培養(yǎng)基中。
上述方法的一個(gè)優(yōu)選的改進(jìn)是將生長好的懸浮培養(yǎng)細(xì)胞首先接種到固體培養(yǎng)基上部少量液體培養(yǎng)基中。將在40℃保持融化狀態(tài)的等量溫液液體瓊脂培養(yǎng)基(1.2-1.6％瓊脂)加到平皿中，在培養(yǎng)基融化之前，將平皿立刻溫和轉(zhuǎn)動使細(xì)胞平整擴(kuò)散在培養(yǎng)基表面，并使細(xì)胞與瓊脂培養(yǎng)基混合。
作為選擇，細(xì)胞也可在擴(kuò)散到選擇培養(yǎng)基表面之前與融化的瓊脂混和。此方法的優(yōu)點(diǎn)是細(xì)胞鑲嵌和固定在選擇培養(yǎng)基上面固體培養(yǎng)基薄層中。與細(xì)胞鑲嵌在整個(gè)20-30ml體積中相比，它能提供更好的細(xì)胞透氣性。實(shí)施例12通過細(xì)胞在液體選擇培養(yǎng)基中生長產(chǎn)生對除草劑原卟啉原氧化酶抑制劑有耐受性的煙草細(xì)胞培養(yǎng)物按實(shí)施例10培養(yǎng)的細(xì)胞以合適的細(xì)胞密度接種到含所需濃度除草劑型原卟啉原氧化酶抑制劑的液體培養(yǎng)基MX1中，細(xì)胞按實(shí)施例10培養(yǎng)和生長，在7～10天周期后，依賴于生長速率，用包含所需濃度抑制劑的培養(yǎng)基，將細(xì)胞傳代培養(yǎng)。
取決于所用的抑制劑濃度，細(xì)胞生長會比無抑制劑慢。實(shí)施例13生產(chǎn)具增強(qiáng)水平的原卟啉原氧化酶的煙草細(xì)胞為了獲得具增強(qiáng)水平的原卟啉原氧化酶的細(xì)胞培養(yǎng)物或愈傷組織，懸浮培養(yǎng)物或愈傷組織以步驟合理的方式轉(zhuǎn)移到不斷增高濃度的除草劑型原卟啉原氧化酶抑制劑中。具體的說以下步驟表示為實(shí)施例11中平板接種細(xì)胞出現(xiàn)的細(xì)胞集落轉(zhuǎn)移到包含與根據(jù)實(shí)施例11中選擇使用的相同濃度的原卟啉原氧化酶抑制劑的MX1培養(yǎng)基中以制備懸浮培養(yǎng)物。另外，實(shí)施例12中選出的細(xì)胞懸浮培養(yǎng)物在包含與實(shí)施例12相同濃度原卟啉原氧化酶抑制劑的液體MX1培養(yǎng)基中傳代培養(yǎng)。
培養(yǎng)物以周為間隔傳代培養(yǎng)1～20次，然后傳代培養(yǎng)到包含下一個(gè)更高除草劑濃度的MX1培養(yǎng)基。此細(xì)胞在包含此較高濃度除草劑的培養(yǎng)基培養(yǎng)1～10個(gè)傳代培養(yǎng)物。然后，此細(xì)胞轉(zhuǎn)移到含有下一個(gè)更高濃度除草劑的MX1培養(yǎng)基中。
作為選擇，實(shí)施例11中選出的愈傷組織塊轉(zhuǎn)移到含所需濃度除草劑的固化MX1培養(yǎng)基上。按照前面段落列出的除使用固體培養(yǎng)基以外的步驟轉(zhuǎn)移到更高濃度的除草劑中。實(shí)施例14測定懸浮培養(yǎng)物中的細(xì)胞除草劑劑量依賴生長為了獲得劑量反應(yīng)曲線，測定在不同除草劑濃度下細(xì)胞的生長。除草劑型原卟啉原氧化酶抑制敏感的野生型煙草細(xì)胞S3的懸浮培養(yǎng)細(xì)胞和選出的對除草劑耐受的或轉(zhuǎn)基因細(xì)胞S3和除草劑耐受的或轉(zhuǎn)基因細(xì)胞在實(shí)施例11中的液體培養(yǎng)基中以高密度預(yù)生長2～4天。這些細(xì)胞洗去用過的培養(yǎng)基，再加入無除草劑的新鮮培養(yǎng)基使之達(dá)到需要濃度(約150mgFW細(xì)胞每毫升懸液)。2.5ml懸液，包含約250～300mg FW細(xì)胞的樣品接種到裝有30ml具所需除草劑濃度的液體培養(yǎng)基的錐形瓶中。小心接種同樣量的細(xì)胞到各瓶中，每個(gè)錐形瓶包含相同體積培養(yǎng)基。每個(gè)除草劑濃度接種3～6個(gè)重復(fù)錐形瓶。除草劑濃度從O(＝對照)，0.1ppb，0.3ppb，1ppb，3ppb，10ppb，30ppb，100ppb，300ppb，1000ppb，3000ppb和10,000ppb。在接種以測定每個(gè)接種瓶中細(xì)胞量時(shí)，也要接種幾個(gè)樣品。
然后細(xì)胞接種在28℃，黑暗的對照條件下生長10天。細(xì)胞的收獲可將各個(gè)瓶子中物質(zhì)傾入附在真空吸濾裝置的濾紙片上以除去所有液體，以獲得合理的干新鮮細(xì)胞量。新鮮的細(xì)胞團(tuán)進(jìn)行稱重，樣品的干重得在干燥后獲得。
細(xì)胞的生長以10天內(nèi)細(xì)胞增量來測定和表達(dá)，并按以下方程以與無除草劑細(xì)胞生長的百分比表示((最終加除草劑細(xì)胞生長質(zhì)量-接種量)×100/(無除草劑細(xì)胞生長量-接種量))。IC50值從繪制數(shù)據(jù)圖表(相對細(xì)胞質(zhì)量對除草劑濃度)上測定。IC50表示細(xì)胞生長為對照生長(細(xì)胞在無除草劑下生長)的50％的除草劑濃度。
此方法的改進(jìn)中，除草劑抗性細(xì)胞培養(yǎng)物，正如在實(shí)施例11和13中得到的，其中的一些愈傷組織碎片轉(zhuǎn)移到包含不同除草劑濃度的固體愈傷組織培養(yǎng)基中，相對生長在培養(yǎng)周期2～6周后測定，稱量愈傷組織塊并與在無除草劑培養(yǎng)基的對照培養(yǎng)相比較。然而，優(yōu)選懸浮方法因其更精確。實(shí)施例15交叉耐受的測定為了測定細(xì)胞表現(xiàn)對類似物或其他除草劑的耐受程度，通過在不斷上升的選定除草劑濃度上生長細(xì)胞來重復(fù)實(shí)施例14。對每種除草劑測定細(xì)胞的相對生長和它們的IC50值并比較。實(shí)施例16測定除草劑耐受性表型在時(shí)間上的穩(wěn)定性為了測定一個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)物的除草劑耐受性表型是否能長時(shí)間維持，細(xì)胞被從有除草劑培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移到無除草劑培養(yǎng)基。按實(shí)施例10描述，細(xì)胞在無除草劑下生長3個(gè)月，并有規(guī)律地以合適間隔進(jìn)行傳代培養(yǎng)(7～10天懸浮培養(yǎng)，而對于愈傷組織培養(yǎng)要3～6周)。已知量的細(xì)胞轉(zhuǎn)移回含除草劑培養(yǎng)基中，并培養(yǎng)10天(懸浮培養(yǎng))，或4周(愈傷組織培養(yǎng))。相對生長按實(shí)施例14測定。實(shí)施例17誘導(dǎo)和培養(yǎng)來自玉米盾片組織的胚原性愈傷組織谷穗在自花傳粉玉米的純培養(yǎng)系Funk2717授粉后12-14天收獲。谷穗移去外殼，然后在加了幾滴除污劑以更好濕潤的20％商業(yè)Chlorox漂白液中搖15分鐘以滅菌。谷穗再用無菌水洗幾次，以后步驟在滅菌空氣流動框中無菌操作。1.5-2.5mm長的胚從具匙突的核中移出并胚軸向下放置在包含2mg/l2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D)和3％蔗糖的培養(yǎng)基上，培養(yǎng)基用0.24％GelriteR固化。
胚原性愈傷組織在將胚的盾片組織在28℃黑暗中培養(yǎng)2-4周形成。此愈傷組織從外植體中移出并轉(zhuǎn)移到包含2mg/l2，4-D的新鮮固體MS培養(yǎng)基中。胚原性愈傷組織的傳代培養(yǎng)以因?yàn)殚g隔重復(fù)。只有具胚原性形態(tài)的愈傷組織部分傳代培養(yǎng)。實(shí)施例18選擇對除草劑型原卟啉原氧化酶耐受的玉米細(xì)胞培養(yǎng)a)使用胚原性愈傷組織的選擇來自實(shí)施例17的胚原性愈傷組織轉(zhuǎn)移到包含含有2mg/l2，4-D，3％蔗糖的N6培養(yǎng)基和足以阻滯生長但不影響培養(yǎng)的胚原性的濃度的原卟啉原氧化酶抑制劑；并以0.24％GelriteR固化的愈傷組織維持培養(yǎng)基上。為提高除草劑耐受性突變的頻率，培養(yǎng)物在選擇前可用化學(xué)誘變劑如乙酰甲烷硫酸或物理誘變劑，如UV光預(yù)處理，并在僅比實(shí)施14中測定的抑制生長濃度低的濃度上生長。培養(yǎng)物在28℃，黑暗中培養(yǎng)。在14天生長后，愈傷組織轉(zhuǎn)移到相同組分的新鮮培養(yǎng)基上。只有具所需胚發(fā)生形態(tài)的即已知為可改變胚發(fā)生愈傷組織II型形態(tài)的培養(yǎng)物進(jìn)行傳代培養(yǎng)。通過以周為間隔的傳代培養(yǎng)，在新鮮培養(yǎng)基上繁殖2～10個(gè)傳代培養(yǎng)物，只有那些生長最快的培養(yǎng)物進(jìn)行傳代培養(yǎng)。最快生長的愈傷組織轉(zhuǎn)移到包含實(shí)施例11設(shè)定的合適的原卟啉原氧化酶抑制劑的愈傷組織維持培養(yǎng)基上。一般在約5～10周的傳代亞培養(yǎng)后，愈傷組織在此除草劑濃度生長很好，此愈傷組織再轉(zhuǎn)移到含有三倍高濃度的抑制劑的愈傷組織維持培養(yǎng)基上，并傳代培養(yǎng)至獲得生長好的培養(yǎng)物。此過程采用包含濃度10倍高于原始合適濃度的原卟啉原氧化酶抑制劑的培養(yǎng)基重復(fù)操作，然后再用包含20和40倍高濃度的培養(yǎng)基。
當(dāng)足夠的愈傷組織產(chǎn)生后，將其轉(zhuǎn)移到適合胚胎成熟和植物再生的再生培養(yǎng)基上。在各個(gè)除草劑濃度上生長的胚發(fā)生愈傷組織轉(zhuǎn)移到再生培養(yǎng)基上。
b)使用胚發(fā)生性懸浮培養(yǎng)的選擇玉米Funk純系2717的胚發(fā)生性懸浮培養(yǎng)按實(shí)施例24建立并通過以周為間隔在新鮮包含2mg/L2，4-D的液體N6培養(yǎng)基上保持。為提高除草劑耐受性突變的頻率，此時(shí)，培養(yǎng)物可用化學(xué)誘變劑，如乙酰甲烷硫酸處理，并且按實(shí)施例14中測定的，僅低于可觀測到生長抑制濃度的濃度。為了選擇，培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移到包含2mg/l2，4-D和足以使生長停滯但不影響培養(yǎng)胚胎發(fā)生的抑制劑濃度的液體N6培養(yǎng)基中。培養(yǎng)物在28℃，黑暗中，120rpm搖床上生長。以周為間隔，培養(yǎng)基移去后加入新鮮培養(yǎng)基。培養(yǎng)物按照它們的生長用培養(yǎng)基稀釋以維持在每50ml培養(yǎng)基中含10ml聚集的細(xì)胞體積。對于每個(gè)傳代培養(yǎng)，培養(yǎng)物要進(jìn)行觀測，只有具所需可變胚發(fā)生形態(tài)的快速生長培養(yǎng)物保留以進(jìn)一步傳代培養(yǎng)。在含N6培養(yǎng)基中經(jīng)過2～10，傳代培養(yǎng)后，對于每周傳代培養(yǎng)，培養(yǎng)物生長速率上升至少2～3倍。此培養(yǎng)物再轉(zhuǎn)移到包含2mg/L 2，4-D和比原始所用高3倍劑量的抑制劑的N6培養(yǎng)基。生長的培養(yǎng)物按上述重復(fù)地在此培養(yǎng)基上傳代培養(yǎng)2～10個(gè)傳代培養(yǎng)物。具有需要的可變胚發(fā)生形態(tài)的快速生長培養(yǎng)物選出進(jìn)一步傳代培養(yǎng)?？焖偕L培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移到包含2mg 2，4-D和比原始所用抑制劑濃度高10倍的N6培養(yǎng)基，具所需可變胚發(fā)生形態(tài)的傳代培養(yǎng)生長培養(yǎng)物的過程重復(fù)2～10次傳代培養(yǎng)直至獲得快速生長培養(yǎng)物。此培養(yǎng)物再轉(zhuǎn)移至包含2mg/l 2，4-D和30倍初始濃度的抑制劑的N6培養(yǎng)基。
為了使所提到除草劑濃度水平選出的胚發(fā)生懸浮培養(yǎng)物再生植物，此培養(yǎng)物首先轉(zhuǎn)移至用0.24％GelriteR固化并包含2mg/l2，4-D和可選擇的培養(yǎng)物曾生長的濃度抑制劑的N6培養(yǎng)基上以產(chǎn)生胚發(fā)生愈傷組織。此胚發(fā)生愈傷組織傳代培養(yǎng)到新鮮愈傷組織維持培養(yǎng)基中直至獲得足夠再生的愈傷組織。只有具所需胚發(fā)生形態(tài)的培養(yǎng)物進(jìn)行傳代培養(yǎng)。實(shí)施例19從選出的愈傷組織和懸浮培養(yǎng)物中再生玉米植株從實(shí)施例13中選出的胚發(fā)生性愈傷組織培養(yǎng)物通過轉(zhuǎn)移到新鮮的再生培養(yǎng)基上再生出植株。使用的再生培養(yǎng)基有由缺少2，4-3的N6培養(yǎng)基組成的ON6培養(yǎng)基，或由含有0.25mg/l2，4-D和10mg/l激動素(6-呋喃甲基腺嘌呤)的N6培養(yǎng)基組成的N61培養(yǎng)基，或由含有0.1mg/l2，4-D和1mg/l激動素的N6培養(yǎng)基組成的N62培養(yǎng)基，全都以0.24％GelriteR固化。培養(yǎng)物在28℃光照下生長(16h每天，10-100 Einsteins/m2sec，采用白色熒光燈)，此培養(yǎng)物每隔兩周在新鮮培養(yǎng)基上傳代培養(yǎng)。3～8周出現(xiàn)小植物。小植物至少2cm高后從粘附的愈傷組織轉(zhuǎn)移到根促生培養(yǎng)基中。有不同的根促生培養(yǎng)基可采用。這些培養(yǎng)基包括缺乏維生素，具普通量的鹽或鹽減半，蔗糖減至1g/l，并缺少生長調(diào)節(jié)物或包含0.1mg/lα-萘乙酸的N6或MS培養(yǎng)基。一旦根長得足夠了，小植物移植到包含殺蠕蟲劑，泥炭蘚和花園土的盆栽混合物中。在移植時(shí)所有愈傷組織都除去，所有瓊脂都洗凈，葉子剪除一半。小植物在溫室中生長，開始用倒置透明塑料杯蓋幾天以保持溫度和在陰處生長。在適應(yīng)氣候后，植株再移栽并生長至成熟。肥料peters 20-20-20(Grace Sierra)用于確保植株健康成長。開花植物要授粉，優(yōu)選自花授粉。實(shí)施例20構(gòu)建植物轉(zhuǎn)化載體有許多轉(zhuǎn)化載體可用于植物轉(zhuǎn)化，本發(fā)明的基因可用于與任何這樣的載體相聯(lián)。所用載體的選擇依賴于優(yōu)選的轉(zhuǎn)化技術(shù)和轉(zhuǎn)化的目標(biāo)種類。對于某些目標(biāo)種類，優(yōu)選不同的抗生素或除草劑選擇性標(biāo)記。在轉(zhuǎn)化中使用的常規(guī)性選擇標(biāo)記包括能提供卡那霉素或其它相關(guān)抗生素抗性的npt11基因(Messing & Vierra，基因19259-268(1982)；Beran等人，自然304184-187(1983))，能提供除草劑phosphinothricin抗性的bar基因(White等人.，核酸研究.181062(1990)，Spencer等人，理論應(yīng)用遺傳學(xué)79625-631(1990)，能提供對抗生素潮霉素抗性的hph基因(Blochinger & Digqelmann，分子細(xì)胞生物學(xué)42929-2931)，和能提供對Methotrexate抗性的dhfr基因(Bourouis等人，EMBO雜志2(7)1099-1104(1983))(1)構(gòu)建適合土壤桿菌轉(zhuǎn)化的載體許多載體可用于對根瘤土壤桿菌進(jìn)行轉(zhuǎn)化。這樣典型的組合至少包括一個(gè)T-DNA邊界序列并包括如pBIN19等的載體。(Be-van.核酸研究(1984)).下面描述了兩種典型載體的構(gòu)建。
