專利名稱：：用于胰島素肺部給藥的方法和組合物的制作方法本申請是1994年3月7日申請的申請序號08/207,472的部分續(xù)申請，全部公開在此作為參考。本發(fā)明涉及用于糖尿病人的胰島素呼吸(道)釋放的方法和組合物。更具體的說，本發(fā)明涉及通過肺進行迅速機體吸收的干粉胰島素的肺部釋放。胰島素是一個50個氨基酸的多肽激素，分子量大約為6000，在正常個體(非糖尿病的)胰島的β-細胞內(nèi)生成。胰島素是調(diào)節(jié)糖代謝，降低血糖水平所必需，系統(tǒng)性缺乏將導(dǎo)致糖尿病。糖尿病人的存活依賴于長期頻繁地施用胰島素來維持可接受的血糖水平。胰島素最常用的給藥方法是皮下注射，一般注入腹部或大腿上部。為了維持可接受的血糖水平，通常需要每天注射胰島素至少一次或者兩次，并在必要時補充注射速效胰島素。當(dāng)糖尿病人使用家用診斷器密切監(jiān)測血糖水平時，將需要更為頻繁的注射來進行治療。具體的講，本發(fā)明是關(guān)于迅速起效胰島素的施用方法，該方法可使血清胰島素在一小時之內(nèi)達峰，葡萄糖在90分鐘內(nèi)達到谷底。通過注射施用胰島素在許多方面不理想。首先，許多病人發(fā)現(xiàn)，為滿足維持正常血糖水平的需要而頻繁地給自己注射既困難又麻煩。這種不情愿可能會導(dǎo)致不遵醫(yī)囑，這在一些非常嚴(yán)重的病例中會危及生命。此外，皮下注射胰島素的機體吸收也相對緩慢，即使使用速效胰島素的制劑時，也經(jīng)常需要45至90分鐘。因此，提供可以避免自我注射同時胰島素又可被機體迅速利用的其它胰島素制劑和給藥途徑，長期以來一直是人們的一個目標(biāo)?，F(xiàn)已提出了許多這種替代性的胰島素給藥途徑，包括鼻內(nèi)、直腸內(nèi)以及陰道內(nèi)的給藥方法。當(dāng)這些技術(shù)避免了皮下注射的不適以及不協(xié)調(diào)的同時，它們也都遭受了自身的限制。直腸內(nèi)及陰道內(nèi)給藥不方便，不舒適，而且后者也不能用于所有的糖尿病人。鼻內(nèi)釋放將方便一些，可能也比注射更容易接受，但由于鼻粘膜有一層厚的阻止大分子通過的上皮層，需要使用有潛在毒性的“增透劑”來影響胰島素透過鼻粘膜。本發(fā)明的特殊興趣在于肺部胰島素給藥，在此，病人吸入一種胰島素制劑并通過肺泡區(qū)的薄的上皮細胞層進行機體吸收。看起來這種肺部胰島素給藥的機體吸收比皮下注射更為迅速，同時還避免了用針。但是，肺部胰島素給藥仍需得到廣泛的接受。以前，肺部給藥經(jīng)常是通過液體胰島素制劑的噴霧法來完成，這需要使用笨重的液體噴霧器。此外，由這種噴霧器形成的氣霧劑只有非常低的胰島素濃度，需要吸入相當(dāng)多的次數(shù)來達到足夠的劑量。胰島素濃度的受限歸因于胰島素在合適的水溶液中的溶解度不好。在一些情況下，需要80次或以上的呼吸來達到足夠的劑量，致使一次用藥的時間為10至20分鐘，甚至更長。提供用于胰島素肺部給藥的改良的方法和組合物是誘人的。如果這種方法和組合物足夠方便，能夠允許甚至在戶外時也可以自我給藥，并且可以通過相對較少的呼吸次數(shù)(最好少于10次)傳送需要的總劑量這將格外誘人。這種方法和組合物還應(yīng)提供機體對胰島素的迅速吸收，最好能在45分鐘或更少的時間內(nèi)達到血清峰值，并在1小時或更少的時間內(nèi)達到血糖谷值。這種迅速起效的制劑將較好地適用于攻擊性治療記錄，從而減少或消除速效或長效胰島素的注射。本發(fā)明的組合物還應(yīng)該是穩(wěn)定的，最好由濃縮的干粉制劑組成。許多文獻中都描述了霧化的胰島水溶液的呼吸給藥，首先是Gansslen(1925)，Klin.Wochenschr.471，還有Laube等(1993)，JAMA2692106-21-9；Elliott(1987)，Aust.Paediatr.J.23293-293；Wigley等(1971)，Diabetes20552-556.Corthorpe等(1992)，PharmRes.9764-768；Govinda(1959)，IndianJ.Physiol.Pharmacol.3161-167；Hastings等(1992)，JAppl.Physiol.731310-1316；Liu等(1993)，JAMA2692106-2109；Nagano等(1985)，JikeikaiMed.J.32503-506；Sakr(1992)Int.J.Phar.861-7；和Yoshida等(1987)，Clin.Res.35160-166。美國專利5,254,330描述了在大顆粒載體賦形劑上的干粉藥物如胰島素的肺部給藥。