專利名稱：血管生成抑制素和用于抑制血管生成的方法
相關申請的交互參考本申請是1994年10月20日提交的美國專利申請序號08/326,785的部分繼續(xù)申請，前者則是1994年4月26提交的美國專利申請的部分繼續(xù)申請。
發(fā)明的所屬領域本發(fā)明涉及稱為血管生成抑制素(angiostatin)的內皮生長抑制劑，該抑制劑可逆地抑制內皮細胞的增殖。更具體地說，本發(fā)明涉及可從體液如血液或尿中分離的，或者可用重組、酶促或化學方法合成的血管生成抑制素蛋白質。血管生成抑制素能夠抑制血管生成相關的疾病和調制血管生成過程。另外，本發(fā)明涉及診斷檢測法和血管生成抑制素檢測藥盒、定位血管生成抑制素的組織化學藥盒、編碼血管生成抑制素的DNA序列和監(jiān)測血管生成抑制素生物合成的分子探針、對血管生成抑制素特異的抗體、產生血管生成抑制素受體的肽激動劑和拮抗劑、抗血管生成抑制素受體特異性抗體刺激動和拮抗劑，以及與血管生成抑制劑肽連接的細胞毒性劑。
發(fā)明的背景本文所用的術語“血管生成”是指產生伸入到組織或器官中的新的血管。在正常生理條件下，人或動物只在很特異受限制的情況下才發(fā)生血管生成。例如，在傷口俞合、胎兒和胚胎發(fā)育及黃體、內皮和胎盤形成中可觀察到正常血管生成。術語“內皮”是指襯在漿液腔、淋巴管及血管內壁上的扁平內皮細胞的薄層。
一般認為受控制的和不受控制的血管生成是以相似方式進行的。內皮細胞和外膜細胞由基底膜包繞形成毛細血管。血管生成隨著由內皮細胞和血細胞釋放的酶侵蝕基底膜開始。然后襯在血管腔內的內皮細胞通過基底膜伸出。血管生成刺激劑誘導內皮細胞通過受侵蝕的基底膜遷移。遷移細胞從母血管分岔形成“新芽”，內皮細胞在這里進行有絲分裂和增殖。內皮細胞新芽彼此合并形成毛細環(huán)，產生新的血管。
持續(xù)的、不受控制的血管生成發(fā)生在多種疾病狀態(tài)、腫瘤轉移及內皮細胞的正常生長中，并支持可見于這些狀態(tài)下的病理性損傷。已將其中存在不受控制的血管生成的各種病理學疾病狀態(tài)歸納分類為血管生成依賴性的或血管生成相關性的疾病。
1971年首先提出了腫瘤生長是血管生成依賴性的這一假想(Folkman J.，Tumor angiogenesisTherapeutic implications.，N，En-gl.Jour.Med.2851182-1186，1971)。其中以最簡單的措詞指出“一旦發(fā)生腫瘤“容納”，腫瘤細胞群體的每次增加之前均有集中于腫瘤上之新毛細血管的增加”。腫瘤“容納”目前被理解為腫瘤生長之血管前期的指征，其中占據(jù)很少幾個立方厘米體積并且不超過幾百萬個細胞的腫瘤細胞群體可以在已有的宿主微血管上存活。在此期之后腫瘤體積的擴大需要誘發(fā)新的毛細血管生成。例如，除非對組織學切片進行高倍顯微鏡檢查，否則將不能在早期血管前期檢測到小鼠的肺部微量轉移。
支持這一觀點的間接證據(jù)包括(1)移植在小鼠皮下透明小室中的腫瘤在神經血管生成之前生長速率緩慢而且呈線性生長，而在神經血管生成之后則生長迅速并近于指數(shù)生長(Algire GH，et al.vascular reactions of normal andmilignant tumors in vivo.I.Vascular reactions of mice to wounds andto normal and neoplastic transplants.J.Natl.Cancer Inst.673-85，1945)；(2)在血管沒有增殖的分離的灌注器官中，腫瘤生長只限于1-2mm3，但當將其移植到小鼠體內并逐漸有神經血管生成時這一體積便迅速擴大到1000倍以上(Folkman J.et al.，Tumor behavior inisolated perfused organsIn vitro growth and metastasis of biopsy ma-terial in rabbit thyroid and canine intestinal segments.Annals ofSurgery 164491-502，1966)。
(3)無血管角膜中的腫瘤生長緩慢而且呈線性生長速率，但在神經血管生成后便變成指數(shù)生長(Gimbrone，M.A.，Jr.et al.，Tu-mot growth and neovascularizationAn experimental model using therabbit cornea.J.Natl.Cancer Institute 5241-427，1974)；(4)懸浮在兔眼前房之水性液體中的腫瘤仍是活的和無血管的，并且被限制在小于1mm3的體積。一旦將其移植到虹膜血管床上，它們便迅速神經血管化并迅速生長，2周內達到其原有體積的16，000倍(Gimbrone MA Jr.，et al.，Turnor dermancy in vivo by pre-vention of neovascularization.J.Exp.Med.13626l-276)；(5)當將腫瘤移植于雞胚絨膜尿囊膜上時，它們在＞72小時的無血管期內生長緩慢，而且平均直徑不超過0.93+0.29mm。在開始神經血管化后的24小時內出現(xiàn)腫瘤迅速擴大，并且到第7天時這些有血管生成的腫瘤達到8.0+2.5mm的平均直徑(Knighton D.，Avascular and vascular phase of tumor growth in the chick embryo.British J.Cancer，35347-356，1977)；(6)兔肝中轉移瘤的血管管型揭示了轉移瘤大小的不均一性，但就這一存在血管化部位來說則顯示出相對不均勻的切開點。通常腫瘤在直徑達1mm之前是無血管的，但在直徑超出1mm時即表現(xiàn)有神經血管生成(Lien W.，et al.，The blood supply of experimental liv-er metastases.II.A microcirculatory study of normal and tumor Ves-sels of the liver with the use of perfused silicone rubber.Suvgery 68334-340，1970)；(7)在胰島β細胞發(fā)生腫瘤的轉基因小鼠中，血管生成前增生的胰島大小限于＜1mm。在6-7周齡時，有4-10％的胰島逐漸神經血管化，并由這些胰島產生超過血管生成前胰島100倍體積的大的血管化腫瘤(Folkman J，et al.，Induction of angiogenesis during thetransition from Hyperplasia to neoplasia，Nature 33958-61，1989)。
(8)抗VEGF(血管內皮生長因子)特異性抗體降低微血管密度，并使三種依賴于VEGF(作為其在裸鼠體內血管生成的唯一介導物)的人腫瘤的生長受到“顯著的”抑制?？贵w則不能抑制腫瘤細胞在體外的生長(Kim K J，et al.，Inhibition of Vascular endothelial growthfactor-induced angiogenesis Suppresses tumor growth in vivo.Nature362841-844，1993)；(9)抗bFGF單克隆抗體使依賴于作為其血管生成之唯一介導物的bFGF分泌的小鼠腫瘤的生長受到70％的抑制。該抗體卻不能在體外抑制腫瘤細胞的生長(Hori A，et al.，Suppression of solidtumor growth by immunoneutralizing monoclonal antibody against hu-man basic fibroblast growth factor.Cancer Research，516180-6184，1991)；(10)腹腔內注射bFGF可通過刺激腫瘤中毛細血管內皮細胞的生長促進原發(fā)瘤及其轉移瘤的生長。腫瘤細胞本身缺少bFGF的受體，并且bFGF不是腫瘤細胞在體內的有絲分裂原(Gross JL，et al.，Modulation of solid tumor growth in vivo by bFGF，Proc.Hmet.As-soc.Canc.Res.3179，1990)；(11)特異性血管生成抑制劑(AGM-1470)抑制腫瘤生長和體內轉移，但在抑制腫瘤細胞體外增殖中其活性則小得多。它抑制血管內皮細胞半最大增殖的濃度比抑制腫瘤細胞增殖低4個對數(shù)值(Ingber D，et al.，AngioinhibinsSynthetic analogues of fumagillinwhich inhibit angiogenesis and suppress tumor growth.Nature，48555-557，1990)。也有間接的臨床證據(jù)表明腫瘤生長是血管生成依賴性的。
(12)轉移到玻璃體的人成視網膜細胞瘤可發(fā)展成不到1mm3直徑的無血管球形體，盡管事實上當將其從已摘除的眼球中切除并進行體外分析時可見它們是存活的并且可摻入3H-胸苷；(13)卵巢腫瘤作為極小的無血管白色籽瘤(1-3mm3)轉移到腹腔上。在其中一個或多個移植物逐漸有神經血管形成之前很少能夠長得較大；(14)乳腺癌(Weidner N，et al.，Tumor angiogenesis correlateswith metastasis in invasive breast carcinoma.N.Engl.J.Med.3241-8，1991，and Weidner N，et al.，Tumor angiogenesisA new sig-nificant and independent prognostic indicator in early-stage breastCarcinoma，J.Natl.Cancer Inst.841875-1887，1992)和前列腺癌(Woodner N，Carroll PR，F(xiàn)lax J，Blumenfeld W，F(xiàn)olkman J.Tumorangiogenesis correlates with metastasis in invasive prostate carcinoma.American J.of Pathology，143(2)401-409，1993)中神經血管化的強度與腫瘤進一步轉移的危險密切相關；(15)在神經血管生成之前人皮膚黑素瘤很少發(fā)生轉移。在神經血管生成后增加了損傷的厚度并增加了轉移的危險(Srivastava A，et al.，The prognostic significance of tumor rascularity in intermediatethiclcness(0.76-4.0mm厚)skin melanoma.Amer.J.Pathol.133419-423，1988)；(16)就膀胱癌來說，血管生成肽即bFGF的尿液水平是指示疾病狀態(tài)和程度的比細胞學檢查更為敏感的指征(Nguyen M，et al.，Elevated levels of an angicgenic peptide，basic fibroblast growth fac-tor，in urine of bladder cancer patients.J.Natl.Cancer Inst.85241-242，1993)。
因此可見，血管生成在腫瘤的轉移中起著重要作用。如果能夠抑制或消除這種血管生成活性，則盡管腫瘤仍存在，也不會生長。在疾病狀況下，阻止血管生成可以避免因新的微血管系統(tǒng)侵入所引起的損傷。針對控制血管生成過程的治療可導致這些疾病的消除或減輕。
因此需要有一種能抑制不需要的血管生長，特別向腫瘤內生長的組合物及方法。另外還需要一種檢測、測定及定位該組合物的方法。該組合物應能夠克服轉移前腫瘤中內源性生長因子的活性并阻止腫瘤中毛細血管的生成，從而抑制腫瘤的生長。該組合物、組合物的片段和對組合物特異的抗體也應能夠調節(jié)如傷口愈合及再生等其他血管生成過程中的毛細血管生成。該抑制血管生成的組合物和方法較好是無毒性的并幾乎不產生付作用。另外還需要一種檢測、測定和定位組合物之結合位點及組合物之生物合成位點的方法。該組合物和組合物的片段應能夠為放射活性和非放射活性標記目的而結合到其他分子上。
發(fā)明的概要本發(fā)明提供了有效地調節(jié)血管生成，及抑制不需要的血管生成，特別是與腫瘤生長有關之血管生成的組合物與方法。本發(fā)明包括已根據(jù)其在體外克服內源性生長因子如bFGF的血管生成活性的能力，以及根據(jù)其與在纖溶酶原的氨基酸98處開始的血纖溶酶原內在部分的氨基酸序列同源性和結構相似性而定義的，稱為“血管生成抑制素”的蛋白質。血管生成抑制素包括如經還原性需丙烯酰胺聚膠電泳法測定分子量約為38千道爾頓至45千道爾頓，具有基本上與在完整的鼠纖溶酶原分子的氨基酸序號98處開始的鼠纖溶酶原的片段相似之氨基酸序列的蛋白質。
血管生成抑制素的氨基酸序列在不同種間稍有變化。例如，人血管生成抑制素的氨基酸序列基本上相似于上述鼠纖溶酶原片段的序列，但活性人血管生成抑制素序列可能開始于完整人纖溶酶原氨基酸序列的氨基酸序號97或99處。此外，人纖溶酶原的片段具有如在小鼠腫瘤模型中所顯示的相似的抗血管生成活性。應明確的是，活性血管生成抑制素分子中的氨基酸數(shù)目可能有變化，并且具有內皮抑制活性的所有氨基酸序列均應包括在本發(fā)明范圍內。
本發(fā)明提供用于治療由不需要的不受控制的血管生成介導的疾病和過程的方法及組合物，所說的方法是以足可抑制血管生成的劑量給人或動物投用包含基本上純化的血管生成抑制素或血管生成抑制素衍生物的組合物。本發(fā)明特別適用于治療腫瘤或抑制腫瘤生長。給患有血管生成前的轉移腫瘤的人或動物投用血管生成抑制素將阻止那些腫瘤的生長或擴展。
本發(fā)明還包括編碼血管生成抑制素的DNA序列，含有編碼血管生成抑制素之DNA序列的表達載體，以及含有一個或多個所說的表達載體的細胞。本發(fā)明進一步包括基因治療方法，借以將編碼血管生成抑制素的DNA序列導入病人體內以在體內修飾血管生成抑制素水平。
本發(fā)明還包括檢測和測定生物體液和組織中血管生成抑制素、以及定位組織和細胞中血管生成抑制素的診斷方法及藥盒。診斷方法和藥盒可以是本領域技術人員熟知的任何配置的。本發(fā)明還包括對血管生成抑制素分子或其部分特異的抗體，以及抑制對血管生成抑制素特異的抗體結合的抗體。這些抗體可以是多克隆抗體或單克隆抗體。可以在診斷藥盒中使用對血管生成抑制素特異的抗體以檢測血管生成抑制素的存在和量，從而借以診斷或預測由血管生成介導的腫瘤或其他疾病的發(fā)生或再發(fā)。也可以將對血管生成抑制素特異的抗體投用于人或動物，以使之產生抗血管生成抑制素的主動免疫，從而降低血管生成抑制作用。
本發(fā)明還包括用于檢測能與體液中血管生成抑制素結合之抗體的存在及其量的診斷方法和藥盒。所說的診斷方法和藥盒可以是本領域技術人員熟知的任何配置的。
本發(fā)明還包括與血管生成抑制素受體結合并向細胞傳遞適當?shù)男盘柡推鸬郊觿┗蜣卓箘┳饔玫目寡苌梢种扑厥荏w特異性抗體。
本發(fā)明還包括能夠進行同位素標記或用其他分子或蛋白質標記的，用于檢測和觀察血管生成抑制素結合位點的血管生成抑制素肽片段及類似物，其中用于檢測和觀察的技術包括但不只限于正電子發(fā)射X線斷層照相術、放射自顯影、流式細胞計數(shù)法、放射受體結合檢測法及放射組織化學法。
這些血管生成抑制素肽和類似物也可用作血管生成抑制素受體的激動劑和拮抗劑，從而提高或阻斷血管生成抑制素的生物學活性。這些肽可用于分離血管生成抑制素受體。
本發(fā)明還包括為治療和研究目的與細胞毒性劑連接的血管生成抑制素、血管生成抑制素片段、血管生成抑制素抗血清，或血管生成抑制素受體激動劑及血管生成抑制素受體拮抗劑。另外，可將血管生成抑制素、血管生成抑制素片段、血管生成抑制素抗血清、血管生成抑制素受體激動劑及血管生成抑制素受體拮抗劑與醫(yī)藥上可接受的賦形劑，及選擇性緩釋化合物或組合物例如生物可降解的聚合物組合在一起，制成治療組合物。
本發(fā)明還包括參與血管生成抑制素轉錄和轉譯之核糖核酸及脫氧核糖核酸的分子探針。這些分子探針提供了用于檢測和測定組織和細胞中血管生成抑制素生物合成的工具。
因此，本發(fā)明的一個目的是提供包含血管生成抑制素的組合物。
本發(fā)明的另一個目的是提供治療由血管生成抑制素介導之疾病和過程的方法。
本發(fā)明的再一個目的是提供用于檢測體液或組織中血管生成抑制素的存在或含量的診斷或預測方法及藥盒。
本發(fā)明的另一個目的是提供治療由血管生成介導的疾病和過程的方法和組合物，這些疾病和過程包括但不只限于血管瘤、實體腫瘤、血液系統(tǒng)腫瘤、白血病、轉移瘤、毛細管擴張、牛皮癬、硬皮病、膿性肉芽腫、心肌血管生成、克羅恩氏病、斑樣神經血管化、冠血管旁系生成、腦血管旁系生成、動靜脈畸型、缺血性肢血管生成、角膜病、潮紅、神經血管性青光眼、糖尿病性視網膜病、晶狀體后纖維組織形成、關節(jié)炎、糖尿病性神經血管形成、黃斑退化、傷口愈合、消化性潰瘍、螺旋菌相關疾病、骨折、瘢痕瘤、血管生成、血細胞生成、排卵、月經來潮、胎盤形成及貓抓傷熱。
本發(fā)明的另一個目的是提供治療腫瘤或抑制腫瘤生長的組合物。
本發(fā)明的再一個目的是提供調節(jié)或模擬在體內或體外產生血管生成抑制素之酶的生成或活性的化合物。
本發(fā)明的再一個目的是通過給需要血管生成抑制素或抗血管生成抑制素抗體的人或動物直接注射血管生成抑制素DNA來提供這樣的血管生成抑制素或抗血管生成抑制素抗體。
本發(fā)明的再一個目的是提供檢測和定量體液中對血管生成抑制素特異性抗體的存在。
本發(fā)明的再一個目的是提供由對血管生成抑制素分子的不識別纖溶酶原的特異性區(qū)域有選擇性的抗血管生成抑制素抗體組成的組合物。
本發(fā)明的再一個目的是提供檢測或預測癌癥的方法。
本發(fā)明的再一個目的是提供用于在體內和體外觀察和定量血管生成抑制素結合位點的組合物。
本發(fā)明的再一個目的是提供用于檢測和定量血管生成抑制素生物合成的組合物。