pCIB200和pCIB2001的構(gòu)建用于構(gòu)建土壤桿菌中重組載體的雙功能載體pCIB200和pCIB201按以下方式構(gòu)建。pTJS75Kan的構(gòu)建是通過允許外切四環(huán)素抗性基因條件下用Nar1消化pTJS75(Schmidhauser和Helinski，細(xì)菌雜志164446-455(1985))，接著插入帶NPT11的pUC4K中的Acc1片段(Messing & Vierra基因19259-268(1982)；Bevan等人，自然304184-187(1983)；McBrida等人，植物分子生物學(xué)14266-276(1990))。Xho1接頭(linker)接到含有T-DNA左右邊界，一個(gè)植物可選擇的nos/npt11嵌合基因和puc多向接頭(polylinker)的pCIBT的EcoRV片段上(Rothstein等人，基因53153-161(1987))，Xho1-消化片段克隆到Sall消化的pTJS75kan中以構(gòu)建pCIB200(見EP0332104，實(shí)施例19(13387)。pCIB200含以下單一的多向接頭限制位點(diǎn)CcoR1，Sst1，Kpn1，Bg11，Xba1，和Sa11。pCIB2001是通過插入其它限制性位點(diǎn)的多向接頭而產(chǎn)生的pCIB200的衍生物。pCIB2001的多向接頭的單一限制位點(diǎn)有EcoR1，Sst1，Kpn1，Bg111，Xba1，Sa11，Mlu1，Bc11，Arr11，Apa1，Hpa1，和stu1。除了含有這些單一限制性位點(diǎn)外，pCIB2001也有植物和細(xì)菌卡納霉素選擇。用于土壤桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化的T-DNA左右邊界，RK2衍生的trfA的在大腸桿菌和其他受體間運(yùn)動的功能，也來自RK2的OriT和OriV的功能。此pCIB2001多向接頭適合于克隆含其自身調(diào)控信號的植物表達(dá)框。
pCIB10和其潮霉素選擇衍生物的構(gòu)建雙向載體pCIB10包括一個(gè)編碼用于在植物中選擇的卡那霉素抗性的基因，T-DNA左右邊界序列和來自廣泛受體范圍的質(zhì)粒pRK252并允許其在大腸桿菌和土壤桿菌中復(fù)制的非聯(lián)合序列。它的構(gòu)建在Rothstein等人，基因53153-161(1987)中描述。Gritz等人.基因25179-188(183))中描述了插入了潮霉素B磷酸轉(zhuǎn)移酶基因的各種pCIB10衍生物的構(gòu)建。這些衍生物能夠在只有潮霉素(pCIB743)或潮霉素和卡那霉素(pCIB715；pCIB717)上挑選轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞〔Rothstein等人，基因53153-161(1987)〕。(2)構(gòu)建適合非土壤桿菌轉(zhuǎn)化的載體不使用土壤桿菌的轉(zhuǎn)化可迥避在選擇轉(zhuǎn)化載體時(shí)對T-DNA序列的需要，因而除了如上描述的含T-DNA序列的載體外，可以使用缺乏這些序列的載體。不依賴土壤桿菌的轉(zhuǎn)化技術(shù)包括通過粒子轟擊，原生質(zhì)體提高(如PEG和電穿孔)和顯微注射變化。載體的選擇主要依賴于較優(yōu)選的轉(zhuǎn)化物種。下面是對構(gòu)建一些典型載體的描述。pCIB3064的構(gòu)建pCIB3064是pUC衍生的并適合于與采用除草劑basta(或phos-phinothricin)選擇的直接基因轉(zhuǎn)移技術(shù)結(jié)合。質(zhì)粒pCIB246包括與大腸桿菌GUS基因有效融合的CaMV35S啟動子和CaMV35S轉(zhuǎn)錄終止子并在PCT公開申請WO93/07278中有描述。此載體的35S啟動子有兩個(gè)啟始位點(diǎn)5′的ATG序列。這些位點(diǎn)可采用標(biāo)準(zhǔn)PCR技術(shù)突變，通過此法可除去ATGs并產(chǎn)生Ssp1和Pvu11限制性位點(diǎn)。新的限制位點(diǎn)離Sa11單一位點(diǎn)96和37bp，離準(zhǔn)確啟始位點(diǎn)101和42bp。所得的pCIB246衍生物命名為pCIB3025。然后GUS基因通過Sa11和Sac1消化從pCIB3025上切下，末端變成平頭并重連接以產(chǎn)生質(zhì)粒pCIB3060。質(zhì)粒pJIT82從John Innes Centre，Norwich獲得，包含來自鏈霉菌的bar基因的400bp Sma1片段切下并插入到pCIB3060的Hpa1位點(diǎn)(Thompson等人，EMBO雜志.62519-2523(1987))。這樣產(chǎn)生的pCIB3064包含用于除草劑選擇的在CaMV35S啟動子和終止子控制下的bar基因，一個(gè)氨芐青霉素抗性基因(用于在E.coli中選擇)和具有Sph1，Pst1，Hind111和BamH1單一位點(diǎn)的多向接頭。此載體適合克隆包括其自身調(diào)節(jié)信號的植物表達(dá)框。
pSOG19和pSOG35的構(gòu)建pSOG35是利用大腸桿菌二氫葉酸脫氫酶(DHFR)基因?yàn)樘峁ethotrexate抗性的選擇性標(biāo)記的轉(zhuǎn)化載體。采用PCR擴(kuò)增pSOG10中的35S啟動子(～800bp)，來自玉米Adh1基因的內(nèi)含子6(～550bp)〔Lou等人，Plant J.3393-403 1993；Dennis等人，核酸研究123983-4000，1984〕和Gus的18pb非轉(zhuǎn)譯引導(dǎo)序列。一個(gè)編碼大腸桿菌二氫葉酸脫氫酶II型基因的250bp片段也通過PCR擴(kuò)增，這兩個(gè)PCR片段與包含pUC19載體主鏈和nopaline合成酶終止子的pB1221(Clonteeh)的Sac1-Pst1片段組裝。這樣的組裝就產(chǎn)生了包含與內(nèi)含子6序列融合的35S啟動子，GUS引導(dǎo)序列，DHFR基因和nopaline合成酶終止子的pSOG19。將pSOG19中GUS引導(dǎo)序列以玉米褪綠病花葉病毒(MCMV)的引導(dǎo)序列代替產(chǎn)生載體pSOG35。pSOG19和pSOG35帶有氨其青霉素抗性的pUC基質(zhì)和共克隆外源基因的Hind111，Sph1，Pst1和EcoRI位點(diǎn)。pSOG10此β-葡糖苷酸酶(GUS)表達(dá)載體是從買自Cloneteds實(shí)驗(yàn)室，Palo Alto，California的質(zhì)粒pB1121衍生的。玉米Adh1基因的內(nèi)含子6用PCR從質(zhì)粒pB428中擴(kuò)增，采用了寡聚核苷酸引物SON0003和SON004；如Bennetzen等人，美國自然科學(xué)研究匯編814125-4128(1987)中所述。
SON00035′-CTCGGATCCAGCAGATTCGAAGAAGGTACAG-3′SON0045′-ACGGGATCCAACTTCCTAGCTGAAAAATGGG-3′此PCR反應(yīng)產(chǎn)物用限制性核酸內(nèi)切酶BamH1消化，在每個(gè)PCR引物5′末端的BamH1位點(diǎn)切開。產(chǎn)生的DNA片段在瓊脂糖凝膠上純化并與在pB1121CaMV35S啟動子和GUS基因之間的BamH1位點(diǎn)連接。連接的DNA轉(zhuǎn)化到E.coli并克隆與限制酶切鑒定的GUS基因相同方向的Adh1內(nèi)含子6。pSOG19此二氫葉酸還原酶(DHFR)表達(dá)載體是將35S啟動子pSOG19中Adh1內(nèi)含子6與質(zhì)粒pHCO的DHFR基因按Bourouis和Jarry，EMBO雜志21099-1104(1983)描述方法融合產(chǎn)生。35S啟動子和Adh1內(nèi)含子6是pSOG10中的片段，以SON0031和SON0010為引物PCR擴(kuò)增而得到。
SON00315′-CATGAGGGACTGACCACCCGGGGATC-3′SON00105′-AGCGGATAACAATTTCACACAGGA-3′所得的片段用限制性核酸內(nèi)切酶Pst1和BspH1消化，并用瓊脂糖純化。
DHFR編碼區(qū)通過以SON0016和SON0017為引物將pHCO用PCR擴(kuò)增而產(chǎn)生。
SON00165′-GCTACCATGGCCACATAGAACACC-3′SON00175′-CGAGAGCTCGCACTTCAACCTTG-3′得到的片段用限制酶Nso1和Sac1消化并在瓊脂糖凝膠上純化。
上述兩個(gè)片段連接到通過用限制性內(nèi)切酶Pst1和Sac1消化并在瓊脂糖上純化含Nos終止子區(qū)和pBI121和pUC19區(qū)的3kb片段從pBI121制備的載體片段。此三向連接物35S啟動子-Adh1內(nèi)含子6-DHFR基因-Nos終止子以正確順序和方向融合以便在植物中功能性表達(dá)。PSOG30此GUS表達(dá)載體是從pSOG10通過按lommel等人，病毒學(xué)181382-385(1991)以三向聯(lián)接將玉米褪綠花葉病素(MCMV)引導(dǎo)序列插入到35S-GUS基因非轉(zhuǎn)譯引導(dǎo)序列中而產(chǎn)生。
17bp MCMV外殼蛋白引導(dǎo)序列加上合理限制性內(nèi)切酶信號的雙鏈可合成并退火。產(chǎn)生的雙鏈片段可用BamH1和Nco1消化并在聚丙烯酰胺凝膠上純化。
此GUS基因編碼區(qū)以SON0039和SON0041為引物，以pBI121為模板用PCR擴(kuò)增。
SON00395′-CGACATGGTACGTCCTGTAGAAACCCACA-3′SON00415′-ATCGCAAGACCGGCAACAGGATTC-3′這些引物可在GUS5′末端加一個(gè)Nco1位點(diǎn)，在GUS3′末端加一個(gè)Sac1位點(diǎn)。得到的片段用限制性內(nèi)切核酸酶Nco1和Sac1消化，并在瓊脂糖凝膠上純化。
GUS基因從質(zhì)粒pSOG10上通過限制性內(nèi)切酶Sac1酶切和限制性內(nèi)切酶BamHI部分酶切而移去，產(chǎn)生的有可在35S啟動子-Adh1內(nèi)含子6后插入編碼序列的BamHI和Sac1位點(diǎn)的載體在瓊脂糖凝膠上純化。
上述三個(gè)片段以三向連接物形式連接產(chǎn)生具以下結(jié)構(gòu)的基因融合物35S啟動子-Adh1內(nèi)含子6-MCMV引導(dǎo)序列-GUS-NOS終止子，所有的都以pUC19載體為主鏈。pSOG35DHFR選擇性標(biāo)記載體除MCMV引導(dǎo)序列插入在DHFR基因非轉(zhuǎn)譯引導(dǎo)序列中以增強(qiáng)轉(zhuǎn)移外與pSOG19相同。以兩步進(jìn)行構(gòu)建首先一個(gè)除含有不是35S的修飾的Adh啟動子外與pSOG30相同的載體pSOG32中的GUS編碼序列被pSOG19中的DHFR編碼序列經(jīng)過用Nco1和Sac1切下GUS，并以Nco1-Sac1片段聯(lián)接進(jìn)DHFR而代替。這樣產(chǎn)生的載體pSOG33具Adh啟動子-Adh1內(nèi)含子6-MCMV引導(dǎo)序列-DHFR編碼區(qū)-Nos終止子，在啟動子和內(nèi)含子之間的Bg111位點(diǎn)及編碼區(qū)和終止子之間的Sac1位點(diǎn)的基因結(jié)構(gòu)。Bg111-Sac1片段通過限制性內(nèi)切酶消化和瓊脂糖凝膠純化而分離，并聯(lián)入pSOG30的BamHI和Sac1位點(diǎn)；用pSOG33的Adh1內(nèi)含子6-MCMV引導(dǎo)序列-DHFR編碼區(qū)代替pSOG30的Adh1內(nèi)含子Z6-MCMV引導(dǎo)序列-GUS編碼區(qū)。實(shí)施例21構(gòu)建植物表達(dá)框想要在轉(zhuǎn)基因植物中表達(dá)的基因序列首先組裝在一個(gè)合適的啟動子之后和一個(gè)合適轉(zhuǎn)錄終止子的上游的表達(dá)框中，這些表達(dá)框就能容易地轉(zhuǎn)移到上面實(shí)施例19描述的植物轉(zhuǎn)化載體中。啟動子的選擇在表達(dá)框中啟動子的選擇將決定轉(zhuǎn)移基因在轉(zhuǎn)基因植物中表達(dá)的空間和時(shí)間形式。選定的啟動子會在特定細(xì)胞類型(如葉表皮細(xì)胞、葉肉細(xì)胞、根皮細(xì)胞)或特定組織或器官(如根、葉或花)中表達(dá)轉(zhuǎn)移基因而且此選擇將反映轉(zhuǎn)移基因要表達(dá)的位置。并且，選定的啟動子可使基因在先誘導(dǎo)或其他時(shí)間調(diào)控啟動子下表達(dá)。進(jìn)一步選定的啟動子可被化學(xué)物質(zhì)調(diào)控。這樣使轉(zhuǎn)移基因只有在需要時(shí)和用化學(xué)物質(zhì)處理時(shí)才會使誘導(dǎo)表達(dá)成為可能。轉(zhuǎn)錄終止子多種轉(zhuǎn)錄終止子可在表達(dá)框中使用。這將導(dǎo)致超過轉(zhuǎn)移基因轉(zhuǎn)錄的終止及它的正確多聚腺苷的產(chǎn)生。合適的轉(zhuǎn)錄終止子并已知在植物中作用的包括CaMV35S終止子，tml終止子，nopaline合成酶終止子，豌豆rbcs E9終止子。這些都可在單子葉或雙子葉植物中應(yīng)用。增強(qiáng)或調(diào)控表達(dá)的序列許多序列發(fā)現(xiàn)能在轉(zhuǎn)錄單元內(nèi)增強(qiáng)基因表達(dá)，并且這些序列能與本發(fā)明的基因聯(lián)合使用以提高它們在轉(zhuǎn)移植物中的表達(dá)。
