專利名稱：核酸序列，含有它們的載體，藥物組合物和治療用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及核酸序列，含有它們的載體，及其治療用途，特別是基因治療用途。更具體講，本發(fā)明涉及含有細(xì)胞內(nèi)結(jié)合蛋白(PIL)編碼基因的核酸序列，和它們的基因治療應(yīng)用，它們結(jié)合或不結(jié)合在適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)載體中。
基因治療就是通過向有關(guān)細(xì)胞或器官中引入遺傳信息以校正缺陷或異常(突變、異常表達(dá)等)。該遺傳信息或在體外引入從器官取出的細(xì)胞，改造后的細(xì)胞再返回機(jī)體中，或直接引入體內(nèi)適當(dāng)組織中。關(guān)于這一點(diǎn)，文獻(xiàn)中已描述了不同的轉(zhuǎn)染和基因轉(zhuǎn)移技術(shù)(參見，Roemer和Friedman的Eur.J.Biochem.208(1992)211)。迄今為止，現(xiàn)有技術(shù)中提出的基因治療途徑是轉(zhuǎn)移遺傳病中有關(guān)活性多肽(激素、生長素等)，反義基因或?yàn)檫M(jìn)行免疫接種的抗原性肽的編碼基因。本發(fā)明涉及一種新的基因治療途徑，它是轉(zhuǎn)移并在靶細(xì)胞(或組織)中表達(dá)一種能夠與細(xì)胞元件相作用從而影響細(xì)胞功能的胞內(nèi)肽。本發(fā)明更具體是基于證明了體內(nèi)表達(dá)可控制某些細(xì)胞功能的改性抗體、然后該抗體留在細(xì)胞內(nèi)的可能性。本發(fā)明還基于證明了在用于基因治療的載體(特別是病毒載體)中克隆編碼這種胞內(nèi)抗體的DNA序列的可能性。
利用抗體進(jìn)行人體治療一般使其定向并中和循環(huán)系統(tǒng)中和/或位于細(xì)胞表面的生物復(fù)合物，引起免疫系統(tǒng)產(chǎn)生一系列反應(yīng)，從而將它們消除。但對腫瘤或由如病毒引起的疾病，該方法大多是無效的，因?yàn)樽⑷氲目贵w無法接近引起染病細(xì)胞失調(diào)的抗原。本發(fā)明提供一種新的特別有利的治療方法，它是在細(xì)胞內(nèi)連續(xù)產(chǎn)生抗體或治療物，通過與其表位結(jié)合減小和/或消除失調(diào)。
文獻(xiàn)中已描述了重組表達(dá)抗體的可行性。例如，專利EP88994描述了抗體重鏈或輕鏈可變區(qū)的體外表達(dá)和純化。同樣，US4946778描述了用接頭連接的抗體重鏈和輕鏈可變區(qū)所組合的改性抗體之編碼DNA的體外表達(dá)。但此專利中描述的抗體無活性，并且一般以不可溶的內(nèi)含體形式合成。這樣的抗體需經(jīng)受化學(xué)處理(變性、復(fù)性等)進(jìn)行純化，以得到活性形式。本發(fā)明證明可以利用這樣的DNA序列在體內(nèi)直接表達(dá)活性胞內(nèi)抗體。本發(fā)明還證明可以利用編碼胞內(nèi)抗體的這種DNA序列特別在人體中進(jìn)行基因治療，該序列受使其在哺乳動物細(xì)胞中表達(dá)的區(qū)域的控制。這一新方法使得可以定向于常規(guī)免疫接種方法無法接近的細(xì)胞元件。而且這一途徑不涉及免疫應(yīng)答的發(fā)展，只是細(xì)胞內(nèi)作用。
因此，本發(fā)明的第一個目的在于含有細(xì)胞內(nèi)結(jié)合蛋白(PIL)編碼基因的核酸序列，該序列在使得其在哺乳動物細(xì)胞中表達(dá)的區(qū)域控制之下。
本發(fā)明還涉及含有如上所定義的核酸序列的載體。更具體講，本發(fā)明載體為病毒來源，如逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒、腺相關(guān)病毒、皰疹病毒、痘苗病毒、HSV病毒等。
本發(fā)明還涉及這些核酸序列或載體在制備用于外科治療和/或治療人體或動物的藥物組合物中的用途。本發(fā)明還涉及含有如上所定義的載體(特別是病毒載體)或核酸序列的藥物組合物。
