專利名稱：生產酶的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及生產酶的方法及適用于該方法的細胞和DNA構建體。使用本發(fā)明的方法可使酶產量大量地增加。
酶作為能催化特異性反應的蛋白質分子，在廣泛的工業(yè)和技術領域已發(fā)現(xiàn)有許多用途，這些領域包括去污劑工業(yè)、食品和飼料工業(yè)、紙漿工業(yè)及紡織工業(yè)。酶比通常用于同樣或類似目的的化學試劑有許多重要的優(yōu)點，一個優(yōu)點是它們易于降解，因此，一般和化學試劑相比對環(huán)境污染較小。因此，許多目的酶被看作常規(guī)使用的化學試劑的具有魅力的替代物。
通常經過發(fā)酵具有天然地或作為被編碼所述酶的核酸序列轉化的結果可產生酶的微生物細胞或其它生物體細胞來生產酶。許多酶以無活性的酶原形式從生產酶的細胞中表達。表達的無活性的酶原典型地經過生產酶的細胞表達的一種或多種蛋白水解酶的作用進行加工轉變成有活性的酶。以外部提供的活化劑進行的加工也有報道，例如以真菌金屬蛋白酶對小牛凝乳酶前體的活化(Stepanov等，1990)。
雖然在酶的生產中在增加特異性酶的產量方面重組DNA技術的發(fā)展和運用是主要的突破，但是仍然有希望在產量方面取得進一步的提高，以此來滿足諸如對酶不斷增長的需要及改善酶生產的經濟性。
現(xiàn)在令人驚奇地發(fā)現(xiàn)，當?shù)鞍姿饷复嬖谟诎l(fā)酵細胞的培養(yǎng)基中時，可能獲得活性酶產量的大量提高，此活性酶以酶原的形式通過發(fā)酵能表達該酶原的細胞來產生。
因此，本發(fā)明涉及經過發(fā)酵以酶原的形式表達酶的細胞來生產活性酶的方法，該方法包括在能使酶原轉變成有活性酶的蛋白水解酶存在的條件下進行發(fā)酵；從發(fā)酵的培養(yǎng)基中回收有活性的酶，在發(fā)酵前和/或發(fā)酵過程中，將蛋白水解酶加入發(fā)酵培養(yǎng)基中。
比較在蛋白水解酶(即降解蛋白質的酶)存在時預期產生蛋白質的情況，發(fā)現(xiàn)蛋白水解酶的存在導致酶產量的大量提高。更具體地說提高兩倍多，例如與不加蛋白水解酶和典型地以所述宿主細胞表達的蛋白水解酶進行酶原活化的方法比較，以所述發(fā)酵生產的活性酶的量，提高4倍多、甚至高于6或8倍。
在本文中，術語“活性酶”意思是指表現(xiàn)出酶活性的酶的形式，例如成熟酶。酶的活性可以通過本領域已知的用于所述酶的方法來測定。
術語“酶原”意思是指酶的前體或前體形式。典型地，酶原由前肽和包含活性酶的氨基酸序列的多肽部分構成。酶原也可稱為前體。在發(fā)酵培養(yǎng)基里酶原可以是穩(wěn)定的，或與生產酶原的發(fā)酵培養(yǎng)基里的活性酶相比更不穩(wěn)定，例如和活性酶相比，在發(fā)酵培養(yǎng)基里的酶原降解更快。
術語“蛋白水解酶”或“成熟酶”在本申請中可交替使用，其意思是指能從細胞表達的酶原切掉前肽的酶，以此實現(xiàn)從酶原向活性酶或成熟酶的轉換。優(yōu)選的蛋白水解酶不裂解或只在有限程度上裂解酶活性需要的活性酶的肽序列。蛋白水解酶可以是一種這樣的酶，其特征是從所述的酶原切掉前序列以產生活性酶，根據(jù)本發(fā)明在此情況下，加入更多量的蛋白水解酶，或許不同于天然酶。
術語“發(fā)酵”意思是指任何培養(yǎng)細胞導致酶以酶原的形式進行表達的方法，所以發(fā)酵可理解為包括在適當?shù)陌l(fā)酵培養(yǎng)基中，在使酶原得以表達的條件下，在實驗室或工業(yè)發(fā)酵罐等水平上進行的搖瓶培養(yǎng)、少量或大規(guī)模發(fā)酵(包括連續(xù)的、成批的和成批加培養(yǎng)液的發(fā)酵)。
在第二方面，本發(fā)明涉及經發(fā)酵以酶原的形式表達酶的細胞來生產活性酶的方法，該方法包括在能將酶原轉變成活性酶的蛋白水解酶存在的條件下進行發(fā)酵，從發(fā)酵培養(yǎng)基中回收活性酶、蛋白水解酶由存在于表達酶原的細胞中的重組DNA序列編碼和表達。期望活性酶產量的提高類似于由上面說明的方法獲得的那樣，這種提高可根據(jù)本發(fā)明的該方面獲得。根據(jù)該第二方面的方法有重要的優(yōu)點在此操作過程中，無需加入蛋白水解酶，盡管它可能象其被下面進一步描述的那樣。
在本文中術語“重組DNA序列”意思是指轉化表達酶原的細胞所用的外源DNA序列。“術語”“外源”，意思是指表達酶原的細胞本身不含有的，編碼蛋白水解酶的所述DNA序列。作為選擇術語“重組DNA序列”意思是指在表達酶原的細胞中正常發(fā)現(xiàn)的，但被置于一個或多個調節(jié)元件(例如啟動子)控制之下的DNA序列，它不同于天然產生的DNA序列相關性序列，并能提高從該DNA序列表達的活性蛋白水解酶的量。而且，此術語意思是指DNA構建體，其中編碼蛋白水解酶的DNA序列的拷貝數(shù)增加了。
本發(fā)明更進一步的方面還涉及包含編碼酶原的核酸序列和編碼能將酶原轉變成活性酶的蛋白水解酶的核酸序列的重組宿主細胞，在所述重組宿主細胞中，至少有一個核酸序列是重組核酸序列。術語“重組”可用上面限定的方式理解。
更進一步地，本發(fā)明涉及含有編碼前酶原的核酸序列和編碼能使酶原轉變成活性酶的蛋白水解酶的DNA序列的DNA構建體，本發(fā)明還涉及帶有該DNA構建體的表達載體。
重組宿主細胞、DNA構建體和表達載體在用于本發(fā)明的方法時具有優(yōu)勢，并可根據(jù)常規(guī)的重組DNA技術來產生。
最后，本發(fā)明涉及一種經本發(fā)明方法生產的活性酶。
本發(fā)明過程中生產的酶原在發(fā)酵培養(yǎng)基中是穩(wěn)定的，即，不受任何實質的降解，因此當存在于發(fā)酵培養(yǎng)基中或從其中回收時要經過相當長的一段時間才能轉變成活性酶。選擇地，原在發(fā)酵培養(yǎng)基中可以是不穩(wěn)定的和迅速被降解，最差的情況發(fā)生在回收或轉變成活性酶之前。本發(fā)明的方法在酶的生產中據(jù)設想是特別重要的。其中在發(fā)酵培養(yǎng)基中的酶原形式不如活性酶穩(wěn)定。在此情況下，據(jù)認為在其降解之前，蛋白水解酶可以使不穩(wěn)定的酶原轉變成活性酶。
雖然本發(fā)明的方法對由表達相應酶原的天然產生的細胞發(fā)酵產生的活性酶生產有益，但是它們被認為對重組活性的生產特別重要，此重組活性酶由轉化入用于發(fā)酵的細胞的核酸序列來編碼。
因此，優(yōu)選用編碼酶原的核酸(例如DNA或RNA序列)轉化表達酶原的細胞。用選擇的本領域中已知的常規(guī)方法進行轉化以適應于選擇的宿主細胞的特征及核酸序列特征。核酸序列可以插入宿主細胞的基團組中，例如通過同源或異源重組的方法實現(xiàn)。作為選擇，核酸序列可以插入能在宿主細胞中自主復制的重組表達載體中。特別地，核酸片段可連接到能指導酶原表達的轉錄和翻譯信號上。
現(xiàn)認為本發(fā)明的方法一般可用于在細胞中作為酶原而表達的任何活性酶的生產，而且特別是其相應的酶原在發(fā)酵培養(yǎng)基中不如活性酶穩(wěn)定的酶。例如，以本發(fā)明方法生產的酶可以是水解酶、氧化還原酶、異構酶、氧化酶或轉移酶。
特別地，所生產的酶可以是蛋白酶、脂酶、淀粉酶、纖維素酶、木聚糖酶、果膠酶、過氧化物酶、漆酶、轉谷氨酰胺酶。
本文中，所生產的酶可以是天然產生的酶或其遺傳工程變異體，后者是通過改變一個或多個氨基酸殘基，例如通過常規(guī)的或定點突變的方法產生。
使用本發(fā)明方法獲得的，產量被提高的一種類型的酶是胰蛋白酶樣蛋白酶。
本文中術語“胰蛋白酶樣蛋白酶”意思是指胰蛋白酶或有類似胰蛋白酶的結構或活性的酶，例如，能在賴氨酸或精氨酸的C—末端一側切開肽鍵的酶。胰蛋白酶樣蛋白酶的活性可以用一個試驗來測定，此試驗基于胰蛋白酶底物的裂解。如下面材料和方法部分所述的N—苯甲酰基—L—精氨酸—P—nitroanilide CL—BAPA或L—BAPNA)的裂解。
已發(fā)現(xiàn)胰蛋白酶樣蛋白酶可由許多不同的生物體(包括哺乳動物、昆蟲和微生物)生產。產生胰蛋白酶樣蛋白酶的微生物的例子是真菌屬Fusarium的一種，參見U.S.Patent No.5,288,627，本文引用作為參考，因此，欲生產的酶可以Fusarium屬的菌株獲得，例如從F.oxysporum、F.merismoides、F.redolens、F.sambucinum、F.solani或F.verticilloides的菌株獲得。