多種內(nèi)含子序列能表現(xiàn)出增強(qiáng)表達(dá)，尤其在單子葉細(xì)胞。例如玉米Adh1基因的內(nèi)含子已發(fā)現(xiàn)在導(dǎo)入細(xì)胞后能很強(qiáng)地促進(jìn)在它同源啟動子下野生型基因的表達(dá)。內(nèi)含子1發(fā)現(xiàn)特別有效地促進(jìn)與氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移霉基因融合的結(jié)構(gòu)的表達(dá)(Callis等人，基因開發(fā)11183-1200(1987))。在相同表達(dá)系統(tǒng)中，玉米bronzel基因內(nèi)含子具相似增強(qiáng)表達(dá)作用(Callis等人，同上)。內(nèi)含子序列已常規(guī)性聯(lián)入到植物轉(zhuǎn)化載體，尤其是在非轉(zhuǎn)譯引導(dǎo)序列中。
許多來自病毒的非轉(zhuǎn)譯序列也已知能促進(jìn)表達(dá)，而且在雙子葉植物細(xì)胞中特別有效。特別是煙草花葉病毒(TMV，“W-序列”)引導(dǎo)序列，玉米褪綠斑病毒(MCMV)和苜蓿花葉病毒(AMV)的引導(dǎo)序列已表現(xiàn)出很有效地增強(qiáng)表達(dá)(如Gallie等人，核酸研究158693-8711(1987)；(Kuzeski等人，植物分子生物學(xué)1565-79(1990))。細(xì)胞內(nèi)基因產(chǎn)物的導(dǎo)向多種引導(dǎo)基因產(chǎn)物的機(jī)制已知存在于植物中，并且控制和使機(jī)制運(yùn)行的序列已有一些較詳細(xì)的鑒定。如葉綠體基因產(chǎn)物的導(dǎo)向就由在各種蛋白質(zhì)氨基末端在葉綠體產(chǎn)生成熟蛋白時(shí)要切除的信號序列控制(如Comai等人，生化雜志26315104-15109(1988))。這些信號序列可與異源基因產(chǎn)物融合影響異源產(chǎn)物進(jìn)入葉綠體(Van den Broeck等人，自然313358-363(1985))。編碼適合信號序列的DNA可從編碼RUBISCO蛋白，CAB蛋白，EPSP合成酶，GS2蛋白等其它已知位于葉綠體的蛋白的cDNAs5′末端分離。
其它基因產(chǎn)物位于其它細(xì)胞器如線粒體和過氧化物酶體(如Unger等人，植物分子生物學(xué)13411-418(1989))。這些產(chǎn)物的編碼CDNA也可用于影響異源基因產(chǎn)物對這些細(xì)胞器的導(dǎo)向。這些序列的例子是線粒體核編碼ATP酶，特異的天冬氨酸轉(zhuǎn)移酶同功酶。細(xì)胞蛋白體的導(dǎo)向在Rogers等人，美國自然科學(xué)研究匯編826512-6516(1985))中有描述。
使基因產(chǎn)物導(dǎo)向到其它細(xì)胞空間的另外序列已有描述。氨基末端序列負(fù)責(zé)導(dǎo)向ER，非原質(zhì)體和糊粉層細(xì)胞的細(xì)胞外分泌(Koehler& HO，植物細(xì)胞2769-783(1990))。另外，氨基末端序列與羧基末端序列結(jié)合負(fù)責(zé)基因產(chǎn)物的液泡導(dǎo)向(Shinshi等人.植物分子生物學(xué).14357-368(1990))。
將上述的合適引導(dǎo)序列與感興趣的轉(zhuǎn)移基因序列融合，可以引導(dǎo)基因產(chǎn)物到任何細(xì)胞器和細(xì)胞空間。對于葉綠體導(dǎo)向，如RU-BISCO基因，CAB基因，EPsP合成酶基因或GS2基因信號序列在轉(zhuǎn)移基因氨基末端ATG框中融合。選定的信號序列要包含已知切割位點(diǎn)并且構(gòu)建的融合物要考慮要求切割的切割位點(diǎn)后所有氨基酸。許多時(shí)候這個(gè)要求可通過在切割位點(diǎn)和轉(zhuǎn)移基因間加入少量氨基酸或進(jìn)一步在轉(zhuǎn)移基因序列內(nèi)替換一些氨基酸來滿足。用于葉綠體進(jìn)入的融合物能夠通過體外對體外轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的轉(zhuǎn)譯，接著采用下面描述的技術(shù)測定葉綠體體外吸收來測定葉綠體的吸收效率C Bartlett等人.在Edelnann等人(Eds)葉綠體分子生物學(xué)方法，Elsevier.pp1081-1091(1982)；Wasmann等人，分子基因遺傳學(xué)205446-453(1986))。這些構(gòu)建技術(shù)在本發(fā)明中是眾所周知的并且也可用在線粒體和過氧化物體。轉(zhuǎn)移基因的表達(dá)可能要求的導(dǎo)向的選擇依賴于前體的細(xì)胞位置要求作為給定路線的起點(diǎn)。這通常為胞質(zhì)的或葉綠體的，盡管有些情況是線粒體和過氧化物體。轉(zhuǎn)移基因的產(chǎn)物一般不需導(dǎo)向ER，非原質(zhì)體或液泡。
上述細(xì)胞導(dǎo)向機(jī)制可不僅用于與它們同源啟動子聯(lián)合，也可與異源啟動子聯(lián)合，這樣可去影響在此轉(zhuǎn)錄啟動子調(diào)控下特異的細(xì)胞導(dǎo)向，因而具有與引導(dǎo)信號來源的啟動子不同的表達(dá)形式。實(shí)施例22雙子葉植物的轉(zhuǎn)化雙子葉植物的轉(zhuǎn)化技術(shù)是本領(lǐng)域已知的，包括土壤桿菌的基礎(chǔ)的技術(shù)和無需土壤桿菌的技術(shù)非土壤桿菌技術(shù)包括原生質(zhì)體和細(xì)胞對外源基因材料的直接吸收。這些可通過PEG或電穿孔介導(dǎo)的吸收，粒子轟擊介導(dǎo)的輸送，或顯微注射來獲得。這些技術(shù)的實(shí)例在Paskowski等人EMBO J 32717-2722(1984)，Potrykus等人，分子基因遺傳學(xué)199169-177(1985)，Reich等人，生物技術(shù)41001-1004(1986)和Klein等人，自然32770-73(1987)中描述。在各例中轉(zhuǎn)化細(xì)胞采用本領(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)再生成完整的植株。
土壤桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化是一個(gè)優(yōu)選的轉(zhuǎn)化雙子葉植物的技術(shù)，因?yàn)樗懈叩霓D(zhuǎn)化效率和在許多種類中有廣泛使用。一些土壤桿菌常規(guī)轉(zhuǎn)化的作物種類包括煙草，西紅柿，向日葵，棉花，油菜，土豆，大豆，苜蓿和楊樹(EP0317511(棉花)，EP0249432(西紅柿，Calgene)，WO87/07299(蕓苔，Calgene)，US4,795,855(楊樹))。土壤桿菌轉(zhuǎn)化典型地包括將帶有感興趣外源DNA的雙向載體(如pBI121(pCIB200或pCIB2001)轉(zhuǎn)移到合適的土壤桿菌菌株，這依靠受體土壤桿菌共生質(zhì)粒T；或染色體上帶的Vir基因的互補(bǔ)(如pCIB200和pCIB2001的CIB542菌株(Uknes等人，植物細(xì)胞5159-169(1993))。轉(zhuǎn)移重組雙向載體到土壤桿菌通過使用帶有重組雙向載體的大腸桿菌的三素本雜交過程而獲得，它是一種輔助大腸桿菌菌株具有諸如pRK2013的質(zhì)粒，能夠移動重組雙向載體到目標(biāo)土壤桿菌菌株。作為選擇，重組雙向載體也可通過DNA轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)移至土壤桿菌(HOfgen & Willmitzer，核酸研究169877(1988))。用重組土壤桿菌轉(zhuǎn)化目標(biāo)植物種類常包括土壤桿菌與植物外植體共同培養(yǎng)并按本領(lǐng)域已知的方法進(jìn)行。在雙向質(zhì)粒下DNA邊界序列間有抗生素或除草劑抗性標(biāo)記的轉(zhuǎn)化組織在選擇性培養(yǎng)基上再生。實(shí)施例23單子葉植物的轉(zhuǎn)化大多數(shù)單子葉植物的轉(zhuǎn)化現(xiàn)已變成常規(guī)性的。優(yōu)選的技術(shù)包括用PEG或電穿孔技術(shù)直接轉(zhuǎn)移基因到原生質(zhì)體，粒子轟擊使之進(jìn)入愈傷組織。轉(zhuǎn)化可在單DNA種類或多DNA種類(即共同轉(zhuǎn)化)中進(jìn)行，而且這些技術(shù)在本發(fā)明中適用。共同轉(zhuǎn)化具有可避免復(fù)雜載體構(gòu)建和產(chǎn)生具有感興趣的基因與選擇性標(biāo)記不相聯(lián)的基因座的轉(zhuǎn)基因植物，且可在以后世代中除去選擇性標(biāo)記等優(yōu)點(diǎn)。這些都可認(rèn)為是需要的。但是，使用共同轉(zhuǎn)化有一缺點(diǎn)為整合到基因組中分開的DNA種類頻率少于100％(Schocher等人.生物技術(shù)41093-1096(1986))。
專利申請EP0292435(Ciba-Geigy)，EP0392225(Ciba-Geigy)和WO93/07278(Ciba-Geigy)描述了一個(gè)玉米精華純培養(yǎng)系列制備愈傷組織和原生質(zhì)體，使用PEG或電穿孔轉(zhuǎn)化原生質(zhì)體，以轉(zhuǎn)化原生質(zhì)體再生玉米植株的技術(shù)。Gorden-Kamm等人，PlantCell 2605-618(1990)和Fromm等人，生物技術(shù)8833-839(1990))已出版了用粒子轟擊轉(zhuǎn)化A188-衍生玉米系的技術(shù)。而且申請WO93/07278(to Ciba-Geigy)和Koziel等人，Biotechnology11194-200(1993)描述了用粒子轟擊轉(zhuǎn)化玉米純培養(yǎng)系的技術(shù)。此技術(shù)采用從授粉14-15天后玉米穗上切下長1.5-2.5mm長的未成熟玉米胚及PDS-100He Biolistis轟擊裝置。
水稻的轉(zhuǎn)化可通過采用原生質(zhì)體和粒子轟擊的直接基因轉(zhuǎn)移技術(shù)操作。原生質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化對Japonica-型和Indica-型有描述(Zhang等人，Plant Cell Rep.7379-384(1988)；Shimamoto等人，自然338274-277(1989)；Dafta等人.生物技術(shù)8736-740(1990))。兩種類型也都可用粒子轟擊常規(guī)轉(zhuǎn)化(Christou等人，生物技術(shù)9957-962(1991))。
專利申請EP0332581(Ciba-Geigy)描述了產(chǎn)生、轉(zhuǎn)化和再生Pooideae原生質(zhì)體的技術(shù)。這些技術(shù)可用于鴨芽和小麥的轉(zhuǎn)化。另外，小麥轉(zhuǎn)化可用Vasil等人，生物技術(shù)10667-674(1992))描述的粒子轟擊進(jìn)入C型長期可再生愈傷組織細(xì)胞中，也可用Vasil等人，生物技術(shù)111553-1558(1993))和Weeks等人，植物生理1021077-1084(1993)描述的粒子轟擊未成熟胚和未成熟胚來源愈傷組織。一個(gè)較優(yōu)的小麥轉(zhuǎn)化技術(shù)包括通過粒子轟擊未成熟胚的小麥轉(zhuǎn)化和包括在基因輸送前的高蔗糖或高麥芽糖步驟。在轟擊前，許多胚(0.75-1mm長)平板接種至含3％蔗糖(Murashige & Skoog，植物生理15473-497(1962))和用于在黑暗中誘導(dǎo)體細(xì)胞胚的2，4-D 3mg/l的培養(yǎng)基上。在選定的轟擊日子，將胚從誘導(dǎo)培養(yǎng)基移至滲壓劑上(即有蔗糖和麥芽糖加到需要濃度，典型的為15％的誘導(dǎo)培養(yǎng)基)。這些胚允許質(zhì)壁分離2-3h再轟擊。典型的是每平皿20個(gè)胚，盡管這不是關(guān)鍵的。使用標(biāo)準(zhǔn)方法將合適的基因攜帶質(zhì)粒(如pCIB3064或pSG35沉積到毫米大小的金粒上。每個(gè)平皿的胚用DuPont Biolistics射擊，氦氣裝置為標(biāo)準(zhǔn)80目篩，約1000Psi爆發(fā)壓力。在轟擊后，胚放回黑暗中恢復(fù)約24h(仍在滲壓劑中)。24小時(shí)后，胚從滲壓劑移至誘導(dǎo)培養(yǎng)基并在上面保持約一個(gè)月直至再生前。約一個(gè)月后，構(gòu)建胚形成愈傷組織的胚外植物轉(zhuǎn)移到進(jìn)一步包含合適選擇劑(如在pCIB3064情況下為10mg/lbasta，在pSOG35情況下為2mg/l methotrexate)的再生培養(yǎng)基(MS+1mg/l NAA，5mg/lGA)。又在約一個(gè)月后，產(chǎn)生的芽轉(zhuǎn)移到稱為“GATS”并裝有半強(qiáng)度MS，2％蔗糖，和相同濃度選擇劑的無菌容器中。專利申請08/147,161中描述了小麥轉(zhuǎn)化方法，本文引用作為參考。實(shí)施例24在大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)中選擇對原卟啉原氧化酶抑制型除草劑有抗性的植物原卟啉原氧化酶基因。
將玉米葉綠體原卟啉原氧化酶編碼質(zhì)粒pWDC-4轉(zhuǎn)化到隨機(jī)誘變株XL1-Red(Stratagene.la Jolla，CA)中。轉(zhuǎn)化物接種到含50g/ml氨芐青霉素的L培養(yǎng)基上在37℃培養(yǎng)48h。轉(zhuǎn)化細(xì)胞層從平板上刮下并用Wizard Megaprep試劑盒promega，Madison WI)提取質(zhì)粒DNA。從此突變株分離的質(zhì)粒DNA約含有2000個(gè)核苷酸一個(gè)堿基改變(見Greener等人，策略T(2)32-34(1994))。
突變質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化到hemG突變株SAS×38(Sasarman等人，遺傳微生物學(xué)雜志113297(1979)并平板接種含100g/ml氨芐青霉素的L培養(yǎng)基和包含各種濃度原卟啉原氧化酶抑制型除草劑的相同培養(yǎng)基上。這些平板在37℃培養(yǎng)2-3天。質(zhì)粒DNA從所有在含有能有效殺死野生型菌株的除草劑濃度上生長的克隆中分離出。分離到的DNA再轉(zhuǎn)化到SAS×38，再平板接種到除草劑上確定抗性是質(zhì)粒攜帶的。
突變的pWDC-4質(zhì)粒DNA再從抗性克隆中分離，并用EcoR1和Xho1將原卟啉原氧化酶編碼序列切下，切下的原卟啉原氧化酶編碼序列再克隆到未突變的pBluscript載體上并按上述同樣方法測試其對原卟啉原抑制型除草劑的抗性。