在本發(fā)明的意義上細(xì)胞內(nèi)結(jié)合蛋白(PIL)指所有能夠識別其表達(dá)所在細(xì)胞的元件、選擇性地相互作用并與之親和的蛋白或蛋白片段。這涉及共價或非共價的化學(xué)作用。通過與細(xì)胞元件(蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、氨基酸、mRNA、tRNA、rRNA、DNA等)的相互作用，可作用于涉及所述元件的細(xì)胞功能，從而控制(刺激、減弱、抑制)該功能。
優(yōu)選地，本發(fā)明的細(xì)胞內(nèi)結(jié)合蛋白由抗體衍生的分子或具有與抗體相當(dāng)?shù)慕Y(jié)合特性的分子組成。特別是具有足夠的選擇性和親和性能在體內(nèi)中和抗原的蛋白質(zhì)。由于它們的特性和位置以下稱這些分子為細(xì)胞內(nèi)抗體。
免疫球蛋白類的分子—抗體—是天然合成的分泌蛋白(主要是B淋巴細(xì)胞)。它們被釋放到細(xì)胞外(循環(huán)系統(tǒng))，并在那里顯示它們的活性(在異地識別并與抗原結(jié)合)?，F(xiàn)已證明，可以在體內(nèi)表達(dá)編碼細(xì)胞內(nèi)抗體的改性基因，而不影響抗體的特異性和親和力。因此編碼細(xì)胞內(nèi)抗體的本發(fā)明核酸序列包括以某種方式改造使抗體不被分泌的抗體基因。具體講，一般通過缺失或突變負(fù)責(zé)其分泌的序列來改造抗體基因。本發(fā)明的細(xì)胞內(nèi)結(jié)合蛋白特別可由含抗原結(jié)合區(qū)的抗體片段組成，如Fab或F(ab)’2片段。但這類細(xì)胞內(nèi)抗體的應(yīng)用涉及含多個基因的核酸序列的表達(dá)，它們分別編碼這些片段的重鏈區(qū)和輕鏈區(qū)；還涉及這些鏈的體內(nèi)正確組裝。因此，可用于本發(fā)明的細(xì)胞內(nèi)抗體的一種特別有利的形式是相應(yīng)于抗體輕鏈可變區(qū)結(jié)合位點(diǎn)的肽通過肽接頭與相應(yīng)于抗體重鏈可變區(qū)結(jié)合位點(diǎn)的肽連接。這類稱為ScFv的細(xì)胞內(nèi)抗體的應(yīng)用是很有益的，因?yàn)樗蓡我换虮磉_(dá)。在實(shí)施例中說明如何構(gòu)建編碼本發(fā)明這種改性抗體的核酸序列。
另外，編碼本發(fā)明細(xì)胞內(nèi)抗體的核酸序列還可以通過化學(xué)、酶或遺傳途徑來改造，以產(chǎn)生穩(wěn)定的、和/或多功能的、和/或長度減小的細(xì)胞內(nèi)抗體，或?yàn)榱擞欣谒鼈冊诩?xì)胞內(nèi)的定位。例如，本發(fā)明的核酸序列可含有編碼核定位肽的序列(NLS)。特別是，可以將本發(fā)明的序列與SV40病毒的NLS編碼序列融合，后者的肽序列如下MPKKKRK(Kalderbn等，Cell 39(1984)499)。
如上所述，本發(fā)明的核酸序列含有使編碼PIL的基因在哺乳動物細(xì)胞中表達(dá)的序列。因此，一般將PIL基因置于轉(zhuǎn)錄和翻譯啟動子區(qū)的控制下，這些啟動子區(qū)要在希望進(jìn)行表達(dá)的哺乳動物細(xì)胞中有功能。這可以是與所述細(xì)胞同源的序列，即天然負(fù)責(zé)基因在所述細(xì)胞中表達(dá)的序列。還可以是不同源的序列，即負(fù)責(zé)蛋白在其它類型細(xì)胞中表達(dá)的序列，負(fù)責(zé)抗體在天然條件下表達(dá)的序列，病毒表達(dá)序列，例如存在于其中引入了本發(fā)明序列的載體中，或者合成或半合成序列。
對用于人體的情況，文獻(xiàn)中已描述了許多功能性啟動子，例如病毒啟動子CMV、SV40、Ela、MLP、LTR等。細(xì)胞啟動子如絨毛蛋白基因的啟動子是有利的，因?yàn)樗鼈兪沟帽磉_(dá)具有組織特異性(對絨毛蛋白而言限于腸部)。
另外，還可以改造表達(dá)序列，例如為了適應(yīng)載體或細(xì)胞的具體類別，減小其長度，提高其轉(zhuǎn)錄啟動子的活性，產(chǎn)生可誘導(dǎo)的啟動子，改善其調(diào)控水平，甚至改變其調(diào)控性質(zhì)。這種改造例如可通過體外誘變、引入另外的控制元件或合成序列、或原始控制文件的缺失或取代來實(shí)現(xiàn)。使用組織特異性啟動子特別有利，以便將PIL的表達(dá)定向于單一的組織中。
另外，當(dāng)核酸序列不含表達(dá)序列時，可在表達(dá)載體中這種核酸序列的下游將其引入。