本發(fā)明的再一個目的是提供有最小付作用的癌癥治療方法。
本發(fā)明的再一個目的是提供包含與用來治療癌癥或抑制癌生長之細胞毒性劑連接的血管生成抑制素或血管生成抑制素片段的組合物。
本發(fā)明的再一個目的是提供向特定位置定點釋放血管生成抑制素相關組合物的方法。
本發(fā)明的再一個目的是提供用于為調節(jié)血管生成過程而進行基因治療的組合物和方法。
在評閱下列已公開的實施方案和待批權利要求的詳細描述后，將會更清楚地了解本發(fā)明的這些和其他目的、特征和優(yōu)點。
附圖的簡要說明

圖1顯示鼠纖溶酶原的全氨基酸序列，即SEQ ID NO1。
圖2顯示小鼠血管生成抑制素的起始部分序列(SEQ ID NO2)，并與相應的人(SEQ ID NO3)、恒河猴(SEQ ID NO4)、豬(SEQ ID NO5)和牛(SEQ ID NO6)纖溶酶原肽片段的序列相比較。首先列出的是小鼠序列，然后是人、恒河猴、豬和牛。
圖3顯示在有或沒有原發(fā)瘤的情況下，肺中腫瘤細胞的BrdU標記指數(shù)。
圖4顯示Lowis原發(fā)性肺腫瘤對體內bFGF推動的血管生成之影響的Matrigel分析。
圖5顯示得自帶Lewis肺癌(LLC-Low)小鼠之血清對得自正常小鼠之血清的劑量反應曲線。在bFGF推動的72小時增殖試驗中檢測牛毛細血管內皮細胞。
圖6顯示低和高轉移瘤在其腹水中含有內皮促有絲分裂活性，但只有低轉移瘤在血清中具有內皮抑制活性。
圖7顯示從帶瘤動物體中部分純化的血清或尿的C4反相層析圖形。
圖8顯示用完整纖溶酶原分子、從人纖溶酶原的賴氨酸結合位點I制劑得到的活性部分、濃縮的帶瘤小鼠的尿和濃縮的正常小鼠的尿處理小鼠13天后腫瘤肺表面轉移情況。
圖9顯示用人纖溶酶原的完整纖溶酶原分子、賴氨酸結合位點I制劑的活性部分、濃縮的帶瘤小鼠的尿和濃縮的正常小鼠的尿處理13天后小鼠的肺重量。
圖10圖解顯示pTrcHis載體。
圖11顯示用抗人纖溶酶原Kringle區(qū)域1-3的單克隆抗體探查的，來自10L按比例增加的發(fā)酵液的大腸桿菌表達之人血管生成抑制素的免疫印跡。箭頭顯示重組人血管生成抑制素。A)顯示用0.2M氨基已酸洗脫的重組血管生成抑制素；B)顯示最后用1×PBS洗脫賴氨酸柱的洗脫物；C)顯示從破碎的細胞得到的澄清溶胞產物。
圖12圖解顯示作為儲備液稀釋度函數(shù)的生長的牛毛細血管內皮細胞的百分抑制率；A1、A2、B1、B2和E是表達人血管生成抑制素抗血管生成活性的重組克?。籆1、C2、D1和D2對照是只含有載體而沒有編碼血管生成抑制素之人DNA序列的陰性對照克隆。
圖13顯示重組人血管生成抑制素對牛毛細血管內皮細胞增殖的體外抑制作用。
圖14顯示在除去原發(fā)腫瘤并用鹽水或具有抗血管生成活性的煙曲霉素類似物處理后的生長增殖指數(shù)和編程性細胞死亡指數(shù)。
圖15顯示一次體內注射40mg/kg/天量的人血管生成抑制素后，對小鼠T241原發(fā)腫瘤生長的抑制率。
圖16顯示以每劑40mg/kg兩次體內注射人血管生成抑制素(80mg/kg/天)后，對小鼠體內LLC-LM原發(fā)腫瘤生長的抑制率。
圖17顯示除去Lewis肺原發(fā)腫瘤對其肺轉移的影響。
圖18顯示腫瘤切除后的生長增殖和編程性細胞死亡指數(shù)。
圖19顯示給帶有移植的T241纖維肉瘤細胞的小鼠投用血管生成抑制素蛋白質對作為時間之函數(shù)的總腫瘤體積的影響。
圖20顯示給帶有移植的Lewis肺癌(LM)細胞的小鼠投用血管生成抑制素蛋白質對作為時間函數(shù)之總腫瘤體積的影響。
圖21顯示給帶有移植的網狀細胞肉瘤細胞的小鼠投用血管生成抑制素蛋白質對作為時間之函數(shù)的總腫瘤體積的影響。
圖22顯示給移植的人前列腺癌PC-3細胞的免疫缺陷性SCID小鼠投用血管生成抑制素蛋白質對作為24天期間之時間函數(shù)的總腫瘤體積的影響。
圖23顯示給帶有移植的人乳腺癌MDA-MB細胞的免疫缺陷性SCID小鼠投用血管生成抑制素蛋白質對作為24天期間之時間函數(shù)的總腫瘤體積的影響。
圖24圖解顯示編碼衍生于小鼠纖溶酶原cDNA之小鼠血管生成抑制素蛋白質的小鼠DNA序列克隆程序。小鼠血管生成抑制素包括小鼠纖溶酶原Kringle區(qū)域1-4。PCR是指聚合酶鏈反應；P1是用于PCR的5′末端寡核苷酸引物；P2是用于PCR的3′末端寡核苷酸引物；SS是指單鏈序列；ATG是轉譯起始密碼子；TAA是轉譯終止密碼子；HA代表血凝素表位尾部(YPYDVPDYASL)；K1、K2、K3和K4分別代表小鼠纖溶酶原Kringle區(qū)域1、2、3和4；CMV是巨細胞病毒啟動子；T7是細菌噬菌體啟動子；PA代表前活化肽；SP6是Sp6啟動子。
圖25圖解顯示非被轉染的細胞(模擬的)、單用沒有編碼血管生成抑制素之DNA序列的載體(載體5)轉染的細胞、以及兩個表達血管生成抑制素的克隆(AST31和AST37)，作為時間(天數(shù))之函數(shù)的細胞數(shù)目。(a)圖代表轉染T241細胞的結果。(b)圖顯示轉染LL2細胞的結果。
圖26顯示培養(yǎng)含有血管生成抑制素克隆之大腸桿菌細胞得到的培養(yǎng)基對細胞數(shù)目的影響。其中包括未被轉染的細胞(模擬的)；單用沒有編碼血管生成抑制素的載體(載體5)轉染的細胞；和三個表達血管生成抑制素的克隆(AST25、AST31和AST37)。(a)圖代表保溫對照組(模擬的)和所有血管生成抑制素克隆(表達和非表達的)的培養(yǎng)基對細胞數(shù)目的影響。(b)圖代表保溫對照組(模擬的)和單獨載體(載體6)及表達小鼠血管生成抑制素之血管生成抑制素克隆的培養(yǎng)基對細胞數(shù)目的影響。(c)圖代表保溫對照組(模擬的)和表達小鼠血管生成抑制素之血管生成抑制素克隆的純化的培養(yǎng)基對細胞數(shù)目的影響，其中培養(yǎng)基被加于賴氨酸-瓊脂糖柱上純化以產生賴氨酸結合成分。
圖27顯示對作為小鼠體內植入T241纖維肉瘤細胞時間的函數(shù)的總腫瘤體積的影響，其中纖維肉瘤細胞已被含有編碼血管生成抑制素蛋白質之DNA序列的載體轉染，并且該載體能夠表達血管生成抑制素蛋白質。“未被轉染的”是指植入小鼠體內的未改變的T241纖維肉瘤細胞?！拜d體6”代表只用不含編碼血管生成抑制素蛋白質之DNA序列的載體轉染的，植入小鼠體內的T241纖維肉瘤細胞。“克隆25，克隆31和克隆37”代表用含有編碼血管生成抑制素蛋白質之載體轉染的，植入小鼠體內的三個T241纖維肉瘤細胞的血管生成抑制素生產克隆。
發(fā)明的詳細描述本發(fā)明包括用于檢測和治療由血管生成介導的或與血管生成相關的疾病和過程的組合物及方法。所說的組合物是可從包括但不只限于血清、尿和腹水的體液中分離的，或以化學或生物學方法(如細胞培養(yǎng)、重組基因表達、肽合成，以及體外酶促催化纖溶酶原或纖溶酶以產生活性血管生成抑制素)合成的血管生成抑制素。重組技術包括使用聚合酶鏈反應(PGR)從DNA來源擴增基因，以及使用反轉錄酶/PCR從RNA來源擴增基因。血管生成抑制素抑制血管向組織如未生成血管的或已有血管生成的腫瘤中生長。
本發(fā)明還涉及包括載體的組合物，其中載體含有編碼血管生成抑制素的DNA序列并且當該載體存在于細胞中時能夠表達血管生成抑制素，以及包括含有載體之細胞的組合物，其中所說的載體含有編碼血管生成抑制素或其片段或類似物的DNA序列，并且其中當載體存在于細胞中時便能夠表達血管生成抑制素，以及包括將含有載體的細胞植入人或非人類動物體內的方法，其中所說的載體含有編碼血管生成抑制素的DNA序列，并且其中當載體存在于細胞內時便能夠表達血管生成抑制素。
另外，本發(fā)明還包括與醫(yī)藥上可接受的賦形劑以及選擇性緩釋化合物或組合物如生物可降解的聚合物結合，以形成治療組合物的血管生成抑制素、血管生成抑制素片段、血管生成素抗血清、血管生成抑制素受體激動劑或血管生成抑制素受體拮抗劑。特別是本發(fā)明包括含有與血管生成抑制素特異結合之抗體的組合物，其中所說的抗體不與纖溶酶原結合。
更具體地說，本發(fā)明包括稱為血管生成抑制素的蛋白質，其為分子量約為38至45千道爾頓(KD)，能夠在體外克服內源性生長因子如bFGF之血管生成活性的蛋白質。如經還原聚丙烯酰胺凝膠電泳所測知的血管生成抑制素具有大約38千道爾頓至45千道爾頓的分子量，并且具有基本上相似于從完整的鼠纖溶酶原分子之氨基酸序號98處開始的鼠纖溶酶原片段的氨基酸序列。術語“基本上相似”當用于血管生成抑制素氨基酸序列時，是指具有抗血管生成活性并且具有大約38KD至45KD之分子量的，而且也與在小鼠纖溶酶原的大約氨基酸序號98處開始的分子量約38KD至45KD的小鼠纖溶酶原的肽片段有高度序列同源性的氨基酸序列。高度同源性是指至少約有60％氨基酸同源性，較好至少有大約70％氨基酸同源性，并且最好至少有大約80％氨基酸同源性。術語“內皮抑制活性”在本文中是指一種分子總地抑制血管生成，例如在有成纖維細胞生長因子的培養(yǎng)物中抑制牛毛細血管內皮細胞生長的能力。
圖1和SEQ ID NO1中顯示了完整鼠纖溶酶原分子的氨基酸序列。血管生成抑制素的序列開始于其大約氨基酸序號98處?；钚匀搜苌梢种扑乜砷_始于完整人纖溶酶原分子的氨基酸97或99處。小鼠血管生成抑制素之前339個氨基酸的氨基酸序列示于圖2(SEQ ID NO2)中，并與來自人(SEQ ID NO3)、恒河猴(SEQID NO4)、豬(SEQ ID NO5)及牛(SEQ ID NO6)纖溶酶原的相應纖溶酶原肽片段的序列相比較。假使這些序列的氨基酸有50％以上是完全相同的，可理解到血管生成抑制素的氨基酸序列在種間是基本上相似的。血管生成抑制素中氨基酸總數(shù)尚不完全清楚，但可以根據(jù)活性分子的分子量限定這一數(shù)目。本發(fā)明血管生成抑制素的氨基酸序列可依據(jù)纖溶酶原分子所來源的種的不同而有所差異。因此，盡管本發(fā)明的衍生于人纖溶酶原的血管生成抑制素與衍生于小鼠的血管生成抑制素稍有序列差異，但如在小鼠腫瘤模型中所顯示的，其同樣有抗血管生成活性。
已證明血管生成抑制素能夠在體外抑制內皮細胞的生長。血管生成抑制素并不抑制衍生于其他類型之細胞系的生長。特別是，血管生成抑制素對Lewis肺癌細胞系、水貂肺表皮細胞、3T3成纖維細胞、牛主動脈平滑肌細胞、牛視網膜色素上皮細胞、MDCK細胞(犬腎上皮細胞)、W138細胞(人胎肺成纖維細胞)、EEN細胞(鼠胎成纖維細胞)和LM細胞(母鼠結締組織)沒有作用。帶瘤小鼠體內的內源性血管生成抑制素以大約每公斤體重10mg的全身濃度使用時可有效地抑制腫瘤轉移。
血管生成抑制素具有由纖溶酶原分子的Kringle區(qū)域限定的特定三維構象(Robbins，K，C.，“The plasminogen-plasmin enzymesystem”Hemostasis and Thrombosis，Basic Principles and Practice，2nd Edition，ed.by Colman，R.W.et al.，J.B.Lippincott Company，PP.340-357，1987)。在纖溶酶原分子的NH2末端部分有5個這樣的Kringle區(qū)域，這些區(qū)域是構象上相關的基元并且有實質上的序列同源性。認為血管生成抑制素的三維構象包括纖溶酶原Kringle區(qū)域1至3和Kringle區(qū)域4的一部分。纖溶酶原分子的每個Kringle區(qū)域均含有大約80個氨基酸及3個二硫鏈。已知在其他生物學活性蛋白質中存在這一半胱氨酸基元。這些蛋白質包括但不只限于凝血酶原、肝細胞生長因子、分散因子(scatter factor)和巨噬細胞刺激蛋白(Yoshimura，T，et al.，“Cloning，sequencing，and ex-pression of human macrophage stimulating protein(MSP，MSTI)Con-firms MSP as a member of the family of Kringle proteins and Locatesthe MSP gene on Chromosome 3”，J.Biol.Chem.，Vol.268，No.21，pp.15461-15468，1993)。預期具有體內抗血管生成活性的任何具有三維Kringle樣構象或半胱氨酸基元的分離的蛋白質或肽均包括在本發(fā)明范圍內。
本發(fā)明還包括為診斷或預測疾病例如癌癥的目的而檢測體液和組織中血管生成抑制素的方法。本發(fā)明還包括檢測細胞與組織中的血管生成抑制素結合位點和受體。本發(fā)明還包括通過給病人投用基本上純化的血管生成抑制素，或血管生成抑制素激動劑或拮抗劑，和/或血管生成抑制素抗血清或抗血管生成抑制素抗血清的抗血清，以治療或預防關節(jié)炎和腫瘤等血管生成疾病及過程的方法。其他治療方法包括投用與細胞毒性劑連接的血管生成抑制素、血管生成抑制素片段、血管生成抑制素類似物、血管生成抑制素抗血清，或血管生成抑制素受體激動劑和拮抗劑。應明確的是，血管生成抑制素可以是動物或人來源的。也可以通過化學反應或與表達系統(tǒng)合用的重組技術合成產生血管生成抑制素。也可以經酶促裂解分離的纖溶酶原或纖溶酶產生具有抗血管生成活性的肽，以生產血管生成抑制素。也可以由模擬將纖溶酶原裂解成血管生成抑制素之內源性酶的作用的化合物產生血管生成抑制素。也可以由影響纖溶酶原裂解酶之活性的化合物來調節(jié)血管生成抑制素的產生。
可以使用與血管生成抑制素特異結合的被動抗體療法來調節(jié)例如生殖、發(fā)育和傷口愈合及組織修復等血管生成依賴性過程。另外，可以投用抗血管生成抑制素抗體之Fab區(qū)域的抗血清，以阻斷內源性血管生成抑制素抗血清與血管生成抑制素結合的能力。
本發(fā)明還包括基因療法，借以調節(jié)病人體內的編碼血管生成抑制素的基因。Gene Transfer into Mammalian Somatic Cells in vivo，N.Yang，Crit，Rev.Biotechn.12(4)335-356(1992)中描述了稱為基因治療的，向細胞內轉移或輸送DNA以表達基因產物蛋白質的各種方法(該文列為參考文獻)。基因治療包括將DNA序列摻入體細胞或生殖系細胞中，用于來自體內或體內治療。基因治療的作用是替換基因、放大正?；虍惓；蚬δ?，及對抗感染性疾病及其他病理學改變。
以基因治療法處理這些醫(yī)學問題的策略包括識別有缺陷的基因，然后加入功能性基因以替換有缺陷基因的功能，或放大減弱的功能性基因等治療策略；或者加入編碼某產物蛋白質的基因，借以處理相關的病理條件，或使組織或器官對某療法更為敏感等預防策略。預防策略的一個例子是可以將血管生成抑制素基因置于病人體內，從而防止血管生成過程的發(fā)生；或者可以插一個使腫瘤細胞對放射治療更敏感的基因，然后再照射腫瘤時將會提高對腫瘤細胞的殺傷。
本發(fā)明中可望使用許多轉移血管生成抑制素DNA或血管生成抑制素調節(jié)序列的方法。作為基因治療的方法，也可想到轉染除正常發(fā)現(xiàn)與血管生成抑制素相聯(lián)系者以外的啟動子序列，或其他可增加血管生成抑制素蛋白質產生的序列。這一技術的一個例子是見于Transkaryotic Therapies，Inc.(Cambridge，Massachusetts)的技術，其中使用同源重組插入一個接通細胞中紅細胞生成素基因的“基因開關”。這樣的“基因開關”可用于激活正常情況下不表達血管生成抑制素(或血管生成抑制素受體)之細胞中的血管生成抑制素(或血管生成抑制素受體)。
用于基因治療的基因轉移方法分成物理學(例如電穿孔、直接基因轉移和顆粒轟擊)、化學(脂質基載體或其他非病毒載體)及生物學(病毒衍生的載體和受體攝入)這三大類方法。例如，可以使用的非病毒載體包括由DNA包被的脂質體?？梢詫⑦@種脂質體/DNA復合物直接靜脈注射到病人體內。一般認為脂質體/DNA復合物集中在肝中，由這里將DNA輸送到巨噬細胞和Kupffer細胞中。這些細胞是長期存活的并因而可提供被輸送之DNA的長期表達。此外，載體或基因的“裸露的”DNA可直接注射到所需器官，組織或腫瘤中，以有目標的釋放治療用DNA。
也可以依據(jù)輸送部位來描述基因治療方法學。輸送基因的基本方式包括來自體內的基因轉移，體內基因轉移，和體外基因轉移。在來自體內的基因轉移中，從病人體內取得細胞并使之在細胞培養(yǎng)物中生長。將DNA轉染到細胞中，擴增被轉染之細胞數(shù)目后重新植入病人體內。在體外基因轉移中，被轉化的細胞是生長于培養(yǎng)物中的細胞，例如組織培養(yǎng)細胞和來自特定病人體內的非特定細胞。轉染這些“實驗室細胞”后選擇并擴充被轉染的細胞，以便植入病人體內或作其他使用。
體內基因轉移包括將DNA導入存在于病人體內的病人細胞中。方法包括使用非感染性病毒介導的基因轉移法以在病人體內釋放基因，或者將裸露的DNA注射到病人體內的某一部位，由一定比例的細胞攝取該DNA并在其中表達基因產物蛋白質。此外，也可使用本文所述的其他方法，例如可使用“基因槍”在體外插入血管生成抑制素DNA或血管生成抑制素調節(jié)序列。
基因治療的化學方法可包括不一定是脂質體的脂質基化合物，以越過細胞膜運送DNA。使用脂轉染劑或細胞轉染劑(即與帶負電荷的DNA結合的脂質基陰離子)，制成可越過細胞膜并向細胞內提供DNA的復合物。另一種化學方法是利用受體基胞吞作用，包括使特異性配體結合到細胞表面受體上，并包膜并穿過細胞膜運輸之。配體與DNA結合并將整個復合物輸送到細胞內。將配體基因復合物注射到血流中，然后具有受體的靶細胞即可特異地結合配體并將配體-DNA復合物輸送到細胞內。
許多基因治療方法學都是利用病毒載體將基因插入細胞內。例如，已在來自體內的方法中使用經過改變的反轉錄病毒載體將基因導入外周和腫瘤侵潤淋巴細胞、肝細胞、表皮細胞、肌細胞，或其他體細胞中。然后將這些改變的細胞引入病人體內，以在體內提供由被插入的DNA編碼的基因產物。
也已使用病毒載體以體內方法將基因插入細胞中。為了指導外來基因的組織特異性表達，可以使用已知為組織特異性的順式作用調節(jié)元件或啟動子。或者，也可經在體內向特定解剖部位原位釋放DNA或病毒載體而達到這一目的。例如，在體內基因向血管中的轉移是通過將體外轉導的內皮細胞植入動脈壁上的選定部位而達到的。病毒感染的周邊細胞也可表達基因產物。例如可以借助一個導管將病毒載體直接送到體內部位，從而只使某些區(qū)域被病毒感染，并提供長期的位點特異性基因表達。也已在乳腺組織和肝組織中證明了可將改變的病毒注射到導入器官的血管內，從而利用反轉錄病毒載體進行體內基因轉移。