特別地，此酶可從F.oxysporum菌株(例如保藏在DeutscheSamolung von Mikroorganismen，與在U.S.Patent No.5,286,627中公開的發(fā)明有關的，保藏號為DSM2672的菌株變異體獲得的一種酶，此酶也可來自上述菌株的變異體或其突變體，這種變異體或突變體保留生產酶的能力，此酶有類似上述限定的胰蛋白酶的活性。編碼從此菌株分離到的胰蛋白酶樣F.oxysporum蛋白酶的核酸序列及胰蛋白酶樣F.oxysporum蛋白酶的氨基酸序列，分別描述在所附的序列鑒定號1和2。
由本發(fā)明方法生產的酶原可以是酶原前體、因此帶有一個與酶原運輸出生產細胞相關的信號肽。信號肽一般可以與所述的酶原相連系或是一種與該酶原融合的肽，例如，為了適于選擇的表達酶原的宿主細胞的分泌過程使其和酶原融合。
根據(jù)本發(fā)明的方法，雖然為某些目的發(fā)現(xiàn)兩種或多種具有類似或不同酶活性的蛋白水解酶聯(lián)合使用有益處，但是酶原的活化通常是通過一種蛋白水解酶完成的。
能使酶原轉變成活性酶的蛋白水解酶的特性主要依賴于被轉變的酶原的特性。因此，為特異性酶活化所用的蛋白水解酶的選擇依賴于對被裂解的肽序列的分析。
當已知或從已知的或假設的編碼酶的核酸序列推導出的酶原或活性酶的氨基酸序列時，使用眾所周知的方法，可以鑒別序列中的前肽或可能的前肽的有限數(shù)目，并由此確定被裂解的肽序列。鑒于此，可以鑒定一種或多種已知的或假設的能裂解特定肽序列的蛋白水解酶，并且其用途可經實驗證實。當然，選擇的蛋白水解酶不應該或只在一定限度上裂解活性酶中的肽鍵，以阻止由此方法生產的活性酶的破壞或活性的大量降低。作為選擇地，對上述方法而言，通過實驗可以鑒定一種或多種有用的蛋白水解酶。
通過上述方法知道在本發(fā)明方法中所用的蛋白水解酶可以是任何有穩(wěn)定蛋白水解活性的酶。例如，蛋白水解酶可以是金屬蛋白酶、絲氨酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶，無論是具有中性的、堿性的還是具有酸性的特征。酶可以是特異性的或非特異性的。這樣的蛋白水解酶的例子可在蛋白酶中發(fā)現(xiàn)，此蛋白酶按照1984年的酶的命名法，屬于酶的命名分類3.4.21—3.4.24。
為活化胰蛋白酶樣蛋白酶，特別是由Fusarium SP(如F.oxyspo-rum)產生的酶，中性金屬蛋白酶、枯草桿菌蛋白酶或天冬氨酸蛋白酶據(jù)認為是特別有用的。當胰蛋白酶樣蛋白酶是由F.osysporumDSM2672生產的酶時，蛋白水解酶可使用嗜熱菌蛋白酶或產生于桿菌(Zamost等，1990，工業(yè)微生物雜志，Vol.5，pp.303—312)的蛋白水解酶，例如，桿菌金屬蛋白酶制品。蛋白水解酶也可是從下面的實施例4和6公開的Aspergillus oryzae或Fusarium oxysporum、獲得的金屬蛋白酶。在一個實施例中，當用F.oxysporum生產時，蛋白水解酶可用于增加胰蛋白酶樣F.oxysporum蛋白酶的產量，在此情況下，和常規(guī)發(fā)酵比較，蛋白水解酶以過量的形式存在。
通過上面的公開，顯然蛋白水解酶可因此加到發(fā)酵培養(yǎng)基中，在此產生待轉變的酶原的細胞得到培養(yǎng)。蛋白水解酶可以成批或持續(xù)地加入。加入的蛋白水解酶舉例來說可作為市售的酶，例如上述的那些酶之一，或可通過培養(yǎng)重組宿主細胞，此細胞本身攜帶一種核酸序列或經一種核酸序列轉化，此核酸序列編碼蛋白水解酶，該細胞在穩(wěn)定的條件下生產酶)及從培養(yǎng)物中回收酶。
選擇地，發(fā)酵培養(yǎng)基中蛋白水解酶的產生可以通過構建能表達酶原及蛋白水解酶的細胞，在有助于酶原和蛋白水解酶生產的條件下培養(yǎng)該細胞，接著用蛋白水解酶激活酶原來實現(xiàn)。通過用核酸序列轉化構建合適的細胞，此核酸序列選擇地存在于一或多種表達載體上，編碼酶原和蛋白水解酶。選擇地，可以選擇已經含有編碼例如酶原的核酸序列的細胞并可經重組DNA方法將編碼蛋白水解酶的核酸序列插入所述的細胞中(或反之亦然)。
在一個選擇性實施例中，本發(fā)明方法通過使細胞表達酶原和使細胞表達能使酶原變成活性形式的蛋白水解酶，以便在使所述的酶原和所述的蛋白水解酶得以表達和使酶原得以轉變成活性酶的合適條件下共同表達；從培養(yǎng)物中回收活性酶。按此實施例，至少一種所述的酶原和蛋白水解酶優(yōu)選重組體。
根據(jù)本發(fā)明，產生酶原活化應該有充足量的蛋白水解酶。按本領域已知的方法通過模型實驗，可以測定存在的蛋白水解酶的量。例如，適宜量的確定可根據(jù)估計的KM值和速度常數(shù)。KM值和速度常數(shù)分別指降解酶原的酶反應和轉變酶原成為活性酶的酶反應而言。
作為選擇，通過加入蛋白水解酶進行發(fā)酵，憑經驗確定必需的蛋白水解酶的量。發(fā)酵條件，例如pH和溫度對酶原的穩(wěn)定性及蛋白水解酶的穩(wěn)定性和活性應該是最適的。
如果認為在發(fā)酵培養(yǎng)基中蛋白水解酶易于降解，例如被按本發(fā)明方法生產的活性酶降解，那么持續(xù)地或分幾部分地供應酶是有益的，例如通過使用批量加入的加入方法。
當?shù)鞍姿饷负兔冈谕患毎斜磉_時，在培養(yǎng)細胞期間，加入更大量的(細胞生產以外的)所述蛋白水解酶到發(fā)酵培養(yǎng)基中是有益的。
當使用共表達時，酶原的成熟可在細胞內完成，假如此成熟或活化酶對細胞沒有損害，就可以以成熟或活性形式從細胞回收。
現(xiàn)認為通過穩(wěn)定酶原(特別是當發(fā)酵培養(yǎng)基中酶原不穩(wěn)定時)可獲得對經本發(fā)明方法生產的活性酶產量增加的積極效果。例如，這種穩(wěn)定可產生較高的細胞內酶原穩(wěn)定性及因此產生較高量的用于被蛋白水解酶活化的酶原。這種穩(wěn)定可以根據(jù)眾所周知的方法，通過合理修飾編碼酶原前肽部分的核酸序列進行，結果導致一個或多個氨基酸加入到前肽C—末端和N—末端的一端或兩端；在前肽氨基酸序列中的一個或許多不同位點取代一個或多個氨基酸；在前肽的一端或兩個末端，或在氨基酸序列的一個或多個位點缺失一個或多個氨基酸；或在前肽的氨基酸序列的一個或多個位點插入一個或多個氨基酸，以便獲得較高穩(wěn)定性的酶原。
作為選擇地，穩(wěn)定作用可通過構建融合蛋白獲取，此融合蛋白含有能轉變成活性的或成熟的具有酶活性的蛋白的酶原或其一部分及一個穩(wěn)定蛋白或其一部分。
此發(fā)明編碼酶原和/或蛋白水解酶的核酸序列及DNA構建體可以源于基因組或cDNA，例如，可通過制備合適生物體的基因組或cDNA文庫，按照標準方法(參見Sambrook等，1989)使用合成的寡聚核苷酸探針(例如根據(jù)酶原或蛋白水解酶的氨基酸序列制備的探針)通過雜交篩選編碼酶原或蛋白水解酶的全部或部分的DNA序列獲得。
通過建立的標準方法，例如由S.L.Beaucage等(1981)及Matthes等(1984)描述的phosphoamidite方法，也可通過合成來制備本發(fā)明的DNA序列及DNA構建體。根據(jù)phosphoamidite方法，合成寡核苷酸，例如用自動DNA合成儀，純化、連接并用合適的載體克隆。
最后，DNA序列和DNA構建體可以是依據(jù)標準技術通過連接合成的、基因組的或cDNA來源的(合適的)片段制備的合成的與基因組的、合成的與cDNA的或基因組的和cDNA的連接片段。
在本發(fā)明方法中，用于表達酶原和/或蛋白水解酶的細胞是在培養(yǎng)時產生大量酶原和/或蛋白水解酶的適宜細胞。如上所述，此細胞可以是本身生產酶原或蛋白水解酶的細胞，但此發(fā)明中優(yōu)選用編碼酶原的核酸和/或編碼蛋白水解酶的核酸轉化的細胞。此細胞適宜地可以是以前用作宿主生產重組蛋白質的細胞，原核或真核細胞，包括但不限于哺乳動物細胞、昆蟲細胞、植物細胞或真菌細胞，優(yōu)選的是微生物，例如細菌或真菌。術語真菌意思是包含絲狀真菌和酵母。