為了制備本發(fā)明的載體，首先應(yīng)鑒定例如希望治療的疾病中有關(guān)的或負(fù)責(zé)的細(xì)胞功能。然后鑒定該功能中涉及的適當(dāng)細(xì)胞元件，然后確定哪一個PIL在其定位、作用、性質(zhì)等上最適于該元件(抗體、衍生物等)。所選出的PIL的相應(yīng)核酸序列可通過分子生物學(xué)技術(shù)(化學(xué)合成、克隆、酶修飾等)獲得，并按實(shí)施例中描述的方法插入適當(dāng)?shù)妮d體中。
本發(fā)明的另一目的涉及含有至少一種上述定義的核酸序列或載體的藥物組合物。
例如注射給人或動物后，本發(fā)明的序列可用于誘導(dǎo)PIL的細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，以影響所確定的細(xì)胞功能。特別是該序列可按WO 90/11092中描述的技術(shù)以裸DNA形式注射。也可以復(fù)合物的形式給藥，例如與DEAE—葡聚糖(Pagano等，J.virol.1(1967)891)，與核蛋白(Kaneda等，Science 243(1989)375)，與脂類(Felgner等，PNAS 84(1987)7413)的復(fù)合物，或以脂質(zhì)體的形式施用(Fraley等，J.Biol.Chem.255(1980)10431)等。
在本發(fā)明的一個優(yōu)選實(shí)施方案中，將如上所定義的核酸序列引入載體中。使用這種載體實(shí)際上有利于穿入細(xì)胞、增加對酶的耐性和提高穩(wěn)定性和細(xì)胞內(nèi)表達(dá)水平。本發(fā)明的載體既可以是質(zhì)粒的也可以是病毒的。但優(yōu)選使用病毒載體。
因此在一優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及插入在病毒載體中的如上所定義的核酸序列。本發(fā)明還涉及在其基因組中插入了至少一種編碼PIL的核酸序列的所有重組病毒。
如上所述，有不同的病毒可用作轉(zhuǎn)移并在體內(nèi)表達(dá)本發(fā)明基因的載體。例如，可舉出逆轉(zhuǎn)錄病毒(RSV、HMS、MMS等)、HSV病毒、腺相關(guān)病毒、腺病毒、痘苗病毒等。
本發(fā)明的重組病毒最好是缺陷病毒?！叭毕莶《尽边@一術(shù)語指在靶細(xì)胞中不能復(fù)制的病毒。一般地講，用于本發(fā)明范圍的缺陷病毒的基因組缺少至少一種所述病毒在所染細(xì)胞中復(fù)制所必需的序列。這些區(qū)域可被消除(全部或部分)，或使其非功能化，或被其它序列(特別是本發(fā)明的核酸序列)取代。該缺陷病毒優(yōu)選仍保留其基因組中病毒顆粒包衣所必需的序列。
文獻(xiàn)中已描述了源自逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺相關(guān)病毒、HSV病毒(單純皰疹病毒)或腺病毒的缺陷重組病毒。.
使用插入在缺陷型重組腺病毒中的本發(fā)明核酸序列是特別有利的。
實(shí)際上存在不同的腺病毒血清型，其結(jié)構(gòu)和特性有些不同，但對人是非病原性的，特別是對非免疫低下的對象。另外，這些病毒不整合在所感染細(xì)胞的基因組中，并可插入外源DNA的大片段。在不同的血清型中，本發(fā)明范圍內(nèi)優(yōu)選使用2型或5型腺病毒(Ad2或Ad5)。對腺病毒Ad5而言，復(fù)制必需序列為E1A和E1B區(qū)。
另外，根據(jù)本發(fā)明編碼胞內(nèi)抗體的基因較短，這一點(diǎn)使得可以有利地在同一載體中同時引入編碼胞內(nèi)抗體的多種基因，這些胞內(nèi)抗體針對宿主細(xì)胞的一個或多個元件的不同區(qū)域。本發(fā)明的一個具體實(shí)施方案是含有編碼針對不同表位的細(xì)胞內(nèi)結(jié)合蛋白的至少兩種核酸序列的載體，特別是病毒載體。
可通過缺陷病毒載體與帶有以上定義的核酸序列的質(zhì)粒之間的同源重組來制備本發(fā)明的缺陷重組病毒(Levrero等，Gene 101(1991)195；Graham，EMBO J.3(12)(1984)2917)。所述病毒和質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染到適當(dāng)?shù)募?xì)胞系中后發(fā)生同源重組。所用細(xì)胞系優(yōu)選應(yīng)(i)可被所述元件轉(zhuǎn)化，和(ii)含有能夠補(bǔ)充病毒基因組缺陷部分的序列，優(yōu)選以整合形式補(bǔ)充以避免重組的危險。作為制備缺陷重組腺病毒可用的細(xì)胞系實(shí)例，可提及人胚胎腎細(xì)胞系293(Graham等，J.Gen.Virol.36(1977)59)，它特別含有整合在其基因組中的腺病毒Ad5基因組左側(cè)部分(12％)。作為可用于制備缺陷逆轉(zhuǎn)錄病毒的細(xì)胞系實(shí)例，可提及CRIP細(xì)胞系(Danos和Mulligan，PNAS 85(1988)6460)。