已用于基因治療方法中的病毒載體包括但不只限于反轉錄病毒、其他DNA病毒例如脊髓灰質炎病毒或新培斯病毒、腺病毒、腺伴隨病毒、皰疹病毒、SV40、痘苗病毒及其他DNA病毒。復制缺陷性鼠反轉錄病毒載體是最廣泛使用的基因轉移載體。鼠白血病反轉錄病毒由與核的核心蛋白和多聚酶(pol)復合的單鏈RNA組成，該RNA被蛋白核心(gag)包裝并由決定宿主范圍的糖蛋白外膜(env)所環(huán)繞。反轉錄病毒的基因組結構包括gag、pol、及被5′和3′長末端重復區(qū)(LTR)所包圍的env基因。反轉錄病毒載體系統(tǒng)揭示了這樣一個事實，即含有5′和3′LTRs及包裝信號的最小載體足以允許載體包裝、感染并整合到靶細胞中，條件是在包裝細胞系中以反式結構供應病毒結構蛋白質。用反轉錄病毒載體進行基因轉移的基本優(yōu)點包括可在大多數(shù)細胞類型中進行有效的感染和基因表達，使單拷貝載體準確地整合到靶細胞染色體DNA中，以及易于操作反轉錄病毒基因組。
腺病毒由與核心蛋白質復合的線性雙股DNA組成，并環(huán)繞有衣殼蛋白質。分子病毒學的進展已導致可以開發(fā)這些生物體的生物學功能，用以創(chuàng)造能夠在體內將新的基因序列轉導到靶細胞內的載體?；谙俨《镜妮d體將以高水平表達基因產物肽。腺病毒即使在低病毒滴度條件下也具有高的感染效率。另外，該病毒作為無細胞病毒顆粒是有全感染性的，所以不必注射病毒生產細胞系。腺病毒載體的另一個潛在優(yōu)點是能夠在體內完成對異源基因的長期表達。
DNA傳輸?shù)臋C械方法可利用包括用于膜融合的融合脂質泡囊如脂質體或其他泡囊、摻入陽離子脂質如脂質轉染劑之DNA的脂質顆粒、多聚賴氨酸介導的DNA轉移、DNA直接注射如將DNA微量注射到生殖細胞或體細胞中、氣動輸送的DNA包被的顆粒如用于“基因槍”中的金顆粒、以及無機化學手段如磷酸鈣轉染法。另一種配體介導的基因治療方法包括使DNA與特異性配體復合以形成配體-DNA結合物，從而將DNA導向特定細胞或組織中。
已發(fā)現(xiàn)將質粒DNA注射到肌肉細胞可使高比例的細胞被轉染并可持續(xù)表達標記基因。質粒的DNA可以被或不被整合到細胞的基因組中。已轉染之DNA的非整合將允許基因產物蛋白質在終末分化的、非增殖的組織中的長期轉染和表達，而不會使細胞或線粒體基因組發(fā)生突變性插入、缺失或改變。治療基因長期但不一定永久地轉移到特定細胞中可用于對遺傳性疾病的治療或預防?？煞蛛A段再注射DNA以維持基因產物水平，而接受體細胞的基因組不會發(fā)生突變。外源DNA的非整合可允許在一個細胞中存在幾種不同的外源DNA構建體，同時所有的構建體均可表達不同的基因產物。
顆粒介導的基因轉移方法最初被用于轉化植物組織。借助顆粒轟擊裝置或“基因槍”，產生一種加速DNA包被之高密度顆粒(如金或鎢)達到高速度的動力，使之穿透靶器官、組織或細胞。顆粒轟擊可用于體外系統(tǒng)，借助來自體內的或體內的轉移技術將DNA導入細胞、組織或器官中。
用于基因轉移的電穿孔是使用電流制得對電穿孔介導的基因轉移敏感的細胞或組織。使用有給定電流強度的簡單電脈沖增加膜的通透性，以這種方式DNA分子即可穿透到細胞中。這一技術可用于體外系統(tǒng)，或借助來自體內的或體內的轉移技術將DNA導入細胞、組織或器官中。
可使用載體介導的體內基因轉移將外源DNA轉染到細胞中?？梢詫⑤d體-DNA復合物方便地導入體液或血流中，然后位點特異性地引向體內的靶器官或組織?？墒褂弥|體和例如多聚賴氨基、脂質轉染劑或細胞轉染劑等多聚陽離子?？砂l(fā)展細胞特異性的或器官特異性的脂質體，這樣由脂質體攜帶的外來DNA便可被靶細胞攝入?？梢宰⑸湟阅承┘毎系奶禺愋允荏w為目標的免疫脂質體，以此作為將DNA插入帶受體之細胞中的方便方法。已使用的另一個載體系統(tǒng)是用于將DNA帶向肝細胞以進行體內基因轉移的脫唾液酸糖蛋白/多聚賴氨酸結合物系統(tǒng)。
也可以將已轉染的DNA與其他類型的載體結合，從而將DNA帶向接受體細胞，然后定居在胞質或核質中?？梢詫NA偶聯(lián)到特異性工程化泡囊復合物中并直接帶入核中。
可以投用與血管生成抑制素基因結合的化合物，或與血管生成抑制素基因相聯(lián)系的控制區(qū)域，或其相應的RNA轉錄物以改變轉錄或轉譯速率，從而完成血管生成抑制素的基因調節(jié)。此外，可以使病人投用被編碼血管生成抑制素的DNA序列轉染的細胞，以提供一個血管生成抑制素的體內來源。例如，可以用含有編碼血管生成抑制素之核酸序列的載體轉染細胞。
本文所用的術語“載體”是指可含有特定核酸序列的或與之相聯(lián)系的運載體，其功能是將特定核酸序列輸送到細胞內。載體的例子包括質粒和傳染性微生物如病毒，或非病毒載體如配體-DNA結合物、脂質體、脂質-DNA復合物?？赏麑⒑醒苌梢种扑谼NA序列的重組DNA分子可操作地連接到表達控制序列上，以形成能夠表達血管生成抑制素的表達載體。被轉染的細胞可以是衍生于病人之正常組織、病人的患病組織的細胞，或者可以是非病人細胞。
例如，可用能夠表達本發(fā)明的血管生成抑制素蛋白質的載體轉染從病人中摘除的腫瘤細胞，然后重新導入病人體內。被轉染的腫瘤細胞在病人體內以足可抑制腫瘤生長的水平產生血管生成抑制素。病人可以是人或非人動物。細胞也可以是由非載體材料，或本領域已知的物理或化學方法如電穿孔、離子穿孔或通過“基因槍”轉染的。另外，可以不借助載體將血管生成抑制素DNA直接注射到病人體內。具體地說，可將血管生成抑制素DNA注射到皮膚、肌肉或血流中。
將血管生成抑制素轉染到病人體內的基因治療方法可以通過將血管生成抑制素DNA整合到細胞的基因組中或微型染色體中，或作為細胞之胞質或核質中的分離的復制或非復制DNA構建體來完成。血管生成抑制素的表達可長期持續(xù)進行，或者定期反復注射以在細胞、組織或器官中維持血管生成抑制素蛋白質的所需水平或預定的血液內水平。
可以在HPLC C4柱上分離血管生成抑制素(見表3)。以30-35％乙腈梯度洗脫血管生成抑制素蛋白質?；谠谶€原條件下的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)分析，有活性蛋白質帶是作為約38千道爾頓的單一峰洗脫的。
本發(fā)明人已證明生長的原發(fā)腫瘤與內皮細胞增殖特異性抑制劑(包括能抑制在轉移范圍以內的血管生成，從而抑制轉移瘤本身的生長的血管生成抑制素)向血流中的釋放相關。與原發(fā)腫瘤相關的血管生成抑制素的來源是未知的，該化合物可通過用特異性蛋白酶降解纖溶酶原來產生，或者血管生成抑制素可能通過編碼血管生成抑制素之特定基因的表達來產生。
原發(fā)腫瘤的血管生成表型取決于血管生成肽以超過由正常細胞產生之內皮細胞抑制物的量生成，但據(jù)信其在向瘤生成轉化期間受到向下調節(jié)。雖然血管生成抑制素在個別腫瘤細胞中的產生相對于由其親代細胞類型產生可能受到下調，但由整個腫瘤合成的抑制物的總量是可進入循環(huán)并抑制微量轉移之遠距離部位的內皮生長。循環(huán)中的血管生成抑制素可比由原發(fā)腫瘤釋放的血管生成肽保持明顯更長的時間。因此，血管生成肽似乎是在局部起作用，而血管生成抑制素則在全身起作用并且以相對長的半衰期在血液中循環(huán)。血管生成抑制素的半衰期約為12小時至5天。
雖然并不拘泥于下列推想，但據(jù)信當腫瘤逐漸有血管生成時便釋放出一種或多種血管生成肽(例如aFGF、bFGF、VEGF、IL-8、GM-CSF等)，其局部作用于來自血管外方向的原發(fā)腫瘤附近的靶內皮，并且不進入循環(huán)(或者以短的半衰期循環(huán))。為使原發(fā)腫瘤繼續(xù)擴充其群體，這些血管生成肽必須以足可克服內皮細胞抑制物(血管生成的抑制物)之作用的量產生。一旦這些原發(fā)腫瘤充分生長，它便繼續(xù)向循環(huán)中釋放內皮細胞抑制物。根據(jù)這一假設，這些抑制物遠距離作用于離開原發(fā)腫瘤的，從血管內方向開始的轉移部位的靶毛細血管內皮，并繼續(xù)進入循環(huán)。因此，恰是在遠距離轉移瘤開始生成血管時，其鄰近部位的毛細血管內皮即受到新進入的血管生成抑制素的中制。
一旦原發(fā)腫瘤達到了足以引起血管生成抑制素連續(xù)向循環(huán)中釋放的大小時，第二次腫瘤移植(微量轉移)便難以開始或增加其自身的血管生成。如果在原發(fā)腫瘤植入后的短時間內發(fā)生第二次腫瘤植入(例如植入皮下，或角膜，或經靜脈內轉移到肺)，則原發(fā)腫瘤將不能抑制次生腫瘤生長(因為次生腫瘤中的血管生成一直在進行中)。如果同時植入兩個腫瘤(例如在相反的兩側)，則抑制物可能對彼此有等同的抑制作用。
本發(fā)明的血管生成抑制素可以(i)作為抗血管生成治療劑投用于帶腫瘤的人或動物；(ii)作為診斷標記監(jiān)測人或動物血清、尿或組織；以及(iii)用作分析腫瘤病人血清和尿中相似血管生成抑制分子的基礎。
作為本發(fā)明的一部分，其包括可從病人的血液或尿等體液中分離的血管生成抑制素或可用本領域已知的重組DNA方法或肽化學合成方法生產的血管生成抑制素。蛋白質純化方法是本領域已知的，下文實施例中提供了純化血管生成抑制素，及檢測抑制物活性之方法的特定實例?？墒褂孟嗨频募夹g完成人內源性血管生成抑制素的分離。
使用重組DNA技術生產血管生成抑制素之方法的一個實例包括以下步驟(1)按上文討論的并在下文中更詳細描述的方法鑒定和純化血管生成抑制素，(2)確定純化之抑制物的N末端氨基酸序列，(3)合成得到血管生成抑制素序列的5′和3′DNA寡核苷酸引物，(4)使用聚合酶擴增血管生成抑制素基因序列，(5)將擴增的序列插入適當?shù)妮d體如表達載體中，(6)將含有基因的載體導入微生物或其他能夠表達抑制物基因的表達系統(tǒng)中，以及(7)分離重組產生的抑制物。適當?shù)妮d體包括病毒、細菌或真核生物(如酵母)表達載體。上述這些技術在實驗室手冊例如Sambrook et al.，“Molecular ClomingALaboratory Manual”2th Eeition，Cold Spring Harbor Press，1989中有更詳細的描述。已公開了人纖溶酶原的DNA序列(Browne，M.J.etal.，“Expression of recombinant human plasminogen and aglycoplas-minogen in HeLa cells”，F(xiàn)ibrinolysis Vol.5(4)，257-260，1991)和列入本文作為參考。
也可以用下述方法從高水平表達血管生成抑制素的細胞或組織(例如腫瘤細胞)中分離血管生成抑制素的基因(1)從組織中分離信使RNA，(2)使用反轉錄酶產生相應的DNA序列，然后(3)使用聚合酶鏈反應(PCR)，以適當?shù)囊飻U增編碼活性血管生成抑制素氨基酸序列的DNA序列。
生產血管生成抑制素或其生物學活性片段的另一種方法是使用肽合成技術。一旦按下文詳述的檢測系統(tǒng)找到了血管生成抑制素的生物學活性片段，即可例如用肽自動測序方法測定其序列?；蛘?，一經使用按上述方法分離了編碼血管生成抑制素的基因或DNA序列，即可使用本領域已知的手工或自動測序方法確定DNA序列。反過來核酸序列也可提供有關氨基酸序列的信息。因此，如果用特殊方法例如胰酶消化法產生了生物學活性片段，或者測定了片段的N末端序列，即可根據(jù)相應的DNA序列確定其余的氨基酸序列。
一旦知道了肽的氨基酸序列，即可用本領域已知的技術，例如E.Atherton and R.C.Sheppard，IRL Press，Oxford，England中所介紹的固相肽合成技術(“Solid Phase Peptiole SynthesisA PracticalApproach”)合成所說的片段。同樣，可合成多個片段，然后將其連接在一起形成較大的片段。也可以合成在特定位置有氨基酸取代的這些合成肽片段，以試驗體內和體外激動和拮抗活性。可以使用對組織具有高度親和性的肽片段從親和柱上分離血管生成抑制素受體。分離和純化血管生成抑制素受體是闡明血管生成抑制素作用機制的基本步驟。分離血管生成抑制素受體和鑒定血管生成抑制素激動劑及拮抗劑將有利于開發(fā)用于調節(jié)血管生成抑制素受體(發(fā)揮生物學活性的最后途徑)的活性。受體的分離得以構建核苷酸探針，從而可使用原位和溶液雜交技術監(jiān)測受體的定位及合成。此外，可以分離血管生成抑制素受體的基因，摻入表達載體中并轉化到細胞例如病人腫瘤細胞內，以提高細胞、組織或腫瘤與血管生成抑制素結合并抑制局部血管生成的能力。
血管生成抑制素可有效地治療由血管生成介導的或涉及血管生成的疾病或過程。本發(fā)明包括用有效量的血管生成抑制素或其生物學活性片段，或共同具有抗血管生成活性的組合的血管生成抑制素片段，或血管生成抑制素激動劑和拮抗劑治療血管生成介導的疾病的方法。血管生成介導的疾病包括但不只限于實體瘤；血源腫瘤如白血??；腫瘤轉移；良性腫瘤例如血管瘤，聽神經瘤，神經纖維瘤，沙眼，及化膿性肉芽腫；類風濕性關節(jié)炎；牛皮癬；眼的血管生成性疾病例如糖尿病性視網膜病、早熟的視網膜病、黃斑退化、角膜移植物排斥、神經血管性青光眼、晶狀體后纖維組織形成、潮紅；Osler-web-ber綜合癥；心肌血管生成；斑塊神經血管生成；毛細管擴張；血友病性關節(jié)；血管纖維瘤及傷口肉芽生成。血管生成抑制素可用于治療因內皮細胞過多或異常刺激所致的疾病。這些疾病包括但不只限于腸粘連、Crohn氏病、動脈粥樣硬化、硬皮病及肥大性瘢痕即瘢痕瘤。血管生成抑制素可因阻止胚胎植入所需的血管生成而用作生育控制劑。血管生成抑制素可用于治療具有例如因貓抓傷病(Rochele mi-nalia quintosa)或潰瘍病(Helicobacter pylori)所致之病理學后果的血管生成的疾病。
血管生成抑制素的合成肽片段具有多種不同的用途。放射標記以高特異性和親和力與血管生成抑制素受體結合的肽，并借以使用放射自顯影和膜結合技術觀察和定量結合位點。這一應用提供了重要的診斷和研究工具。對血管生成抑制素受體之結合性質的了解有助于研究與受體相關聯(lián)的轉導機制。
另外，用短半衰期同位素標記的血管生成抑制素有可能利用正電子發(fā)射X線斷層法或其他先進的放射照相技術在體內顯現(xiàn)受體結合位點，以定位有血管生成抑制素結合位點的腫瘤。
系統(tǒng)取代這些合成肽內的氨基酸，可產生血管生成抑制素受體的高親和力肽激動劑和拮抗劑，以增加或減少與其受體結合的血管生成抑制素?？墒褂眠@樣的激動劑抑制微量轉移的生長，從而限制腫瘤的擴散。在血管生成不足的情況下應用血管生成抑制素的拮抗劑以阻斷血管生成抑制素的抑制作用并促進血管生成。例如，這種處理方法可具有促進糖尿病人傷口愈合的治療作用。
利用血管生成抑制素肽展開從培養(yǎng)的腫瘤細胞中分離血管生成抑制素受體的親和柱。在分離并純化血管生成抑制素受體后進行氨基酸序列分析?？苫谶@一信息鑒定并分離編碼血管生成抑制素受體的基因。然后將克隆的核酸序列插入到能夠表達該受體的載體中。這些技術都是本領域技術人員熟知的。將編碼血管生成抑制素受體的核酸序列轉染到腫瘤細胞中，并由被轉染的腫瘤細胞表達該受體，以提高這些細胞對內源性或外源性血管生成抑制素的反應性并進而降低轉移生長的速率。
將細胞毒性劑如蓖麻蛋白連接到血管生成抑制素及高親和性血管生成抑制素肽片段上，從而提供用于破壞結合血管生成抑制素之細胞的工具?？梢栽诎ǖ恢幌抻谖⒘哭D移和原發(fā)腫瘤在內的許多位置見到這些細胞。以造成最大化釋放的方式將與細胞毒性劑連接的肽輸注到所需的部位。例如，通過套管將蓖麻蛋白連接的高親和性血管生成抑制素片段輸送到導向靶部位的血管中或直接導向靶部位。也可以通過與輸注導管連接的滲透泵以受控制的方式釋放這些藥劑。也可以將組合的血管生成抑制素拮抗劑與血管生成刺激劑合用，以增加組織的血管生成。這一療法可有效地破壞轉移性癌癥。
血管生成抑制素可與其他用于治療疾病的組合物和方法合用。例如，可常規(guī)使用外科手術、放射治療或化學療法連同血管生成抑制素治療腫瘤，然后給病人投用血管生成抑制素以繼續(xù)擴展對微量轉移灶的控制，并穩(wěn)定和抑制殘存原發(fā)腫瘤的生長。此外，可將血管生成抑制素、血管生成抑制素片段、血管生成抑制素抗血清、血管生成抑制素受體激動劑、血管生成抑制素受體拮抗劑或其混合物與藥學上可接受的賦形劑、適當?shù)木忈尰|如生物可降解的聚合物組合，制成治療組合物。
所使用的緩釋基質通常是由聚合物等材料制得的，可經酶促或酸/堿水解或溶解而降解的基質。一旦引入體內，基質即受到酶和體液的作用。緩釋基質可選自生物相容性材料，例如脂質體、聚交酯(聚乳酸)、聚乙交酯(乙醇酸的聚合物)、乳交酯共乙交酯(乳酸和乙醇酸的共聚物)、聚酐、聚(原酸)酯、多肽、透明質酸、膠原、硫酸軟骨素、羧酸、脂肪酸、磷脂、多糖、核酸、多聚氨基酸、氨基酸例如苯丙氨酸、酪氨酸、異亮氨酸、多核苷酸、聚乙烯基丙烯、聚乙烯吡咯烷酮及硅氧烷。優(yōu)選的生物可降解基質是選自聚交酯、聚乙交酯、聚交酯共乙交酯(乳酸和乙醇酸的共聚物)。
本發(fā)明的血管生成調節(jié)治療組合物可以是固體、液體或氣霧化形式的，并可按任何已知的給藥途徑給藥。固體治療組合物的例子包括丸劑、乳膏及可植入的劑量單位。丸劑可經口服給藥，治療性乳膏可表面給藥。可植入的劑量單位可在局部例如腫瘤部位給藥，或者可以植入皮下以便全身釋放治療用血管生成調節(jié)組合物。液體組合物的例子包括適于皮下、靜脈內、關節(jié)內注射的配制品，及適于表面或眼內給藥的配制品。氣霧劑的例子包括肺部給藥的吸入劑。
本發(fā)明的血管生成抑制素還可用于產生對抑制物和其受體特異的抗體?？贵w可以是多克隆或單克隆抗體?？梢詫⑦@些與血管生成抑制素或血管生成抑制素受體特異結合的抗體用于本領域技術人員熟知的診斷方法及藥盒中，借以檢測或定量體液或組織中的血管生成抑制素或血管生成抑制素受體。可使用這些試驗的結果來診斷或預測腫瘤及其他血管生成所介導的疾病的發(fā)生或復發(fā)。