合適的細菌的例子是Bacillus屬，例如Bacillus subtilis、Bacilluslicheniformis、Bacillus lentus、Nacillus brevis、Bacillus stearothermophilus、Bacillus alkalophilus、Bacillus amyloliquefaciens、Bacillus coagulans Bacil-lus megaterium、Bacillus Circulans、Bacillus lautus及Streptomyces屬，例如Streptomyces lividans的革蘭氏陽性菌。合適的革蘭氏陰性菌的例子包括Escherichia屬菌，例如E.coli。宿主菌細胞的轉化例如可通過原生質體轉化或經已知方法制備的感受態(tài)細胞產生。另一種合適的細菌細胞是Pseudomonasspp例如Pseudomonas cepucia、Pseudomonasfragi、Pseudomonas gladioli、Pseudomonas fluorescens、Pseudomonasstutzeri、Pseudomonas alcaligenes、Pseudomonas Pseudomonas pseudoalcali-genes、Pseudomonas putida、Pseudomonas glumae或Pseudom onas aerug-inosa細胞。
選擇地，細胞可以是真菌，即酵母或絲狀真菌細胞。例如酵母細胞可以是Saccharomyces屬，例如S.cerevisiae的細胞。例如絲狀真菌宿主生物體可以是Aspergillus sp、例如A.niger.或A.oryzae菌株。用于轉化Aspergillus宿主細胞和表達重組蛋白的技術恰當?shù)財⑹鲇贓P238023。選擇地，真菌宿主細胞可以是Fusarium SP，例如F.oxysporum菌株，例如其轉化可如Malardier等(1989)所述的方法進行。
在此發(fā)明的重組細胞中，編碼酶原的核酸序列和/或編碼蛋白水解酶的核酸核酸序列可由表達載體攜帶或選擇地存在于宿主細胞的基因組中。
為了獲得表達，通常將啟動子置于編碼酶原和/或蛋白水解酶的核酸序列之前。啟動子可以是在選擇的宿主細胞中呈現(xiàn)強烈轉汞活性的任何核酸序列及源于編碼細胞外或細胞內蛋白質諸如淀粉酶、葡萄糖淀粉酶、蛋白酶、脂酶、纖維素酶或蛋白水解酶的基因。特別是當使用細菌宿主時，適合的啟動子的例子是E.colilac操縱子啟動子、Streptomyces coelicolor瓊脂酶基因dagA啟動子、Bacillus licheni-formisα—淀粉酶基因(amyL)啟動子、Bacillus stearothermophilus產生麥芽糖的淀粉酶基因(amyM)啟動子、Bacillus Amyloliguefaciensα—淀粉酶(amyQ)啟動子、Bacillus subtilis XylA和XinB基因啟動子等。為了在真菌宿主中轉錄，有用的啟動子例如是源于編碼A.oxyzae TAKA淀粉酶、Rhzomucor miehei天冬氨酸蛋白酶、A.niger中性淀粉酶、A.niger酸性穩(wěn)定α—淀粉酶、A niger葡萄糖淀粉酶、Rhizomucor miehei脂酶、A.oryzae堿性蛋白酶、A.oryzae丙糖磷酸異構酶或A.nidulans乙酰胺酶的基因啟動子。
其它和酶原表達相關的序列包括終止和多聚腺苷酸化序列及核糖體結合位點，它們可合適地從與啟動子同樣的來源得到。
載體還可包含在所述宿主細胞中能使載體復制的核酸序列，例如合適的復制起點及選擇性標記，如其產物補充宿主細胞缺陷的基因、或給宿主細胞提供抗生素抗性的基團。
在本發(fā)明方法中為了培養(yǎng)產生的重組宿主細胞，所用的肉湯或培養(yǎng)基可以是適于所述細胞生長的任何普通培養(yǎng)基。合適的培養(yǎng)基如基礎或復合培養(yǎng)基可購自于市場或根據(jù)公開的配方(如美國典型培養(yǎng)物保藏中心的目錄)制備。
可按常規(guī)方法從培養(yǎng)基中回收酶、包括通過離心或過濾從培養(yǎng)基中分離細胞、必要時在破碎細胞后沉淀上清液或濾液中的蛋白質成分沉淀可用鹽法(如硫酸銨)，接著用各種層析方法(如離子交換層析、親和層析或類似方法純化。實際的回收方法依賴于所述酶的種類。附圖簡述下列附圖進一步解釋本發(fā)明，其中

圖1說明用于表達在實施例中進一步敘述的重組胰蛋白酶樣F.oxysporum蛋白酶的表達質粒PSX183的構建。
圖2F.oxysporum蛋白水解酶活性與用于加工F.oxysporum蛋白酶原的Bacillus成熟酶活性的比較。
圖3A、3B、3C和3D顯示了根據(jù)cDNA序列確定的P45的基因組DNA序列和推導的氨基酸序列。
圖4顯示了質粒pDM120的圖譜。
圖5顯示質粒pSO2的圖譜。
圖6顯示了包含F(xiàn).oxysporum胰蛋白酶樣蛋白酶原和F.oxyspo-rum P45蛋白水解酶基因的A.oryzae轉化子的SDS—PAGE分析。泳道包含的上清液如下泳道1，分子量標記，泳道2，對照A.oryzae菌株(未轉化的)；泳道3，只用p45轉化的A.oryzae；泳道4，只用pSX183胰蛋白酶樣蛋白酶轉化的A.oryzae；泳道5—10，用p45和F.oxysporum胰蛋白酶樣蛋白酶原轉化的A.oryzae菌株。
圖7顯示了純化的npIN—末端氨基酸序列與p45的比較本發(fā)明以下列實施例進一步說明，這些實施例無論如何不意味著是對本文限定的本發(fā)明范圍的限制。實施例實施例1瓶發(fā)酵中的酶活性使用不同水平的Bacillus stearothermophilus(Bs)蛋白酶對胰蛋白酶樣Fusarium蛋白酶產量的影響可分別用含基礎和復合培養(yǎng)基的搖瓶發(fā)酵來估計，發(fā)酵溫度為34℃、30℃和26℃。
材料和方法真菌菌株Fusarium oxysporum DSM2672按布達佩斯條約的期限于1983年6月6日保藏在德國的Deutsche Sammlung Von Mikroorganismen，Gottingen，并在美國專利5,288,627中進行了進一步的描述Aspergillus Oryzae IFO4177能表達胰蛋白酶樣F.oxysporum蛋白酶的重組A.oryzae菌株的構建編碼胰蛋白酶樣F.oxysporum蛋白酶的酶原形式及含有所附SEQ ID NO1所示的DNA序列的cDNA，插入到Noma等(1986)(Nature319640—646)所述的載體pCDV1—PL中，產生質粒pSX180。cDNA編碼區(qū)作為NcoI—XbaI酶切片段插入到As-pergillus表達質粒p777(EPO489718)，此質粒用BamHI切割并用XbaI部分切割。為將克隆DNA的5’一端連接到載體上將合成接頭DNA KFN709/710(圖1所述)加入連接反應液中。結果產生的質粒pSX183和帶有來自A.Ridulans(WO91/17243)amdS的質粒PToC90一起共轉染入A.oryzae(IFO4177)。蛋白水解酶使用了Zamost等(1990)所述的Bacillus stearothermophilus(BS)蛋白酶TPM—8。對振蕩瓶發(fā)酵而言用凍干粉末形式，活性為5AU(H)/g、對模型實驗(實施例3)而言，用晶體蛋白BS—蛋白酶形式，活性為75AU(H)/g。酶的比活近于100AU(H)/g。發(fā)酵液復合培養(yǎng)基FGAP培養(yǎng)基15.0g/l麥芽糖糊精30.0g/l大豆粉5.0g/l Bacto蛋白胨15.0g/lKH2PO40.4g/lPluronicR，pH6.5基礎培養(yǎng)基ASPOZ培養(yǎng)基琥珀酸10.0g/l
MgCl2·6H2O 0.8g/lKCl 1.8g/lNaH2PO41.0g/lH2ONa2SO41.8g/l尿素 2.0g/l檸檬酸2.0g/l痕量金屬sol. 0.5ml/lI*Pluronic 0.1ml/l用5N NaOH調pH至6.0滅菌后20g/l麥芽糖糊精(MD01)*)痕量金屬溶液114.3g/l ZnSO37H2O2.5g/lCuSO45H2O0.5g/lNiCl26H2O13.8g/l FeSO47H2O8.5g/lMnSO4H3O3.0g/l檸檬酸H2O將可變量的BS—蛋白酶以無菌過濾液形式加入到含50ml AS-POZ培養(yǎng)基的250ml無蓋聚丙烯搖瓶中。用1ml用表達質粒pSX183(下面進一步描述的構建體)轉化的A.oryzae(IFO4177)孢子懸液(大約105孢子/ml)培養(yǎng)搖瓶，并以實施例中指定的300rpm和濕度培養(yǎng)。在第4天分析上清液中胰蛋白酶樣Fusarium蛋白酶的存在。胰蛋白酶樣Fusarium蛋白酶活性的測定使用特異性的底物N—苯甲?；狶—精氨酸—P—nitroanilide鹽酸(L—BAPNA)分析胰蛋白酶樣蛋白酶。緩沖液0.01M二甲基谷氨酸(Sigma D4379)、0.2M硼酸和0.002MCaCl2，用NaOh調pH為6.5。底物L—BAPA購自Sigma(B3133)或Merck(Art.10754)。制備0.2M溶于二甲基亞砜中的母液(87mg/ml)冷凍貯存)并用上述緩沖液稀釋至0.004M。試驗為了進行試驗將胰蛋白酶樣蛋白酶稀釋至大約15μg/ml。在一個96孔的微滴度板中將200μl0.004ML—BAPA與20μl稀釋的胰蛋白樣蛋白酶混合。用含20μl緩沖液和200μl0.004ML—BAPA的空白對照作校正。