然后病毒增殖并按分子生物學(xué)經(jīng)典技術(shù)回收和純化。
本發(fā)明還涉及含有如上所定義的至少一種缺陷重組病毒的藥物組合物。
可適當(dāng)配制本發(fā)明的藥物組合物，以通過表皮、口服、胃腸外、鼻內(nèi)、靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、皮下、眼內(nèi)等途徑給藥。
藝選地，在本發(fā)明藥物組合物中含有注射劑配方可接受的藥用載體。特別是無菌、等滲的鹽水溶液(磷酸一鈉、磷酸二鈉、氯化鈉、氯化鉀、氯化鈣或氯化鎂等，或這些鹽的混合物)，或干組合物，特別是凍干品，它通過加入無菌水或生理血清能形成注射溶液。
用于給藥的核酸(序列或載體)的劑量可與不同參數(shù)相適應(yīng)，特別是所用給藥方法、有關(guān)的疾病、要表達(dá)的基因、還有要求的治療時間。一般地，本發(fā)明的重組病毒被配制成104—1014pfu/ml，優(yōu)選106—1010pfu/ml的劑量，并以此形式給藥。pfu(空斑形成單位)相當(dāng)于病毒溶液的感染能力，通過感染適當(dāng)?shù)募?xì)胞培養(yǎng)物，一般5天后測量被感染細(xì)胞的空斑數(shù)目。病毒溶液滴度pfu的測定技術(shù)在文獻(xiàn)中有充分的說明。
本發(fā)明的目的還在于含有如上定義的核酸序列的所有重組細(xì)胞。
含在載體中或不在載體中的本發(fā)明序列及含有它們的藥物組合物可用于許多疾病的治療。例如它們可用于在體內(nèi)所有類型組織中轉(zhuǎn)移并表達(dá)基因。另外還可以根據(jù)所治療疾病進(jìn)行靶向治療(向具體組織水平的轉(zhuǎn)移特別由載體的選擇決定，而表達(dá)由具體啟動子的選擇決定)。本發(fā)明的序列或載體有利地用于在人或動物體內(nèi)產(chǎn)生胞內(nèi)蛋白，這些蛋白能夠特異性地作用于各種細(xì)胞功能，例如細(xì)胞增殖、代謝物的合成、蛋白合成、DNA的復(fù)制和/或轉(zhuǎn)錄等。因此本發(fā)明使得可以特異、局部和有效地治療許多細(xì)胞功能障礙，這些細(xì)胞功能障礙造成不同疾病，尤其是癌、病毒或細(xì)菌疾病，或更廣義地講，所有其中可鑒定出細(xì)胞介質(zhì)的疾病。用于治療與細(xì)胞增殖相關(guān)的疾病在一特別有利的方案中，本發(fā)明的核酸序列含有編碼PIL的基因，該P(yáng)IL能夠作用于并影響細(xì)胞增殖中相關(guān)因子的活性。細(xì)胞增殖要調(diào)動各種因子，如膜受體(G蛋白)、癌基因、酶(蛋白激酶、法尼基轉(zhuǎn)移酶、磷酸脂酶等)、核苷(ATP、AMP、GDP、DTP等)，活化因子[鳥苷(GRF、GAP等)交換因子、轉(zhuǎn)錄因子等]等。能夠結(jié)合并中和這種因子的本發(fā)明PIL的細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，使得能控制細(xì)胞增殖的進(jìn)程。在細(xì)胞增殖逃出天然調(diào)控機(jī)制，導(dǎo)致例如出現(xiàn)腫瘤的情形下，這一點(diǎn)是特別有益的。實(shí)際上許多因子(瘤基因的基因產(chǎn)物和在這些產(chǎn)物效果的信號化中相關(guān)的因子)已與細(xì)胞增殖的失調(diào)現(xiàn)象相關(guān)。例如，90％的胰腺癌具有在第十二個密碼子上突變的癌基因Ki—ras(Almoguera等.，Cell 53(1988)549)。同樣，已證明結(jié)腸腺癌和甲狀腺癌(50％)中，或在肺癌和髓細(xì)胞性白血病(30％，Bos，J.L.Cancer Res，49(1989)4682)中存在突變的ras基因?，F(xiàn)已鑒定出許多其它癌基因(myc，fos，jun，ras，myb，erb，等)，其突變形式似與細(xì)胞增殖的失調(diào)有關(guān)。