也可將血管生成抑制素用于檢測和定量能夠結合血管生成抑制素之抗體的方法和藥盒中。這些藥盒可以檢測循環(huán)血管生成抑制素抗體，借以指示在由原發(fā)瘤于原位分泌的血管生成抑制素存在下出現(xiàn)的微量腫瘤轉移傳播。有這種循環(huán)抗血管生成抑制素抗體的病人很可能發(fā)展多發(fā)腫瘤和癌癥，并且很可能在進行一段時間的治療后出現(xiàn)腫瘤復發(fā)?？墒褂眠@些抗血管生成素抗體Fab片段作為抗原以產生可用于中和抗血管生成抑制素抗體的抗血管生成抑制素Fab片段血清。可用這種方法，減少抗血管生成抑制素抗體對循環(huán)血管生成抑制素的排除，從而有效地提高循環(huán)血管生成抑制素水平。
本發(fā)明的另一個方面是涉及阻斷過量內源性血管生成抑制素之作用的方法。為此可使用對系統(tǒng)內不需要的血管生成抑制素特異的抗體來被動免疫人或動物。這種方法對于治療異常排卵、月經和胎盤形成，以及血管生成是很重要的，并為檢測血管生成抑制素排除對腫瘤轉移過程的影響提供了有用的手段。血管生成抑制素抗體的Fab片段含有血管生成抑制素的結合位點?？墒褂帽绢I域已知的技術從血管生成抑制素抗體中分離該片段?？墒褂醚苌梢种扑乜寡宓腇ab片段作為抗原以產生抗Fab片段抗血清。輸注這種針對抗血管生成抑制素Fab片段的抗血清可阻止血管生成抑制素與血管生成抑制素抗體結合。可經阻斷血管生成抑制素與抗血管生成抑制素之Fab片段的結合，中和內源性抗血管生成抑制素抗體而達到治療目的。這種方法的凈效果是有利于提高內源性循環(huán)血管生成抑制素達到靶細胞的能力，從而減少轉移瘤傳播。
應明確的是，本發(fā)明意欲包括具有內皮抑制活性之血管生成抑制素的任何衍生物。本發(fā)明包括完整的血管生成抑制素蛋白質、血管生成抑制素蛋白質的衍生物及血管生成抑制素蛋白質的生物學活性片段。其中包括具有氨基酸取代的或帶有與氨基酸功能基團連接之糖鏈或其他分子的有血管生成抑制素活性的蛋白質。本發(fā)明還包括編碼血管生成抑制素和血管生成抑制素受體的基因及由這些基因表達的蛋白質。
可以作為按本領域技術人員已知的配制方法得到的藥用配制品中的分離的和基本上純化的蛋白質和蛋白質片段來提供有上述血管生成抑制素活性的蛋白質和蛋白質片段?？砂闯Ｒ?guī)途徑投用這些配制品。一般說來，可合用表面、透皮、腹腔內、顱內、腦室內、腦內、子宮內、陰道內、口腔、直腸或胃腸道外(如靜脈內、脊髓內、皮下或肌肉內)等途徑給藥。另外，可將血管生成抑制素摻入用于緩慢釋放化合物的生物可降解的聚合物內，將聚合物植入希望釋放藥物的鄰近部位例如腫瘤部位，以緩慢地全身釋放血管生成抑制素。也可以利用滲透微泵使藥物通過插管受控制地以高濃度釋放到感興趣的部位，例如直接導向轉移生長部位或導入進入腫瘤的血管內。例如在Brem et al.，J.Neurosurg.74441-446(1991)(引用其全文作為參考)中詳細描述了生物可降解的聚合物及其應用。
本發(fā)明血管生成抑制素的劑量取決于疾病狀態(tài)、被處理的病理條件及其他臨床因素，例如人或動物的體重和一般狀況，以及給藥途徑等。為治療人或動物，可投用0.5mg/kg至500mg/kg的血管生成抑制素。依據(jù)血管生成抑制素在特定動物或人體內的半衰期，可以每天幾次或每周一次給藥。應明確的是，本發(fā)明適用于人和脊椎動物。本發(fā)明的方法欲包括單一或多種藥物同時或相繼給藥。
血管生成抑制素配制品包括適于口服、直腸內、眼內(包括晶體內或眼房內)、鼻內、表面(包括口腔或舌下)、子宮內、陰道內或胃腸道外(包括皮下、腹腔內、肌肉內、靜脈內、皮內、顱內、氣管內及硬膜腔內)途徑給藥的配制品。血管生成抑制素配制品可以作為單位劑量形式存在并可用常規(guī)制藥技術制得。這些技術包括使活性成分與醫(yī)藥上可接受的載體或賦形劑結合的步驟。一般說來，可使活性成分與液體載體或精細分散的固體載體均勻地和密切的結合制成配制品，然后在必要時制成成形產品。
適于胃腸道外給藥的配制品包括可含有抗氧化劑、緩沖劑、制菌劑及可使配方與病人的血液有等滲壓之溶質的液體和非液體無菌注射溶液；以及可包括懸浮劑和增稠劑的液體和非液體無菌懸液。配制品可以存在于單劑量或多劑量的容器例如密封的安瓶和小瓶中，并可制成凍干品，使用前只要加入無菌液體載體例如注射用水即可?？梢詮那笆龅臒o菌粉末、顆粒和片劑制備臨時使用的注射溶液和懸液。
優(yōu)選的單位劑量配制品是含有每日劑量或單位的、每日亞劑量的或其適當部分之給藥成分的配制品。應明確的是，除了上面特別提到的成分外，本發(fā)明的配制品還可含有常規(guī)用于這種類型配方中的其他藥劑。例如可以加入細胞毒性劑，或與血管生成抑制素或其生物學功能肽片段組合，以提供雙重治療效果。
可以按標準微量化學手段和以HPLC及質譜法檢查的純度來合成本發(fā)明的血管生成抑制肽。肽合成、HPLC純化及質譜法都是本領域技術人員已知的。也可以在重組大腸桿菌或酵母表達系統(tǒng)中生產血管生成抑制素肽和血管生成抑制素受體肽，并用柱層析法純化之。
可以合成完整血管生成抑制素分子的不同的肽片段，這些肽片段的應用包括但不只限于作為誘導產生特異性抗血清的抗原、作為在血管生成抑制素結合位點上有活性的激動劑和拮抗劑、作為可以與細胞毒性劑連接或合用的肽，用于有針對性的殺傷結合血管生成抑制素的細胞?？梢曰谄湓诜肿又獠繀^(qū)域上的位置來選擇包含這些肽的氨基酸序列，以便于與抗血清結合。在所合成的片段中分別代表血管生成抑制素的氨基和羧基末端，以及分子的中間區(qū)域。
使用蛋白質序列數(shù)據(jù)庫例如GenBank、Brookhaven Protein、SWISS-PROT及PIR，將這些肽序列與已知的序列相比較，以確定可能的序列同源性。這一信息有利于排除與其他分子上表現(xiàn)有高度序列同源性的序列，從而在開發(fā)血管生成抑制素的抗血清、激動劑和抑制劑中提高特異性。
可以使用標準方法將血管生成抑制素和血管生成抑制素衍生的肽偶聯(lián)到其他分子上。血管生成抑制素的氨基和羧基末端均含有酪氨酸和賴氨酸殘基，并可使用多種技術進行同位素和非同位素標記，例如用常規(guī)技術(酪氨酸殘基-氯胺T、iodegen、乳過氧化物酶；賴氨酸殘基-Bolton-Hunter試劑)進行放射標記。這些偶聯(lián)技術都是本領域技術人員已知的?；蛘?，可以將酪氨酸或賴氨酸加到沒有這些殘基的片段上，以便于標記肽分子上的反應性氨基和羥基基團。基于氨基酸上可利用的功能性基團選擇偶聯(lián)技術，這些基團包括但不只限于氨基、巰基、羧基、酰胺、苯酚和咪唑。用于影響這些偶聯(lián)的各種試劑包括戊二醛、重氮化的聯(lián)苯胺、碳化二亞胺和對苯醌。
將血管生成抑制素與同位素、酶、載體蛋白質、細胞毒性劑、熒光分子、化學發(fā)光劑、生物發(fā)光劑及其他化合物偶聯(lián)，以提供多種應用。使用適于特定反應的不同技術來確定偶聯(lián)反應的效率。例如，使用有高比活性的氯胺T和Na125I完成用125I對血管生成抑制素肽的放射標記。用焦亞硫酸鈉終止反應并在一次性使用的柱上將混合物脫鹽。從柱上洗脫標記的肽并收集各部分。從各部分取等份試樣并在γ計數(shù)器中測放射活性。以這種方法，從標記的血管生成抑制素肽中分離未反應的Na125I。儲存有最高比放射活性的肽部分，以用于繼后的分析，例如用于分析其與血管生成抑制素抗血清結合的能力。
肽結合物的另一個應用是用于生產多克隆抗血清。例如使用戊二醛將含有賴氨酸殘基的血管生成抑制素肽連接到純化的牛血清白蛋白上。經檢測放射性標記之肽的摻入來確定反應的效率。透析分離未反應的戊二醛和肽。將結合物儲存?zhèn)溆谩?br> 可以產生抗血管生成抑制素、血管生成抑制素類似物、血管生成抑制素之肽片段及血管生成抑制素受體的抗血清。在肽合成和純化后，使用本領域技術人員已知的技術引發(fā)產生多克隆和單克隆抗血清。例如可以在兔、綿羊、山羊或其他動物體內產生多克隆抗血清?？梢詫⒔Y合于牛血清白蛋白等載體分子上的血管生成抑制素肽，或血管生成抑制素本身與佐劑混合物合用，乳化后，皮下注射于背部、頸部、協(xié)腹部的多個部位，有時也可注射于動物的足墊中。以例如2至4周的間隔期進行加強注射。每次注射后約7至10天經靜脈穿刺，例如從擴張后的耳緣靜脈采取血液樣品。使血樣于4℃過夜凝固，并于4℃下以大約2400xg離心約30分鐘。除去血清，等分后于4℃下保存以備短時內使用，或者于-20至-90℃保存留待以后的分析使用。
對產生多克隆抗血清的所有血清樣品和生產單克隆抗血清的培養(yǎng)基樣品進行分析以確定抗體滴度。通過幾種手段確定溶度，例如使用點印跡和密度分析法，也可以用蛋白A、第二抗血清、冷乙醇或活性碳-葡聚糖沉淀放射標記的肽-抗體復合物，然后再用γ計數(shù)器測定活性。也可以在市購的親和層析柱上純化最高滴度抗血清。使血管生成抑制素肽偶聯(lián)到親和柱中的凝膠上。使抗血清樣品通過柱，而抗血管生成抑制素抗體仍結合于柱上。然后洗脫這些抗體，收集后檢測其溶度和特異性。
試驗最高溶度血管生成抑制素抗血清以確定a)對抗原有最高特異性結合并有最低非特異性結合的最適抗血清稀釋度；b)在頂替標準曲線中結合漸增量之血管生成抑制素肽的能力，c)與包括纖溶酶原及相關種動物之血管生成抑制素在內的相關肽和蛋白質的可能的交叉反應性，d)檢測血漿、尿、組織和細胞培養(yǎng)基之提取物中之血管生成抑制素肽的能力。
檢測血管生成抑制素和血管生成抑制素受體的藥盒也將包括在本發(fā)明范圍內。進一步檢查具有最高溶度和特異性并可檢測血漿、尿和組織，以及細胞培養(yǎng)基之提取物中血管生成抑制素肽的抗血清，將很容易建立用于迅速、可靠、靈敏并特異地檢測和定位血管生成抑制素的藥盒。這些檢測藥盒包括但不只限于使用以下技術競爭和非競爭檢測法、放射免疫法、生物發(fā)光檢測法、化學發(fā)光檢測法、熒光檢測法、夾心檢測法、免疫放射檢測法、點印跡法、包括用于迅速監(jiān)測尿或血液的ELISA、微量溶定板、抗體包被條或測桿在內的酶聯(lián)測定法、以及免疫細胞化學檢測法。對每種藥盒均要確定其使用范圍、靈敏性、精確度、可靠性、特異性及再現(xiàn)性。在頂替或活性標準曲線上于20％、50％和80％點位置確定測定內和測定間的變化。
常用于研究和臨床中檢測藥盒的一個例子是放射免疫試驗(RIA)藥盒。以下舉例說明血管生成抑制素RIA檢測法。在成功地進行放射碘標記并純化血管生成抑制素或血管生成抑制素肽后，向在適當緩中系統(tǒng)中含有相對恒定量放射活性(例如10,000cpm)的試管中以幾個不同的稀釋度加入有最高溶度的抗血清。其他試管則含有緩沖液或預免疫血清，以確定非特異性結合。4℃保溫24小時后，加入蛋白A并旋轉試管，室溫下保溫90分鐘，并于4℃下以大約2000-2500xg離心，以沉淀出與標記之抗原結合的抗體復合物。抽吸除去上清液并在γ計數(shù)器中計數(shù)沉淀物中的放射活性。進一步鑒定減去非特異性結合后結合大約10-40％標記肽的抗血清稀釋液的特征。
然后，向含有放射標記肽和抗血清的試管內加入已知量的血管生成抑制素肽，以估計用于產生抗血清的該肽的稀釋度范圍(約為0.1pg至10ng)。繼續(xù)保溫一段時間，例如24至48小時后，加入蛋白A并離心該試管，除去上清并計數(shù)沉淀中的放射活性。由未被標記的血管生成抑制素肽(標準品)取代放射標記的血管生成抑制素肽的結合作用，得到標準曲線。向檢測試管中加入幾個濃度的其他血管生成抑制素肽片段、纖溶酶原、和來自不同種動物的血管生成抑制素，以及同源肽，以分析血管生成抑制素抗血清的特異性。
使用已成功地用于提取血管生成抑制素的提取技術從包括但不只限于原發(fā)和繼發(fā)腫瘤、Lewis肺癌、血管生成抑制素生產細胞的培養(yǎng)物、胎盤、子宮、以及腦、肝和腸等其他組織的各種組織中制備提取物。在凍干或真空離心蒸發(fā)濃縮(Speedvac)組織提取物后，加入檢測緩沖液并分成不同等份置于RIA試管內。已知血管生成抑制素生產細胞的提取物產生與標準曲線平行的頂替曲線，而不產生血管生成抑制素之組織的提取物則不從血管生成抑制素抗血清中置換放射標記的血管生成抑制素。另外，以漸增的量向檢測試管中加入得自帶Lewis肺癌之動物的尿、血漿及腦脊液的提取物。平行頂替曲線表明了血管生成抑制素檢測法檢測組織和體液中之血管生成抑制素的實用性。
另外還對等分樣品進行反相HPLC分析，以進一步鑒定含血管生成抑制素的組織提取物。收集洗脫部分，在真空離心蒸發(fā)濃縮器中干燥，加RIA緩沖液重新溶解并用血管生成抑制素RIA檢測法分析之。最大量的血管生成抑制素免疫反應性存在于血管生成抑制素洗脫位置所對應的各管中。
檢測藥盒中備有使用說明書、抗血清、血管生成抑制素或血管生成抑制素肽、及可能的放射標記的血管生成抑制素和/或用于沉淀未結合之血管生成抑制素-血管生成抑制素抗體復合物的試劑。藥盒可用于檢測患有或沒有腫瘤之動物和人的生物體液和組織提取物中的血管生成抑制素。
另一種藥盒是用于定位組織和細胞中的血管生成抑制素。該血管生成抑制素免疫組織化學藥盒提供有使用說明書、血管生成抑制素抗血清，和可能的封閉血清及與用來觀察第一抗血清存在的熒光分子例如異硫氰酸熒光素，或某些其他試劑連接的第二抗血清。免疫組織化學技術是本領域技術人員已知的。該血管生成抑制素免疫組織化學藥盒允許使用光學和電子顯微鏡定位組織切片和培養(yǎng)的細胞中的血管生成抑制素。其可用于研究和臨床目的。例如，活體解剖或收集腫瘤并用切片機切制組織切片，以檢查血管生成抑制素產生的部位。在檢測和治療癌癥中，這些資料可用于診斷及可能的治療目的。觀察血管生成抑制素生物合成之位點的另一種方法包括放射標記用于原位雜交的核酸，以探查血管生成抑制素信使RNA。同樣，也可以用免疫組織化學技術定位、觀察并定量血管生成抑制素受體。
借助下列實施例進一步舉例描述本發(fā)明，但這些實施例并不以任何方式限制本發(fā)明的范圍。相反，很顯然，在閱讀本說明書后，可提示本領域技術人員在不背離本發(fā)明的精神和/或待批權利要求范圍的情況下對本發(fā)明作出各種其他修改和改動。
實施例1選擇一個其中轉移瘤的生長受到原發(fā)瘤的抑制并在除去原發(fā)瘤后加速轉移瘤生長的動物-腫瘤系統(tǒng)經篩選各種能夠抑制其自身轉移的小鼠腫瘤，選擇出其中原發(fā)瘤最有效地抑制肺轉移的Lewis肺癌。給同基因C57B16/J六周齡雄性小鼠注射(背部皮下)1×106個腫瘤細胞。3-4天后第一次出現(xiàn)可見的腫瘤。當腫瘤長到大約1500mm3時，將小鼠隨機分成兩組。第一組完全切除原發(fā)病，第二組則在假手術后留下整個腫瘤。雖然500mm3至3000mm3大小的腫瘤抑制轉移瘤的生長，但1500mm3原發(fā)瘤是以高存活率被安全切除并且不發(fā)生局部復發(fā)的最大原發(fā)瘤。
21天后殺死所有小鼠并進行尸體解剖。在帶有完整原發(fā)瘤的小鼠體內有4+2個可見的轉移灶，而在已切除了腫瘤的小鼠體內則有50+5個轉移灶(p＜0.0001)。如前已證明的，與腫瘤生長密切相關的肺臟重量進一步證實了這些數(shù)據(jù)。與留有完整原發(fā)瘤的小鼠相比，已切除了腫瘤的小鼠凈肺臟重量增加了400％(p＜0.0001)。
該實驗模型給出可再現(xiàn)的數(shù)據(jù)，并且所述的實驗是可以重復的。該腫瘤被標記為“Lewis腫瘤-低轉移性”(LLC-Low)。在缺乏B和T淋巴細胞的SCID小鼠中，腫瘤也以幾乎完全相同的模式抑制轉移。
實施例2分離無論是否除去了原發(fā)瘤均高度轉移的Lewis肺癌的變體在一組小鼠中從實施例1的LLC-Lwo細胞系自發(fā)產生Lewis肺癌的高轉移變體，按照實施例1中所述的方法分離之并重復移植之。無論是否存在原發(fā)瘤，該腫瘤LLC-High)均形成30處以上的可見的肺轉移。
實施例3小鼠體內轉移瘤的大小和腫瘤細胞的增殖速率。抑制轉移之原發(fā)瘤(LLC-Low)的影響。
所有實驗中均使用C57B16/J小鼠。小鼠皮下接種LLC-Low細胞，14天后切除半數(shù)小鼠的原發(fā)瘤。于切除腫瘤后的第5、10和15天殺死小鼠。得到肺轉移的組織學切片。帶有完整原發(fā)瘤的小鼠的肺中具有未形成神經血管的微量轉移灶。這些轉移瘤的直徑限于12-15層細胞，并且甚至在除去腫瘤后的15天也沒有顯示明確的增大。相反，切除了原發(fā)瘤的動物早在手術后5天即出現(xiàn)大的有血管生成的轉移瘤。到切除腫瘤后的第15天這些轉移瘤的體積進一步增大4倍(如反映在肺臟重量的增加及組織學改變)。在實驗結束前沒有50％除去了原發(fā)瘤的動物死于腫瘤肺轉移。所有帶完整原發(fā)瘤的動物在實驗結束時仍存活。
計數(shù)被以前注入小鼠體內的BrdU著染的細胞核，確定轉移灶內腫瘤細胞的復制速率。在帶有完整原發(fā)瘤之動物的小的無血管的轉移瘤中，摻入BrdU之腫瘤細胞的高百分率相當于已除去了原發(fā)瘤之小鼠的大的有血管生成的轉移瘤中腫瘤細胞的BrdU摻入量(圖3)。這一發(fā)現(xiàn)提示，原發(fā)瘤的存在對轉移灶內腫瘤細胞的復制速率沒有直接影響。
圖3中，左框顯示在有或沒有原發(fā)腫瘤的情況下肺中腫瘤細胞的BrdU標記指數(shù)。在進行免疫組織化學染色前，先將切片用0.2MHCl浸透10分鐘，并在0.2M Tris-HCl、2mM CaCl2中用1μg/ml蛋白酶K(Boehringer Mannheim GmbH，Mannheim，Germany)于37℃下消化15分鐘。計數(shù)陽性核(250倍)的百分數(shù)以估計標記指數(shù)。圖3的右框顯示帶有完整的原發(fā)瘤或手術切除原發(fā)瘤后5、10和15天時，對總肺腫瘤重量的分析結果。腹腔注射BrdU(0.75mg/小鼠)后6小時殺死動物。
實施例4在完整原發(fā)瘤存在下抑制肺轉移灶中的血管生成。
為了檢測肺轉移灶中腫瘤血管化的程度，用抗yon Willebrand因子的抗體(一種內皮特異性標記，得自Dako inc.，Carpenteria，CA)給組織染色。帶有完整腫瘤之動物的轉移灶圍繞著已有肺血管形成薄的環(huán)帶(8-12腫瘤細胞層)。除了血管內襯的內皮細胞，沒有或很少細胞是von Willebrand因子陽性的。相反，除去原發(fā)瘤后5天之動物的肺轉移灶不僅較大，而且其中還充滿了含內皮細胞(這些細胞呈現(xiàn)von Willebrand因子強染色)的毛細血管芽。