在Elisa讀數(shù)器中監(jiān)測405nm下的吸收率改變(δOD/分)在25℃或室溫下每5分鐘讀數(shù)一次，讀10分鐘計算與胰蛋白酶含量有關的結果作為Fusarium胰蛋白酶樣蛋白酶的參考。BS—蛋白酶活性測定用N，N—二甲基酪蛋白(DMC)為底物測定BS—蛋白酶的活性。在此過程中形成的主要氨基基團和能形成彩色復合物的三硝基苯磺酸反應。在50℃pH8.3反應進行9分鐘。為了計算每個時間單位吸光率(在420nm)的變化，反應在原位繼續(xù)進行。測定時間是3分鐘。吸選率的改變是對反應速率和酶活性的測量。此活性是相對于酶的標準品(AlcalaseR)測定的，而且所用的單位與標準品相同。單位定義為AU(H)。
在約200ml煮沸的去離子水中經不斷攪拌20分鐘，溶解4.0gN，N—二甲基酪蛋白制備N，N—二甲基酪蛋白溶液(0.4％)，結果產生的溶液與以11.92g Hepes緩沖液(Sigma H—3375)、3.69g NaCl進一步含9.0ml4N NaOH、1mmol CaCl2并加入1.5ml Brij35溶液(在1000ml水中含150.0g Brij35(Atlas Chemie))制備的溶液混合。
通過將要分析的0.5—1.0g的酶與導致產生合適酶濃度的Na2SO3溶液量的2％Na2SO3溶液(200gNa2SO3、15ml Brij35溶液、1mmol CaCl2，加去離子水至10L)混合制備酶樣品。
通過在200ml去離子水中溶解200mg 2，4，6—三硝基苯磺酸制備與在反應中形成的主要氨基基團反應的2，4，6—三硝基苯磺酸溶液。
從標準品和樣品的反應速度確定BS—蛋白酶的活性，此測定是用從6—9分鐘OD(幅度)的增加表示，每個測定5秒鐘。通過免疫電泳(RIE)測定胰蛋白酶樣Fusarium蛋白酶通過RIE分析酶學上有活性的胰蛋白酶樣Fusarium蛋白酶及其前體形式。在1％的瓊脂糖(Litex HSA/HSB，1∶1)以20μl抗體/ml進行水平火箭免疫電泳。容器中的溶液和凝膠緩沖液由41mMTris(羥甲基)氨基甲烷和13mM甘氨酸緩沖液pH8.6組成。在15℃以2V/cm電泳近18小時。
經標準方法用家兔制備用于本方法中抗純化的胰蛋白酶樣Fusarium蛋白酶的抗體。用純化的蛋白酶免疫家兔，劑量為250μg/劑量，每周一次，共10周，實驗中用粗制血清。
發(fā)現(xiàn)活性酶向正極移動，前體形式向負極移動。結果從每套發(fā)酵條件下獲得的結果示于下面表1
表1
通過PIE估價了胰蛋白酶樣Fusariumm蛋白酶(表中稱為“胰蛋白酶”)的前體形式。通過RIE和BAPNA酶實驗估價了成熟形式。
對于30℃的搖瓶培養(yǎng)，分析了前體形式及成熟形式的酶。由表1顯而易見，含基礎培養(yǎng)基和BS—蛋白酶的搖瓶檢測不到酶原，而在無BS—蛋白酶的搖瓶中測定到53mg/ml的酶原。這些結果表明BS—蛋白酶能切除酶的前序列。
在含20AU(H)/l BS—蛋白酶的復合培養(yǎng)基中26°培養(yǎng)獲得429mg/l有活性的或成熟的胰蛋白樣蛋白酶，與之相比，經無BS—蛋白酶的對照發(fā)酵獲得1 42mg/ml(活性酶產量相應增長約3倍)。成熟胰蛋白酶樣蛋白酶的水平在基礎培養(yǎng)基中略低，和對照47mg/ml相比，產物的最高量是360mg/l(活性酶產量相應增長約8倍)。
可以看出通過使用本發(fā)明方法獲得的增加在基礎培養(yǎng)基中比復合培養(yǎng)基顯著地高。設想用于生產Fusariumm胰蛋白酶樣蛋白酶的A.oryzae重組宿主細胞本身生產了能活化所述胰蛋白酶樣蛋白酶的蛋白水解酶。在復合培養(yǎng)基中獲得的明顯低的效果可能是由于在復合培養(yǎng)基中合成了由A.oryzae生產的較高水平的自然產生的成熟蛋白酶。應強調的是，雖然設想A.oryzae宿主細胞本身生產了活化的胰蛋白酶樣蛋白酶，但是在發(fā)酵過程中加入BS—蛋白酶對所獲得的活性胰蛋白酶樣蛋白酶的產量產生大量增加的影響是可見的。實施例2模型體系中酶的活化在模型實驗中評價了BS—蛋白酶從胰蛋白酶樣Fusatrium蛋白酶的酶原裂解前序列的能力。材料和方法模型體系中酶的活化在BAPA實驗緩沖液(pH6.5)中制備胰蛋白酶樣Fusarium蛋白酶前體形式以及包含BS—蛋白酶或天然產生的F.oxysporum活性蛋白酶P45溶液(下面實施例4敘述了其分離過程)的稀釋液。20μl含約15mg/l的胰蛋白酶樣酶原稀釋液與100μl蛋白水解酶溶液在96孔的微滴度板中混合，并在25℃培養(yǎng)。培養(yǎng)5和40分鐘后，使用100μl0.008ML—BAPA底物和上述方法分析活化或成熟胰蛋白酶樣蛋白酶的量。在BAPA實驗中，為測試蛋白水解酶的未知作用，使用了20μl緩沖液代替胰蛋白酶樣Fusarium蛋白酶的前體形式。結果使用了來自在不加BS—蛋白酶的基礎培養(yǎng)基中含有質粒pSX183轉化的A.oryzae4177，搖瓶發(fā)酵的發(fā)酵上清液。上清液含90mg/l的胰蛋白酶樣蛋白酶前體形式。
用三種不同濃度的BS—蛋白酶(0、0.5和5AU(H)/l)孵育18mg/l酶原稀釋液。5和40分鐘后測定生產的活性胰蛋白酶樣蛋白酶的量。根據(jù)在表2的結果說明，BS—蛋白酶能切掉胰蛋白酶樣蛋白酶酶原的前序列，結果產生活性的胰蛋白酶樣蛋白酶。而且，證明在實驗中BS—蛋白酶無未知的作用。在實驗期間，活性或成熟酶濃度的改變將影響分析結果，在此情況下只進行了粗略的估價(由“～”表示)。
表2
實施例3發(fā)酵培養(yǎng)基中酶和酶原的穩(wěn)定性材料和方法評價胰蛋白酶樣Fusarium蛋白酶的穩(wěn)定性通過在30℃培養(yǎng)用質粒pSX183轉化的A.oryzae在復合培養(yǎng)基中發(fā)酵所得的培養(yǎng)基上清液并以適當?shù)臅r間間隔取樣來評價具活性的胰蛋白酶樣Fusarium蛋白酶的穩(wěn)定性。在實施例1的材料與方法部分描述了轉化子和培養(yǎng)基。粗制的胰蛋白酶樣Fuserium蛋白酶酶原的生產HA.oryzae(IFO4177)發(fā)酵液制備粗制酶原，IFO4177用實施例1的材料和方法部分所述的質粒pSX183轉化，在下述條件下獲得了前體形式500ml無蓋搖瓶含100ml YDP(10g/l Bacto酵母提取物、20g/l Bacto胰蛋白胨、30g/l葡萄糖)，與含近106孢子的A.oryzae培養(yǎng)物一起孵育，并在26℃、125rpm下培養(yǎng)2天。通過過濾除去細胞殘留成分，通過超濾法從培養(yǎng)基制得粗制前體形式，接著凍干。
胰蛋白酶樣Fusarium蛋白酶酶原的穩(wěn)定性和活化評價。
通過向上述發(fā)酵上清液中加入粗制酶原(大約100mg/l)，在30℃培養(yǎng)并以合適的時間間隔取樣來估價酶原的穩(wěn)定性/成熟性。結果在30℃A.oryzae轉化子(IFO4177/pSX183)發(fā)酵培養(yǎng)基上清液中活性胰蛋白酶樣蛋白酶的穩(wěn)定性如表3所示。
1)經BAPNA實驗估計活性。在發(fā)酵液中沒測到前體形式。
表3的結果說明在發(fā)酵培養(yǎng)基中成熟酶相當穩(wěn)定。因此，4小時后，實際上沒有活性損失，20小時后，只損失10％。
通過加入100mg/l的粗制酶原至表3所述的發(fā)酵培養(yǎng)基中估計了胰蛋白酶樣蛋白酶酶原的穩(wěn)定性和成熟程度。結果見表4。
表4
<p>1)其值校正成發(fā)酵上清液本身的胰蛋白胰量。
2)由從發(fā)酵上清液分離的活化酶激活前體形式，發(fā)酵上清液帶有F.oxysporum DSM2672，然后經BAPNA試驗估測。用在平行實驗中測定的成熟酶量校正其值。