該方法消除了提供抗性的非編碼序列突變?nèi)鐔幼由仙蛔?即突變體的抗性是突變導(dǎo)致未修飾原卟啉原氧化酶表達(dá)上升)而僅留下抗性是由于原卟啉原氧化酶編碼序列突變造成的突變體。對所有用此法測定為純的除草劑抗性原卟啉原氧化酶基因DNA序列進(jìn)行測定，并通過與野生型pWDC-4原卟啉原氧化酶序列比較鑒定突變。
通過上述過程，鑒定了一個(gè)在pWDC-4序列(SEQ ID NO 5)中498位核苷酸由C變?yōu)門的抗性突變。帶有此突變的質(zhì)粒命名為pMzC-1Val。這個(gè)在166氨基酸(SEQ ID NO.6)由丙氨酸密碼子GCT變?yōu)槔i氨酸密碼子GTT的轉(zhuǎn)變導(dǎo)致了在細(xì)菌測試中原卟啉原氧化酶對原卟啉原氧化酶抑制性除草劑抗性至少高10倍。在pBluscript SK載體中的pMiC-1Val于1994年9月30以pWDC-8命稱保存在農(nóng)業(yè)研究培養(yǎng)物收集中心并給定保存號NRRL#21340。
同樣的方法用于在各種載體中篩選擬南芥原卟啉原氧化酶-1基因的除草劑抗性形成。鑒定到一個(gè)在pWDC-2序列(SEQ IDNO.1)689核苷酸由C變?yōu)門的抗性突變。此質(zhì)粒定為pAraC-1Val。這個(gè)改變與上面pMzC-1Val突變體相同，將在擬南芥protox蛋白序列相應(yīng)位置的220氨基酸(SEQ ID NO.2)處丙氨酸密碼子GCT變?yōu)槔i氨酸密碼子GTT。
第二個(gè)抗性基因包括在pWDC-2序列(SEQ ID NO.1)的1307核苷酸的A變?yōu)镚，此質(zhì)粒定為pAraC-2Cys。這個(gè)改變?yōu)樵?26氨基酸(SEQ ID NO.2)酪氨酸密碼子TAC轉(zhuǎn)變成胱氨酸密碼子TGC。這個(gè)在玉米protox-1序列在核苷酸順序1115-1117(SEQID NO.5，氨基酸位置372，SEQ ID NO.6)對應(yīng)的酪氨酸密碼子相似突變后會產(chǎn)生此酶的除草劑抗性形式。
第三抗性突變在pWDC-2序列(SEQ ID NO.1)691核苷酸由G變?yōu)锳。此質(zhì)粒命名為pArac-3Ser。這個(gè)突變體在與pArac-1突變體鄰近的密碼子位置221氨基酸(SEQ ID NO.2)甘氨酸密碼子GGT變?yōu)镾er密碼子AGT。在玉米protox-1序列497-499核苷酸位置(SEQ ID NO.5，氨基酸位置167SEQ ID NO.6)對應(yīng)的甘氨酸密碼子可相似突變產(chǎn)生此酶的除草劑抑制形式。
上述突變產(chǎn)生的原卟啉原氧化酶在細(xì)菌測試中至少有10倍的原卟啉原氧化酶抑制型除草劑抗性。
在pFl61載體中的pArac-2cys于1994年11月14日定為pWDC-7，保存在農(nóng)業(yè)研究培養(yǎng)物收集中心，并給定保存號NRRL#21339N。實(shí)施例25在隨機(jī)篩選鑒定的位置額外的除草劑抗性密碼子替換在隨機(jī)篩選中鑒定為除草劑抗性位點(diǎn)的氨基酸被其他氨基酸替代并在細(xì)菌系統(tǒng)中測定其功能和除草劑抗性。擬南芥Protox-1序列的寡聚核苷酸指導(dǎo)的突變通過Transformer Site-Directed Mu-tagonesis試劑盒(Clotech.Palo Alto，CA)實(shí)施。在氨基酸的改變通過序列分析證實(shí)后，突變的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到SAS×38并平板接種到L-amp100培養(yǎng)基上以測試其功能，在各種濃度原卟啉原氧化酶抑制型除草劑上測試其耐受性。
該方法用于擬南芥原卟啉原氧化酶序列(SEQ ID NO.1)在688-690核苷酸的丙氨酸密碼子和1306～1308核苷酸的酪氨酸密碼子。結(jié)果表明在688-690核苷酸的丙氨酸密碼子能改變?yōu)槔i氨酸，蘇氨酸，亮氨酸或胱氨酸密碼子都可產(chǎn)生有功能并對除草劑抗性的原卟啉原氧化酶。結(jié)果進(jìn)一步表明在1306～1308核苷酸的酪氨酸密碼子可改變?yōu)殡装彼?，異亮氨酸，亮氨酸，纈氨酸或蘇氨酸密碼子而產(chǎn)生有功能并對除草劑有抗性的原卟啉原氧化酶。實(shí)施例26抗性突變對各種原卟啉原氧化酶抑制化合物的交叉耐受性選出對單一除草劑抗性的抗性突變質(zhì)粒進(jìn)行對其他原卟啉原氧化酶抑制化合物抗性譜的測試，包含野生型質(zhì)粒的SAS×38株接種到有一個(gè)濃度范圍的各種化合物上以測定各化合物的致死濃度。接種SAS×38的抗性突變質(zhì)粒，并在含有至少10倍包含野生型質(zhì)粒SAS×38株致死濃度的各種化合物上存活。
交叉耐受測試結(jié)果表明鑒定的突變體對各種原卟啉原氧化酶抑制型化合物有抗性。具體的說，結(jié)果表明1)AraC1-Val突變提供的原卟啉原氧化酶抗性包括但不限于此具有結(jié)構(gòu)式IV，XI，XIII，XIV和XVII的化合物。2)AraC-2Cys突變提供對原卟啉原氧化酶抑制劑抗性包括，但不僅限于對具結(jié)構(gòu)式XI，XIII，XV和XVII的化合物有抗性。3)MzC-1Val突變體提供對原卟啉原氧化酶抑制劑抗性包括，但不僅限于對具結(jié)構(gòu)式XI，XII，XIII，XIV，XV，XVI和XVII的化合物有抗性。4)AraC-3Ser突變提供對原卟啉原氧化酶抑制劑抗性包括但不僅限于對具結(jié)構(gòu)式IV，XII，XIII，XIV，XV和XVII的化合物有抗性。實(shí)施例27通過過度表達(dá)植物原卟啉原氧化酶基因產(chǎn)生除草劑耐受性植物來自野生型和抗性突變AraC-1Val基因的擬南芥Protox-1編碼序列用EcoR1和Xho1部分消化而切出并克隆到植物表達(dá)質(zhì)粒pCGN1761ENX上，這個(gè)包含兩份35S-原卟啉原氧化酶基因融合區(qū)域的表達(dá)框用Xba1酶切出后克隆到雙向載體pCIB200中。這個(gè)雙向原卟啉原氧化酶質(zhì)粒用電穿孔轉(zhuǎn)化到土壤桿菌，再用真空過濾法(Bechtold等人，1993)轉(zhuǎn)化入擬南芥。轉(zhuǎn)化物在卡那霉素上選擇，T2種子從一些獨(dú)立株系上產(chǎn)生。這些種子接種到含有各種濃度原卟啉原氧化酶抑制型除草劑的GM培養(yǎng)基上并測定發(fā)芽和存活。過表達(dá)野生型或抗性突變原卟啉原氧化酶多轉(zhuǎn)基因系在對空載體對照是致死的除草劑濃度下產(chǎn)生大量綠色幼苗。
本文描述的本發(fā)明的多種修改對本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是顯而易見的。這些修改應(yīng)在所附權(quán)利要求的范圍內(nèi)。
序列描述(1)一般信息(i)申請人(A)姓名CIBA-GEIGY AG(B)街道Klybeckstr.141(C)城市Basel(E)國家瑞士(F)郵政編碼(ZIP)4002(G)電話+41 61 69 11 11(H)傳真+41 61 696 79 76(I)電報(bào)962,991(ii)發(fā)明的題目真核生物中原卟啉原氧化酶活力的操作。(iii)序列的數(shù)目20(iv)計(jì)算計(jì)可讀形式(A)媒介類型軟盤(B)計(jì)算機(jī)IBM PC兼容機(jī)(C)操作系統(tǒng)PC-DOS/MS-DOS(D)軟件Patent In Release #1.0，Version # 1.25(EPO)(2)SEQ ID NO1的信息(i)序列特征(A)長度1719堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ii)分子類型cDNA(iii)假設(shè)無(iv)反義無(ix)特征(A)名稱/鍵CDS(B)位置31..1644
(D)其他信息/注＝“擬南芥的原卟啉原氧化酶-1cDNA；序列來自pWDC-2”(xi)序列描述SEQ ID NO1TGACAAAATT CCGAATTCTC TGCGATTTCC ATG GAG TTA TCT CTT CTC CGT CCG54Met Glu Leu Ser Leu Leu Arg Pro1 5ACG ACT CAA TCG CTT CTT CCG TCG TTT TCG AAG CCC AAT CTC CGA TTA102Thr Thr Gln Ser Leu Leu Pro Ser Phe Ser Lys Pro Asn Leu Arg Leu10 15 20AAT GTT TAT AAG CCT CTT AGA CTC CGT TGT TCA GTG GCC GGT GGA CCA150Asn Val Tyr Lys Pro Leu Arg Leu Arg Cys Ser Val Ala Gly Gly Pro25 30 35 40ACC GTC GGA TCT TCA AAA ATC GAA GGC GGA GGA GGC ACC ACC ATC ACG198Thr Val Gly Ser Ser Lys Ile Glu Gly Gly Gly Gly Thr Thr Ile Thr45 50 55ACG GAT TGT GTG ATT GTC GGC GGA GGT ATT AGT GGT CTT TGC ATC GCT246Thr Asp Cys Val Ile Val Gly Gly Gly Ile Ser Gly Leu Cys Ile Ala60 65 70CAG GCG CTT GCT ACT AAG CAT CCT GAT GCT GCT CCG AAT TTA ATT GTG294Gln Ala Leu Ala Thr Lys His Pro Asp Ala Ala Pro Asn Leu Ile Val75 80 85ACC GAG GCT AAG GAT CGT GTT GGA GGC AAC ATT ATC ACT CGT GAA GAG342Thr Glu Ala Lys Asp Arg Val Gly Gly Asn Ile Ile Thr Arg Glu Glu90 95 100AAT GGT TTT CTC TGG GAA GAA GGT CCC AAT AGT TTT CAA CCG TCT GAT390Asn Gly Phe Leu Trp Glu Glu Gly Pro Asn Ser Phe Gln Pro Ser Asp105 110 115 120CCT ATG CTC ACT ATG GTG GTA GAT AGT GGT TTG AAG GAT GAT TTG GTG438Pro Met Leu Thr Met Val Val Asp Ser Gly Leu Lys Asp Asp Leu Val125 130 135TTG GGA GAT CCT ACT GCG CCA AGG TTT GTG TTG TGG AAT GGG AAA TTG486Leu Gly Asp Pro Thr Ala Pro Arg Phe Val Leu Trp Asn Gly Lys Leu140 145 150AGG CCG GTT CCA TCG AAG CTA ACA GAC TTA CCG TTC TTT GAT TTG ATG534Arg Pro Val Pro Ser Lys Leu Thr Asp Leu Pro Phe Phe Asp Leu Met155 160 165AGT ATT GGT GGG AAG ATT AGA GCT GGT TTT GGT GCA CTT GGC ATT CGA582Ser Ile Gly Gly Lys Ile Arg Ala Gly Phe Gly Ala Leu Gly Ile Arg170 175 180CCG TCA CCT CCA GGT CGT GAA GAA TCT GTG GAG GAG TTT GTA CGG CGT630Pro Ser Pro Pro Gly Arg Glu Glu Ser Val Glu Glu Phe Val Arg Arg185 190 195 200AAC CTC GGT GAT GAG GTT TTT GAG CGC CTG ATT GAA CCG TTT TGT TCA 678Asn Leu Gly Asp Glu Val Phe Glu Arg Leu Ile Glu Pro Phe Cys Ser205 210 215GGT GTT TAT GCT GGT GAT CCT TCA AAA CTG AGC ATG AAA GCA GCG TTT 726Gly Val Tyr Ala Gly Asp Pro Ser Lys Leu Ser Met Lys Ala Ala Phe220 225 230GGG AAG GTT TGG AAA CTA GAG CAA AAT GGT GGA AGC ATA ATA GGT GGT 774Gly Lys Val Trp Lys Leu Glu Gln Asn Gly Gly Ser Ile Ile Gly Gly235 240 245ACT TTT AAG GCA ATT CAG GAG AGG AAA AAC GCT CCC AAG GCA GAA CGA 822Thr Phe Lys Ala Ile Gln Glu Arg Lys Asn Ala Pro Lys Ala Glu Arg250 255 260GAC CCG CGC CTG CCA AAA CCA CAG GGC CAA ACA GTT GGT TCT TTC AGG 870Asp Pro Arg Leu Pro Lys Pro Gln Gly Gln Thr Val Gly Ser Phe Arg265 270 275 280AAG GGA CTT CGA ATG TTG CCA GAA GCA ATA TCT GCA AGA TTA GGT AGC 918Lys Gly Leu Arg Met Leu Pro Glu Ala Ile Ser Ala Arg Leu Gly Ser285 290 295AAA GTT AAG TTG TCT TGG AAG CTC TCA GGT ATC ACT AAG CTG GAG AGC 966Lys Val Lys Leu Ser Trp Lys Leu Ser Gly Ile Thr Lys Leu Glu Ser300 305 310GGA GGA TAC AAC TTA ACA TAT GAG ACT CCA GAT GGT TTA GTT TCC GTG 1014Gly Gly Tyr Asn Leu Thr Tyr Glu Thr Pro Asp Gly Leu Val Ser Val315 320 325CAG AGC AAA AGT GTT GTA ATG ACG GTG CCA TCT CAT GTT GCA AGT GGT 1062Gln Ser Lys Ser Val Val Met Thr Val Pro Ser His Val Ala Ser Gly330 335 340CTC TTG CGC CCT CTT