Lee和Sciara(1976)在J.Pharm.Sci.65567-572中描述了用于傳送懸浮于拋射劑上的結(jié)晶胰島素的計量劑量吸入器(MDI)。美國專利5230094描述了一個將胰島素傳送到一個空隙中來調(diào)節(jié)吸氣流速的MDI。重組胰島素的支氣管給藥由Schluter等(摘要，1984年，Diabetes3375A)和Kohler等(1987年，Atemw.Lungenkrkh13230-232)作了簡要描述。美國專利5011678和Nagai當(dāng)(1984)J.Contr.Rel.115-22)描述了在增強劑的存在下，包括胰島素在內(nèi)的多種多肽的鼻內(nèi)及呼吸給藥。美國專利5204108；4294829；和4153689；PCT申請WO93/02712，WO91/02545，WO90/09780和WO88/04556；英國專利1527605；Ryden和Edman(1992)Int.J.Pharm.831-10；以及Bjork和Edman(1988，Int.J.Pharm.47233-238)描述了含有增強劑并且/或者包含于控釋制劑中的胰島素的鼻內(nèi)給藥，無定形胰島素的制備和穩(wěn)定性由Rigsbee和Pikal(AmericanAssociationofPharmaceuticalSciences(AAPS)，1993年12月14-18日，LakeBuenaVista，佛羅里達)作了描述。在載體上噴霧干燥多肽、多核苷酸以及其他不穩(wěn)定藥物以形成無定形結(jié)構(gòu)來穩(wěn)定藥物的方法在歐洲專利申請520748中作了描述。根據(jù)本發(fā)明，對一個哺乳動物，具體的講是一個患有糖尿病的病人，胰島素的煙霧化以及機體給藥的方法和組合物在避免了皮下注射的同時，還可以迅速吸收進入血液循環(huán)。具體的講，本發(fā)明的方法基于以干粉的形式進行胰島素的肺部給藥。令人驚奇的是，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)吸入的干胰島素粉末沉積于肺泡區(qū)，并被肺泡的上皮細胞迅速吸收進入血液循環(huán)。因此，胰島素粉末的肺部給藥可以成為皮下注射給藥的一個有效的替代方法。本發(fā)明的第一個方面，所用的胰島素是干的粉末，通常但并不必須是一個大體無定形狀態(tài)，將其分散于空氣或其它生理上可接受的氣流中以形成煙霧劑。將該煙霧俘獲于一個有噴嘴的容器中，病人可以通過噴嘴吸入煙霧。隨需要，干粉胰島素可與藥物上可接受的干粉載體組合，這在下面有更詳細的描述。胰島素的干粉優(yōu)選地由直徑低于10μm顆粒組成，更為優(yōu)選的低于7.5μm，最為優(yōu)選的低于5μm，通常在0.1μm至5μm的范圍之內(nèi)。令人驚奇的是，本發(fā)明的干粉胰島素組合物在肺內(nèi)吸收時，無需使用象那些通過鼻粘膜及上呼吸道進行吸收時所需的增透劑。第二個方面，本發(fā)明提供的胰島素組合物，主要由平顆粒尺寸低于10μm的干粉胰島素組成，其中可能組合有干粉藥物載體。胰島素組合物中最好不含增透劑并且所包含的顆粒直徑優(yōu)選低于10μm，更為優(yōu)選低于7.5μm，最為優(yōu)選低于5μm，通常在0.1至5μm范圍之間。通常，在干粉胰島素中含有重量比為5％至95％的胰島素，更為常用的是從15％至80％附著在一個合適的載體上，通常是糖、有機鹽、氨基酸、多肽或蛋白質(zhì)，此后會有更詳細的描述。本發(fā)明的第三個方面，胰島素干粉的制備是通過將胰島素溶于一個緩沖水溶液中，然后將該溶液噴霧干燥制得顆粒尺寸低于10μm至5μm之間大體無定形顆粒，隨需要，將藥物載體也溶于緩沖液中形成一個均相溶液，在將此溶液噴霧干燥時制得包含有胰島素、載體、緩沖劑以及溶液中存在的所有其它成份的獨立顆粒。優(yōu)選載體是糖，有機鹽，氨基酸，多肽或蛋白質(zhì)，這些載體在噴霧干燥中可以制得大體無定形的結(jié)構(gòu)。無定形載體既可以是玻璃狀的，也可以是橡膠狀的，可以增加胰島素在貯存過程中的穩(wěn)定性。在利的是，這種穩(wěn)定了的制劑還可以在吸入到肺泡區(qū)后有效地將胰島素釋放進入血液。通過參閱剩余部分的詳細說明及插圖，對于本發(fā)明的性質(zhì)及優(yōu)點的深入了解將變得明顯。圖1是一個根據(jù)本發(fā)明的方法霧化胰島素制劑的系統(tǒng)的圖解說明。圖2是病人從圖1的系統(tǒng)中吸入霧化的胰島素的圖解說明。圖3A和3B是用曲線來說明在霧化三種不同的干粉制劑后，大鼠對重組人胰島的吸收以及引起的血糖反應(yīng)。每一個點代表三只不同大鼠的平均值。