從表4的結果看出A.oryzae(IFO4177能活化前體形式。此外，顯然在發(fā)酵培養(yǎng)基中前體形式不穩(wěn)定。加入的前體形式，一半轉變成了活性酶，另一半降解了。實施例4源于Fusarium Oxysporum的p45蛋白水解酶的分離與鑒定材料與方法純化在以9000rpm離心F.oxysporum培養(yǎng)10分鐘，用0.45μm濾膜過濾上清液，將200ml濾液在Amicon cell(PM10 membrane)和Cen-triprep—0(Amicon)上濃縮至0ml。將5ml濃縮液稀釋至100ml，并用乙酸將pH調到5，用下列緩沖液通過1ml Monos柱0.1M硼酸、10mM DMG、2mM氯化鈣、pH5.2以NaCl梯度為0—＞0.5M過柱超過70分鐘，以1ml/min的流速用上述鑒定的緩沖液洗10分鐘后，收集到1.5ml組分并經Centricon—10(Amicon)濃縮。
用0.1M硼酸、10mM DMG、2mM CaCl2、pH6.5，在流速為0.4ml/min的條件下，經Superose12(HR10/30，Pharmacin)進行凝膠過濾。蛋白水解酶實驗在37℃、0.1M Tris、2mM CaCl2、pH7的溶液中(當pH較低時，使用100mM硼酸、10mM DMG、2mM CaCl2)預孵育30—60分鐘后，根據(jù)上述實施例1公開的，從重組胰蛋白酶樣Fusarium，Oxysporum蛋白酶原釋放的胰蛋白酶活性測定蛋白水解酶活性。在微滴度板上測定胰蛋白酶活性，用100μl底物(母液87mg/ml—BAPNA(sigma)，溶于DMSO中，用緩沖液稀釋50倍)和100μl樣品混合，使用來自Molecular Devices的Thermomax microplate reader8測定405nm的吸收率。SDS—PAGE和在pVDF上電印跡按制造商的說明書進行SDS—PAGF(10—27％，Novex)電泳，欲電泳的樣品在加入加樣緩沖液前與PMSF一起預孵育。用來自Novex的印跡模在3mM Na2CO3、10mM NaHCO3、20％MeOH、pH9.9中以30V、電印跡到前印跡膜(Applied Biosystems)上按Applied Biosys-tems所述染色前印跡。IEF覆蓋按制造商的說明書進行電泳IEF(Amphdine PAG—PlatepH3.5—9.5，Pharmacia)并染色。在0.1MTris、2mM CaCl2、pH8.1的溶液中首先平衡要覆蓋的凝膠15分鐘，然后用10ml1％的瓊脂糖、0.1M Tris、2mM CaCl2、pH8.1的溶液加入300μl L—BAPNA母液及500μl公開于上述實施例1(～0.25mg/ml)的重組—胰蛋白酶樣Fusariumm Oxysporum蛋白酶原后來覆蓋。氨基酸分析及氨基酸測序使用MDS—2000水解測定儀(CEM)分析了凍干樣品的微波易化氣相水解。使用含1％酚(脫氧劑)的6N HCl產生氣相。在70psi(～148℃)水解20分鐘。凍干水解的樣品，并重溶于20μl500pmol/μl的肌氨酸和正纈氨酸中作為內標。按制造商的說明書，使用來自Hewlett—Packard的Amino Quat進行分析。注射1μl樣品。按制造商的說明，使用來自Applied Biosystems的476A蛋白質測序儀(ProteinSequencer)，測定氨基酸序列。為了運行HPLC使用了預混合緩沖液。結果來自F.oxysporum培養(yǎng)基的p45的純化通過使用陽離子交換層析(MonoS)，接著在Superose12上通過凝膠過濾，從濃縮和過濾的發(fā)酵培養(yǎng)基中純化p45蛋白水解酶。通過分析蛋白水解酶的活性從Monos選擇餾分，蛋白水解酶活性是上述實施例1公開的來自于胰蛋白酶樣Fusarium oxysporum蛋白酶原釋放的胰蛋酶樣活性。通過使用和分離MonoS—餾分同樣的方法鑒定含來自Superose12柱的餾分的蛋白水解酶。在SDS—PAGE純化的蛋白水解酶似乎為單條帶，45KDa。用IEF(pH3.5—9.5)觀察了兩種異構形式的成熟酶，等電點分別為8.4和8.17。
來自氨基酸分析的結果表明，這種蛋白水解酶如序列表SEQ IDNO3所示含有N—末端氨基酸序列。純化的F.oxysporum p45(成熟酶)顯示了高比活。
來自凝膠過濾柱的所述的蛋白水解酶(成熟酶)餾分放在一起上樣到制備的IEF設備上。穩(wěn)定安培度后樣品以1000V電泳1小時，然后在500V再電泳30分鐘，接著每個3ml收集30個餾分。只有一個餾分含在SDS—PAGE上所見的蛋白水解酶。圖2所示為P45活性與Bacillusdn成熟餾活性的比較。p45成熟酶是金屬蛋白質金屬蛋白酶含有催化的鋅金屬中心，鋅金屬中心參與肽類骨架的求解?；钚凿\中心將這些蛋白酶和活性依賴于鈣存在的Calpain區(qū)別開來。作為金屬蛋白酶的蛋白酶的確定是通過用1，10—phenan-throlin(1mM)去除鋅中心，接著經Zn2+(0.1—100μm)滴定恢復全部活性實現(xiàn)的。
表5所示在上述實施例1中公開的胰蛋白酶樣Fusarium oxys-porum蛋白酶不受1，10—phenanthroline抑制，因為在有或無抑制劑加入時，產生同樣的胰蛋白酶活性，分別為33.S×10-4和34.0×10-4△Abs/min。上面實施例1材料與方法部分描述的胰蛋白酶樣Fusarium oxysporum蛋白酶原或Fusarium oxysporumm成熟酶樣品單獨不含任何胰蛋白酶活性(表1)，然而當聯(lián)用時，成熟酶裂解上面實施例1材料方法部分描述的重組胰蛋白酶樣Fusarium oxysporum蛋白酶原，結果產生活性胰蛋白酶。當加入1mM 1，10—phenanthro-line(表5)時，成熟酶活性受到抑制。然而，一旦加入1mM Zn2+便產生Fusarium成熟酶全部重新活化。當用EDTA(1mM)代替1，10—phenanthroline時產生了類似的結果。
表5用1，10—phenanthroline抑制Fusarium成熟酶
實施例5Fusarium oxysporum p45基因的克隆通過PCR首先克隆了F.oxysporum p45基因的一部分。使用N末端蛋白質序列(SEQ ID NO4)設計了一個引物并通過內源成熟酶肽序列(SEQ ID NO5)設計了反向引物。使用DNA引物和從Fusarium F.oxysporum分離的基因組DNA進行PCR?；蚪MDNA分離如下在30℃使近于15g濕重的F.oxysporum接種生長在MY50培養(yǎng)基因(50g/l麥芽糖糊精、2g/l Mg2SO4、10g/l KH2PO4、2g/l檸檬酸、10g/l酵母提取物、3g/l尿素、2g/l K2SO4、0.5ml痕量金屬溶液，用5N NaOH調pH至6)。將菌絲體懸于16ml TE(10mMTris·HCl、1mM EDTA pH8.0)中，分為兩管、每管中加入約12g0.45—0.52mm的玻璃珠(Thomas Scientific)。每30秒將樣品交替渦旋并冰凍一次，直到能看到粘性分裂物產生。將樣品渦旋另外兩個30秒，在每份樣品中加入2.5ml 20％SDS。反轉混合樣品，室溫孵育10分鐘，并再次混合。在室溫，3.5K旋轉離心樣品8分鐘。將上清液合并在50ml聚丙烯管中。用等體積經酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1)平衡過的TE提取樣品，然后在10000rpm4℃離心10分鐘。在37℃用300μl10mg/ml蛋白酶K處理樣品30分鐘。如上所述DNA經酚/氯仿/異戊醇(P/C/I)提取、乙醇沉淀并溶于5ml TE中。樣品在65℃用150μl 10mg/l RNase A處理15分鐘，然后在37℃ 15分鐘。樣品再用蛋白酶K處理(100μμl 10mg/ml 15小時，37℃)然后經P/C/I抽提兩次及乙醇沉淀。將DNA挑取到彎曲的巴斯德吸管上并轉移至5ml80％的乙醇中。以10000rpm離心樣品3分鐘。短暫干燥DNA沉淀物，并溶于1m/TZ中。
如下PCR用于克隆部分F.osysporum p45成熟酶基因在50μl體積內，將每個約100pmole的合成PCR引物DNA(此DNA溶于1×Taq緩沖液中(Boehringer Mannheim))、每個濃度為100μM的dGTP、dATP、dTTP和dCTP與50—100ng F.oxysporum基因組DNA混合。加入1—5單位Taq DNA聚合酶(Boehringer Mannheim)。PCR溫育為，95℃5分鐘，然后進行35個循環(huán)(95℃30秒50℃1分鐘72℃1分鐘)。PCR反應產生兩個約1.0和1.3kb量的DNA片段。這些片段經凝膠電泳分離、純化、克隆進E.Coli復制質粒，并用分子生物學領域中已知的標準方法測序。通過用從直接蛋白質測序獲得的氨基酸序列，比較翻譯用的DNA發(fā)現(xiàn)，1.0kb DNA片段含有F.oxysporum p45基因序列。因此，用PCR產生的1.0kb DNA片段為探針從F.oxysporum基因組DNA文庫中克隆整個成熟酶基因。