在對肺轉移灶中存在之內皮細胞的免疫組織化學分析中，接種后19天帶完整的原發(fā)肺腫瘤之小鼠的肺轉移灶中出現(xiàn)圍繞已有微血管的腫瘤細胞環(huán)帶。這些轉移限于8-12個細胞層。沒有環(huán)繞微血管的神經血管化的跡象，并且不含任何新的微血管。這是典型的最大體積無血管的血管生成前轉移。
在對切除原發(fā)瘤后5天(接種原發(fā)瘤后19天)收集的組織進行的免疫組織化學分析中，可見圍繞著肺中已有血管的轉移灶。相反，在已切除了原發(fā)瘤的樣品中，則可見腫瘤有神經血管生成。因此，完整原發(fā)瘤抑制轉移灶中新的毛細血管的生成，但轉移灶中腫瘤細胞的增殖不受原發(fā)瘤的影響。
實施例5原發(fā)瘤抑制移植到小鼠角膜中之第二個腫瘤的血管生成。該第二個腫瘤的生長受到抑制。
第0天將0.25至0.5mm2Lewis肺腫瘤(LLC-Low)植入小鼠角膜中(Muthukkaruppan Vr.，et al.，Angiogenesis in the mousecornea.Science 2051416-1418，1979)。于角膜移植腫瘤前4或7天或在角膜移植腫瘤當天，或在角膜移植腫瘤后4或7天，經背部皮下接種1×106個LLC-Low細胞而形成原發(fā)瘤。對照小鼠接受角膜移植物但沒有皮下腫瘤。其他對照小鼠接受角膜移植物并于角膜移植前4天于背部接種LLC-High腫瘤細胞。每天用狹縫光源立體顯微鏡觀察角膜腫瘤生長情況(用接目測微器測量)及由角膜邊緣生長的新的毛細血管。
在不帶原發(fā)皮下腫瘤的對照小鼠中，從角膜植入后第6至7天開始，持續(xù)到第10天大部分角膜(6/8)發(fā)展了神經血管化。到第10天時，有血管生成的角膜腫瘤達到大約全眼的1/4體積。在原發(fā)皮下LLC-Low腫瘤存在下，如果原發(fā)瘤在角膜腫瘤植入前至少4天時仍在原位置，則角膜移植物并沒血管形成(表1)。在沒有神經血管化的情況下，角膜腫瘤生長緩慢，在角膜內呈薄的、白色的，無血管的園盤。
然而，如果在角膜植入后4天時沒有植入原發(fā)瘤，則角膜逐漸有血管生成，并且3/3的角膜腫瘤以如不帶腫瘤之對照組動物一樣的速率生長。在原發(fā)皮下LLC-High腫瘤存在下，從角膜植入后第7開始持續(xù)至第10天大部分角膜(2/3)出現(xiàn)了神經血管化。第10天時，有血管生成的角膜腫瘤再次達到約占全眼1/4的體積。
表1原發(fā)皮下腫瘤對角膜中腫瘤血管生成的抑制作用[除標(*)者為LLC-High外，所有原發(fā)瘤均為LLC-Low腫瘤]
當原發(fā)LLC-Low皮下腫瘤在植入眼腫瘤前7天(即-7)被植入時，可望有0/10角膜將顯示神經血管化。但其中2個腫瘤(2/10)已因太大(＞3cm3)而逐漸壞死。
實施例6
完整原發(fā)瘤抑制由堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)的次級皮下植入物誘導的血管生成。
雖然實施例V和VI中所述的實驗顯示原發(fā)瘤抑制繼發(fā)性轉移瘤中的血管生成，但這些研究并沒有揭示是否原發(fā)瘤(i)直接抑制，或(ii)通過下調轉移性腫瘤細胞的血管生成活性而間接抑制內皮增殖(或血管生成)。為了區(qū)分這兩種可能性，經植入含有堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)的matrigel來誘導皮下血管生成病灶(Passan-iti A.et al.，A simple，quantitative method for assessing angiogenesisand anti-angiogenic agent using recenstituted basement membrance，heparin and fibroblast growth factor，Lab Invest.67519，1992)。
在肝素存在下將含有25或50ng/mlbFGF的Matrigel(一種基底膜蛋白質提取物)皮下注射到正常和帶瘤小鼠(LLC-Low)的腹部表面。4天后殺死小鼠并檢測凝膠中的血紅蛋白濃度，以定量血管生成水平。前已顯示進入matrigel中之新血管的數(shù)目與血紅蛋白濃度相關(FolkmanJ.，Angiogenesis and its inhibitors，“ImportantAdvances in Oncology 1985”，VT Devita，S.Hellman and S.Rosen-berg，ed.J.B.Lippincott，philadelphia，1985)。還制備了一些用于組織學檢查的凝膠。在正常小鼠中，含有50ng/ml bFGF的matrigel沉淀物完全是紅色的。它們受到新生毛細血管的嚴重侵入，并含有2.4g/dl血紅蛋白。缺乏bFGF的matrigel是半透明的和灰色的，并只含有0.4g/dl血紅蛋白(相差6倍)。相反，從帶有原發(fā)瘤小鼠體內得到的matrigel則只含有0.5g/dl血紅蛋白(圖4)。
在本實驗中幾乎完全抑制血管生成表明，存在Lewis肺原發(fā)腫瘤可直接抑制bFGF誘導的血管生成。
實施例7將來自帶瘤動物的血清轉輸?shù)揭亚谐嗽l(fā)瘤的動物體內以抑制腫瘤轉移。
按上述方法給小鼠移植Lewis肺癌。15天后，當腫瘤體積約為1500mm3時將小鼠隨機分成4組。3組完全切除了原發(fā)瘤；1組保留腫瘤(假外科手術處理)。然后3組切除腫瘤的小鼠每天接受腹腔內注射的鹽水、正常非帶瘤小鼠的血清，或帶有1500mm3Lewis肺癌之小鼠的血清。留有完整腫瘤的一組小鼠接受腹腔內鹽水注射。所有小鼠均處理21天，然后無痛處理動物并計數(shù)腫瘤轉移灶數(shù)目。
表2
這些結果得到肺臟重量的進一步證實。兩組間的差異統(tǒng)計為P＝＜0.0001[(55和50)對(7和3)]。使用得自帶瘤動物尿中的血管生成抑制素得到了相似的結果。
實施例8牛毛細血管內皮(BCE)細胞檢測法只使用第9至14代的BCE細胞。于第0天，以12,500細胞/孔的濃度將BCE細胞鋪敷在剛膠化的(1.5％明膠在PBS中于37℃，10％CO2環(huán)境下放置24小時，然后用0.5ml PBS淋洗)24孔平板上。使用血細胞計數(shù)器計數(shù)細胞。將細胞鋪板在加有10％熱滅活的(56℃處理20分鐘)小牛血清和1％glutamine-pen-strep(GPS)的500μlDMEM中。
按下述方法攻擊BCE細胞除去培養(yǎng)基并換成250μl DMEM/5％BCS/1％GPS。然后將待試樣品加到各孔中(加入量依據(jù)待試樣品的不同而不同)。將平板放于37℃/10％CO2條件下放置約10分鐘。向各孔內加入含2ng/ml bFGF的250μl DMEM/5％BCS/1％GPS。最后的培養(yǎng)基是含1ng/ml bFGF的500μl DMEM/5％BCS/1％GPS。將平板重新放回37℃/10％CO2保溫箱中保溫72小時。
第4天，除去培養(yǎng)基以計數(shù)細胞，然后用胰蛋白酶將各孔處理2-3分鐘(0.5ml胰蛋白酶/EDTA)。將懸浮細胞轉移到含有9.5mlHemetall的閃爍瓶中并使用Coulter計數(shù)器計數(shù)。一活性單位是含有當將內皮細胞在1ng/ml bFGF中保溫72小時，能夠對毛細血管內皮增殖產生半最大抑制作用之血管生成抑制素的血清量。
實施例9帶有低轉移性Lewis肺癌(LLC-Low)之小鼠的血清在體外抑制毛細血管內皮細胞增殖。
在72小時增殖試驗中，用堿性成纖維細胞生長因子(bFGF，1ng/ml)刺激牛毛細血管內皮細胞。加到這些培養(yǎng)物中的帶瘤小鼠的血清以劑量依賴性和可逆的方式抑制內皮細胞增殖。正常血清不是抑制性的(圖5)。內皮細胞增殖以相似方式(相對于對照組)受到得自帶瘤nu/nu小鼠和SCID小鼠之血清的抑制。除去原發(fā)瘤后，3-5天血管生成抑制素活性從血清中消失。
帶瘤動物的血清也抑制牛主動脈內皮細胞和衍生可自發(fā)小鼠血管內皮瘤的內皮細胞(Obeso，et al.，“Methods in Laboratory Investi-gation，A Hemangioendothelioma-derived cell line；Its use as a Medelfor the Study of Endothelial Cell Biology”，Lab Invest.，63(2)，259-269，1990)，但不抑制Lewis肺癌細胞、3T3成纖維細胞、主動脈平滑肌細胞、水貂肺表皮細胞或W138人胎肺成纖維細胞。
實施例10不抑制轉移的帶Lewis肺癌(LLC-High)之小鼠的血清，并不抑制體外毛細血管內皮細胞增殖。
相對于對照組，帶有LLC-High原發(fā)瘤之小鼠的血清并沒有明顯地抑制bFGF刺激的牛毛細血管內皮細胞的增殖。另外，當對該血清進行前兩個步驟的純化(肝素-Sepharose層析和凝膠過濾)時，各洗脫部分中均未見有血管生成抑制素活性。
實施例11Lewis肺癌(低轉移性)小鼠的腹水也誘導產生血管生成抑制素血清。
給小鼠腹腔內注射LLC-Low或LLC-High腫瘤細胞(106個)，一周后從10-20只小鼠體內各得到1-2ml血色腹水。可見其中有轉移瘤細胞接種。然后無痛處死小鼠。經心臟穿刺得到血清。也從作為對照的正常不帶瘤小鼠體內得到血清。離心血清和腹水以除去細胞，并檢測上清液對bFGF(1ng/ml)刺激的牛毛細血管內皮細胞增殖的影響(參見實施例IX)。72小時后來源于帶兩種類型腫瘤之小鼠的腹水刺激了明顯超過對照組的毛細血管內皮細胞增殖(即100％增殖，參見圖6)。相反，來源于帶低轉移瘤小鼠的血清則抑制內皮細胞增殖(其抑劑作用為對照組的79％)。帶高轉移瘤細胞系之小鼠的血清則有高達200％的刺激性。
這些數(shù)據(jù)顯示低轉移瘤細胞系造成的腹水含有超過血管生成抑制素的內皮生長刺激物的優(yōu)勢。這種情況類似于實體原發(fā)瘤。此外，血管生成抑制素活性出現(xiàn)在血清中，似乎未受到刺激活性的對抗。這一模式相似于實體原發(fā)瘤(LLC-Low)。來自高轉移瘤(LLC-High)的腹水也似乎含有優(yōu)勢內皮細胞刺激物，但在血清中未能鑒定出血管生成抑制素。
實施例12用柱層析法從血清中分級分離血管生成抑制素，并經SDS-PAGE分析生長抑制部分。
為了純化血管生成抑制素，合并得自帶瘤小鼠的血清。然后使用肝素-Sepharose、Biogel A0.5mm瓊脂糖和幾輪C4反相高效液相層析(HPLC)相繼層析分離按上述體外抑制活性試驗法檢測的抑制活性。對含有內皮抑制活性的HPLC部分進行SDS-PAGE，顯示出表觀還原分子量為38,000道爾頓的不連續(xù)的帶，其大約被純化106倍(見表3)，達到大約2×107的比活性。在純化的不同階段，用特異性抗體測試合并的各洗脫部分中是否有已知內皮抑制劑存在。在部分純化或完全純化的洗脫物中未發(fā)現(xiàn)有血小板因子4、血小板反應蛋白或轉化生長因子β。
表3
*1活性單位是含有當內皮細胞在bFGF1ng/ml中保溫72小時，能夠對毛細血管內皮增殖產生半最大抑制作用之血管生成抑制素的血清量。
實施例13用柱層析法從尿中分級分離血管生成抑制素并經SDS-PAGE分析生長抑制部分。
從血清中純化內皮細胞抑制物受到可從各小鼠體內得到的小體積血清及血清中的大量蛋白質的阻礙。
分析得自帶瘤小鼠的尿并發(fā)現(xiàn)其含有不帶瘤小鼠和帶有LLC-High腫瘤之小鼠的尿中所沒有的內皮細胞增殖抑制物。利用純化血清的相同手段(如上文所述)純化內皮細胞抑制活性(圖7)。
圖7顯示對部分純化之帶瘤動物血清或尿進行的C4反相層析的結果。按照實施例IX中所述的72小時增殖試驗法在加有bFGF的牛毛細血管內皮細胞上檢驗所有層析分離的部分。兩種情況下，在30-35％乙腈洗脫的第23管中見到一個分立的抑制活性峰。對從第三輪C4反相層析分離帶瘤動物的血清得到的抑制活性部分進行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分析，結果顯示出一條約為38,000道爾頓的帶。
實施例14鑒定循環(huán)血管生成抑制素的特征。
按照實施例9中所述的方法檢測內皮抑制作用。在SynchropakHPLC柱(Synchrom，Inc.Lafayettle，IN)上分離血管生成抑制素。以30-35％乙腈梯度處洗脫抑制物。在還原條件下(β-巰基乙醇，5％V/V)進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，洗脫出38千道爾頓的有活性的蛋白質帶。在非還原下洗脫出28千道爾頓的有活性的蛋白質。不管初始樣品是從尿中還從血清中分離出來的均在相似點上發(fā)現(xiàn)活性。其他帶的蛋白質則沒有測到活性。
當進行加熱(100℃，10分鐘)或用胰蛋白酶處理時，便丟失了與這些帶相聯(lián)系的活性。如用水/氯仿混合物(1∶1)提取有活性的帶，發(fā)現(xiàn)活性只在水相中。
實施例15從人纖溶酶原中純化抑制性片段。
纖溶酶原賴氨酸結合位點I得自Sigma Chemical Company。制劑是用彈性蛋白酶消化后純化的人纖溶酶原。以這種方法得到的賴氨酸結合位點I是含有聚集體形式的，至少有纖溶酶A鏈(Kringle 1+2+3)中前三個三聯(lián)環(huán)結構(編號1至3)的肽的群體(Sotrrup-Jensen，L.，et al.Progress in Chemical Fibrinolysis and Thrombolysis，Vol.3，191，Davidson，J.F.，et al.eds，Raven Press，New York 1978；Wiman，13，et al.，Biochemica et Biophysica Acta，579，142(1979))。將纖溶酶原賴氨酸結合位點I(Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO)重新懸浮于水中并加于已用HPLC級水/0.1％TFA平衡過的C4反相柱上。用水/0.1％TFA至乙腈/0.1％TFA的梯度洗，并將洗脫的各管內容物收集到聚丙烯試管中。在真空離心蒸發(fā)濃縮器中蒸發(fā)每一個等分部分，重新懸浮于水中，加于用來進行增殖試驗的BCEs上。使用相似的洗脫梯度將抑制活性部分重新純化兩次。在最后一次過C4柱時使用30-35％乙腈梯度洗脫抑抑制活性部分。對抑制活性部分進行SDS-PAGE顯示出3條表觀還原分子量為40、42.5和45kd的分立的帶。在非還原條件下進行SDS-PAGE則顯示出3條分子量分別為30、32.5和35kd的帶。
實施例16
從SDS-PAGE中提取抑制活性。
在非變性條件下進行SDS-PAGE，以進一步分離從人纖溶酶原中純化的抑制活性部分。從凝膠上切下相當于用銀染色法在加有同樣樣品的相鄰泳道中所看到之帶的凝膠區(qū)域，并在加有1ml磷酸鹽緩中鹽水的聚丙烯管中于4℃保溫12小時。除去上清并對鹽水透析兩次各6小時(MWCO＝6-8000)，再對蒸鎦水透析兩次各6小時。真空離心以蒸發(fā)透析液。將產物重新懸浮于鹽水中，并加于用1ng/ml堿性成纖維細胞生長因子刺激的牛毛細血管內皮細胞中測定72小時。分別從三條帶中提取的蛋白質均抑制了毛細血管內皮細胞增殖。
實施例17纖溶酶原片段處理研究給小鼠移植Lewis肺癌，并在腫瘤為1500-2000mm3時切除之。手術當天將小鼠隨機分成6組，每組6只小鼠。小鼠每天接受腹腔注射的三個純化的人纖溶酶原抑制性片段、完整人纖溶酶原、帶瘤動物的尿、正常小鼠的尿或鹽水。給一組只經過假處理的帶瘤小鼠注射鹽水。除去原發(fā)瘤后，立即給小鼠腹腔內由注射24μg(1.2mg/kg/天/小鼠)作為上樣劑量的抑制性纖溶酶原片段。然后在實驗期間每天腹腔內注射12μg抑制性片段(0.6mg/kg/天/小鼠)。切除腫瘤后對照組小鼠接受同樣劑量的完整纖溶酶原分子。為了進行尿處理，過濾、廣泛透徹并凍干正常或帶瘤小鼠的尿，然后重新懸浮在無菌水中得到250倍濃縮的尿液。在除去原發(fā)瘤的當天給小鼠兩次腹腔內注射作為上樣劑量的0.8ml來自帶瘤小鼠或正常小鼠的經過透析的尿濃縮液。然后在整個實驗過程中每天腹腔內注射0.4ml經過透析并濃縮的尿。繼續(xù)處理13天，然后殺死動物并進行尸體解剖。
實驗結果示于圖8和9中。圖8顯示經13天處理后的表面肺轉移。表面肺轉移是指尸體解剖時見于小鼠肺中之轉移的數(shù)目。使用立體顯微鏡計數(shù)轉移數(shù)目。圖8顯示所計數(shù)的表面肺轉移的平均數(shù)和平均數(shù)的標準誤。如圖中所示，帶有原發(fā)瘤的這組小鼠未見有轉移。已切除了原發(fā)瘤并用鹽水處理的小鼠則顯示有廣泛轉移。用人的纖溶酶原片段處理的小鼠未顯示有腫瘤轉移。用完整的纖溶酶原處理的小鼠顯示有廣泛轉移，表明完整的纖溶酶原分子沒有內皮抑制活性。用經過透析并濃縮的帶瘤小鼠的尿處理的小鼠未出現(xiàn)腫瘤轉移。用濃縮的正常小鼠的尿處理的小鼠則顯示有廣泛轉移。測定肺的重要得到了相似的結果(圖9)。
實施例18鼠和人血管生成抑制素的氨基酸序列在Applied Biosystem Model 477A蛋白質序列儀上檢測從小鼠尿中分離的和人賴氨酸結合位點I片段制劑中分離的血管生成抑制素的氨基酸序列。用聯(lián)機ABI Model 120A HPLC鑒定苯基酶硫因酸化氨基酸鎦份。從鼠和人血管生成抑制素N末端序列和胰酶消化產物測得的氨基酸序列表明，血管生成抑制素的序列相似于在鼠纖溶酶原之氨基酸序號98處開始的序列。因此，血管生成抑制素的氨基酸序列是包含具有如用還原聚丙烯酰胺凝膠電泳法測得分子量約為38千道爾頓至45千道爾頓之蛋白質的分子，并且具有基本上與在完整鼠纖溶酶原分子之氨基酸序號98處開始的鼠纖溶酶原片段相似的氨基酸序列。圖1中顯示了鼠血管生成抑制素的起始氨基酸序列(SEQ ID NO2)。該氨基酸序列的長度可能比圖1中所示的序列稍長些或稍短些。