在時間零點開啟干粉煙霧發(fā)生器。對87％胰島素/檸檬酸鹽，20％胰島素-甘露糖醇/檸檬酸鹽，20％胰島素-棉子糖/檸檬酸鹽粉末的煙霧化作用分別在5分鐘，14分鐘和20分鐘時完成。動物禁食過夜。4A和4B是用曲線說明平均血清胰島素和葡萄糖的時間-濃度曲線，對Cynomolgus猴的煙霧劑及皮下給藥分別進行了比較。煙霧劑組中報道的是三只猴子平均值，皮下組中報道的是四只猴子的平均值。圖5A是用曲線說明人皮下注射(○)和吸入三次噴射(●)的平均胰島素濃度隨時間的變化。圖5B顯示與5A中胰島素濃度相對應(yīng)的平均葡萄糖濃度。圖6A是人皮下注射(○)和吸入三次噴霧給藥(●)所引起的血漬胰島素濃度對時間變化的曲線說明。圖6B是對應(yīng)于6A中的胰島素水平的血清葡葡糖水平的曲線說明.圖7B和7A給出了皮下給藥(○)和噴霧給藥(●)的血清胰島素(7A)和葡萄糖水平(7B)的個體間差異比較。圖8A，8B和8C顯示了人胰島素的反相HPLC(rpHPLC)。圖8A是一個胰島素標(biāo)準(zhǔn)品的色譜分析，在25℃下溶于10mMHCl中，顯示人胰島素在23.87分鐘洗脫，脫氨基胰島素在30.41分鐘洗脫。圖8B顯示一個相似的人胰鳥素標(biāo)準(zhǔn)品的色譜圖。圖8C顯示根據(jù)本發(fā)明制備本發(fā)明制備的噴霧干燥的重組胰島素制劑的相似的色譜圖。圖9顯示了一個胰島素制劑在噴霧干燥前后的紫外光譜。在可見光譜內(nèi)沒有觀察到光的散射，表明胰島素在噴霧干燥過程中沒有發(fā)生聚集。根據(jù)本發(fā)明，胰島素是做為干粉出現(xiàn)?！案煞邸币馕吨勰┲械乃趾康陀谥亓勘鹊拇蠹s10％，通常低于重量比的大約5％，優(yōu)選低于重量比的大約3％?！胺勰币馕吨葝u素包含具有選擇尺寸的自由流動的顆粒，以允許穿透到肺泡中，優(yōu)選直徑小于10μm，更為優(yōu)選低于7.5μm，最優(yōu)選的低于5μm，通常是直徑在0.1μm到5μm之間。本發(fā)明至少是部分地基于干粉胰島素可通過宿主的肺方便迅速地吸收這一意外的觀察結(jié)果。很奇怪干粉胰島素能夠到達肺泡區(qū)，因為已經(jīng)知道諸如胰島顆粒等水溶性藥都是吸濕的。參見Byron等編輯，RespiratoryDrugDelivery，CRCPress，BacaRaton，(1990)，150頁。因此，曾經(jīng)預(yù)測，為顆粒經(jīng)過肺的導(dǎo)氣管時(其中37℃時的相對溫度超過99％)，各顆粒將有吸水并長大形成一個有效顆粒大小超過本發(fā)明中10μm的上限的趨向。如果一個胰島素顆粒的實在部分大于目標(biāo)中的尺寸范圍，預(yù)期這些顆粒將會沉積在肺的中央導(dǎo)氣管內(nèi)而不是肺泡區(qū)，從而限制了(藥物)的釋放及隨后的機體吸收。此外，肺上皮細胞上的流動層非常薄，通常只有給藥胰島素粉末直經(jīng)的幾分之一。因此，在本發(fā)明之前很難預(yù)料于的胰島素顆粒在沉積于肺泡區(qū)時是否會溶解。另人驚奇的是，干的胰島素粉末顯然既可以進入肺泡區(qū)內(nèi)又可以在其沉積于肺泡區(qū)后立刻溶解。溶解了的胰島素就可以透過上皮細胞進入循環(huán)?，F(xiàn)在確信，胰島素的有效吸收是由于它在肺泡的超薄(＜0.1μm)流動層中的迅速溶解。本發(fā)明中顆粒的平均尺寸比肺流動層大10到50倍，而顆粒的溶解及機體對胰島素的吸收卻非常迅速，使人很感意外。的確，正如在此后的實驗部分中所顯示的，本發(fā)明的干胰島素制劑可以提供比目前最常用的皮下注射給藥方法更為迅速的血清胰島素峰值以及葡萄糖下降。然而，實施在此描述的本發(fā)明無需對于精確機制的了解。根據(jù)本發(fā)明，優(yōu)選的組合物中將基本不含增透劑?！霸鐾竸笔潜砻婊钚曰衔?，它可以促進胰島素(或其它藥物)穿透粘膜，建議在鼻內(nèi)、直腸內(nèi)、陰道內(nèi)給藥的制劑中使用。增透劑的范例包括膽汁鹽，如?；悄懰猁}、甘膽酸鹽和脫氧膽酸鹽；褐霉酸，如牛磺脫氫褐霉素以及生物可容性洗滌劑，如吐溫，Laureth-9以及類似物質(zhì)。然而，在用于肺部的制劑中使用增透劑通常是不合適的，因為這些表面活性化合物會對肺內(nèi)的上皮血液屏障產(chǎn)生不利影響。令人驚奇的是，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的干粉胰島素組合物無需使用增透劑在肺內(nèi)也很容易吸收。適于本發(fā)明使用的胰島素干粉包括無定形胰島素、結(jié)晶胰島素以及無定形和結(jié)晶胰島素二者的混合物。