使用如發(fā)現(xiàn)于Sambrook等1989，Molecular CloningA LaboraforyManual，Cold Spring Harbor，NY所述的那些方法，從F.oxysporum基因組DNA制備入噬菌體基因組DNA文庫。在200μl含10mM Tris(pH7.5)、50mM NaCl、7mM MgCl2、7mM2—巰基乙醇和4單位限制酶Sau 3A的溶液中于37℃消化總共50μg基因組DNA1分鐘。通過瓊脂糖凝膠電泳分離部分消化的分子大小在10—20Kb的DNA，接著電洗脫到透析膜，并使用Elutip—D柱(Schleicher和Schuell)濃縮。用限制酶BamHI切割并用磷酸酶(Clonetech)處理的的入噬菌體EMBLA臂1μg與300—400μg Sau3A切割的基因組DNA在標準條件下(見Sambrook等，1989，Molecular CloningA Laboratory Manaual，COld SPring Harbor，NY)于25μl體積中連接。使用市售試劑盒(Gigapack ColdII，Stratagene)，遵照制造者的說明書，從此連接混合物中制備入噬菌體。使用標準方法(Sambrook等，1989，Molecular CloningA Laboratory Manual，Cold Spring Harbor，NY)進行約18000個重組入噬菌體鋪板并生產濾膜(to N＋filters，Ammersham)。使用制造者提供的說明書，經用于非放射性核酸檢測(Boehringer Mannheim)的Genius試劑盒處理濾膜用作雜交使用。用作p45成熟酶探針的DNA如上所述是1.0kb PCR片段。使用制造者提供的DIG標志試劑盒和說明，經PCR dioxigenin(DIG)摻入標記探針。15ng 1.0kb p45片段混合于1×Tag緩沖液(Bochringer Mannheim)、1×DIG標記混合物(Bochringer Mannheim)，此混合物含100pmmmol N—末端引物(SEQID NO4)和內部反向引物(SEQ ID NO5)、1—5單位Taq聚合酶(Bochringer Mannheim)，總體積為80μl。反應條件為95℃ 3分鐘、35×[95℃30秒、50℃/分、72℃/分]、72℃5分。使用Genius試劑盒制造者提供的說明、用DIG標記探針進行濾膜雜交并在其條件下洗滌。
按制造者(Bochringer Mannheim)所述，用Lumiphos 530可觀察的堿性磷酸酶結合的抗—digoxigenin抗體檢測雜交噬菌體。使用Qi-agen Lambda Midi kit(QIAGEN，INc)，從陽性入克隆制備DNA制品。用限制酶EocRI消化來自一個制品的DNA，將6.3kg片段亞克隆進質粒PUC118。此亞克隆的部分DNA序列分析鑒定出p45基因的整個編碼區(qū)(見圖3和SEQ ID NO6)。克隆p45cDNA按以前發(fā)表的方法(CHirgwin等Biochemistry 185294—5299(1989)，Aviv和Leder，Proceedings of the National Aceademy of Sci-ences，USA 691408—1412(1972)，Sambrook等1989，MolecularCloningA Laboratory Manual，Cold Spring Harbor，NY)，并做下列修改，從F.oXYsporum制備總RNA和Poly—A RNA。特別地，液氮中的菌絲體磨成粉末，此后邊攪拌邊重懸于含4M硫氰酸胍、0.5的Na—laurylsarcosine、25nM的檸檬酸鈉及0.1M 2—巰基乙醇pH7.0的溶腸緩沖液中，在室溫放置30分鐘。通過低速(5000rpm，30分)離心去除細胞殘渣。典型地，使用從Boehringer Mannheim獲得的Oligo(dT)纖維素分離Poly—ARNA餾分。
使用發(fā)夾/RNaseH方法(Sambrook等，1989，Molecular CloningA Laboratory MManual，Cold Spring Harbor，NY)，用PolyARNA產生cDNA。
特別地，將5μμl水中的5μg polyRNA于70℃加熱，然后置于冰上。制備了50μl總的反應混合物，包括polyARNA、50mMM Tris(pH8.3)、75mM KCl、3mM MgCl2、10mM DTT，每個1mM的dGTP、dATP、dTTP和dCTP、40單位RNasin、10μg Oligo(dT12—18)引物及1000單位SuperScriptII RNase H—逆轉錄酶(Bethesda ResearchLaboratories)?；旌衔镌?5℃溫育1小時。然后向沉淀核酸中加入30μl10mM Tris(pH7.5) 1mM EDTA、40μg糖原載體(BoehingerMannheim)、0.2體積10M乙酸銨及2.5體積乙醇。離心后，沉淀重懸于20mM Tris(pH7.4)、90mM KCl、4.6mM MgCl2、10mM硫酸銨、16μM βNAD+、每個為100μM的dGTP、dATP、dTTP、dCTP、44單位Ecoli DNA聚合酶I、6.25單位RNaseH及10.5單位DNA連接酶的混合物中。在16℃此溶液中進行第二鏈DNA合成3小時。經乙醇沉淀濃縮DNA，在30℃將沉淀重懸于30μl30mM NaAC(pH4.6)、300mmM Nace、1mM ZnSO4、0.35mM DTT、2％甘油和30單位Mung Bean核酸酶(Bethesda Research Laboratories)中30分鐘。用70μl10mM Tris(pH7.5)1mM EDTA中和DNA溶液，經酚抽提及乙醇沉淀。在50μl緩沖液(20mMTris—乙酸pH7.9、10mM乙酸鎂、50mM乙酸鉀、1mM DTT、每個0.5mM的dGTP dATP dTTP dCTP)中，37℃用7.5單位T4聚合酶(Invitrogen)處理沉淀。通過加入EDTA至20mmM終止反應，接著用酚抽提及乙醇沉淀。此方法的結果是雙鏈cDNA，帶有平末端，適于結合DNA接頭及克隆進任何載體。
帶EcoRI接頭的cDNA在瓊脂糖凝膠上使其大小片段分開，以獲得分子大小為0.7kb或較大的cDNA。通過電洗脫從凝膠中回收cDNA，并經酚抽提及乙醇沉淀純化。大小分開的cDNA用于構建入cDNA文庫。cDNA克隆進入ZIPLOX壁(Gibco BRL)。用噬菌斑挑選技術和如前面所述的DNA雜文，使用467bp的digoxigenin標記片段作為探針(基因組克隆的bp336—803)鑒定全長cDNA入克隆。在質粒pZLl中如制造商(菌株和質粒來源于Gibco BRL)所述回收全長cDNA。測定全長cDNA序列并和基因組DNA序列比較?；蚪MDNA長2049bp并含3個內含子。p45蛋白酶原前體的推測的編碼區(qū)由一個推斷的18個氨基酸的信號序列、一個266個氨基酸的前區(qū)及一個388個氨基酸成熟區(qū)組成，如SEQ ID NO6及圖3所示。實施例6同一微生物宿主(A.oryzae)中p45蛋白水解酶及胰蛋白酶樣蛋白酶的共表達。
在此所述的實施例中，提出了對另一個胰蛋白酶樣蛋白酶成熟的分開。
一個2101bp的Bam HI/NruI基因組p45蛋白酶原前體片段插入到TAKA淀粉酶啟動子和淀粉糖苷酶(AMMMG)終止子之間。為實現(xiàn)此目的，使用PCR技術，直接引入一個BamHI位點此位點在ATG起始密碼子上游，修改基因的5’端。在基因的3’端使用了自終止子密碼子下游44bp的內源性NruI位點。p45表達質粒稱為pDM120(圖4)。用質粒pDM120和pSO2共轉化pyrG—A.oryzae宿主菌株，質粒pSO2含A.oryzae pyrg標記(見表5)。