N末端氨基酸分析和人賴氨酸結合位點I活性部分的胰酶消化產物(見實施例15)顯示，該部分的序列開始于人纖溶酶原的大約氨基酸97或99處，并且人血管生成抑制素是與鼠血管生成抑制素同源的。人血管生成抑制素(開始于氨基酸98處)的初始氨基酸序列示于圖2(SEQ ID NO3)中。圖2中將鼠和人血管生成抑制素的氨基酸序列與其他種動物如豬、牛和恒河猴纖溶酶原的相應內部氨基酸序列作了比較，表明這些種動物中存在血管生成抑制素。
實施例19人血管生成抑制素在大腸桿菌中的表達使用pTrcHisA載體(Invitrogen)(圖10)得到高水平的。從trc啟動子開始受調節(jié)的轉錄，用以提高真核基因在大腸桿菌中的轉譯效率。表達與N末端鎳結合的聚組氨酸尾部相融合的血管生成抑制素，以便于使用金屬親和樹脂進行一步驟純化。融合肽中的腸激酶切割識別位點允許繼后從純化的重組蛋白質上去掉N末端組氨酸融合肽。發(fā)現(xiàn)重組人血管生成抑制素蛋白質可結合賴氨酸，可與對Kringle區(qū)域1、2和3特異的單克隆抗體發(fā)生交叉反應，并且在體外抑制bFGF促成的內皮細胞增殖。
為了構建插入片段，經反轉錄并使用聚合酶鏈反應(PCR)和特異性引物進行擴增，以從人肝mRNA制得編碼人血管生成抑制素的基因片段。1131堿基對的產物編碼人纖溶酶原的氨基酸93至470。將經過擴增的片段克隆到pTrcHisA的XhoI/KpnI位點中，并將所得到的構建體轉化到XL-1B(得自Stratagene)大腸桿菌宿主細胞內。同時將只含有質粒載體pTrcHisA的對照克隆轉化到XL-1B大腸桿菌宿主細胞內。將此克隆定名為載體對照克隆。按下述方法純化兩克隆。
按以下方法選擇表達菌落使已用編碼血管生成抑制素的基因轉化的大腸桿菌菌落轉移物生長于加有IPTG的硝化纖維素濾膜上并將濾膜疊置在LB瓊脂板上。在用IPTG誘導表達后，溶解硝化纖維素濾膜上的菌落。封閉硝化纖維素轉移物，淋洗并用兩種分立的識別血管生成抑制素之特殊構象的單克隆抗體(單克隆抗體(MAb)Dcd和Vap；由S.G.McCance和F.J.Castellino(Vniversity ofNotre Dame)惠贈)探查之。選擇由mAbs識別的強表達菌落。
為了確定最大表達的適宜時間，在IPTG誘導前后的不同時間收集細胞并進行反復凍融，然后進行SDS-PAGE分析，并用單克隆抗體Dcd和Vap進行免疫印跡和探針雜交分析。
從中選擇出克隆pTrcHisA/HAsH4。用IPTG誘導4小時，然后收集細胞沉淀，將其重新懸浮在50mM Tris pH8.0、2mM EDTA、5％甘油和200mg/ml溶菌酶中并于4℃下攪拌30分鐘。將此漿液以14,000rpm離心25分鐘并將沉淀物重新懸浮在50mM Tris pH8.0、2mM EDTA、5％甘油和0.1％DOC中。將此懸液于4℃攪拌1小時，然后以14,000rpm離心25分鐘。該步驟得到的上清部分即含有所表達的血管生成抑制素。發(fā)現(xiàn)大腸桿菌表達的人血管生成抑制素具有天然血管生成抑制素的能夠與賴氨酸結合的物理性質。以一步驟法在賴氨酸-Sepharose(Pharmacia或sigma)柱上純化大腸桿菌表達的血管生成抑制素。用0.2Mε-氨基-正已酸(pH7.5)從柱上洗脫血管生成抑制素。
在經過這些實驗之后，對克隆pTrcHisA/HAsH4進行放大到10升的批量發(fā)酵。離心分離從該放大誘導得到的細胞并重新懸浮在50mM Tris(pH7.5)中，以10,000psi破碎細胞三次，并在每次處理之間于10℃下冷卻。在4℃下以10,000rpm離心30分鐘以澄清所得到的溶胞產物，并在賴氨酸-Sepharose柱上分離所表達的血管生成抑制素(圖11)。
將經過純化的大腸桿菌表達的人血管生成抑制素對水徹底透析，然后凍干。將此被表達的人血管生成抑制素重新懸浮在培養(yǎng)基(DMEM，5％BCS，1％慶大霉素/青霉素/鏈霉素)中，達到估計約為3μg/ml的濃度，并用于如實施例8中所述的體外牛毛細血管內皮(BCE)細胞試驗。同樣，按處理克隆pTrcHisA/HAsH4的相同方法處理只含載體的對照克隆。同樣用IPTG誘導，并將細菌溶胞產物用于結合賴氨酸，用0.2m氨基己酸洗脫，徹底透析并凍干。也以估計的3μg/ml的濃度將該對照制劑重新懸浮在培養(yǎng)基中。從不同的誘導、批量發(fā)酵及分離純化過程得到的重組血管生成抑制素及對照樣品均已在Entre Med，Maryland獲得編號。在Children′s Hospital，Boston以雙盲方式對這些編號的樣品進行BCE試驗。
對重組人血管生成抑制素進行的BCE試驗結果表明，在大腸桿菌中表達的人血管生成抑制素抑制由bFGF(用量為1ng/ml)引起的BCE細胞增殖(圖12)。對培養(yǎng)基中的儲備重組血管生成抑制素(約3μg/ml)進行1∶5、1∶10和1∶20倍稀釋。
按下列公式計算百分抑制率 其對BCE細胞增殖的百分抑制率與相似濃度的纖溶酶原衍生的血管生成抑制素的百分抑制率差不多或較高些。圖13中顯示了反復進行BCE試驗所獲得的結果，其中重組血管生成抑制素儲備液的1∶5稀釋液給出與使用纖溶酶原衍生之血管生成抑制素相似的百分抑制率。圖13顯示了這一令人驚奇的結果，其中人重組血管生成抑制素蛋白質抑制60％以上，甚至高達75％以上的培養(yǎng)的BCE增殖。
實施例20血管生成抑制素通過增加編程性細胞死亡的速率來保持微量轉移的休止期。
在給C57BL6/J小鼠皮下接種Lewis肺癌細胞(1×106)后，生長成大約1.5cm3的原發(fā)瘤。對動物進行原發(fā)瘤切除或假手術。在手術后第5、10和15天殺死小鼠并對其肺進行組織學檢查。切除了原發(fā)瘤的動物比經過假手術的對照組動物表現(xiàn)有更大量的微量轉移灶增殖(圖14)。這些改變還伴有肺臟重量的顯著增加。
用6-氟脫搪尿苷(BrdU)攝入法分析腫瘤細胞增殖情況，于第5、9和13天顯示帶完整原發(fā)瘤的動物和切除了腫瘤的動物間沒有差異，表明不能根據(jù)增加增殖率來解釋腫瘤體積的增加(圖15)。因此，檢查了這些動物體內的細胞死亡情況。用末端脫氧核苷酸基轉移酶(TdT)技術并借助免疫組織化學標記之DNA片段檢查編程性細胞死亡——一個依賴于基因表達之改變的，并看作是發(fā)育期間細胞清除的以及發(fā)生在迅速增殖組織如小腸中的細胞死亡過程。在動物死亡的每個時間測定編程性細胞死亡指數(shù)。在所有檢查期間，除去原發(fā)瘤均引起了編程性細胞死亡指數(shù)的統(tǒng)計學上的顯著增加(約增加3-4倍)(圖15)。
用血管生成抑制素的外源抑制物處理已切除了原發(fā)瘤的小鼠，獲得了進一步的支持性證據(jù)。所說的外源抑制物，即TNP-1470(0-氯乙酰氨基甲?；鶡熐勾?，以前稱為AGM-1470)是一種具有所報導的血管生成活性之煙曲霉素的類似物。皮下注射TNP-1470(每兩天30mg/kg)所得到的結果與上述有完整原發(fā)瘤之動物的實驗結果十分相似。與注射鹽水的對照組動物相比，這些動物表現(xiàn)有較低的肺重量，相當?shù)脑鲋持笖?shù)和增加了的編程性細胞死亡指數(shù)(圖16)。
這些數(shù)據(jù)表明，當腫瘤細胞增殖率與細胞死亡的等價速率相平衡對轉移保持在休止狀況。除去原發(fā)瘤引起轉移灶生長的迅速增加，可能是由于除去了血管生成抑制物(血管生成抑制素)，從而因提高了腫瘤細胞編程性死亡速率而失去對轉移灶生長的控制。這些效應是與除去原發(fā)瘤和投用外源血管生成抑制物后見到的效應相似的?？偟卣f來，這些數(shù)據(jù)提示原發(fā)瘤釋放可維持微量轉移休止的血管生成抑制素。
實施例21用血管生成抑制素體內處理原發(fā)瘤。
用如上文實施例15中所述的有限彈性蛋白酶消化法從人纖溶酶原中純化血管生成抑制素。給六周齡雄性C57B16/J小鼠投用重新懸浮于磷酸鹽緩沖鹽水中的血管生成抑制素，然后皮下接種1×106個Lewis肺癌或T241纖維肉瘤細胞。4天后當腫瘤大小為80-160mm2時開始用血管生成抑制素治療。通過腹腔內(ip)或皮下(sc)途徑給小鼠一次注射40mg/kg或兩次注射80mg/kg血管生成抑制素。在治療后的19天里于不同時間處死動物。
以每日劑量40mg/kg(ip)投用血管生成抑制素對T241原發(fā)瘤的生長產生十分顯著的抑制作用(圖17)。這種抑制效果在兩天內即可看到，并且在整個研究過程中成倍增加。到第18天，血管生成抑制素處理之小鼠腫瘤體積約為鹽水處理之小鼠的腫瘤的38％。統(tǒng)計學上這一差異特別顯著(p＜0.001，Students t試驗)。
血管生成抑制素處理(每天投用兩次，每次40mg/kg，ip或sc，總劑量為80mg/kg/天)也顯著地降低了LLC-LM原發(fā)瘤的生長速度(圖17)。第4天見到這樣的抑制效果，并且在以后的時間里可見這種成倍增加。在實驗的最后一天(第19天)，血管生成抑制素處理的小鼠平均腫瘤體積僅為鹽水處理之小鼠的20％，差異性顯著(p＜0.001，Student t試驗)。
在另一個實驗系列中，給移植了T241纖維肉瘤、Lewis肺癌(LM)或網狀細胞肉瘤細胞的小鼠投用血管生成抑制素(每12小時50mg/kg)。就每種類型的腫瘤細胞來說，接受血管生成抑制素的小鼠均明顯減小了腫瘤體積。圖19所示數(shù)據(jù)證明，在第24天帶有T241纖維肉瘤的小鼠經用血管生成抑制素治療后，其平均腫瘤體積僅為未經治療之小鼠的15％。圖20顯示，在第24天帶有Lewis肺瘤(IM)的小鼠經用血管生成抑制素治療后其平均腫瘤體積僅為未經治療之小鼠的13％。圖21所示數(shù)據(jù)表明，在第24天帶有網狀細胞肉瘤的小鼠經用血管生成抑制素治療后其平均腫瘤體積僅為未經治療之小鼠的19％。所示數(shù)據(jù)代表在各時間點上4只小鼠的平均值。
這些結果表明血管生成抑制素是三種不同原發(fā)瘤體內生長的極強抑制劑。
實施例22用血管生成抑制素體內處理人細胞衍生的原發(fā)瘤。
研究了血管生成抑制素對兩個人腫瘤細胞系，即人前列腺癌PC-3和人乳腺癌MDA-MB的作用。給免疫缺陷性SC1D小鼠移植人腫瘤細胞，基本上按實施例21中所述的方法每12小時用50mg/kg血管生成抑制素處理小鼠。結果證明本發(fā)明的血管生成抑制素蛋白質是人腫瘤細胞生長的強有力抑制劑。圖21顯示，在第24天時用血管生成抑制素處理的帶人前列腺癌PC-3的小鼠平均腫瘤體積只是未經處理之對照組小鼠的2％。圖23顯示，在在第24天時用血管生成抑制素處理的帶人乳腺癌MDA-MB的小鼠平均腫瘤體積只是未經處理之對照組小鼠的8％。
實施例23基因治療——血管生成抑制素基因轉染對腫瘤體積的影響。
使用PCR技術產生從編碼鼠纖溶酶原氨基酸1-460之小鼠纖溶酶原cDNA(得自American Type Culture Collection(ATCC))衍生的1380堿基對血管生成抑制素DNA序列，并插入到表達載體中。將表達載體轉染到T241纖維肉瘤細胞中并將被轉染的細胞植入小鼠體內。對照組小鼠接受未被轉染的T241細胞或只用載體轉染的T241細胞(即不表達血管生成抑制素的轉染的細胞)。實驗中使用三個表達血管生成抑制素的被轉染的細胞克隆。測定整個時間過程中的平均腫瘤體積。結果顯示與使用未被轉染的和非表達的對照細胞相比，表達血管生成抑制素的細胞克隆在小鼠體內可使其平均腫瘤體積顯著降低。
編碼小鼠血管生成抑制素蛋白質的小鼠DNA序列衍生于小鼠纖溶酶原cDNA。小鼠血管生成抑制素包含小鼠纖溶酶原Kringle區(qū)域1-4。圖24中顯示了構建該克隆的程序。
使用LIPOFECTINTM轉染系統(tǒng)(可購自Life Technologies，Gaithersbury，MD)將小鼠血管生成抑制素蛋白質克隆轉染到T241纖維肉瘤細胞中。LIPOFECTINTM試劑是加在膜過濾水中的陽離子脂質N-[1-(2，3-二油酰氧基)丙基]-n，n，n-氯化三甲銨(DOTMA)和二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)的1∶1(W/W)脂質體制劑。
瞬時轉染細胞的步驟如下1.將T241細胞培養(yǎng)在60cm2組織培養(yǎng)皿中，種子細胞約為1-2×105個，加于添加有血清的適當生長培養(yǎng)基中。
2. 37℃在CO2孵箱中保溫細胞，直至細胞達到40-70％匯合，保溫時間一般為18-24小時，但具體時間將取決于不同細胞類型。T241腫瘤細胞匯合度約為70％。
3.在12×75mm無菌試管中制備下列溶液溶液A各次轉染中，將5μgDNA稀釋在100μl無血清OPTI-MEMI還原血清培養(yǎng)基(可得自Life Technologies)中，(也可以使用組織培養(yǎng)級去離子水)。
溶液B為各次轉染，將30μgLIPOEFECTN稀釋在100μlOPTI-MEM培養(yǎng)基中。
4.將兩溶液合并，輕輕混合，并于室溫下保溫10-15分鐘。
5.用無血清培養(yǎng)基洗細胞兩次。
6.對每次轉染，均將0.8ml無血清培養(yǎng)基加到每個含有LIPO-FECTINTM試劑一DNA復合物的試管中。輕輕混合并將混合物加在細胞上。
7. 37℃下在CO2孵箱中將細胞保溫大約12小時。
8.用1mg/ml含有血清的選擇培養(yǎng)基取代含DNA的培養(yǎng)基，并于37℃在CO2孵箱中保溫48-72小時。
9.轉染后48-72小時檢測細胞提取物的基因活性。
可使用血管生成抑制素特異性抗體檢測用于表達血管生成抑制素蛋白質的被轉染細胞。或者，在大約10-14天后，G418抗性集落出現(xiàn)于CMV-血管生成抑制素轉染的T241細胞中。另外，有許多克隆見于單用載體轉染的克隆中，但不見于未被轉染的克隆中。使用免疫熒光方法根據(jù)其血管生成抑制素的表達來選擇G418抗性克隆。
令人感興趣的是，如圖25和26中所示，用血管生成抑制素轉染的T241細胞和Lewis肺細胞的體外細胞生長沒有受到抑制或其他不利的影響。
圖27顯示轉染實驗的結果。所有三個表達血管生成抑制素的T241轉染的克隆均使小鼠的平均腫瘤體積比對照組小鼠的平均腫瘤體積有明顯降低。植入克隆37之小鼠的平均腫瘤體積僅為對照組的13％，而植入克隆31和克隆25的小鼠平均腫瘤體積分別僅為對照組的21％和34％。這些結果證明可以將編碼血管生成抑制素的DNA序列轉染到細胞中，可由被植入的細胞中轉染的DNA序列表達血管生成抑制素蛋白質，并且所表達的血管生成抑制素可在體內發(fā)揮抑制腫瘤生長的功能。
實施例24定位血管生成抑制素表達的體內部位為了定位血管生成抑制素蛋白質表達的體內部位，分析得自各種不同類型的細胞即Lewis肺癌細胞(小鼠)、T241纖維肉瘤(小鼠)和Burkitt′s淋巴瘤細胞(人)，包括新鮮腫瘤或幾次傳代后的細胞培養(yǎng)物的總RNA，以確定是否存在血管生成抑制素轉錄物。樣品的Northern分析表明，除正常小鼠肝RNA外沒有與所有樣品中的其他序列雜交的信號，只是正常小鼠肝RNA給出一個相當于小鼠纖溶酶原的約2.4Kb信號。人樣品的Northern分析表明，除正常人肝RNA外沒有與所有樣品中之人血管生成抑制素序列雜交的信號，只是正常人肝RNA顯示一個相當于人纖溶酶原的約2.4Kb信號。
反轉錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)分析顯示，除了正常小鼠肝以外沒有來自用小鼠血管生成抑制素序列探查之所有樣品的任何產物。QT-PCR分析表明，沒有來自除了正常人肝以外的用人血管生成抑制素序列探查之所有人樣品的任何產物(預計小鼠的序列大小為1050bp，人的序列大小為1134bp)。
因此可以看出，上述所有小鼠樣品均沒有產生小鼠血管生成抑制素轉錄物(推測其相當于小鼠纖溶酶原的氨基酸97至450)，并且上述人樣品均沒有產生人血管生成抑制素轉錄物(估計其相當于人纖溶酶原的氨基酸93至470)。在正常小鼠/人肝中得到的陽性信號是來自與纖溶酶原雜交的信號。
實施例25在酵母中表達血管生成抑制素將編碼人纖溶酶原之氨基酸93至470的基因片段克隆到pHIL-SI(Invitrogen)的Xho/EcoRI位點中，以允許使用巴斯德畢赤(pichia pastoris)酵母中的PH01分泌信號分泌表達蛋白質。同樣，將編碼人纖溶酶原之氨基酸93至470的基因片段克隆到pPIC9(In-vitrogen)的SnaBI/EcoRI位點中，以允許使用巴斯德畢赤酵母中的α因子分泌信號分泌表達蛋白質。在這些系統(tǒng)中表達的血管生成抑制素蛋白質將具有許多比在大腸桿菌中表達者更好的優(yōu)點，例如在蛋白質加工、蛋白質折迭以及包括糖基化在內的轉譯后修飾等方面。
文獻Sreekrishna，K.et al.(1988)High level expression of het-erologous proteins in methylotropic yeast Pichia pastoris，J.Basic Mi-crobiol.29(4)265-278和Clare，J.J.et al.(1991)Production of epi-dermal growth factor in yeastHigh-Level secretion using Pichia pas-toris strains containg multiple gene copies，Gene 105205-212(兩文獻均列為本文參考文獻)中描述了在巴斯德畢赤酵母中的基因表達。
實施例26
血管生成抑制素蛋白質在轉基因動物和植物中的表達創(chuàng)造表達血管生成抑制素基因轉錄物的如?；蜇i家族的轉基因動物。例如這些轉基因動物可在其乳汁中表達血管生成抑制素蛋白質。另外也可構建表達血管生成抑制素基因轉錄物的可食轉基因植物。
Smith H.，Phytochrome transgenicsfunctional，ecological andbiotechnical applications，Semin.Cell.Biol.(1984)5[5]315-325中描述了表達外來DNA之轉基因動物的構建。
應明確的是，上述內容只涉及本發(fā)明的優(yōu)選實施方案，可以在不背離待批權利要求中所示本發(fā)明之精神和范圍的前提下對本發(fā)明作出許多改動和改進。