干粉胰島素優(yōu)選通過一定條件下的噴霧干燥來制備，生成大體無定形粉末，顆粒的尺寸在上述范圍之內(nèi)。除此之外，無定形胰島素的制備可以通過將合適的胰島素溶液在一定條件下冷凍干燥、真空干燥、蒸發(fā)干燥來形成無定形結(jié)構(gòu)。這樣制得的無定形胰島素然后可以經(jīng)過研磨或碾碎制得在適宜尺寸范圍之內(nèi)的顆粒。結(jié)晶干粉胰島素可以通過研磨或噴射碾碎大塊的結(jié)晶胰島素形成。形成含有顆粒在適宜尺寸范圍之內(nèi)的胰島素粉末的優(yōu)選方法是噴霧干燥，首先將純凈的大塊胰島素(通常是結(jié)晶的形式)溶于生量上可接受的緩沖水溶液，一般來說是PH值在2到9范圍之間的檸檬酸鹽緩沖液。溶解的胰島素濃度從重量的0.01％到重量1％，通常中從0.1％到0.2％。該溶液然后可以用傳統(tǒng)噴霧干燥設(shè)備(來自于Buchi，Niro等供應(yīng)商)噴霧干燥，生成大體無定形的顆粒產(chǎn)品。干胰素粉應(yīng)主要由在要求尺寸范圍之內(nèi)的胰島素顆粒組成，基本不含其它任何生物活性物質(zhì)，藥物載體等。這種“純凈”制劑可能包括一些微量成份，如防腐劑，它存在的量很少，一般低于重量的10％，通常低于重量的5％。使用這種純凈制劑，即使是大劑量所需的吸入次收也可以大大減少，通常僅需一次呼吸。本發(fā)明的胰島素粉末可任意地與適于呼吸和肺部給藥的藥物載體或賦形劑組合。當(dāng)想要降低用于病人的粉末中的胰島素濃度時，這些載體可能僅起填充劑的作用，但它同樣也可以起到增加胰島素組合物的穩(wěn)定性和改善粉末在粉末分散器中的分散性，從而提供更為有效、更易重現(xiàn)的胰島素釋放；以及改善胰島素的工藝性能如流動性和稠度，以易于生產(chǎn)和粉末填充的作用。適宜的載體材料可以是無定形粉末，結(jié)晶粉末，或者無定形與結(jié)晶粉末的組合。適宜的材料包括(a)糖如果糖、半乳糖、葡萄糖、D-甘露糖、山梨糖等的單糖；像乳糖、海藻糖、纖維素二糖等二糖；環(huán)糊精如2-羥丙基-β環(huán)糊精；像棉子糖、麥芽糖糊精、葡聚糖等多糖；(b)氨基酸如甘氨酸、精氨酸、天冬氨酸、甘氨酸、半胱氨酸、賴氨酸等。(c)由有機酸及有機堿制備的有機鹽如檸檬酸鈉、抗壞血酸鈉、葡萄糖酸鎂、葡萄糖酸鈉，氨基丁三醇鹽酸鹽等。(d)多肽和蛋白如天冬酰苯氨酸甲酯人血清白蛋白、明膠及此類。(e)alditols，如甘露糖醇、木糖醇等。優(yōu)選的載體組群包括乳糖、海藻糖、棉子糖、麥芽糖糊精、甘氨酸、檸檬酸鈉、氨基丁三醇鹽酸鹽、人血清白蛋白及甘露糖醇。這些載體材料可以與胰島素在噴霧干燥前組合，也就是將載體材料加入到準(zhǔn)備進行噴霧干燥的緩沖溶液中。在這種方法中，載體材料將作為胰島素顆粒的一部分與其同時形成。一般地，當(dāng)載體材料經(jīng)噴霧干燥與胰島素一起形成時，在各顆粒中胰島素的含量將占重量百分比的5％到95％，優(yōu)選從20％到80％。顆粒的其余部分主要是載體材料(一般占重量比的5％到95％，通常是20％到80％)，但也含緩沖劑，不可能包括上面所述的其他成份。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，分散到肺泡區(qū)的顆粒(也就是那些小于10μm，在要求尺寸范圍內(nèi)的顆粒)中含有載體材料并不顯著干擾機體對胰島素的吸收。此外，也可以將載體單獨制成干粉形式并經(jīng)混合與胰島素組合在一起。單獨制造的粉末載體通常是結(jié)晶(以防止吸水)，但在一些情況下也可以是無定形的或是結(jié)晶與無定形體的混合物。需對載體顆粒的大小進行選擇以改善胰島素粉的流動性，一般在20μm到100μm的范圍內(nèi)。在此尺寸范圍內(nèi)的載體顆粒通常并不進入肺泡區(qū)內(nèi)，經(jīng)常在吸入之前在給藥裝置內(nèi)就與胰島素相分離。因此，進入到肺泡區(qū)的顆粒主要包括胰島素和緩沖劑。優(yōu)選的載體材料是尺寸在上述范圍內(nèi)的甘露糖醇晶體。本發(fā)明的干胰島素粉也可以與其它活性物質(zhì)組合。例如，在干胰島素粉末中加入少量糊精或活性糊精類似物有利于改善對糖尿病的治療。糊精是由正常(非糖尿病的)個體的胰腺β細胞與胰島素同時分泌的一種激素。人們確信糊精在體內(nèi)調(diào)節(jié)胰島素的活性，而且有人提出將糊精與胰島素同時給藥可以加強對血糖的控制。將干粉糊精與本發(fā)明的組合物中的胰島素組合，可以提供達到這種同時給藥的非常方便的產(chǎn)品。糊精可以按重量比從0.1％到10％與胰島素混合(基于藥物中的胰島素的總重量)，優(yōu)選從重量比的0.5％到2.5％。