通過原生質體方法(Christensen等Biotechnology 61419—1422(1988)，Yelton等Proceedings of the National Academy of Sciences(USA)811470—1474(1984))進行A.oryzae轉化。典型地，將oryzae菌絲體生長在營養(yǎng)豐富的培養(yǎng)基中。通過如過濾、離心等技術從培養(yǎng)基中分離菌絲體。向滲透性穩(wěn)定緩沖液(如用磷酸鈉緩沖到pH5.8的1.2M MgSO4)中的菌絲體加入酶制品NovozymeR(NovoNordisk)。在30℃攪拌，溫育懸液60分。收集原生質體并將其重懸于含鈣如STC(1.2M Sorbitol 1 10mM CaCl2、10mM Tris—HCl pH7.5)的滲透性穩(wěn)定緩沖液中。將轉化的DNA加到大約100μl原生質體懸液中，然后加入200μl PEG溶液(60％PEG 4000、10mM CaCl2、10mM Tris·HCl(pH7.5)在室溫孵育混合物20分鐘。加入另外1mlPEG溶液，在室溫再溫育20分鐘。用8ml STC緩沖液稀釋轉化的原生質體并涂到選擇平板上。使用乙酰胺(作為生長的唯一氮源)平板選擇含外源提供的amdS標記的轉化子?；A培養(yǎng)基平板能用于含外源提供的pyrG基因的轉化子。
在37℃轉化子生長在M400D培養(yǎng)基(麥芽糖糊精，50.0g/l、Mg-SO4·7H2O，2.0g/L、KH2PO2，2.0g/l、檸檬酸，4.0g/l、酵母提取物，8.0g/l、尿素，2.0g/l、痕量金屬溶液(如上所述)，0.5ml/L、用5N NaOH調pH至6.0)并用SDS—PAGE分析培養(yǎng)基中p45的生產。至少在一個轉化子(菌株DLM7)中看見了在約45KD遷移的一條主要帶，而在對照培養(yǎng)物中沒見到p45。通過蛋白質序列分析分析了DLM7中生產的重組p45，N—末端殘基和從F.oxysporumm產生的p45成熟N—末端相匹配。因此，當用A.oryzae生產時，p45被正確地加工。
為了產生能表達p45和胰蛋白酶樣蛋白酶的宿主生物體，菌株DLM7經含胰蛋白酶樣蛋白酶的質粒pSX233和含作為選擇標記的A.nidulans amS基因的pTOC90共轉化。質粒pSX233是質粒pSX183的衍生物，使用標準的分子生物學技術，使前體胰蛋白酶樣蛋白酶基因起始端的DNA接頭從GGATCCTC-GAATTCTCTTCAGATCTCTTCACCATGG(SEQ ID NO7)變成GGATCC ACCATGG(SEQ ID NO8)。下面劃線的ATG指起始蛋氨酸密碼子的位置。將共轉化轉化子接種在FG4P培養(yǎng)基中生長，使用L—BAPNA實驗分析子F.oxysporum胰蛋白酶樣蛋白酶活性。六個轉化子比不含p45的菌株生產更多的胰蛋白酶樣蛋白酶。經SDS—PAGE(圖6)分析了這些轉化子培養(yǎng)物(及對照)的上清液。所有轉化子表明，胰蛋白酶樣蛋白酶和p45成熟酶產生于同樣的宿主生物體。結果表明，在相同宿主細胞(A.oryzae)中(前體)胰蛋酶樣蛋白酶和F.oxysporum p45成熟酶的共表達使活性胰蛋白酶樣蛋白酶的表達明顯提高。實施例7源于Aspergillus oryzae的中性金屬蛋白酶(npl)的純化及起始鑒定材料與方法純化收集101A.oryzac1560(7Cl—78)發(fā)酵液，經0.1μm中空纖維(Amicon)過濾得91培養(yǎng)基，并在3KDa切好的旋轉超濾軟片(Ami-con)上濃縮至700ml。
將300ml稀釋至1000ml(＜1.5mS，pH7.1)并加樣至150ml(2.6cm i.d.)Q—Sepharose柱上，此柱用0.1MM硼酸、10mM DMG、2mmM CaCl2、pH6.2平衡流速為5ml/分。用緩沖液洗滌柱，并以6ml/分的洗脫速度用1050ml0—＞1M NaCl梯度液洗脫。收集到12ml餾分，分析成熟酶活性以獲得上述實施例1公開的胰蛋白酶樣Fusari-um oxysporum蛋白酶原成熟活性。將合成熟酶的餾分合并，在YM3膜上濃縮。
此后將匯合液稀釋至80ml(＜1.5mS，ph7.5)，上樣至20mlMonoQ柱(1.6cm i.d.)上，此柱用20mM Tris、20mM CaCl2、pH7.5的溶液平衡并用300ml，梯度為0—＞0.5M NaCl溶液洗脫，流速為6ml/分。收集4.5ml餾分并測試成熟酶活性。合并具有活性的餾分，并在Centriprep—10上濃縮。
使用Hiload Superdex 200 16/60柱，使3ml MQ1進行凝膠過濾，此柱經100mM硼酸、10mM DMF、2mM GaCl2、pH6.2的溶液平衡，流速為1ml/分。收集1ml餾分。合并具有成熟酶活性的餾分。
通過在phenyl—superose5/5(流速為0.5ml/min，1.7—＞OM(NH4)2SO4梯度，60分，25mM Tris pH7，收集1ml餾分)與同CHsepharose4B(15ml柱，1.6cm i.d.，流速為2ml/min，0—＞100％B80分(A25mM乙酸，pH5，B0.1M Tris，1M NaCl，25％異丙醇，pH7.5)，收集3ml餾分)聯(lián)偶的桿菌素上做輔助柱層析建立進一步純化步驟。每次過柱(用3.5ml各自的緩沖液洗脫)在PD—10上脫鹽2ml S2，上樣3ml。將有成熟酶活性的餾分混在一起。使用桿菌素柱進行較大量純化；3ml S12＋3ml S13＋1ml S2在PD—10上脫鹽進入25mM乙酸pH5中，上樣10ml到柱上?；旌嫌谐墒烀富钚缘酿s分并在Centricon—10和Microcon—10上濃縮。肝菌肽的偶聯(lián)根據(jù)制造者的說明進行肝菌素與活化CH Sepharose 4B(Pharma-cia)的偶聯(lián)。使用CH Sepharose(在1mM HCl中溶脹并在偶聯(lián)緩沖液中洗滌)6.6g和溶于0.1M NaHCO3，0.5M NaCl pH8的溶液中的0.25g(18250單位)桿菌素(Sigma)偶聯(lián)，室溫處理2小時。用0.1MTris，pH8封閉過多的活性基團，接著用0.1M乙酸、0.5M NaCl Ph4洗滌。成熟酶實驗在0.1M Tris，2mM CaCl2pH7.5(在較低的pH，使用了硼酸/DMG或含CaCl2乙酸緩沖液)，37℃預孵育30分鐘后從上述(～25μg/ml)公開的實施例1的胰蛋白酶樣Fusarium oxysporum蛋白酶原釋放的胰蛋白酶活性測定成熟酶的活性。在微滴度板中測定胰蛋白酶活性100μl底物(母液87mg/ml L—BAPNA(sigma)，存在于DMS中，用緩沖液稀釋50倍)，使用購自Molecular Devices的Ther-momax微板閱讀器測定405nm的吸光度。SDS—PAGE和電印跡到PVDF根據(jù)制造者的指導(125伏2小時)，進行SDS—PAGE(10—27％，Novex)，將欲上樣樣品在加入上樣緩沖液前與PMSF(0.2％)預孵育。使用購自Novex的印跡模在3mM Na2CO3、10mM NaHCO3、20％MeOH，pH9.9溶液中，25伏2.5小時電印跡到前印跡膜(Ap-plied Biosystems)上。根據(jù)Applied Biosystems所述染色前印跡。IEF—覆蓋按制造者說明進行(1500V，50mA，1.25小時)IEF(AmpholinePAG—板pH3。5—9.5，Pharmacia)和染色。在0.1MM Tris，2mMCaCl2pH7中將欲覆蓋的凝膠首先平衡15分鐘，然后用1％瓊脂糖、0.1M Tris、2mM CaCl2，pH7的溶液加入L—BAPNA的母液(稀釋50倍)及公開上述實施例1(粗濃縮內湯1mg/ml，稀釋50倍)中的胰蛋白酶樣Fusarium oxysporum蛋白酶原后覆蓋通過在覆蓋緩沖液中加入1％脫脂乳進行酪蛋白覆蓋。氨基酸測序按制造者的指導，使用購自Applied Biosystems的476A蛋白質測序儀進行氨基酸測序，預混合緩沖液用于HPLC操作中。結果上述純化方法純化3300多倍(純度)95％(SDS—PAGE))。從SDS—PAGE得知純化的npl分子量為46KDa左右并從IEF得知pl為4.5左右。覆蓋的IEF—凝膠(用上述公開的實施例1中的胰蛋白酶樣Fusarium oxysporum蛋白酶原和L—BAPNA覆蓋)。說明成熟酶活性產生于pl4.5。在此也觀察到酪蛋白清除。當對純化的npl進行N—末端氨基酸測序時，獲得了一序列(前幾個循環(huán)含一些背景)。此氨基酸序列對應于N—末端氨基酸序列，此序列從46KDa帶獲得，此帶是從pVDF—膜上SDS—凝膠印跡得到的，圖7報道了產生的氨基酸序列。