TCT GAA TCT GCT GCA AAT GCA CTC TCA AAA CTA 1110Leu Leu Arg Pro Leu Ser Glu Ser Ala Ala Asn Ala Leu Ser Lys Leu345 350 355 360TAT TAC CCA CCA GTT GCA GCA GTA TCT ATC TCG TAC CCG AAA GAA GCA 1158Tyr Tyr Pro Pro Val Ala Ala Val Ser Ile Ser Tyr Pro Lys Glu Ala365 370 375ATC CGA ACA GAA TGT TTG ATA GAT GGT GAA CTA AAG GGT TTT GGG CAA 1206Ile Arg Thr Glu Cys Leu Ile Asp Gly Glu Leu Lys Gly Phe Gly Gln380 385 390TTG CAT CCA CGC ACG CAA GGA GTT GAA ACA TTA GGA ACT ATC TAC AGC 1254Leu His Pro Arg Thr Gln Gly Val Glu Thr Leu Gly Thr Ile Tyr Ser395 400 405TCC TCA CTC TTT CCA AAT CGC GCA CCG CCC GGA AGA ATT TTG CTG TTG 1302Ser Ser Leu Phe Pro Asn Arg Ala Pro Pro Gly Arg Ile Leu Leu Leu410 415 420AAC TAC ATT GGC GGG TCT ACA AAC ACC GGA ATT CTG TCC AAG TCT GAA 1350Asn Tyr Ile Gly Gly Ser Thr Asn Thr Gly Ile Leu Ser Lys Ser Glu425 430 435 440GGT GAG TTA GTG GAA GCA GTT GAC AGA GAT TTG AGG AAA ATG CTA ATT 1398Gly Glu Leu Val Glu Ala Val Asp Arg Asp Leu Arg Lys Met Leu Ile445 450 455AAG CCT AAT TCG ACC GAT CCA CTT AAA TTA GGA GTT AGG GTA TGG CCT 1446Lys Pro Asn Ser Thr Asp Pro Leu Lys Leu Gly Val Arg Val Trp Pro460 465 470CAA GCC ATT CCT CAG TTT CTA GTT GGT CAC TTT GAT ATC CTT GAC ACG 1494Gln Ala Ile Pro Gln Phe Leu Val Gly His Phe Asp Ile Leu Asp Thr475 480 485GCT AAA TCA TCT CTA ACG TCT TCG GGC TAC GAA GGG CTA TTT TTG GGT 1542Ala Lys Ser Ser Leu Thr Ser Ser Gly Tyr Glu Gly Leu Phe Leu Gly490 495 500GGC AAT TAC GTC GCT GGT GTA GCC TTA GGC CGG TGT GTA GAA GGC GCA 1590Gly Asn Tyr Val Ala Gly Val Ala Leu Gly Arg Cys Val Glu Gly Ala505 510 515 520TAT GAA ACC GCG ATT GAG GTC AAC AAC TTC ATG TCA CGG TAC GCT TAC 1638Tyr Glu Thr Ala Ile Glu Val Asn Asn Phe Met Ser Arg Tyr Ala Tyr525 530 535AAG TAAATGTAAA ACATTAAATC TCCCAGCTTG CGTGAGTTTT ATTAAATATT 1691LysTTGAGATATC CAAAAAAAAA AAAAAAAA 1719(2)SEQ ID NO2的信息(i)序列特征(A)長度537個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(xi)序列描述SEQ ID NO2Met Glu Leu Ser Leu Leu Arg Pro Thr Thr Gln Ser Leu Leu Pro Ser1 5 10 15Phe Ser Lys Pro Asn Leu Arg Leu Asn Val Tyr Lys Pro Leu Arg Leu20 25 30Arg Cys Ser Val Ala Gly Gly Pro Thr Val Gly Ser Ser Lys Ile Glu35 40 45Gly Gly Gly Gly Thr Thr Ile Thr Thr Asp Cys Val Ile Val Gly Gly50 55 60Gly Ile Ser Gly Leu Cys Ile Ala Gln Ala Leu Ala Thr Lys His Pro65 70 75 80Asp Ala Ala Pro Asn Leu Ile Val Thr Glu Ala Lys Asp Arg Val Gly85 90 95Gly Asn Ile Ile Thr Arg Glu Glu Asn Gly Phe Leu Trp Glu Glu Gly100 105 110Pro Asn Ser Phe Gln Pro Ser Asp Pro Met Leu Thr Met Val Val Asp115 120 125Ser Gly Leu Lys Asp Asp Leu Val Leu Gly Asp Pro Thr Ala Pro Arg130 135 140Phe Val Leu Trp Asn Gly Lys Leu Arg Pro Val Pro Ser Lys Leu Thr145 150 155 160Asp Leu Pro Phe Phe Asp Leu Met Ser Ile Gly Gly Lys Ile Arg Ala165 170 175Gly Phe Gly Ala Leu Gly Ile Arg Pro Ser Pro Pro Gly Arg Glu Glu180 185 190Ser Val Glu Glu Phe Val Arg Arg Asn Leu Gly Asp Glu Val Phe Glu195 200 205Arg Leu Ile Glu Pro Phe Cys Ser Gly Val Tyr Ala Gly Asp Pro Ser210 215 220Lys Leu Ser Met Lys Ala Ala Phe Gly Lys Val Trp Lys Leu Glu Gln225 230 235 240Asn Gly Gly Ser Ile Ile Gly Gly Thr Phe Lys Ala Ile Gln Glu Arg245 250 255Lys Asn Ala Pro Lys Ala Glu Arg Asp Pro Arg Leu Pro Lys Pro Gln260 265 270Gly Gln Thr Val Gly Ser Phe Arg Lys Gly Leu Arg Met Leu Pro Glu275 280 285Ala Ile Ser Ala Arg Leu Gly Ser Lys Val Lys Leu Ser Trp Lys Leu290 295 300Ser Gly Ile Thr Lys Leu Glu Ser Gly Gly Tyr Asn Leu Thr Tyr Glu305 310 315 320Thr Pro Asp Gly Leu Val Ser Val Gln Ser Lys Ser Val Val Met Thr325 330 335Val Pro Ser His Val Ala Ser Gly Leu Leu Arg Pro Leu Ser Glu Ser340 345 350Ala Ala Asn Ala Leu Ser Lys Leu Tyr Tyr Pro Pro Val Ala Ala Val355 360 365Ser Ile Ser Tyr Pro Lys Glu Ala Ile Arg Thr Glu Cys Leu Ile Asp370 375 380Gly Glu Leu Lys Gly Phe Gly Gln Leu His Pro Arg Thr Gln Gly Val385 390 395 400Glu Thr Leu Gly Thr Ile Tyr Ser Ser Ser Leu Phe Pro Asn Arg Ala405 410 415Pro Pro Gly Arg Ile Leu Leu Leu Asn Tyr Ile Gly Gly Ser Thr Asn420 425 430Thr Gly Ile Leu Ser Lys Ser Glu Gly Glu Leu Val Glu Ala Val Asp435 440 445Arg Asp Leu Arg Lys Met Leu Ile Lys Pro Asn Ser Thr Asp Pro Leu450 455 460Lys Leu Gly Val Arg Val Trp Pro Gln Ala Ile Pro Gln Phe Leu Val465 470 475 480Gly His Phe Asp Ile Leu Asp Thr Ala Lys Ser Ser Leu Thr Ser Ser485 490 495Gly Tyr Glu Gly Leu Phe Leu Gly Gly Asn Tyr Val Ala Gly Val Ala500 505 510Leu Gly Arg Cys Val Glu Gly Ala Tyr Glu Thr Ala Ile Glu Val Asn515 520 525Asn Phe Met Ser Arg Tyr Ala Tyr Lys530 535(2)SEQ ID NO3的信息(i)序列特征(A)長度1738堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ii)分子類型CDNA(iii)假設(shè)無(iv)反義無(ix)特征(A)名稱/鍵CDS(B)位置70..1596(D)其他信息/注＝“擬南芥的原卟啉原氧化酶-2CDNA；序列來自pWDC-1”(xi)序列描述SEQ ID NO3TTTTTTACTT ATTTCCGTCA CTGCTTTCGA CTGGTCAGAG ATTTTGACTC TGAATTGTTG 60CAGATAGCA ATG GCG TCT GGA GCA GTA GCA GAT CAT CAA ATT GAA GCG 108Met Ala Ser Gly Ala Val Ala Asp His Gln Ile Glu Ala1 5 10GTT TCA GGA AAA AGA GTC GCA GTC GTA GGT GCA GGT GTA AGT GGA CTT 156Val Ser Gly Lys Arg Val Ala Val Val Gly Ala Gly Val Ser Gly Leu15 20 25GCG GCG GCT TAC AAG TTG AAA TCG AGG GGT TTG AAT GTG ACT GTG TTT 204Ala Ala Ala Tyr Lys Leu Lys Ser Arg Gly Leu Asn Val Thr Val Phe30 35 40 45GAA GCT GAT GGA AGA GTA GGT GGG AAG TTG AGA AGT GTT ATG CAA AAT 252Glu Ala Asp Gly Arg Val Gly Gly Lys Leu Arg Ser Val Met Gln Asn50 55 60GGT TTG ATT TGG GAT GAA GGA GCA AAC ACC ATG ACT GAG GCT GAG CCA 300Gly Leu Ile Trp Asp Glu Gly Ala Asn Thr Met Thr Glu Ala Glu Pro65 70 75GAA GTT GGG AGT TTA CTT GAT GAT CTT GGG CTT CGT GAG AAA CAA CAA 348Glu Val Gly Ser Leu Leu Asp Asp Leu Gly Leu Arg Glu Lys Gln Gln80 85 90TTT CCA ATT TCA CAG AAA AAG CGG TAT ATT GTG CGG AAT GGT GTA CCT 396Phe Pro Ile Ser Gln Lys Lys Arg Tyr Ile Val Arg Asn Gly Val Pro95 100 105GTG ATG CTA CCT ACC AAT CCC ATA GAG CTG GTC ACA AGT AGT GTG CTC 444Val Met Leu Pro Thr Asn Pro Ile Glu Leu Val Thr Ser Ser Val Leu110 115 120 125TCT ACC CAA TCT AAG TTT CAA ATC TTG TTG GAA CCA TTT TTA TGG AAG 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GAT GGA GTT CCT GCA CTA GGC AGG TGG TCA ATT 1020Leu Ala Cys Thr Phe Asp Gly Val Pro Ala Leu Gly Arg Trp Ser Ile305 310 315TCT GTT GAT TCG AAG GAT AGC GGT GAC AAG GAC CTT GCT AGT AAC CAA 1068Ser Val Asp Ser Lys Asp Ser Gly Asp Lys Asp Leu Ala Ser Asn Gln320 325 330 335ACC TTT GAT GCT GTT ATA ATG ACA GCT CCA TTG TCA AAT GTC CGG AGG 1116Thr Phe Asp Ala Val Ile Met Thr Ala Pro Leu Ser Asn Val Arg Arg340 345 350ATG AAG TTC ACC AAA GGT GGA GCT CCG GTT GTT CTT GAC TTT CTT CCT 1164Met Lys Phe Thr Lys Gly Gly Ala Pro Val Val Leu Asp Phe Leu Pro355 360 365AAG ATG GAT TAT CTA CCA CTA TCT CTC ATG GTG ACT GCT TTT AAG AAG 1212Lys Met Asp Tyr Leu Pro Leu Ser Leu Met Val Thr Ala Phe Lys Lys370 375 380GAT GAT GTC AAG AAA CCT