糊精可以從供應(yīng)商處買到(例如AniylinCorporation，SanDiego，California)，并很容易調(diào)配到本發(fā)明的組合物中。例如，糊精可以與胰島素、載體一起溶于水溶液或其它合適的溶液中，將該溶液噴霧干燥制得粉末產(chǎn)品。本發(fā)明的干粉胰島素組合物優(yōu)選用常用的方法將其分散在流動的空氣中或其它生理上可接受的氣流中來煙霧化。在共同未決的申請?zhí)枮?7/910048，公開號為WO93/00951的申請中描述了一個適用于這種分散的系統(tǒng)，其所有公開內(nèi)容在此以參考。參閱圖1，將干的，自由流動的胰島素粉末加入高速的空氣或氣體流中，得到的分散物人存儲室10(holdingChamber)中。存儲室10設(shè)有噴嘴12，噴嘴位于空氣粉末分散物入口的對面。室10的體積要足夠大的俘獲合適的劑量，隨需要還可以設(shè)置擋板和/或單向閥門的防止污染。在室10中俘獲了一次劑量的胰島素粉末后，病人P(圖2)從噴嘴12吸氣，把霧化的分散物吸入肺中。當(dāng)病人P吸氣時，補充空氣從切向空氣入口14進入，進入的空氣按通常的旋渦方式流動，把霧化的胰島素從小室中帶入病人的肺中。室的體積及霧化劑量的大小要使病人可以完全吸入伴有足夠空氣的全部胰島素以保證胰島素到達肺泡區(qū)的深處。這種霧化的胰島素粉末在替代皮下注射速效胰島素來治療糖尿病或相關(guān)的胰島素缺乏癥時特別有用。令人驚奇的是，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)由干粉胰島素的噴霧給藥引起的胰島素吸收和血糖反應(yīng)比皮下注射所引起的要明顯快多。因此，本發(fā)明的方法和組合物在用于病人需頻繁地監(jiān)測血糖水平并在需要時施用胰島素來維持目的血清濃度的治療方案中特別有價值，也可以用以需要進行機體胰島素給藥的任何時候。病人可以像剛才所述那樣通過吸入適量的胰島素來達到需要的劑量。通過剛才所述的方法進行機體胰島素釋放的效率一般在大約15％到30％，每一次的劑量(基于每一次的吸入)一般在大給0.5mg到10mg。通常，在一次呼吸給藥中適宜的胰島素總劑量在大約0.5mg到15mg。因此，病人可以通過一至四次的呼吸來達到需要的劑量。提供下述實例是為了進行說明而不是進行限定。實驗部分材料和方法材料結(jié)晶人胰島素鋅，26.3unit/mg(LillyLot#784KK2，EliLillyandCompany，Indianapolis，IN)反相HPLC檢測，純度大于99％。USP甘露糖醇(RoquetteCorporation，Gurnee，IL)。棉子糖(PfanstiehlLaboratories，Waukegan，IL)。二水合檸檬酸鈉，USP，ACS和一水合檸檬酸，USP(J.T.Baker，Phillipsburg，NJ)。粉末的制備胰島素粉末的制備是將大塊結(jié)晶胰島素溶于含有賦形劑(甘露糖醇或棉子糖或不加)的檸檬酸鈉緩沖溶液中，得到的最終固體濃度為7.5mg/ml，PH值為6.7±0.3。噴霧干燥器的操作在入口處的溫度在110℃到120℃之間，供給液體速度為5ml/min，形成出口處的溫度在70℃到80℃之間。然后將溶液濾過0.22μm的濾膜并在Buchi噴霧干燥器內(nèi)噴霧干燥，形成良好的白色無定形粉末。生成的粉末在干燥環(huán)境中(相對＜溫度10％)保存于蓋緊蓋子的容器內(nèi)。粉末分析粉末的顆粒尺寸分布的測量是將粉末在SedisperseA-11(Micromeritics，Norcross，GA)內(nèi)分散后用液體離心沉積法在HoribaCAPA-700顆粒尺寸分析儀上進行。粉末的水分含量的測定是通過KarlFischer法在三菱CA-06濕度計上進行。在粉末制作過程前后的胰島素完整性的測量是以人胰島素標(biāo)準(zhǔn)品為參照，將稱量過的部分粉末重新溶于蒸餾水中并將重新溶解的溶液與加入噴霧干燥器內(nèi)的原始溶液進行比較。通過反相HPLC中的保留時間和峰面積來測定胰島素分子是否在此過程中發(fā)生了化學(xué)修飾或降解。運用紫外吸收來測定胰島素的濃度(278μm)以及是否存在不溶性聚合物(400μm)。此外還要測量開始時以及新配制的溶液的PH值。通過偏光顯微鏡來確證胰島素粉末的無定性特性。大鼠的煙霧劑接觸大鼠實驗在噴霧劑接觸室內(nèi)進行。雌性大鼠(280-300gm)禁食過夜。將動物(每次實驗21至24只)放置于有機玻璃管內(nèi)，然后封固于有48個氣門、只露鼻子的(mose-only)煙霧劑接觸室內(nèi)(In-Tox產(chǎn)品，Albuquerque，NM)。