表達(dá)能夠結(jié)合這些細(xì)胞因子(優(yōu)選它們的致癌形式)的PIL，從而減弱或抑制其作用，這提供了一種治療癌癥新途徑的可能性。
在一特別有意義的方案中，本發(fā)明涉及含有包括細(xì)胞內(nèi)抗體編碼基因的核酸序列的載體，所述細(xì)胞內(nèi)抗體能夠與癌基因的表達(dá)產(chǎn)物或與癌基因信號化途徑中相關(guān)的因子相作用。
在目標(biāo)癌基因中，本發(fā)明意義上可舉出癌基因ras，fos，jun，myc，myb和erb。
在癌基因信號化途徑中相關(guān)的因子中，可特別舉出膜受體—可定向于其分子內(nèi)區(qū)段—[G蛋白，激酶(例如酪氨酸激酶)，磷酸化酶，法尼基轉(zhuǎn)移酶]，核苷交換因子(GAP、GRF因子等)等。
更優(yōu)選地，本發(fā)明涉及含有編碼胞內(nèi)抗體的核酸序列的載體，特別是病毒載體，該胞內(nèi)抗體針對癌基因或癌基因信號化途徑中相關(guān)的因子，由相當(dāng)于抗體輕鏈可變區(qū)的結(jié)合位點(diǎn)的肽與相當(dāng)于抗體重鏈可變區(qū)結(jié)合位點(diǎn)的肽通過肽接頭連接而成。
更具體講，本發(fā)明涉及表達(dá)針對ras依賴性信號化途徑之因子的胞內(nèi)抗體的缺陷重組病毒。
如實(shí)施例中所示，轉(zhuǎn)化癌細(xì)胞后抗P21(ras基因表達(dá)產(chǎn)物)、抗GAP或抗P53胞內(nèi)抗體的表達(dá)使得表型回復(fù)。用于治療病毒疾病本發(fā)明核酸序列也可以是能夠作用于病原性病毒(HIV、乳頭瘤病毒等)感染周期的胞內(nèi)抗體的編碼序列。
更具體講，在HIV病毒的例子中，實(shí)際可得的抗病毒藥或在后期臨床試驗(yàn)中的抗病毒藥，不能阻斷病毒的增殖，而僅阻仰疾病的發(fā)展。這主要是因?yàn)閷@些抗病毒藥的耐性株的出現(xiàn)。有效免疫接種的發(fā)展也遇到了許多障礙HIV的遺傳變異使得不能確定一穩(wěn)定的抗原結(jié)構(gòu)，以提供對抗存在的不同菌株的體液或細(xì)胞免疫反應(yīng)。象在抗病毒藥的情況中病毒通過點(diǎn)突變耐受選擇壓力一樣，迄今為止嘗試的免疫接種試驗(yàn)中，HIV似乎逃逸免疫系統(tǒng)。
本發(fā)明構(gòu)成一種治療HIV感染的新途徑，即通過表達(dá)PIL(特別是細(xì)胞內(nèi)抗體)在其復(fù)制周期中封閉病毒。本發(fā)明特別解決了疫苗和抗病毒藥途徑中遇到的遺傳變異問題。在經(jīng)典的免疫接種中，已證明免疫反應(yīng)主要發(fā)生在可變區(qū)。而使用本發(fā)明的細(xì)胞內(nèi)抗體可以選擇不僅保守而且對一種病毒蛋白功能必不可少的表位。優(yōu)選地，細(xì)胞內(nèi)抗體是針對長度足以阻止通過點(diǎn)突變偏移產(chǎn)生耐性和適應(yīng)性的病毒的表位。另外，編碼本發(fā)明胞內(nèi)抗體的基因長度較小，可以用同一基因治療載體有利地定向于(單一或多種蛋白)的多個區(qū)域。
tat和rev這兩種主要病毒調(diào)控蛋白是實(shí)施本發(fā)明最重要的靶標(biāo)。實(shí)際上，這兩種蛋白是病毒復(fù)制必不可少的。而且，針對tat或rev信使RNA的反義信使RNA或核酶的表達(dá)阻止病毒復(fù)制。這些蛋白的作用機(jī)制有相當(dāng)多的文獻(xiàn)依據(jù)tat是轉(zhuǎn)錄的反式激活因子，而rev保證復(fù)制周期早期和晚期間的轉(zhuǎn)換。這兩種蛋白固定在病毒信使RNA上時顯示其活性，并且已相當(dāng)明確地限定了這種固定所需的肽區(qū)域，這對其功能是必不可少的。另外，已證明它們在RNA上的固定位點(diǎn)(tat為TAR區(qū)，rev為RRE區(qū))的過度表達(dá)(Surexepression)，抑制其對病毒表達(dá)的功能。
在這些條件下，本發(fā)明的一個特別有利的方案是使用編碼這樣的胞內(nèi)抗體的DNA序列，該胞內(nèi)抗體針對tat或rev蛋白并能夠中和它們的活性。有利的是，這種抗體針對tat或rev的負(fù)責(zé)其與RNA固定的區(qū)域。
針對這些表位的本發(fā)明細(xì)胞內(nèi)抗體可按實(shí)施例中描述的方法制備。特別是，從單克隆抗體T—B(12)(Hybridolab)開始，經(jīng)遺傳改造可得到抗tat抗體。