CTG GAA GGA TTT GGG GTC TTA ATA CCT TAC 1260Asp Asp Val Lys Lys Pro Leu Glu Gly Phe Gly Val Leu Ile Pro Tyr385 390 395AAG GAA CAG CAA AAA CAT GGT CTG AAA ACC CTT GGG ACT CTC TTT TCC 1308Lys Glu Gln Gln Lys His Gly Leu Lys Thr Leu Gly Thr Leu Phe Ser400 405 410 415TCA ATG ATG TTC 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TCA TAT CTT GAA TCT CAC ACC AAG CAT AAT AAT TCA 1692Asp Leu Ala Ile Ser Tyr Leu Glu Ser His Thr Lys His Asn Asn Ser530 535 540CAT TGAAAGTGTC TGACCTATCC TCTAGCAGTT GTCGACAAAT TTCTCCAGTT 1745His545CATGTACAGT AGAAACCGAT GCGTTGCAGT TTCAGAACAT CTTCACTTCT TCAGATATTA1805ACCCTTCGTT GAACATCCAC CAGAAAGGTA GTCACATGTG TAAGTGGGAA AATGAGGTTA1865AAAACTATTA TGGCGGCCGA AATGTTCCTT TTTGTTTTCC TCACAAGTGG CCTACGACAC1925TTGATGTTGG AAATACATTT AAATTTGTTG AATTGTTTGA GAACACATGC GTGACGTGTA1985ATATTTGCCT ATTGTGATTT TAGCAGTAGT CTTGGCCAGA TTATGCTTTA CGCCTTTAAA2045AAAAAAAAAA AAAAAA2061(2)SEQ ID NO8的信息(i)序列特征(A)長度544個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(xi)序列描述SEQ ID NO8Met Leu Ala Leu Thr Ala Ser Ala Ser Ser Ala Ser Ser His Pro Tyr1 5 10 15Arg His Ala Ser Ala His Thr Arg Arg Pro Arg Leu Arg Ala Val Ieu20 25 30Ala Met Ala Gly Ser Asp Asp Pro Arg Ala Ala Pro Ala Arg Ser Val35 40 45Ala Val Val Gly Ala Gly Val Ser Gly Leu Ala Ala Ala Tyr Arg Leu50 55 60Arg Gln Ser Gly Val Asn Val Thr Val Phe Glu Ala Ala Asp Arg Ala65 70 75 80Gly Gly Lys Ile Arg Thr Asn Ser Glu Gly Gly Phe Val Trp Asp Glu85 90 95Gly Ala Asn Thr Met Thr Glu Gly Glu Trp Glu Ala Ser Arg Leu Ile100 105 110Asp Asp Leu Gly Leu Gln Asp Lys Gln Gln Tyr Pro Asn Ser Gln His115 120 125Lys Arg Tyr Ile Val Lys Asp Gly Ala Pro Ala Leu Ile Pro Ser Asp130 135 140Pro Ile Ser Leu Met Lys Ser Ser Val Leu Ser Thr Lys Ser Lys Ile145 150 155 160Ala Leu Phe Phe Glu Pro Phe Leu Tyr Lys Lys Ala Asn Thr Arg Asn165 170 175Ser Gly Lys Val Ser Glu Glu His Leu Ser Glu Ser Val Gly Ser Phe180 185 190Cys Glu Arg His Phe Gly Arg Glu Val Val Asp Tyr Phe Val Asp Pro195 200 205Phe Val Ala Gly Thr Ser Ala Gly Asp Pro Glu Ser Leu Ser Ile Arg210 215 220His Ala Phe Pro Ala Leu Trp Asn Leu Glu Arg Lys Tyr Gly Ser Val225 230 235 240Val Asp Ser Lys Asp Ser Gly Asp Lys Asp Leu Ala Ser Asn Gln Thr325 330 335Phe Asp Ala Val Ile Met Thr Ala Pro Leu Ser Asn Val Arg Arg Met340 345 350Lys Phe Thr Lys Gly Gly Ala Pro Val Val Leu Asp Phe Leu Pro Lys355 360 365Met Asp Tyr Leu Pro Leu Ser Leu Met Val Thr Ala Phe Lys Lys Asp370 375 380Asp Val Lys Lys Pro Leu Glu Gly Phe Gly Val Leu Ile Pro Tyr Lys385 390 395 400Glu Gln Gln Lys His Gly Leu Lys Thr Leu Gly Thr Leu Phe Ser Ser405 410 415Met Met Phe Pro Asp Arg Ala Pro Asp Asp Gln Tyr Leu Tyr Thr Thr420 425 430Phe Val Gly Gly Ser His Asn Arg Asp Leu Ala Gly Ala Pro Thr Ser435 440 445Ile Leu Lys Gln Leu Val Thr Ser Asp Leu Lys Lys Leu Leu Gly Val450 455 460Glu Gly Gln Pro Thr Phe Val Lys His Val Tyr Trp Gly Asn Ala Phe465 470 475 480Pro Leu Tyr Gly His Asp Tyr Ser Ser Val Leu Glu Ala Ile Glu Lys485 490 495Met Glu Lys Asn Leu Pro Gly Phe Phe Tyr Ala Gly Asn Ser Lys Asp500 505 510Gly Leu Ala Val Gly Ser Val Ile Ala Ser Gly Ser Lys Ala Ala Asp515 520 525Leu Ala Ile Ser Tyr Leu Glu Ser His Thr Lys His Asn Asn Ser His530 535 540Ile Val Gly Ala Ile Leu Ser Lys Leu Ala Ala Lys Gly Asp Pro Val245 250 255Lys Thr Arg His Asp Ser Ser Gly Lys Arg Arg Asn Arg Arg Val Ser260 265 270Phe Ser Phe His Gly Gly Met Gln Ser Leu Ile Asn Ala Leu His Asn275 280 285Glu Val Gly Asp Asp Asn Val Lys Leu Gly Thr Glu Val Leu Ser Leu290 295 300Ala Cys Thr Phe Asp Gly Val Pro Ala Leu Gly Arg Trp Ser Ile Ser305 310 315 320(2)SEQ ID NO9的信息(i)序列特征(A)長度1697個(gè)堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ii)分子類型cDNA(iii)假設(shè)無(iv)反義無(ix)特點(diǎn)(A)名稱/鍵CDS(B)位置29..1501(D)其他信息/注＝“酵母原卟啉原氧化酶-3cDNA；序列來自pWDC-5”(xi)序列描述SEQ ID NO9TTGGCATTTG CCTTGGAACCA ACAATTCT ATG TCA ATT GCA ATT TGT GGA GGA52Met Ser Ile Ala Ile Cys Gly Gly1 5GGT ATA GCT GGT CTT AGT ACA GCA TTT TAT CTT GCT AGA TTG ATT CCA 100Gly Ile Ala Gly Leu Ser Thr Ala Phe Tyr Leu Ala Arg Leu Ile Pro10 15 20AAA TGT ACT ATT GAT TTG TAC GAA AAA GGT CCT CGT TTA GGT GGA TGG 148Lys Cys Thr Ile Asp Leu Tyr Glu Lys Gly Pro Arg Leu Gly Gly Trp25 30 35 40CTT CAG TCG GTC AAA ATC CCG TGT GCA GAT TCT CCA ACA GGA ACG GTT 196Leu Gln Ser Val Lys Ile Pro Cys Ala Asp Ser Pro Thr Gly Thr Val45 50 55TTG TTT GAG CAA GGT CCT AGA ACT CTT CGT CCT GCT GGG GTT GCT GGC 244Leu Phe Glu Gln Gly Pro Arg Thr Leu Arg Pro Ala Gly Val Ala Gly60 65 70TTA GCA AAC TTA GAT TTA ATT AGC AAG TTG GGC ATC GAA GAC AAG TTG 292Leu Ala Asn Leu Asp Leu Ile Ser Lys Leu Gly Ile Glu Asp Lys Leu75 80 85TTA AGG ATT TCG AGC AAT TCT CCC AGC GCA AAA AAC CGA TAT ATT TAT 340Leu Arg Ile Ser Ser Asn Ser Pro Ser Ala Lys Asn Arg Tyr Ile Tyr90 95 100TAC CCA GAT CGC TTA AAT GAA ATT CCT TCA AGC ATT TTA GGG AGT ATA 388Tyr Pro Asp Arg Leu Asn Glu Ile Pro Ser Ser Ile Leu Gly Ser Ile105 110 115 120AAG TCG ATT ATG CAG CCT GCT TTG CGT CCG ATG CCT TTG GCT ATG ATG 436Lys Ser Ile Met Gln Pro Ala Leu Arg Pro Met Pro Leu Ala Met Met125 130 135CTT GAG CCC TTT CGT AAA AGT AAG CGA GAT TCG ACA GAT GAA AGC GTG 484Leu Glu Pro Phe Arg Lys Ser Lys Arg Asp Ser Thr Asp Glu Ser Val140 145 150GGT TCA TTT ATG AGA AGA AGA TTT GGT AAA AAC GTT ACG GAT AGA GTT 532Gly Ser Phe Met Arg Arg Arg Phe Gly Lys Asn Val Thr Asp Arg Val155 160 165ATG AGT GCA ATG ATA AAT GGT ATT TAT GCT GGT GAT TTG AAT GAT TTG 580Met Ser Ala Met Ile Asn Gly Ile Tyr Ala Gly Asp Leu Asn Asp Leu170 175 180TCT ATG CAT TCT AGC ATG TTT GGA TTT TTA GCG AAG ATT GAA AAA AAG 628Ser Met His Ser Ser Met Phe Gly Phe Leu Ala Lys Ile Glu Lys Lys185 190 195 200TAT GGA AAC ATT ACT TTG GGA TTA ATT AGA GCT CTT CTT GCA CGT GAA 676Tyr Gly Asn Ile Thr Leu Gly Leu Ile Arg Ala Leu Leu Ala Arg Glu205 210 215ATA TTA TCT CCT GCT GAG AAA GCT TTG GAA AGC AGC ACT ACT CGC AGA 724Ile Leu Ser Pro Ala Glu Lys Ala Leu Glu Ser Ser Thr Thr Arg Arg220 225 230GCC AAA AAC AGC AGA GCT GTC AAA CAG TAT GAA ATC GAC AAG TAT GTT 772Ala Lys Asn Ser Arg Ala Val Lys Gln Tyr Glu Ile Asp Lys Tyr Val235 240 245GCT TTC AAG GAA GGG ATT GAG ACT ATT ACA TTG TCA ATA GCA GAT GAA 820Ala Phe Lys Glu Gly Ile Glu Thr Ile Thr Leu Ser Ile Ala Asp Glu250 255 260TTA AAA AAA ATG CCG AAT GTC AAG ATA CAT CTA AAC AAA CCG GCC CAA 868Leu Lys Lys Met Pro Asn Val Lys Ile His Leu Asn Lys Pro Ala Gln265 270 275 280ACT TTG GTT CCA CAT AAA ACT CAG TCT CTT GTA GAC GTC AAT GGT CAA 916Thr Leu Val Pro His Lys Thr Gln Ser Leu Val Asp Val Asn Gly Gln285 290 295GCT TAC GAG TAT GTT GTG TTT GCA AAC TCT TCT CGC AAT TTA GAG AAT 964Ala Tyr Glu Tyr Val Val Phe Ala Asn Ser Ser Arg Asn Leu Glu Asn300 305 310CTA ATA TCT TGT CCT AAA ATG GAA ACT CCG ACG TCG AGT GTT TAT GTC 1012Leu Ile Ser Cys Pro Lys Met Glu Thr Pro Thr Ser Ser Val Tyr Val315 320 325GTC AAC GTT TAT TAT AAG GAC CCT AAT GTT CTT CCA ATC CGT GGT TTT 1060Val Asn Val Tyr Tyr Lys Asp Pro Asn Val Leu Pro Ile Arg Gly Phe