到達呼吸區(qū)域的空氣流量保持在7.2-9.8L/min，并通過真空將其移走，因此用magnahelic計測量時，在室內(nèi)會有輕微的負壓(約1.5cmH2O)。根據(jù)充入室內(nèi)的粉末的多少，煙霧劑的接觸時間在5到20分鐘之間。用手將粉末加入到一個小的文丘里氏噴嘴中來分散粉末顆粒，形成良好的煙霧云。文氏噴嘴的操作壓力超過15psig，空氣流量設(shè)置在7.21/min到9.81/min。文氏噴嘴裝在清晰的有機玻璃分散室的底部，通過它將煙霧劑加入到只露鼻子的接觸室中。大鼠煙霧劑室的校準(zhǔn)呼吸區(qū)內(nèi)的粉末濃度測定通過使用In-Tox過濾器在21/min真空流量下收集呼吸區(qū)內(nèi)大部分的計時過濾的樣品，小室在有動物及沒有動物時均進行了校準(zhǔn)。粉末的質(zhì)量用重量分析測定。呼吸區(qū)內(nèi)粉末的顆粒大小通過設(shè)置在呼吸孔的階式碰撞取樣器(InTox產(chǎn)品)在21/min的流量下測定。每一級的粉末質(zhì)量用重量分析測定。每次實驗使用21至24只大鼠，煙霧劑接觸時間持續(xù)5到20分鐘。在時間零點和煙霧劑接觸結(jié)束后大約7、15、30、60、90、120、180和240分鐘各殺死三只大鼠。將大鼠麻醉，打開其腹部，從腹主動脈抽取大量血液樣品。然后用頸部脫位法處死動物。血液在室溫下凝集30分鐘，然后用血清分離試管在3500rmp下離心20分鐘。血清可以立即進行分析，也可以在-80℃下冷凍直至分析。在煙霧劑給藥結(jié)束后盡快(0-7min)處死三只大鼠，抽取其血液并半它們的肺用5ml的灌洗6次。最終混合的灌洗樣品中的胰島素含量在計算生物利用度時作為大鼠的煙霧劑的劑量。靈長類接觸系統(tǒng)使用幼小的野生雄性Cynomolgus猴種的fascicularis彌猴2-5kg(CharlesRiverPrimates，Inc.)進行靈長類煙霧劑研究(每組3-4只動物)。對動物皮下注射胰島素(EliLilly，Indianapolis，Indiana)或讓其接觸胰島素粉末煙霧劑。每只動物均關(guān)在只露頭部的接觸單元中，以適當(dāng)?shù)牧魉?71/min)供給新鮮的實驗氣體的供給動物最少的氧氣需要量。將動物固定在椅樣的器具上使其處于直立的坐姿。罩子是清晰的，可以使動物完整地看到它們的周圍環(huán)境。在(動物)腿上插上留置導(dǎo)管，從而可以在任意時間抽取血液樣品。在整個過程中猴子完全清醒并表現(xiàn)得安靜。靈長類的血液處理與大鼠相同(見上)。靈長類類霧劑接觸系統(tǒng)包括呼吸監(jiān)測器，可以對每只猴子吸入的空氣量進行定量。這個數(shù)值與測得的呼吸空氣中的胰島素濃度一起可以計算出每只動物確切吸入了多少胰島素。人體實驗對24個正常人分別用皮下注射和吸入霧化的干粉胰島素進行胰島素給藥。每次皮下注射包括10.4單位的HumulinR，100u/ml(EliLilly，Indianapolis，Indiana)。干胰島素粉是用上述的噴霧干燥的方法制備的無定形粉末，含有20％重量比的甘露糖醇賦形劑。將胰島素干粉藥物(5mg)在高速空氣流中進行分散，形成良好的煙霧劑并將其俘獲于小室中。每個個體對每一個煙霧劑團或每次“噴射”通過緩慢地深呼吸吸入煙霧劑粉末。粉末通過三次噴射給藥(劑量為31.9單位)。如下所述，血清胰島素及葡萄糖水平隨時間進行測定。血清分析大鼠、靈長類及人的血清胰島素水平的測定應(yīng)用適于人胰島素的Coat-A-Count放射免疫分析儀(DiagnositcProductsCorporation，LosAngeles，CA)。對每一組樣品均做了標(biāo)準(zhǔn)曲線。分析的靈敏度大約為43pg/ml。評估內(nèi)變化率(withinassayvariability)＜5％(CV％)。葡萄糖分析由加利福尼亞獸醫(yī)診斷公司(WestSacramento，CA)使用適于BoehringerMannheim/Hitachi747分析儀的葡萄糖/HK試劑系統(tǒng)包進行。評估內(nèi)變化率(％CV)＜3％。在大鼠實驗中，煙霧劑的相對生物利用度的計算是通過將調(diào)整劑量的免疫活性胰島素(IRI)濃度-時間曲線的曲線下面積(AUC)與由皮下注射所得到的進行比較。在大鼠中，用全部灌洗胰島素的質(zhì)量作為煙霧劑的劑量。一些胰島素在肺部灌洗之前即被吸收，因此用這種方法估計的劑量可能稍微低估了沉積的總劑量。對這種推測的損失來進行校正。在猴子實驗中，除了用吸入的胰島素的量代替肺灌洗胰島素作為煙霧劑的劑量外，相對生物利用度的計算與上面大鼠的相似。