序列表(1)一般信息(i)申請人THE CHILDREN′S MEDICAL CENTER CORPO-RATION(ii)發(fā)明名稱血管生成抑制素及使用方法(iii)序列數(shù)6(iv)通訊地址(A)收件人Jones & Askew(B)街191 Peachtree Street，37th Floor(C)城市Atlanta(D)州Georgia(E)國家U.S.
(F)郵編30303-1769(v)計算機可讀形式(A)介質類型Floppy盤(B)計算機IBM PC兼容機(C)操作系統(tǒng)PC-DOS/MS-DOS(D)軟件PatentIn Release #1.0，Version #1.30
(vi)目前申請資料(A)申請?zhí)朥S(B)申請日(C)分類(vii)在先申請資料(A)申請?zhí)朥S08/248,629(B)申請日26-APR-1994(vii)在先申請資料(A)申請?zhí)朥S08/326,785(B)申請日20-OCT-1994(viii)律師/代理人信息(A)名稱Johnson，James D.
(B)登記號31，771(C)參考/文檔號05213-0122(ix)電訊信息(A)電話404-818-3700(B)傳真404-818-3799(2)SEQ ID NO1的信息(i)序列特征(A)長度812氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型(D)拓撲結構線性
(ii)分子類型蛋白質(iii)假設無(vi)來源(A)生物體小鼠(xi)序列描述SEQ ID NO1Met Asp His Lys Glu Val Ile Leu Leu Phe Leu Leu Leu Leu Lys Pro1 5 10 15Gly Gln Gly Asp Ser Leu Asp Gly Tyr Ile Ser Thr Gln Gly Ala Ser20 25 30Leu Phe Ser Leu Thr Lys Lys Gln Leu Ala Ala Gly Gly Val Ser Asp35 40 45Cys Leu Ala Lys Cys Glu Gly Glu Thr Asp Phe Val Cys Arg Ser Phe50 55 60Gln Tyr His Ser Lys Glu Gln Gln Cys Val Ile Met Ala Glu Asn Ser65 70 75 80Lys Thr Ser Ser Ile Ile Arg Met Arg Asp Val Ile Leu Phe Glu Lys85 90 95Arg Val Tyr Leu Ser Glu Cys Lys Thr Gly Ile Gly Asn Gly Tyr Arg100 105 110Gly Thr Met Ser Arg Thr Lys Ser Gly Val Ala Cys Gln Lys Trp Gly115 120 125Ala Thr Phe Pro His Val Pro Asn Tyr Ser Pro Ser Thr His Pro Asn130 135 140Glu Gly Leu Glu Glu Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Asn Asp Glu Gln145 150 155 160Gly Pro Trp Cys Tyr Thr Thr Asp Pro Asp Lys Arg Tyr Asp Tyr Cys165 170 175Asn Ile Pro Glu Cys Glu Glu Glu Cys Met Tyr Cys Ser Gly Glu Lys180 185 190Tyr Glu Gly Lys Ile Ser Lys Thr Met Ser Gly Leu Asp Cys Gln Ala195 200 205Trp Asp Ser Gln Ser Pro His Ala His Gly Tyr Ile Pro Ala Lys Phe210 215 220Pro Ser Lys Asn Leu Lys Met Asn Tyr Cys His Asn Pro Asp Gly Glu225 230 235 240Pro Arg Pro Trp Cys Phe Thr Thr Asp Pro Thr Lys Arg Trp Glu Tyr245 250 255Cys Asp Ile Pro Arg Cys Thr Thr Pro Pro Pro Pro Pro Ser Pro Thr260 265 270Tyr Gln Cys Leu Lys Gly Arg Gly Glu Asn Tyr Arg Gly Thr Val Ser275 280 285Val Thr Val Ser Gly Lys Thr Cys Gln Arg Trp Ser Glu Gln Thr Pro290 295 300His Arg His Asn Arg Thr Pro Glu Asn Phe Pro Cys Lys Asn Leu Glu305 310 315 320Glu Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Gly Glu Thr Ala Pro Trp Cys Tyr325 330 335Thr Thr Asp Ser Gln Leu Arg Trp Glu Tyr Cys Glu Ile Pro Ser Cys340 345 350Glu Ser Ser Ala Ser Pro Asp Gln Ser Asp Ser Ser Val Pro Pro Glu355 360 365Glu Gln Thr Pro Val Val Gln Glu Cys Tyr Gln Ser Asp Gly Gln Ser370 375 380Tyr Arg Gly Thr Ser Ser Thr Thr Ile Thr Gly Lys Lys Cys Gln Ser385 390 395 400Trp Ala Ala Met Phe Pro His Arg His Ser Lys Thr Pro Glu Asn Phe405 410 415Pro Asp Ala Gly Leu Glu Met Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Gly Asp420 425 430Lys Gly Pro Trp Cys Tyr Thr Thr Asp Pro Ser Val Arg Trp Glu Tyr435 440 445Cys Asn Leu Lys Arg Cys Ser Glu Thr Gly Gly Ser Val Val Glu Leu450 455 460Pro Thr Val Ser Gln Glu Pro Ser Gly Pro Ser Asp Ser Glu Thr Asp465 470 475 480Cys Met Tyr Gly Asn Gly Lys Asp Tyr Arg Gly Lys Thr Ala Val Thr485 490 495Ala Ala Gly Thr Pro Cys Gln Gly Trp Ala Ala Gln Glu Pro His Arg500 505 510His Ser Ile Phe Thr Pro Gln Thr Asn Pro Arg Ala Asp Leu Glu Lys515 520 525Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Gly Asp Val Asn Gly Pro Trp Cys Tyr530 535 540Thr Thr Asn Pro Arg Lys Leu Tyr Asp Tyr Cys Asp Ile Pro Leu Cys545 550 555 560Ala Ser Ala Ser Ser Phe Glu Cys Gly Lys Pro Gln Val Glu Pro Lys565 570 575Lys Cys Pro Gly Arg Val Val Gly Gly Cys Val Ala Asn Pro His Ser580 585 590Trp Pro Trp Gln Ile Ser Leu Arg Thr Arg Phe Thr Gly Gln His Phe595 600 605Cys Gly Gly Thr Leu Ile Ala Pro Glu Trp Val Leu Thr Ala Ala His610 615 620Cys Leu Glu Lys Ser Ser Arg Pro Glu Phe Tyr Lys Val Ile Leu Gly625 630 635 640Ala His Glu Glu Tyr Ile Arg Gly Leu Asp Val Gln Glu Ile Ser Val645 650 655Ala Lys Leu Ile Leu Glu Pro Asn Asn Arg Asp Ile Ala Leu Leu Lys660 665 670Leu Ser Arg Pro Ala Thr Ile Thr Asp Lys Val Ile Pro Ala Cys Leu675 680 685Pro Ser Pro Asn Tyr Met Val Ala Asp Arg Thr Ile Cys Tyr Ile Thr690 695 700Gly Trp Gly Glu Thr Gln Gly Thr Phe Gly Ala Gly Arg Leu Lys Glu705 710 715 720Ala Gln Leu Pro Val Ile Glu Asn Lys Val Cys Asn Arg Val Glu Tyr725 730 735Leu Asn Asn Arg Val Lys Ser Thr Glu Leu Cys Ala Gly Gln Leu Ala740 745 750Gly Gly Val Asp Ser Cys Gln Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu Val Cys755 760 765Phe Glu Lys Asp Lys Tyr Ile Leu Gln Gly Val Thr Ser Trp Gly Leu770 775 780Gly Cys Ala Arg Pro Asn Lys Pro Gly Val Tyr Val Arg Val Ser Arg785 790 795 800Phe Val Asp Trp Ile Glu Arg Glu Met Arg Asn Asn805 810(2)SEQ ID NO2的信息(i)序列特征(A)長度339氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型(D)拓撲結構線性(ii)分子類型蛋白質
(iii)假設無(vi)來源(A)生物體小鼠(xi)序列描述SEQ ID NO2Val Tyr Leu Ser Glu Cys Lys Thr Gly Ile Gly Asn Gly Tyr Arg Gly1 5 10 15Thr Met Ser Arg Thr Lys Ser Gly Val Ala Cys Gln Lys Trp Gly Ala20 25 30Thr Phe Pro His Val Pro Asn Tyr Ser Pro Ser Thr His Pro Asn Glu35 40 45Gly Leu Glu Glu Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Asn Asp Glu Gln Gly50 55 60Pro Trp Cys Tyr Thr Thr Asp Pro Asp Lys Arg Tyr Asp Tyr Cys Asn65 70 75 80Ile Pro Glu Cys Glu Glu Glu Cys Met Tyr Cys Ser Gly Glu Lys Tyr85 90 95Glu Gly Lys Ile Ser Lys Thr Met Ser Gly Leu Asp Cys Gln Ala Trp100 105 110Asp Ser Gln Ser Pro His Ala His Gly Tyr Ile Pro Ala Lys Phe Pro115 120 125Ser Lys Asn Leu Lys Met Asn Tyr Cys His Asn Pro Asp Gly Glu Pro130 135 140Arg Pro Trp Cys Phe Thr Thr Asp Pro Thr Lys Arg Trp Glu Tyr Cys145 150 155 160Asp Ile Pro Arg Cys Thr Thr Pro Pro Pro Pro Pro Ser Pro Thr Tyr165 170 175Gln Cys Leu Lys Gly Arg Gly Glu Asn Tyr Arg Gly Thr Val Ser Val180 185 190Thr Val Ser Gly Lys Thr Cys Gln Arg Trp Ser Glu Gln Thr Pro His195 200 205Arg His Asn Arg Thr Pro Glu Asn Phe Pro Cys Lys Asn Leu Glu Glu210 215 220Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Gly Glu Thr Ala Pro Trp Cys Tyr Thr225 230 235 240Thr Asp Ser Gln Leu Arg Trp Glu Tyr Cys Glu Ile Pro Ser Cys Glu245 250 255Ser Ser Ala Ser Pro Asp Gln Ser Asp Ser Ser Val Pro Pro Glu Glu260 265 270Gln Thr Pro Val Val Gln Glu Cys Tyr Gln Ser Asp Gly Gln Ser Tyr275 280 285Arg Gly Thr Ser Ser Thr Thr Ile Thr Gly Lys Lys Cys Gln Ser Trp290 295 300Ala Ala Met Phe Pro His Arg His Ser Lys Thr Pro Glu Asn Phe Pro305 310 315 320Asp Ala Gly Leu Glu Met Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Gly Asp Lys325 330 335Gly Pro Trp(2)SEQ ID NO3的信息(i)序列特征(A)長度339氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型(D)拓撲結構線性(ii)分子類型蛋白質(iii)假設無(vi)來源(A)生物體人(xi)序列描述SEQ ID NO3Val Tyr Leu Ser Glu Cys Lys Thr Gly Asn Gly Lys Asn Tyr Arg Gly1 5 10 15Thr Met Ser Lys Thr Lys Asn Gly Ile Thr Cys Gln Lys Trp Ser Ser20 25 30Thr Ser Pro His Arg Pro Arg Phe Ser Pro Ala Thr His Pro Ser Glu35 40 45Gly Leu Glu Glu Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Asn Asp Pro Gln Gly50 55 60Pro Trp Cys Tyr Thr Thr Asp Pro Glu Lys Arg Tyr Asp Tyr Cys Asp65 70 75 80Ile Leu Glu Cys Glu Glu Glu Cys Met His Cys Ser Gly Glu Asn Tyr85 90 95Asp Gly Lys Ile Ser Lys Thr Met Ser Gly Leu Glu Cys Gln Ala Trp100 105 110Asp Ser Gln Ser Pro His Ala His Gly Tyr Ile Pro Ser Lys Phe Pro115 120 125Asn Lys Asn Leu Lys Lys Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Arg Glu Leu130 135 140Arg Pro Trp Cys Phe Thr Thr Asp Pro Asn Lys Arg Trp Glu Leu Cys145 150 155 160Asp Ile Pro Arg Cys Thr Thr Pro Pro Pro Ser Ser Gly Pro Thr Tyr165 170 175Gln Cys Leu Lys Gly Thr Gly Glu Asn Tyr Arg Gly Asn Val Ala Val180 185 190Thr Val Ser Gly His Thr Cys Gln His Trp Ser Ala Gln Thr Pro His195 200 205Thr His Asn Arg Thr Pro Glu Asn Phe Pro Cys Lys Asn Leu Asp Glu210 215 220Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Gly Lys Arg Ala Pro Trp Cys His Thr225 230 235 240Thr Asn Ser Gln Val Arg Trp Glu Tyr Cys Lys Ile Pro Ser Cys Asp245 250 255Ser Ser Pro Val Ser Thr Glu Gln Leu Ala Pro Thr Ala Pro Pro Glu260 265 270Leu Thr Pro Val Val Gln Asp Cys Tyr His Gly Asp Gly Gln Ser Tyr275 280 285Arg Gly Thr Ser Ser Thr Thr Thr Thr Gly Lys Lys Cys Gln Ser Trp290 295 300Ser Ser Met Thr Pro His Arg His Gln Lys Thr Pro Glu Asn Tyr Pro305 310 315 320Asn Ala Gly Leu Thr Met Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Ala Asp Lys325 330 335Gly Pro Trp(2)SEQ ID NO4的信息(i)序列特征(A)長度339氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型