330 335 340GGG CTT TTG ATT CCA TCA TGC ACT CCA AAT AAT CCG AAT CAT GTT CTT 1108Gly Leu Leu Ile Pro Ser Cys Thr Pro Asn Asn Pro Asn His Val Leu345 350 355 360GGT ATC GTT TTT GAT AGT GAG CAA AAC AAC CCT GAA AAT GGA AGC AAG 1156Gly Ile Val Phe Asp Ser Glu Gln Asn Asn Pro Glu Asn Gly Ser Lys365 370 375GTC ACT GTC ATG ATG GGA GGG TCT GCT TAT ACA AAA AAT ACT TCT TTG 1204Val Thr Val Met Met Gly Gly Ser Ala Tyr Thr Lys Asn Thr Ser Leu380 385 390ATT CCA ACC AAC CCC GAA GAA GCC GTT AAC AAT GCT CTC AAA GCT TTG 1252Ile Pro Thr Asn Pro Glu Glu Ala Val Asn Asn Ala Leu Lys Ala Leu395 400 405CAG CAT ACT TTA AAA ATA TCC AGT AAG CCA ACA CTC ACG AAT GCA ACA 1300Gln His Thr Leu Lys Ile Ser Ser Lys Pro Thr Leu Thr Asn Ala Thr410 415 420TTA CAA CCA AAT TGC ATC CCT CAA TAT CGT GTT GGG CAT CAA GAT AAT 1348Leu Gln Pro Asn Cys Ile Pro Gln Tyr Arg Val Gly His Gln Asp Asn425 430 435 440CTT AAT TCT TTG AAA TCT TGG ATT GAG AAA AAT ATG GGA GGG CGA ATT 1396Leu Asn Ser Leu Lys Ser Trp Ile Glu Lys Asn Met Gly Gly Arg Ile445 450 455CTT CTA ACT GGA AGT TGG TAT AAT GGT GTT AGT ATT GGG GAT TGT ATT 1444Leu Leu Thr Gly Ser Trp Tyr Asn Gly Val Ser Ile Gly Asp Cys Ile460 465 470ATG AAT GGA CAT TCA ACA GCT CGA AAA CTA GCA TCA TTG ATG AAT TCT 1492Met Asn Gly His Ser Thr Ala Arg Lys Leu Ala Ser Leu Met Asn Ser475 480 485TCT TCT TGAGCGTTTA TAAATGTTGA TATAAAATTA GTATATAGTT CCTTTGATTA 1548Ser Ser490TTTTATGAGT TGAAAATGCC ACTTGTGAAA TAATTTTGCA CAAGCCCTTT TATTACAGAC1608GTATATGCGA GGACATTCGA CAAACGTTTG AAATTAAAAA TCATATGCCT TTTAGCTTAA1668GACATCAAGG TCATGAATAA TAAAATTTT 1697(2)SEQ ID NO10的信息(i)序列特征(A)長度490氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(xi)序列描述SEQ ID NO10Met Ser Ile Ala Ile Cys Gly Gly Gly Ile Ala Gly Leu Ser Thr Ala1 5 10 15Phe Tyr Leu Ala Arg Leu Ile Pro Lys Cys Thr Ile Asp Leu Tyr Glu20 25 30Lys Gly Pro Arg Leu Gly Gly Trp Leu Gln Ser Val Lys Ile Pro Cys35 40 45Ala Asp Ser Pro Thr Gly Thr Val Leu Phe Glu Gln Gly Pro Arg Thr50 55 60Leu Arg Pro Ala Gly Val Ala Gly Leu Ala Asn Leu Asp Leu Ile Ser65 70 75 80Lys Leu Gly Ile Glu Asp Lys Leu Leu Arg Ile Ser Ser Asn Ser Pro85 90 95Ser Ala Lys Asn Arg Tyr Ile Tyr Tyr Pro Asp Arg Leu Asn Glu Ile100 105 110Pro Ser Ser Ile Leu Gly Ser Ile Lys Ser Ile Met Gln Pro Ala Leu115 120 125Arg Pro Met Pro Leu Ala Met Met Leu Glu Pro Phe Arg Lys Ser Lys130 135 140Arg Asp Ser Thr Asp Glu Ser Val Gly Ser Phe Met Arg Arg Arg Phe145 150 155 160Gly Lys Asn Val Thr Asp Arg Val Met Ser Ala Met Ile Asn Gly Ile165 170 175Tyr Ala Gly Asp Leu Asn Asp Leu Ser Met His Ser Ser Met Phe Gly180 185 190Phe Leu Ala Lys Ile Glu Lys Lys Tyr Gly Asn Ile Thr Leu Gly Leu195 200 205Ile Arg Ala Leu Leu Ala Arg Glu Ile Leu Ser Pro Ala Glu Lys Ala210 215 220Leu Glu Ser Ser Thr Thr Arg Arg Ala Lys Asn Ser Arg Ala Val Lys225 230 235 240Gln Tyr Glu Ile Asp Lys Tyr Val Ala Phe Lys Glu Gly Ile Glu Thr245 250 255Ile Thr Leu Ser Ile Ala Asp Glu Leu Lys Lys Met Pro Asn Val Lys260 265 270Ile His Leu Asn Lys Pro Ala Gln Thr Leu Val Pro His Lys Thr Gln275 280 285Ser Leu Val Asp Val Asn Gly Gln Ala Tyr Glu Tyr Val Val Phe Ala290 295 300Asn Ser Ser Arg Asn Leu Glu Asn Leu Ile Ser Cys Pro Lys Met Glu305 310 315 320Thr Pro Thr Ser Ser Val Tyr Val Val Asn Val Tyr Tyr Lys Asp Pro325 330 335Asn Val Leu Pro Ile Arg Gly Phe Gly Leu Leu Ile Pro Ser Cys Thr340 345 350Pro Asn Asn Pro Asn His Val Leu Gly Ile Val Phe Asp Ser Glu Gln355 360 365Asn Asn Pro Glu Asn Gly Ser Lys Val Thr Val Met Met Gly Gly Ser370 375 380Ala Tyr Thr Lys Asn Thr Ser Leu Ile Pro Thr Asn Pro Glu Glu Ala385 390 395 400Val Asn Asn Ala Leu Lys Ala Leu Gln His Thr Leu Lys Ile Ser Ser405 410 415Lys Pro Thr Leu Thr Asn Ala Thr Leu Gln Pro Asn Cys Ile Pro Gln420 425 430Tyr Arg Val Gly His Gln Asp Asn Leu Asn Ser Leu Lys Ser Trp Ile435 440 445Glu Lys Asn Met Gly Gly Arg Ile Leu Leu Thr Gly Ser Trp Tyr Asn450 455 460Gly Val Ser Ile Gly Asp Cys Ile Met Asn Gly His Ser Thr Ala Arg465 470 475 480Lys Leu Ala Ser Leu Met Asn Ser Ser Ser485 490(2)SEQ ID NO11的信息(i)序列特征(A)長度41堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ii)分子類型其他核酸(A)說明用于構(gòu)建pCGN1761ENX的寡聚核苷酸(iii)假設(shè)無(iv)反義無(xi)序列描述SEQ ID NO11AATTATGACG TAACGTAGGA ATTAGCGGCC CGCTCTCGAG T 41(2)SEQ ID NO12的信息(i)序列特征(A)長度40個(gè)堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ii)分子類型其他核酸(A)說明用于構(gòu)建pCGN1761ENX的寡聚核苷酸(iii)假設(shè)無(iv)反義無(xi)序列描述SEQ ID NO12AATTACTCGA GAGCGGCCGC GAATTCCTAC GTTACGTCAT 40(2)SEQ ID NO13的信息(i)序列特征(A)長度31個(gè)堿基對(B)類型核酸
(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ii)分子類型其它核酸(A)說明用于構(gòu)建pSOG10的引物SON003(iii)假設(shè)無(iv)反義無(xi)序列描述SEQ ID NO13CTCGGATCCAGCAGATTCGAAGAAGGTACAG 31(2)SEQ ID NO14信息(i)序列特征(A)長度31個(gè)堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ii)分子類型其他核酸(A)說明用于構(gòu)建pSOG10的引物SON0004(iii)假設(shè)無(iv)反義無(xi)序列描述SEQ ID NO14ACGGGATCCAACTTCCTAGCTGAAAAATGGG 31(2)SEQ ID NO15的信息(i)序列特征(A)長度26堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ii)分子類型其他核酸(A)說明用于構(gòu)建pSOG19的引物SON0031(iii)假設(shè)無(iv)反義無(xi)序列描述SEQ ID NO15CATGAGGGACTGACCACCCGGGGATC 26(2)SEQ ID NO16的信息(i)序列特征(A)長度24個(gè)堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ii)分子類型其他核酸(A)說明用于構(gòu)建pSOG19的引物SON0010(iii)假設(shè)無(iv)反義無(xi)序列描述SEQ ID NO16AGCGGATAACAATTTCACACAGGA 24(2)SEQ ID NO17的信息(i)序列特征(A)長度24個(gè)堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ii)分子類型其他核酸(A)說明用于構(gòu)建pSOG19的引物SON0016(iii)假設(shè)無(iv)反義無(xi)序列描述SEQ ID NO17GCTACCATGGCCACATAGAACACC 24(2)SEQ ID NO18的信息(i)序列特征(A)長度23個(gè)堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ii)分子類型其他核酸(A)說明用于構(gòu)建pSOG19的引物SON0017(iii)假設(shè)無(iv)反義無(xi)序列描述SEQ ID NO18CGAGAGCTCGCACTTCAACCTTG 23(2)SEQ ID NO19的信息(i)序列特征(A)長度28個(gè)堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ii)分子類型其他核酸(A)說明用于構(gòu)建pSOG30的引物SON0039(iii)假設(shè)無(iv)反義無(xi)序列描述SEQ ID NO19CGACATGGTACGTCCTGTAGAAACCCACA28(2)SEQ ID NO20的信息(i)序列特征(A)長度24個(gè)堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ii)分子類型其他核酸(A)說明用于構(gòu)建pSOG30的引物SON0041(iii)假設(shè)無(iv)反義無(xi)序列描述SEQ ID NO20ATCGCAAGACCGGCAACAGGATTC2權(quán)利要求
1.一種編碼來自真核生物的具原卟啉原氧化酶活力的(protox)蛋白質(zhì)的分離的DNA分子。
2.權(quán)利要求1的分離的DNA分子，其中所說的真核生物為高等真核生物。
3.權(quán)利要求2的分離的DNA分子，其中所說的高等真核生物是植物。
4.權(quán)利要求3的分離的DNA分子，其中所說的植物是雙子葉。
5.權(quán)利要求4的分離的DNA分子，其中所說雙子葉植物是擬南芥。
6.權(quán)利要求5的分離的DNA分子，其中所說的蛋白質(zhì)包含選自SEQ ID NOS.2和4的氨基酸序列。
7.權(quán)利要求3的分離的DNA分子，其中所說的植物為單子葉。
8.要求要求7的分離的DNA分子，其中所說的單子葉植物為玉米。
9.權(quán)利要求8的分離的DNA分子，其中所說的蛋白質(zhì)包括從SEQID NOS6和8中選出的氨基酸序列。
10.一種DNA分子，編碼修飾的原卟啉原氧化酶(protox)，包括至少有一氨基酸修飾的真核原卟啉原氧化酶，其中所說的修飾的原卟啉原氧化酶是指能耐受抑制所說真核原卟啉原氧化酶的量的除草劑。