N—末端氨基酸序列和來自F.oxysporum(圖7)的p45的N—末端序列64％同源。發(fā)現(xiàn)此蛋白酶的最適pH為5.5—6.0。以不同的pH，在稀釋緩沖液中，用上述公開于實施例1中的胰蛋白酶樣Fusarium oxysporum蛋白酶原孵育。微生物的保藏下列生物材料保藏Agridlltural Research Seruice Patent CultureCollection(NRRL)，Northern Regional Research Center，1815 UniuersityStreet，Illinois，61604，USA菌株 登記號 保藏日期E.coli含pDM120 NRRL B—212394/21/94(p45成熟酶)(EMMMCC0099)E.coli含pSO2(pyrG)(EMCC0100) NRRL B—212404/21/94E.coli含pSX233(EMCC0101) NRRL B—212414/21/94此菌株保藏情況保證在此專申請未決期間、其培養(yǎng)物對專利和商標官員授權的個人以及按37C.F.R.ξ1.14和35U.S.Cξ122規(guī)定，和按布達佩斯條約規(guī)定的情況可以得到。
保藏物代表3每個保藏菌株生物學純的菌株。保藏物根據(jù)外國專利法的要求可獲得，所說的國家是指本主題申請或其后續(xù)中請遞交的國家。然而，應該清楚保藏物的可利用性不包含許可，此損害由政府行為所授予的專利權來實施本發(fā)明主題。
本文敘述和要求的發(fā)明范圍不受本文公開的具體實施例限制。因這些實施例是對本發(fā)明的幾個方面的解釋。事實上除了本文說明和敘述的那些外，對本發(fā)明的各種修改對本領域的技術人員來說是顯而易見的。這些修改也落在所附的權利要求范圍內。
說明書中引用的參考文獻Enzyme Nomenclature，1984，Published for the Intemational Union of Biochemistryby Academic Press，Inc.Zamost et al.，Joumal of Industrial Microbiology，Vol.5，pp.303-312，1990Stepanov et al，F(xiàn)EB 08012，Vol.260，No.2，pp.173-175，1990Malardier et al.，Gene78(1989)，pp.147-156Sambrook et al.，1989，Molecular CloningA Laboratory Manual，2nd Ed.，ColdSpring Harbor，1989Beaucage et al.(1981)，Tetrahedron Letters22，pp.1859-1869Matthes et al.(1984)，The EMBO J.3，pp.801-805Mortensen，S.B.，Thim，L.，Christensen，T.，Woeldike，H.，Hjortshoej，K.andHansen，M.T.(1989)，J.Chromatogr.476，227-233Noma et al.(1986)，Nature319，640-646INDICATIONS RELATING TO A DEPOSITED MICROORGANISM(PCT Rule 13bis)
INDICATIONS RELATING TO A DEPOSTTED MICROORGANISM(PCT Rule 13bis
權利要求
1.一種通過發(fā)酵以酶原形式表達酶的細胞來生產活性酶的方法，此方法包括在不同于活性酶并能使酶原轉變成活性酶的蛋白水解酶存在時進行發(fā)酵、從發(fā)酵培養(yǎng)基中回收活性酶，其中在發(fā)酵前和/或發(fā)酵過程中加入蛋白水解酶。
2.一種通過發(fā)酵以酶原形式表達酶的細胞來產生活性酶的方法，此方法包括在不同于活性酶并能使酶原轉變成活性酶的蛋白水解酶存在時進行發(fā)酵、從發(fā)酵培養(yǎng)基中回收活性酶，其中蛋白水解酶由表達酶原的細胞中存在的重組DNA序列編碼和表達。
3.根據(jù)權利要求2的方法，在細胞培養(yǎng)期間，加入更多量的所述蛋白水解酶。
4.根據(jù)權利要求1或2的方法，其中細胞表達的酶原在發(fā)酵培養(yǎng)基中不如活性酶穩(wěn)定。
5.根據(jù)權利要求1或2的方法，其中用編碼酶原的核酸序列轉化表達酶原的細胞。
6.根據(jù)權利要求1或2的任一權利要求的方法，其中生產的酶是水解酶、氧化還原酶、異構酶、氧化酶或轉移酶。
7.根據(jù)權利要求6的方法，其中生產的酶是蛋白酶、脂酶、淀粉酶、纖維素酶、木聚糖酶、果膠酶、過氧化物酶、漆酶或谷氨酰胺轉移酶。
8.根據(jù)權利要求7的方法，其中要生產的酶是胰蛋白酶樣蛋白酶。
9.根據(jù)權利要求8的方法，其中要生產的酶從Fusarium屬菌株獲得，例如從F.oxysporum、F.merisoides、F.redolens、F.sambucinum、F.solani或F.verticilloides菌株獲得。
10.根據(jù)權利要求9的方法，其中所要生產的酶是從保藏在Deutsche Sammmlung Von Milroorganismen，Gottingen，Germany，保藏號為DSM2672的F.oxysporumm菌株獲得的胰蛋白酶樣蛋白酶。
11.根據(jù)權利要求1或2，其中酶原以酶原前體表達。
12.根據(jù)權利要求1或2的任一權利要求的方法，其中蛋白水解酶是金屬蛋白酶絲氨酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶或半胱氨酸蛋白酶。
13.根據(jù)權利要求8—10的任一權利要求的方法，其中蛋白水解酶是中性金屬蛋白酶、堿性蛋白酶或枯草桿菌蛋白酶。
14.根據(jù)權利要求1或3的方法，其中的蛋白水解酶是在合適的條件下培養(yǎng)用編碼蛋白水解酶的核酸序列轉化的宿主細胞以生產該蛋白水解酶，并從培養(yǎng)物中回收該蛋白水解酶來生產的。
15.根據(jù)權利要求1或2的方法，其中表達酶原和/或蛋白水解酶的細胞是微生物。
16.根據(jù)權利要求15的方法，其中微生物是細菌或真菌。
17.根據(jù)權利要求16的方法，其中的微生物是革蘭氏陽性細菌，例如Bacillus或Streptomyces屬的細菌；革蘭氏陽性細菌，例如Escherichia屬的細菌；酵母，例如Saccharomyces屬菌、或絲狀真菌、例如Aspergillus或Fusariumm屬的真菌。
18.一種含有編碼酶原的核酸序列和編碼使酶原變成活性酶的蛋白水解酶的核酸序列的重組宿主細胞，酶原石如活性酶穩(wěn)定；其中在重組宿主細胞中至少有一個核酸序列是重組核酸序列。
19.根據(jù)權利要求18的重組宿主細胞，其中編碼酶原和/或編碼蛋白水解酶的核酸序列由表達載體攜帶。
20.一種含有編碼酶原的DNA序列和編碼能使酶原轉變?yōu)榛钚悦傅牡鞍姿饷傅腄NA序列的DNA構建體，酶原石如活性酶穩(wěn)定。
21.一種含有如權利要求20限定的DNA構建體的重組表達載體。
22.一種含有根據(jù)權利要求20的DNA構建體或根據(jù)權利要求21的重組表達載體的重組宿主細胞。
23.根據(jù)權利要求18或22的重組宿主細胞，它是細胞或真菌。
24.根據(jù)權利要求23的重組宿主細胞是革蘭氏陽性細菌，例如Bacillus或Streptomyces屬細菌；革蘭氏陽性細菌，例如Escherichia屬的細菌；酵母，例如Saccharomyces屬菌或絲狀真菌，例如Asperigillus或Fusariumm屬真菌。
25.根據(jù)權利要求1—17任一權利要求的方法生產的活性酶。
全文摘要
本發(fā)明涉及生產活性酶的方法，包含在不同于活性酶并能使前酶原轉變成活性酶的蛋白水解酶存在時發(fā)酵活性酶的前體形式。本發(fā)明還涉及宿主細胞、重組表達載體及適用于本方法的宿主細胞。
文檔編號A61K39/12GK1125466SQ94192473
公開日1996年6月26日 申請日期1994年5月4日 優(yōu)先權日1993年5月5日
發(fā)明者S·哈思楚珀, S·博蘭納, B·R·喬根森, T·克里思蒂森, B·B·喬根森, J·R·舒思特, M·馬登, D·L·莫耶, C·福格桑 申請人:諾沃挪第克公司, 諾沃挪第克生物工藝公司