其功能易于被胞內(nèi)抗體抑制的HIV復(fù)制中重要的另一靶蛋白，是核殼體蛋白NCP7。實(shí)際上，該蛋白在逆轉(zhuǎn)錄(早期)中，在整合中，和在晚期中，但更重要的是在衣殼化中起重要作用。這種多重功能的原因是它具有活性酶結(jié)構(gòu)作用。據(jù)描述它是一種雜交酶，它使得病毒核酸復(fù)合在逆轉(zhuǎn)錄期間形成RNA/DNA和DNA/DNA，及在衣殼化時形成RNA/RNA和RNA/tRNA—lys3。NCP7顯示對感染性病毒的產(chǎn)生是必需的。
通過針對NCP 7的胞內(nèi)抗體的細(xì)胞質(zhì)粒表達(dá)進(jìn)行基因治療，在病毒RNA二聚化和衣殼化中抑制NCP7的功能，這也構(gòu)成了本發(fā)明的一個具體實(shí)施方案。
按照實(shí)施例中描述的方法可制備針對能中和這種蛋白的表位的本發(fā)明胞內(nèi)抗體。
其它病毒元件也可以作為本發(fā)明基因治療的目標(biāo)，特別是CD4分子上的固定位點(diǎn)(例如包膜的糖蛋白(gp120/41))，包膜的多聚化區(qū)，gp120/gp41的裂解位點(diǎn)，蛋白酶，整合酶，更廣義地講，包括所有病毒蛋白。當(dāng)包膜呈天然形式時，這些區(qū)段一般是不可接近的。因此，它們的免疫原性很弱，利用它們進(jìn)行免疫接種是不可能的。本發(fā)明使得可以定向于這些病毒元件，因此具有很好的治療前景。另外，如上所述，編碼本發(fā)明胞內(nèi)抗體的基因較小，可以有利地在同一載體中同時表達(dá)多種胞內(nèi)抗體，這些抗體針對一種或多種這些靶標(biāo)的不同區(qū)域。
本發(fā)明的核酸序列還可以是以下PIL的編碼序列，這些PIL能夠作用于和影響代謝物合成中、蛋白合成中或DNA復(fù)制和/或轉(zhuǎn)錄中相關(guān)因子的活性。
通過以下實(shí)施例將更全面地描述本發(fā)明，這些實(shí)施例應(yīng)看作說明性的而非限制性的。


圖1(A)ScFv—ras的限制性酶切圖譜。(B)ScFv—Gap的限制性酶切圖譜。(C)本發(fā)明胞內(nèi)抗體的瞬時表達(dá)對癌基因ras或Her2轉(zhuǎn)化能力的中和作用。py＝對照細(xì)胞；ScFv＝僅用psv2.ScFv.ras轉(zhuǎn)染的細(xì)胞；VAL＝用表達(dá)致癌性ras的載體Ha—ras Val12轉(zhuǎn)染的細(xì)胞；VAL＋ScFv＝用psv2.ScFv.ras質(zhì)粒和Ha—ras Val12共轉(zhuǎn)染的細(xì)胞；HER2＝用表達(dá)致癌性Her 2的載體轉(zhuǎn)染的細(xì)胞；HER2＋ScFv＝用PSV 2.ScFv.ras質(zhì)粒和Her 2共轉(zhuǎn)染的細(xì)胞。分子生物學(xué)的一般技術(shù)用于分子生物學(xué)中的常規(guī)方法如質(zhì)粒DNA的制備性提取、質(zhì)粒DNA的氯化銫梯度離心、瓊脂糖或丙烯酰胺凝膠電泳、電洗脫純化DNA片段、苯酚或苯酚—氯仿抽提蛋白質(zhì)、在含鹽介質(zhì)中用乙醇或異丙醇沉淀DNA、在大腸桿菌中的轉(zhuǎn)化等都是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的，并在文獻(xiàn)中有充分的描述[Maniatis T.等，“Molecular Cloning，a Laboratory Manual”，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Har-bor，N.Y.，1982；Ausubel F.M.等(eds)，“Current Protocols in MolecularBiololgy”，John Wiley & Sons，New York，1987]。
pBR322，pUC型質(zhì)粒和M13系噬菌體是從市場上購得的(Bethesda Research Laborataries)。
關(guān)于連接，先將DNA片段用瓊脂糖或丙烯酰胺電泳按其大小分離，用苯酚或苯酚/氯仿混合物提取，用乙醇沉淀，然后按照供應(yīng)商的推薦方法在噬菌體T4的DNA連接酶(Biolabs)存在下孵育。