11.權(quán)利要求10的DNA分子，其中所說的真核原卟啉原氧化酶來自植物。
12.權(quán)利11中的DNA分子，其中所說的植物是雙子葉。
13.權(quán)利要求12的DNA分子，其中所說的雙子葉植物是擬南芥。
14.權(quán)利要求13的DNA分子，其中所說的真核原卟啉原氧化酶包括選自SEQ ID NOS2和4的氨基酸序列。
15.權(quán)利要求14的DNA分子，其中所說的真核原卟啉原氧化酶包括在SEQ ID No.2表示的氨基酸序列。
16.權(quán)利要求15的DNA分子，其中所說的至少一個(gè)氨基酸改變是選自SEQ ID No.2的220處丙氨酸，221處甘氨酸，426處酪氨酸的氨基酸替代。
17.權(quán)利要求16的DNA分子，其中所說的220處丙氨酸被選自纈氨酸，蘇氨酸，亮氨酸，胱氨酸和酪氨酸的氨基酸替代。
18.權(quán)利要求16的DNA分子，其中所說的221處甘氨酸被絲氨酸替代。
19.權(quán)利要求16的DNA分子，其中所說的在426處酪氨酸被選自胱氨酸，異亮氨酸，亮氨酸和蘇氨酸的氨基酸取代。
20.權(quán)利要求11的DNA分子，其中所說的植物為單子葉。
21.權(quán)利要求20的DNA分子，其中所說的單子葉植物為玉米。
22.權(quán)利要求21的DNA分子，其中所說的真核原卟啉原氧化酶包括選自SEQ ID NOS.6和8的氨基酸序列。
23.權(quán)利要求22的DNA分子，其中所說的真核原卟啉原氧化酶包括選自SEQ ID No.6表示的氨基酸序列。
24.權(quán)利要求23的DNA分子，其中所說的至少一個(gè)氨基酸改變是選自SEQ ID No.6中166位丙氨酸，167位甘氨酸和372位酪氨酸的氨基酸替代。
25.權(quán)利要求24的DNA分子，其中所說的166位丙氨酸被選自纈氨酸，蘇氨酸，亮氨酸，胱氨酸和酪氨酸的氨基酸取代。
26.權(quán)利要求24的DNA分子，其中所說的167處甘氨酸被絲氨酸替代。
27.權(quán)利要求24的DNA分子，其中所說的372處酪氨酸可被選自胱氨酸，異亮氨酸，亮氨酸和蘇氨酸的氨基酸取代。
28.根據(jù)權(quán)利要求10～27中任何一個(gè)的DNA分子，它是植物基因組的一部分。
29.一類嵌合基因，它包括一個(gè)與編碼具有原卟啉原氧化酶(protox)活力的高等真核生物蛋白質(zhì)的異源DNA分子有效相聯(lián)的啟動子。
30.權(quán)利要求29的嵌合基因，其中所說的啟動子在植物中有活力。
31.權(quán)利要求30的嵌合基因另外還包括與所說DNA分子有效相連的信號序列，其中所說的信號序列能引導(dǎo)所說DNA分子編碼的蛋白質(zhì)進(jìn)入葉綠體。
32.權(quán)利要求30的嵌合基因另外還包括與所說DNA分子有效相連的信號序列，其中所說的信號序列能引導(dǎo)所說的DNA分子編碼的蛋白質(zhì)進(jìn)入線粒體。
33.一種嵌合基因，包含在植物中有活力并與權(quán)利要求10的DNA分子有效相聯(lián)的啟動子。
34.權(quán)利要求33的嵌合基因，另外還包括與所說DNA分子有效相連的信號序列，其中所說的信號序列能引導(dǎo)所說的DNA分子編碼的蛋白質(zhì)進(jìn)入葉綠體。
35.權(quán)利要求34的嵌合基因，另外還包括與所說的DNA分子有效相連的信號序列，其中所說的信號序列能引導(dǎo)所說的DNA分子編碼的蛋白質(zhì)進(jìn)入線粒體。
36.根據(jù)權(quán)利要求29～35中任何一項(xiàng)的嵌合基因，它是植物基因組的一部分。
37.一種含有權(quán)利要求29～35中任何一項(xiàng)之嵌合基因的重組載體，其中所說的載體能穩(wěn)定轉(zhuǎn)化進(jìn)受體細(xì)胞。
38.一種含有權(quán)利要求33的嵌合基因的重組載體，其中所說的載體能穩(wěn)定轉(zhuǎn)化進(jìn)植物細(xì)胞。
39.一類受體細(xì)胞，它用根據(jù)權(quán)利37或38中任何一項(xiàng)的載體穩(wěn)定地轉(zhuǎn)化，其中所說的受體細(xì)胞能表達(dá)所說的DNA分子。
40.權(quán)利要求39的受體細(xì)胞，選自植物細(xì)胞，細(xì)菌細(xì)胞，酵母細(xì)胞，和昆蟲細(xì)胞。
41.包括含有權(quán)利10～28中任意一項(xiàng)的DNA分子的其后代的植物或植物細(xì)胞，其中所說的DNA分子是在所說植物中表達(dá)并分別賦予所說的植物和植物細(xì)胞耐受抑制自然產(chǎn)生的原卟啉原氧化酶活力的量的除草劑。
42.包括含有權(quán)利要求29～36中任何一項(xiàng)的嵌合基因的其后代的植物或植物細(xì)胞，其中所說的嵌合基因分別賦予所說的植物和植物細(xì)胞耐受抑制自然產(chǎn)生的原卟啉原氧化酶活力的量的除草劑。
43.包括具有改變的原卟啉原氧化酶(protox)活力的其部分的植物和它的后代，其中所說的改變的原卟啉原氧化酶活性賦予所說植物及其后代耐受抑制自然產(chǎn)生原卟啉原氧化酶活力的量的除草劑。
44.權(quán)利要求41～43中任何一項(xiàng)的植物，其中所說的植物為雙子葉植物。
45.權(quán)利要求44的植物，其中所說的植物選自大豆，棉花，煙草，甜菜和油菜。
46.權(quán)利要求41～43中任何一項(xiàng)的植物，其中所說的植物為單子葉植物。
47.權(quán)利要求46的植物，其中所說的植物選自玉米，小麥，高梁，黑麥，燕麥，turf草和水稻。
48.權(quán)利要求41～43中任何一項(xiàng)的植物，其中所說的改變的原卟啉原氧化酶活性是通過所述植物中自然產(chǎn)生的原卟啉原氧化酶的過表達(dá)而獲得。
49.權(quán)利要求41～43中任何一項(xiàng)的植物，其中所說的改變的原卟啉原氧化酶活性是通過編碼除草劑耐受性原卟啉原氧化酶的DNA分子的表達(dá)獲得的。
50.權(quán)利要求49中的植物，其中所說的除草劑耐受性原卟啉原氧化酶在原核生物中自然產(chǎn)生。
51.權(quán)利要求50的植物，其中所說的原核生物選自大腸桿菌，枯草芽孢桿菌和鼠傷寒沙門氏菌。
52.權(quán)利要求49的植物，其中所說的除草劑耐受性原卟啉原氧化酶是原核生物中自然產(chǎn)生的蛋白質(zhì)的修飾形式。
53.根據(jù)權(quán)利要求41～52中任何一項(xiàng)的植物的種子。
54.根據(jù)權(quán)利要求41～52中任何一項(xiàng)的植物，它是雜交植物。
55.根據(jù)權(quán)利要求41～54中任何一項(xiàng)的植物繁殖材料，用保護(hù)劑覆蓋處理。
56.根據(jù)權(quán)利要求55的繁殖材料，包括選自除草劑，殺蟲劑，殺真菌劑，殺細(xì)菌劑，殺線蟲劑，殺軟體動物劑和其混合物的制品。
57.根據(jù)權(quán)利要求55或56中的繁殖材料，其特征在于它由種子組成。
58.一種控制不需要的植物生長的方法，包括對權(quán)利要求41～54中任何一項(xiàng)的植物種群施用有效劑量的原卟啉原氧化酶抑制劑除草劑。
59.權(quán)利要求58的方法，其中所說的植選自大豆，棉花，煙草，甜菜，油菜，玉米，小麥，高梁，黑麥，燕麥，苔草(turf grass)和水稻。
60.權(quán)利要求59的方法，其中所說的原卟啉原氧化酶抑制型除草劑選自aryluracil，二苯醚，oxidiazole，亞胺，苯吡唑，吡啶衍生物，3-代-2-芳基-4，5，6，7-四氫吲哚，phenopylate和O-苯吡咯烷與呱啶氨甲酸酯的phenopylate類似物。
61.權(quán)利要求60的方法，其中所說的原卟啉原氧化酶抑制型除草劑是具以下結(jié)構(gòu)式的亞胺類 (結(jié)構(gòu)式V)其中Q等于 (結(jié)構(gòu)式VI)或 (結(jié)構(gòu)式VII) (結(jié)構(gòu)式VIII)或 (結(jié)構(gòu)式IX)或 (結(jié)構(gòu)式IXa)或 (結(jié)構(gòu)式IXb)其中R1代表H，Cl或F，R2代表Cl，R3可被醚，硫醚，酯，氨基或烷基取代，并且其中R2和R3能形成5或6元雜環(huán)。
62.權(quán)利要求61中的方法，其中所說的亞胺類選自 (結(jié)構(gòu)式X)(結(jié)構(gòu)式XI) (結(jié)構(gòu)式XII) (結(jié)構(gòu)式XIII) (結(jié)構(gòu)式XIV) (結(jié)構(gòu)式XV) (結(jié)構(gòu)式XVI)；和 (結(jié)構(gòu)式XVII)其中R表示(C2-6-烷氧基)羰基-C1-4-烷基。
63權(quán)利要求58的方法，其中所說的原卟啉原氧化酶抑制型除草劑具有從以下選出的結(jié)構(gòu)式 (結(jié)構(gòu)式XVIII) (結(jié)構(gòu)式XIX) (結(jié)構(gòu)式XX)，和 (結(jié)構(gòu)式XXI)
64.一種測定在植物中化學(xué)物質(zhì)對原卟啉原氧化酶抑制能力的方法包括，(a)在所說原卟啉原氧化酶能夠催化所說原卟啉原1X轉(zhuǎn)化為原卟啉1X的條件下將所說原卟啉原氧化酶和原卟啉原1X在第一反應(yīng)混合物中混合。(b)在與所說第一反應(yīng)混合物相同條件下將所說的化學(xué)物質(zhì)，所說的原卟啉原氧化酶和原卟啉原1X在第二反應(yīng)混合物中混合。(c)在大約395～410nm激發(fā)所述第一和所述第二反應(yīng)混合物。(d)比較所說第一和所說第二反應(yīng)混合物在大約622～635nm的熒光。如果所說的第二反應(yīng)混和物的熒光明顯低于所說的第一反應(yīng)混合物的熒光，那么其中所說的化學(xué)物質(zhì)就能夠抑制所述原卟啉原氧化酶的活力。
65.一個(gè)鑒定在細(xì)胞種群中對原卟啉原氧化酶抑制劑有抗性的修飾的原卟啉原氧化酶的方法，包括步驟(a)將所說種群在能抑制該酶未修飾形式的量的所說的原卟啉原氧化酶抑制劑存在的條件下培養(yǎng)；(b)從步驟(a)中選出生長未受抑制的細(xì)胞；(c)分離和鑒定存在于選自步驟(b)的細(xì)胞的原卟啉原氧化酶。
66.一種從非轉(zhuǎn)化的植物中選擇用感興趣的轉(zhuǎn)移基因轉(zhuǎn)化的植物，植物組織或植物細(xì)胞的方法，包括(a)用能被植物表達(dá)的感興趣的轉(zhuǎn)移基因和一個(gè)編碼對原卟啉原抑制劑有抗性的改變的原卟啉原氧化酶的基因轉(zhuǎn)化一類植株，植物組織或植物細(xì)胞；(b)將轉(zhuǎn)化的植物或植物細(xì)胞轉(zhuǎn)移到含有原卟啉原氧化酶抑制劑的培養(yǎng)基上，并(c)挑選在此培養(yǎng)基上存活的植物或植物細(xì)胞
67.一種能與真核原卟啉原氧化酶基因或mRNA特異性雜交的探針，其中所說的探針包括與真核原卟啉原氧化酶編碼序列的相鄰的部分，并至少有10個(gè)核苷酸的長度。
68.權(quán)利要求67的探針，其中所說的編碼序列選自SEQ ID NOS.1，3，5，7和9。
69.一種產(chǎn)生包含編碼真核原卟啉原氧化酶(protox)活性的蛋白的分離DNA分子的受體細(xì)胞的方法，包括用根據(jù)權(quán)利要求37或38的重組載體分子轉(zhuǎn)化所述受體細(xì)胞。
70.一種產(chǎn)生包含編碼真核原卟啉原氧化酶(protox)活性的蛋白的分離的DNA分子的植物細(xì)胞的方法，包括用根據(jù)權(quán)利要求37或38的重組載體分子轉(zhuǎn)化所述的植物細(xì)胞。
71.一種產(chǎn)生包含編碼具有原卟啉原氧化酶(protox)活力的真核蛋白的分離的DNA分子的轉(zhuǎn)基因親本植物的轉(zhuǎn)基因后代的方法，包括用根據(jù)權(quán)利要求37或38的重組載體分子轉(zhuǎn)化所說的親本植物并用已知植物培養(yǎng)技術(shù)將除草劑耐受特點(diǎn)轉(zhuǎn)移到所說轉(zhuǎn)基因植物后代中去。
72.一種產(chǎn)生編碼具有原卟啉原氧化酶(protox)活性的真核蛋白的DNA分子的方法，包括(a)建立合適真核生物來源的CDNA文庫。(b)通過對原卟啉原氧化酶活力缺陷型突變受體生物提供此酶活力來鑒定編碼原卟啉原氧化酶的CDNA克隆。
73.一種產(chǎn)生編碼具有原卟啉原氧化酶(protox)活力的真核蛋白的DNA分子的方法，包括(a)建立合適的真核生物來源的基因組或CDNA文庫。(b)用根據(jù)權(quán)利要求67中的探針分子探測所說的文庫。
74.根據(jù)權(quán)利要求28或36的任意一項(xiàng)的DNA分子在將對抑制自然產(chǎn)生的原卟啉原氧化酶活性的量的除草劑的耐受性從親代植物傳遞給子代上的應(yīng)用，包括首先通過將根據(jù)權(quán)利要求10的27中任何一項(xiàng)的DNA分子穩(wěn)定摻入所說親本植物基因組中而用該DNA分子轉(zhuǎn)化親本植物，隨后采用已知植物培養(yǎng)技術(shù)將除草劑耐受性特征轉(zhuǎn)移到上述轉(zhuǎn)基因親本植物的后代中。
75.根據(jù)權(quán)利要求28或36中任意一項(xiàng)的DNA分子在制備用于對動物，尤其是人類原卟啉原氧化酶(protox)活性缺陷進(jìn)行治療的醫(yī)學(xué)工具上的應(yīng)用。
76.根據(jù)權(quán)利要求28或36中任意一項(xiàng)的DNA分子在制備用于對動物，尤其是人類原卟啉原氧化酶(protox)活性缺陷進(jìn)行診斷的醫(yī)學(xué)工具上的應(yīng)用。
77.一種藥用組合物，包含與藥用上可接受的載體組合的來自真核生物并具有原卟啉原氧化酶活力的蛋白質(zhì)，用于動物或人體的治療方法和診斷目的。
全文摘要
本發(fā)明提供編碼自然原卟啉原氧化酶(protox)及其除草劑耐受性的修飾形式的新的真核DNA序列。也提供了具有改變的原卟啉原氧化酶活力，并對除草劑有耐受性的植物。這些植物可以是培養(yǎng)或基因工程處理后而對原卟啉原氧化酶抑制劑有抗性，這通過將自然原卟啉原氧化酶基因突變成抗性形式或通過提高自然原卟啉原氧化酶基因表達(dá)水平，或用修飾的真核或原核原卟啉原氧化酶編碼序列或除草劑耐受性野生型原核原卟啉原氧化酶序列轉(zhuǎn)化實(shí)現(xiàn)。還描述了新的真核原卟啉原氧化酶序列在診斷及其他方面的用途。還公開了編碼野生型和改變了的原卟啉原氧化酶的植物基因，純化的植物原卟啉原氧化酶，從植物中分離原卟啉原氧化酶的方法，使用原卟啉原氧化酶編碼基因的方法。
文檔編號A61K48/00GK1150820SQ95193629
公開日1997年5月28日 申請日期1995年6月8日 優(yōu)先權(quán)日1994年6月16日
發(fā)明者E·R·瓦德, S·沃勒拉茨 申請人:希巴-蓋古股份公司