在大鼠中，估算的劑量中只包括沉積于肺的物質(zhì)，而不包括沉積于鼻腔和咽喉部位的胰島素。在猴子中，估算的劑量中包括所有進入動物體內(nèi)的胰島素。大鼠胰島素吸收結(jié)果所有用于動物研究的胰島素粉末的顆粒尺寸(集體平均直徑)在1-3μ范圍內(nèi)，水份含量＜3％。用反相HPLC測得粉末中的胰島素純度＞97％。在圖8C中顯示了20％胰島素制劑的代表性色譜圖。粉末在重新溶于純凈水后得到澄清溶液，在400nm的紫外吸收小于0.01，pH值為6.7±0.3。在圖9中顯示了20％胰島素制劑的代表性紫外圖譜。在In-Tox48氣門的接觸室中，應(yīng)用下面三種胰島素粉末制劑作為煙霧劑進行了大鼠實驗。1.87.9％胰島素；11.5％檸檬酸鈉；0.6％檸檬酸。2.20％胰島素；66％甘露糖醇；12％檸檬酸鈉，0.6％檸檬酸。3.20％胰島素；66％棉子糖；12.4％檸檬酸鈉，0.6％檸檬酸。表1列出了三次不同大鼠接觸研究的主要測量結(jié)果，包括在小室操作條件下呼吸區(qū)域內(nèi)煙霧劑的特性。由于在填加粉末過程中粉末的碰撞以及不完全分散引起的在墻壁上的損失，只有部分加入文氏噴嘴的粉末到達了大鼠的呼吸區(qū)域(34-67％)。然而在呼吸區(qū)域的煙霧劑顆粒的尺寸對于肺部沉積比較理想(1.3-1.9μm)，并且比原始制劑的顆粒尺寸(2.0-2.8μm)稍微小了些，這是由于在動物接觸室內(nèi)選擇性丟失了大的顆粒。表1.大鼠煙霧劑接觸測量結(jié)果</tables>表2顯示了三次煙霧劑以及一次皮下研究的大鼠血清胰島素及葡萄糖結(jié)果。圖3A和3B顯示了三種經(jīng)煙霧劑給藥的制劑的血清免疫活性胰島素(IRI)時-量曲線以及血清葡萄糖時-量曲線。表3給出了不同研究的胰島素tmax和葡萄糖tmin以及與皮下注射相比較煙霧劑的相對生物利用度。表2.大鼠血清胰島素和葡萄糖結(jié)果表3煙霧劑與皮下注射(SC)胰島素在動物中的比較大鼠SC大鼠88％胰島素甘露糖醇煙霧劑大鼠20％胰島素甘露糖醇煙霧劑大鼠20％胰島素棉子糖煙霧劑猴子SC猴子20％胰島素甘露糖煙霧劑胰島素Max*15min16min21min17min15min30min葡萄糖min*30min31min43min37min45min45min葡萄糖下降77％42％62％21％45％73％相對生物利用度100％10％**44％**14％**100％12％***</table></tables>*T從煙霧劑接觸結(jié)束計起葡萄糖min＝在研究中觀察到大于最大降低值的85％時的時間**基于煙霧劑接觸結(jié)束時從肺灌洗回收得到的胰島素***基于吸入的胰島素，包括在鼻腔及咽喉內(nèi)損失所有三種制劑都對大鼠的機體循環(huán)提供了迅速吸收的胰島素(圖3A和3B)。20％胰島素/甘露糖醇粉末的生物利用度及葡萄糖反應(yīng)較高(表3)。不過沒有進行許多重復(fù)實驗，不能確定差別是否顯著。靈長類結(jié)果對4只猴子注射與人體實驗相同的劑量(0.2u/kg，每只猴子約27μg)，得到皮下注射(SC)的數(shù)據(jù)與煙霧劑的結(jié)果進行比較(圖4A和4B)。表4顯示了猴子噴霧接觸的數(shù)據(jù)，表5顯示煙霧劑接觸及皮下研究的平均血清胰島素及葡萄糖(結(jié)果)。煙霧劑產(chǎn)生了很強的胰島素及葡萄糖反應(yīng)(高劑量)。圖4顯示了兩次煙霧劑及一次皮下研究的平均血清胰島素圖形的比較。從這些圖形的曲線下面積計算出煙霧劑胰島素的相對生物利用度為12％。表4猴子煙霧劑接觸數(shù)據(jù)</tables>人體(實驗)結(jié)果下面的表5列出了呼吸給藥與皮下注射的比較結(jié)果。呼吸煙霧劑給藥的吸收(20分鐘達峰)比皮下注射(60分鐘達峰)快得多，引起的葡萄糖反應(yīng)(60分鐘達谷)也比皮下注射(90分鐘達谷)快得多。胰島素及葡萄糖反應(yīng)在煙霧劑中的重現(xiàn)性與注射時至少同樣的好。注射用的劑量根據(jù)體重做了仔細的調(diào)整，煙霧劑的劑量未調(diào)整。由葡萄糖反應(yīng)得出的煙霧劑胰島素的生物活性相對于注射為28-36％。由胰島素曲線下面積得出的三次噴射給藥組的煙霧劑胰島素的生物利用度，相對于注射為22.8％。