按照供應(yīng)商的說明，用大腸桿菌的DNA聚合酶I的Klenow片段(Biolabs)對凸起的5’末端補(bǔ)平。按照制造商的推薦方法，在噬菌體T4的DNA聚合酶(Biolabs)存在下對凸起的3’末端進(jìn)行破壞。凸起的5’末端經(jīng)核酸酶S1仔細(xì)處理進(jìn)行破壞。
利用合成的寡聚脫氧核苷酸的體外定向突變是用Amersham提供的試劑盒按Taylor等開發(fā)的方法[Nucleic Acids Res.13(1985)8749—8764]來進(jìn)行的。
用所謂的PCR技術(shù)對DNA片段的酶擴(kuò)增[Polymerase—cat—a-lvzed Chain Reaction，Saiki R.K.等，Science 230(1985)1350—1354；Mullis K.B和Faloona F.A，Meth.Enzym.155(1987)355—350]可用“DNA thermal cycler”(Perkin Elmer Cetus)按制造商的說明進(jìn)行。
用A mersham銷售的檢測盒根據(jù)Sanger等研制的方法驗(yàn)證核苷酸序列。
實(shí)施例1抗ras胞內(nèi)抗體的編碼DNA序列的克隆和表達(dá)本實(shí)施例描述編碼細(xì)胞內(nèi)結(jié)合蛋白的核酸序列的克隆和表達(dá)，該胞內(nèi)結(jié)合蛋白再現(xiàn)單克隆抗體Y13—259的特性。Y13—259抗體是針對Ras蛋白的(ref.ATCC CRL 1742)(J.Virol.43,294—304，1982)，是向細(xì)胞中注射一次即可中和致癌性Ras蛋白功能的抗體[Smith和Coll，(1986)Nature，320,540—843；Kung等.，Exp.Cell.Res.(1986)162,363—371]。
1.1.DNA序列的制備已按美國專利4,946,778中描述的技術(shù)制備了編碼胞內(nèi)抗體(ScFv片段)的DNA序列。然后將該序列置于哺乳動物細(xì)胞中功能性啟動子的控制之下。
按Chirguin S.H.等[Biochemistry 18,5294(1979)]描述的技術(shù)，從分泌Y13—259抗體的雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)物中分離了RNA polyA。借助于從隨機(jī)的六核苷酸形成的引物，這些RNA用于一種逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)中。所得cDNA作為兩種PCR反應(yīng)的基質(zhì)—一種是用鼠VH的特異引物擴(kuò)增Y13—259的重鏈(VH)可變區(qū)片段，—第二種是用鼠序列衍生的10個引物的混合物得到VL片段。
這樣得到340pb和325pb的兩個片段，然后用一接頭將其組裝起來，該接頭能將VH cDNA正確地置于VL cDNA的5’。該接頭編碼15個氨基酸，由三個(Gly)4Ser重復(fù)片段組成[Orlandi，R等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，86,3833—3837(1979)]。此胞內(nèi)抗體的序示于SEQ ID NO.1中(第28—270殘基)。該序列提供足夠的VH—VL融合體的釋放度，以使其按平行方向組裝，從而保證對抗原的適當(dāng)親和力。
然后將融合核酸序列VH—接頭—VL插入一噬菌粒中，該噬菌粒能使胞內(nèi)抗體(ScFv片段)在噬菌體M13的表面表達(dá)(圖1A)。這種表達(dá)使得容易鑒別和選擇正確識別抗原的細(xì)胞內(nèi)抗體。
1.2經(jīng)改造的胞內(nèi)抗體的功能評價通過限制性酶切從噬菌粒分離編碼抗Ras改性胞內(nèi)抗體的DNA序列(VH—接頭—VL)，然后插入SV2載體中，并處在SV40的早期雙增強(qiáng)子啟動子的控制之下(Schweighofler等，Science，256,825—827，1992)，以測試其拮抗致癌性Ras作用的能力。這樣得到的質(zhì)粒稱為psv2.ScFv.ras。按以下幾個試驗(yàn)進(jìn)行功能評價。