(D)拓撲結構線性(ii)分子類型蛋白質(iii)假設無(vi)來源(A)生物體恒河猴(xi)序列描述SEQ ID NO4Val Tyr Leu Ser Glu Cys Lys Thr Gly Asn Gly Lys Asn Tyr Arg Gly1 5 10 15Thr Met Ser Lys Thr Arg Thr Gly Ile Thr Cys Gln Lys Trp Ser Ser20 25 30Thr Ser Pro His Arg Pro Thr Phe Ser Pro Ala Thr His Pro Ser Glu35 40 45Gly Leu Glu Glu Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Asn Asp Gly Gln Gly50 55 60Pro Trp Cys Tyr Thr Thr Asp Pro Glu Glu Arg Phe Asp Tyr Cys Asp65 70 75 80Ile Pro Glu Cys Glu Asp Glu Cys Met His Cys Ser Gly Glu Asn Tyr85 90 95Asp Gly Lys Ile Ser Lys Thr Met Ser Gly Leu Glu Cys Gln Ala Trp100 105 110Asp Ser Gln Ser Pro His Ala His Gly Tyr Ile Pro Ser Lys Phe Pro115 120 125Asn Lys Asn Leu Lys Lys Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Gly Glu Pro130 135 140Arg Pro Trp Cys Phe Thr Thr Asp Pro Asn Lys Arg Trp Glu Leu Cys145 150 155 160Asp Ile Pro Arg Cys Thr Thr Pro Pro Pro Ser Ser Gly Pro Thr Tyr165 170 175Gln Cys Leu Lys Gly Thr Gly Glu Asn Tyr Arg Gly Asp Val Ala Val180 185 190Thr Val Ser Gly His Thr Cys His Gly Trp Ser Ala Gln Thr Pro His195 200 205Thr His Asn Arg Thr Pro Glu Asn Phe Pro Cys Lys Asn Leu Asp Glu210 215 220Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Gly Glu Lys Ala Pro Trp Cys Tyr Thr225 230 235 240Thr Asn Ser Gln Val Arg Trp Glu Tyr Cys Lys Ile Pro Ser Cys Glu245 250 255Ser Ser Pro Val Ser Thr Glu Pro Leu Asp Pro Thr Ala Pro Pro Glu260 265 270Leu Thr Pro Val Val Gln Glu Cys Tyr His Gly Asp Gly Gln Ser Tyr275 280 285Arg Gly Thr Ser Ser Thr Thr Thr Thr Gly Lys Lys Cys Gln Ser Trp290 295 300Ser Ser Met Thr Pro His Trp His Glu Lys Thr Pro Glu Asn Phe Pro305 310 315 320Asn Ala Gly Leu Thr Met Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Ala Asp Lys325 330 335Gly Pro Trp(2)SEQ ID NO5的信息(i)序列特征(A)長度339氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型(D)拓撲結構線性(ii)分子類型蛋白質(iii)假設無(vi)來源(A)生物體豬(xi)序列描述SEQ ID NO5Ile Tyr Leu Ser Glu Cys Lys Thr Gly Asn Gly Lys Asn Tyr Arg Gly1 5 10 15Thr Thr Ser Lys Thr Lys Ser Gly Val Ile Cys Gln Lys Trp Ser Val20 25 30Ser Ser Pro His Ile Pro Lys Tyr Ser Pro Glu Lys Phe Pro Leu Ala35 40 45Gly Leu Glu Glu Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Asn Asp Glu Lys Gly50 55 60Pro Trp Cys Tyr Thr Thr Asp Pro Glu Thr Arg Phe Asp Tyr Cys Asp65 70 75 80Ile Pro Glu Cys Glu Asp Glu Cys Met His Cys Ser Gly Glu His Tyr85 90 95Glu Gly Lys Ile Ser Lys Thr Met Ser Gly Ile Glu Cys Gln Ser Trp100 105 110Gly Ser Gln Ser Pro His Ala His Gly Tyr Leu Pro Ser Lys Phe Pro115 120 125Asn Lys Asn Leu Lys Met Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Gly Glu Pro130 135 140Arg Pro Trp Cys Phe Thr Thr Asp Pro Asn Lys Arg Trp Glu Phe Cys145 150 155 160Asp Ile Pro Arg Cys Thr Thr Pro Pro Pro Thr Ser Gly Pro Thr Tyr165 170 175Gln Cys Leu Lys Gly Arg Gly Glu Asn Tyr Arg Gly Thr Val Ser Val180 185 190Thr Ala Ser Gly His Thr Cys Gln Arg Trp Ser Ala Gln Ser Pro His195 200 205Lys His Asn Arg Thr Pro Glu Asn Phe Pro Cys Lys Asn Leu Glu Glu210 215 220Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Gly Glu Thr Ala Pro Trp Cys Tyr Thr225 230 235 240Thr Asp Ser，Glu Val Arg Trp Asp Tyr Cys Lys Ile Pro Ser Cys Gly245 250 255Ser Ser Thr Thr Ser Thr Glu His Leu Asp Ala Pro Val Pro Pro Glu260 265 270Gln Thr Pro Val Ala Gln Asp Cys Tyr Arg Gly Asn Gly Glu Ser Tyr275 280 285Arg Gly Thr Ser Ser Thr Thr Ile Thr Gly Arg Lys Cys Gln Ser Trp290 295 300Val Ser Met Thr Pro His Arg His Glu Lys Thr Pro Gly Asn Phe Pro305 310 315 320Asn Ala Gly Leu Thr Met Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Ala Asp Lys325 330 335Ser Pro Trp(2)SEQ ID NO6的信息(i)序列特征(A)長度339氨基酸(B)類型氨基酸
(C)鏈型(D)拓撲結構線性(ii)分子類型蛋白質(iii)假設無(vi)來源(A)生物體牛(xi)序列描述SEQ ID NO6Ile Tyr Leu Leu Glu Cys Lys Thr Gly Asn Gly Gln Thr Tyr Arg Gly1 5 10 15Thr Thr Ala Glu Thr Lys Ser Gly Val Thr Cys Gln Lys Trp Ser Ala20 25 30Thr Ser Pro His Val Pro Lys Phe Ser Pro Glu Lys Phe Pro Leu Ala35 40 45Gly Leu Glu Glu Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Asn Asp Glu Asn Gly50 55 60Pro Trp Cys Tyr Thr Thr Asp Pro Asp Lys Arg Tyr Asp Tyr Cys Asp65 70 75 80Ile Pro Glu Cys Glu Asp Lys Cys Met His Cys Ser Gly Glu Asn Tyr85 90 95Glu Gly Lys Ile Ala Lys Thr Met Ser Gly Arg Asp Cys Gln Ala Trp100 105 110Asp Ser Gln Ser Pro His Ala His Gly Tyr Ile Pro Ser Lys Phe Pro115 120 125Asn Lys Asn Leu Lys Met Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Gly Glu Pro130 135 140Arg Pro Trp Cys Phe Thr Thr Asp Pro Gln Lys Arg Trp Glu Phe Cys145 150 155 160Asp Ile Pro Arg Cys Thr Thr Pro Pro Pro Ser Ser Gly Pro Lys Tyr165 170 175Gln Cys Leu Lys Gly Thr Gly Lys Asn Tyr Gly Gly Thr Val Ala Val180 185 190Thr Glu Ser Gly His Thr Cys Gln Arg Trp Ser Glu Gln Thr Pro His195 200 205Lys His Asn Arg Thr Pro Glu Asn Phe Pro Cys Lys Asn Leu Glu Glu210 215 220Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Gly Glu Lys Ala Pro Trp Cys Tyr Thr225 230 235 240Thr Asn Ser Glu Val Arg Trp Glu Tyr Cys Thr Ile Pro Ser Cys Glu245 250 255Ser Ser Pro Leu Ser Thr Glu Arg Met Asp Val Pro Val Pro Pro Glu260 265 270Gln Thr Pro Val Pro Gln Asp Cys Tyr His Gly Asn Gly Gln Ser Tyr275 280 285Arg Gly Thr Ser Ser Thr Thr Ile Thr Gly Arg Lys Cys Gln Ser Trp290 295 300Ser Ser Met Thr Pro His Arg His Leu Lys Thr Pro Glu Asn Tyr Pro305 310 315 320Asn Ala Gly Leu Thr Met Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Ala Asp Lys325 330 335Ser Pro Trp
權利要求
1.血管生成抑制素。
2.權利要求1的血管生成抑制素，其包含以還原聚丙烯酰胺凝膠電泳法檢測具有大約38千道爾頓至45千道爾頓的分子量，并具有基本上相似于從鼠纖溶酶原分子大約氨基酸序號98處開始的鼠纖溶酶原片段之氨基酸序列的蛋白質。
3.權利要求2的血管生成抑制素，其中氨基酸序列是衍生于人纖溶酶原、鼠纖溶酶原、牛纖溶酶原、恒河猴纖溶酶原或豬纖溶酶原的纖溶酶原片段。
4.權利要求3的血管生成抑制素，其中氨基酸序列選自SEQ IDNO2、SEQ ID NO3、SEQ ID NO4、SEQ ID NO5和SEQ IDNO6。
5.權利要求1的血管生成抑制素，其中蛋白質能夠抑制血管生成。
6.權利要求3的血管生成抑制素，其中纖溶酶原片段具有內皮抑制活性。
7.權利要求1的血管生成抑制素，其中蛋白質能夠抑制血管生成相關疾病。
8.權利要求1的血管生成抑制素，其中血管生成相關疾病是癌癥。
9.權利要求1的血管生成抑制素，其包括具有以還原聚丙烯酰胺凝膠電泳法測知分子量約為38千道爾頓至45千道爾頓的蛋白質；能夠結合賴氨酸的蛋白質；以及能夠抑制血管生成的蛋白質。
10.治療患有血管生成介導之疾病的人或動物的方法，包括給有血管生成介導之疾病的人或動物投用有效量的血管生成抑制素。
11.權利要求10的方法，其中血管生成抑制素是經還原聚丙烯酰胺凝膠電泳測定具有約38千道爾頓至45千道爾頓的分子量，并且有基本上相似于從鼠纖溶酶原分子氨基酸序號98處開始的鼠纖溶酶原片段之氨基酸序列的蛋白質。
12.權利要求11的方法，其中氨基酸序列是衍生于人纖溶酶原、鼠纖溶酶原、牛纖溶酶原、恒河猴纖溶酶原或豬纖溶酶原的纖溶酶原片段。
13.權利要求11的方法，其中氨基酸序列選自SEQ ID NO2、SEQ ID NO3、SEQ ID NO4、SEQ ID NO5和SEQ ID NO6。
14.權利要求10的方法，其中血管生成性疾病選自癌癥、關節(jié)炎、黃斑變性和糖尿病性視網膜病。
15.權利要求1的血管生成抑制素，其中血管生成抑制素包含具有如用還原聚丙烯酰胺凝膠電泳法測定為大量38千道爾頓至45千道爾頓分子量的蛋白質；能夠結合氨基酸的蛋白質；以及能夠抑制血管生成的蛋白質。
16.診斷血管生成介導的疾病或確定其預后的方法，其包括測定用還原聚丙烯酰胺凝膠電泳法測知分子量約為38千道爾頓至45千道爾頓，并且具有基本上相似于從鼠纖溶酶原分子氨基酸序號98處開始之鼠纖溶蛋白片段氨基酸序列之蛋白質的濃度。
17.權利要求16的方法，其中疾病是癌癥。
18.包含分離的編碼血管生成抑制素之DNA序列的組合物。
19.權利要求18的組合物，其中DNA序列編碼基本上相似于SEQ ID NO2的氨基酸序列，并且其中氨基酸序列在小鼠腫瘤模型中具有抗血管生成活性。
20.權利要求18的組合物，其中DNA序列編碼選自SEQ IDNO2、SEQ ID NO3、SEQ ID NO4、SEQ ID NO5和SEQ IDNO6的氨基酸序列。
21.權利要求18的組合物，其進一步包括與編碼血管生成抑制素的DNA序列相聯(lián)的載體，其中當載體存在于細胞中時能夠表達血管生成抑制素。
22.包括其中含有載體之細胞的組合物，其中載體包含編碼血管生成抑制素的DNA序列，并且其中當載體存在于細胞內時能夠表達血管生成抑制素。
23.權利要求22的組合物，其中DNA序列編碼選自SEQ IDNO2、SEQ ID NO3、SEQ ID NO4、SEQ ID NO5和SEQ IDNO6的氨基酸序列。
24.包括將含有載體的細胞植入人或非人動物體內之步驟的方法，其中載體含有編碼血管生成抑制素的DNA序列，并且其中載體當存在于細胞內時能夠表達血管生成抑制素。
25.權利要求24的方法，其中DNA序列編碼選自SEQ ID NO2、SEQ ID NO3、SEQ ID NO4、SEQ ID NO5和SEQ ID NO6的氨基酸序列。
26.含有血管生成抑制素和醫(yī)藥上可接受之賦形劑的組合物。
27.權利要求26的組合物，其進一步包含緩釋基質。
28.權利要求26的組合物，其中血管生成抑制素是經還原聚丙烯酰胺凝膠電泳測知具有38至45千道爾頓的分子量，并且具有基本上相似于從鼠纖溶酶原分子氨基酸序號98處開始的鼠纖溶酶原片段之氨基酸序列的蛋白質。
29.包含與血管生成抑制素特異結合之抗體的組合物，其中抗體不與纖溶酶原結合。
全文摘要
本發(fā)明涉及內皮細胞生長抑制劑和其使用方法。內皮細胞生長抑制劑是一種從血液或尿中分離的蛋白質，該蛋白質是從C4反相高效液相層析柱上作為單一峰洗脫的。內皮細胞生長抑制劑是一種經還原聚丙烯酰胺凝膠電泳測定分子量在大約38千道爾頓和45千道爾頓之間的蛋白質分子，并且具有基本上相似于從鼠纖溶酶原分子的98位氨基酸開始之鼠纖溶酶原片段的氨基酸序列。
文檔編號A61K48/00GK1149319SQ95193293
公開日1997年5月7日 申請日期1995年4月26日 優(yōu)先權日1994年4月26日
發(fā)明者M·S·奧里利, M·J·福爾克曼, K·L·希姆, Y·考 申請人:兒童醫(yī)學中心公司