表5人體實驗的血清胰島素和葡萄糖結(jié)果胰島素個體編號#S劑量/注個體內(nèi)的血清胰島素最大值的基于胰島素曲線下面射或發(fā)泡劑量*增加μU/ml時間積的相對生物利用度1-24(SC注射)10.4U10.4U5.8-20.960min100.0％7-24(噴射)76.0U31.9U6.1-28.520min22.8％葡萄糖個體編號#S平均血清葡萄糖mg/dl下降量最小值的％SC基于胰島素AUC的下降mg/dl時間的相對生物利用度1-24(SC注射)93.6-64.928.790min100％100％7-24(噴射)91.8-67.624.260min84.3％27.4％*儀器效率＝42％在圖5A-5B中進一步顯示了人體實驗的結(jié)果。圖5A顯示皮下注射(○)及吸入(三次噴射，●)的平均血清胰島素濃度隨時間的變化。在圖5B中的相似的方式顯示了平均血清葡萄糖水平。在圖6A和6B中分別顯示了胰島素的峰值與葡萄糖的谷值，在圖7A和7B中分別顯示了胰島素與葡萄糖的個體間差異。此外，在煙霧劑接觸過程中，猴子的淺呼吸(潮式呼吸)不是用于肺部深處沉積的優(yōu)選呼吸方式。如預(yù)期的那樣，當(dāng)使用最佳的呼吸方式，同時用嘴而不是用鼻子吸入煙霧劑團時，在人體實驗中觀察到了較高的生物利用度。雖然前述的發(fā)明為達到使理解清楚的目的，以說明和實例的方式對某些細節(jié)做了描述，但那些可能實施的改變和修飾顯然在附加的權(quán)利要求書的范圍內(nèi)。權(quán)利要求1.霧化胰島素制劑的方法，所述方法包括提供干粉胰島素；將一定數(shù)量的所述干粉分散在氣體流中形成煙霧劑；并且將煙霧劑俘獲在設(shè)有供患者隨后吸入的噴嘴的小室中。2.如權(quán)利要求1所述的方法，其中的胰島素基本不含增透劑。3.如權(quán)利要求1所述的方法，其中的胰島素附著于干粉載體上，重量濃度在5％至99％范圍內(nèi)。4.如權(quán)利要求3所述的方法，其中的粉末載體包括糖、有機鹽、氨基酸、多肽或蛋白質(zhì)。5.如權(quán)利要求1所述的方法，其中的胰島素干粉包含平均尺寸小于10μm的顆粒。6.如權(quán)利要求1所述的方法，其中的干粉包含含有胰島素及載體兩者的獨立顆粒。7.如權(quán)利要求6所述的方法，其中各個顆粒的胰島素含量為從重量比的5％至99％。8.胰島素呼吸(道)釋放的改進方法，其中的改進包括釋放胰島素干粉。9.如權(quán)利要求8所述的改進方法，其中的胰島素基本不含增透劑。10.如權(quán)利要求8所述的改進方法，其中的胰島素附著于干粉載體上，重量濃度在10％至99％范圍內(nèi)。11.如權(quán)利要求10所述的改進方法，其中粉末載體包括糖、有機鹽、氨基酸、多肽或蛋白質(zhì)。12.如權(quán)利要求8所述的改進方法，其中的胰島素干粉包括平均尺寸小于10μm的顆粒。13.如權(quán)利要求8所述的改進方法，其中的干粉包含有胰島素及載體兩者的獨立顆粒。14.如權(quán)利要求13所述的改進方法，其中各個顆粒胰島素含量為從重量比5％至99％。15.制備穩(wěn)定的干粉胰島素組合物的方法，所述方法包括將胰島素溶于緩沖水溶液中形成溶液；以及將溶液噴霧干燥制得平均尺寸小于10μm的大體無定形顆粒。16.如權(quán)利要求15所述的方法，其中的胰島素與藥物載體一起溶于緩于水溶液中，其中在噴霧干燥中制得各個顆粒的胰島素含量為從重量比5％至99％的干粉。17.如權(quán)利要求16所述的方法，其中的藥物載體是可以在噴霧干燥中產(chǎn)生粉末的糖、有機鹽、氨基酸、多肽或蛋白質(zhì)。18.如權(quán)利要求17所述的方法，其中的糖選自甘露糖醇、棉子糖、乳糖、麥芽糖糊精和海藻糖。19.如權(quán)利要求17所述的方法，其中的有機鹽選自檸檬酸鈉、乙酸鈉、抗壞血酸鈉。20.用于肺部釋放的胰島素組合物，所述組合物包含附著于藥物載體材料上的、胰島素含量為重量比5％至99％，并且尺寸低于10μm的獨立顆粒。21.如權(quán)利要求20所述的胰島素組合物，其中的組合物基本不含增透劑。22.如權(quán)利要求20所述的胰島素組合物，其中的藥物載體材料包括糖，該糖選自甘露糖醇、棉子糖、乳糖、麥芽糖糊精和海藻糖。23.如權(quán)利要求20所述的胰島素組合物，其中的藥物載體材料包括選自檸檬酸鈉、葡萄糖酸鈉、抗壞血酸鈉的有機鹽。24.由權(quán)利要求15的方法制得的胰島素組合物。25.主要由平均顆粒尺寸小于10μm的干粉胰島素組成的胰島素組合物。全文摘要通過胰島素的干粉煙霧劑的吸入進行哺乳動物宿主的胰島素系統(tǒng)釋放。發(fā)現(xiàn)胰島素干粉能夠經(jīng)肺的肺泡區(qū)域快速吸收。文檔編號A61K38/28GK1152867SQ95191910公開日1997年6月25日申請日期1995年2月7日優(yōu)先權(quán)日1994年3月7日發(fā)明者約翰·S·帕頓,琳達·C·福斯特,羅伯特·M·普萊茲申請人:吸入治療系統(tǒng)