a)在哺乳動物細(xì)胞中的瞬時轉(zhuǎn)染為了評價在哺乳動物細(xì)胞中的瞬時轉(zhuǎn)染，將質(zhì)粒psv2.ScFv.ras按照Schweighoffer等[Science，256,825—827(1992)]描述的方法與能使Ha—ras Val 12基因表達(dá)的載體共轉(zhuǎn)染至NIH 3T3細(xì)胞中。用從啟動子控制下的報(bào)導(dǎo)基因“氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶(CAT)”得到的酶活性，記錄了所研究的信號化途徑的活化狀態(tài)，其中啟動子含有與同時共轉(zhuǎn)染的Ras作用呈“反式”的相應(yīng)核苷酸元件(RRE)這些RRE元件是由雜合啟動子雜交瘤的TK增強(qiáng)子構(gòu)成(Wasylyk和同事，EMBO，J.7，2475，1988)。
所得結(jié)果示于圖1C中。分析所得CAT活性，說明了從Y13—259抗體制備的改性胞內(nèi)抗體拮致癌性Ras活性的能力。
與允許具有酪氨酸激酶活性的癌基因—癌基因HER2(II型人表皮生長因子)—表達(dá)的質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染的質(zhì)粒psv2.ScFv.ras，也在質(zhì)粒“CTA”試驗(yàn)中阻斷此癌基因的活性(圖1)。
b)被轉(zhuǎn)化細(xì)胞的病灶形成癌細(xì)胞具有形成轉(zhuǎn)化病灶的特性，特別是表達(dá)癌基因Ras的成纖維細(xì)胞NIH 3T3(Barlat等，Oncogene(1993)，B，215—218)。
如在以上試驗(yàn)中那樣，NIH 3T3細(xì)胞在含10％胎牛血清的Dul-bcao改良的Eagle培養(yǎng)基(DMEM)中，于37℃含5％CO2的潮濕環(huán)境中培養(yǎng)。然后這些細(xì)胞按陽離子脂質(zhì)轉(zhuǎn)染技術(shù)(Schweighoffer等，Science，256，825—827，1992)，用致癌性RasHa—ras Val12、psv2.ScFv.ras質(zhì)粒(參見以上a)項(xiàng))和過量10倍的新霉素抗性基因共轉(zhuǎn)染。每個平皿轉(zhuǎn)染相同量的總DNA。
轉(zhuǎn)染24小時后，來自每個100mm佩特里平皿的轉(zhuǎn)染細(xì)胞以1比10的比例分入存在0.4mg/ml(培養(yǎng)基)G418(GIBCO/BRL)的相同培養(yǎng)基中，并培養(yǎng)。培養(yǎng)14天后，計(jì)算每μg轉(zhuǎn)染DNA所得轉(zhuǎn)化病灶的數(shù)目。
所得結(jié)果示于下表中。它們代表四次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值。
表在抗ras胞內(nèi)抗體存在下Ha—ras Val 12對NIH 3T3細(xì)胞的轉(zhuǎn)化

所得結(jié)果清楚表明抗ras胞內(nèi)抗體大大抑制癌基因ras的轉(zhuǎn)化能力。
另外，從a)中所得結(jié)果來看，Y13—159抗體的ScFv片段表達(dá)也必然阻止其它有助于細(xì)胞Ras蛋白活化的癌基因如HER1、HER2的轉(zhuǎn)化。
應(yīng)認(rèn)識到，本領(lǐng)域技術(shù)人員在本申請中所描述結(jié)果的基礎(chǔ)上，可用編碼針對其它細(xì)胞元件的胞內(nèi)抗體(如ScFv片段)之核酸序列重復(fù)本發(fā)明。這些胞內(nèi)抗體可從已知對抗這些細(xì)胞元件的抗體制得，或通過鑒定要中和的抗原、借助該抗原或其優(yōu)選表位進(jìn)行免疫，然后從所得抗體、從其mRNA或從其雜交瘤制備胞內(nèi)抗體。在細(xì)胞轉(zhuǎn)化過程中涉及的其它元件也可以作為靶標(biāo)。例如，按照同樣方法從雜交瘤M38、M8、M70、M90和M30(ATCC HB 9158)制備編碼抗ras的胞內(nèi)結(jié)合抗體的其它DNA序列，其中所述雜交瘤的抗體分別針對Ha—Ras蛋白的1—23、24—69、90—106、107—130和131—152位殘基。而且，如上所述，可有利地制備同時帶有編碼不同胞內(nèi)抗體的多種序列的載體，以提供優(yōu)異的中和活性。實(shí)施例2編碼抗GAP胞內(nèi)抗體的DNA序列的克隆和表達(dá)本實(shí)施例描述編碼下述胞內(nèi)結(jié)合蛋白的核酸序列的克隆和表達(dá)，該胞內(nèi)結(jié)合蛋白再現(xiàn)抗GAP蛋白之單克隆抗體的特性。
GAP蛋白(GTP酶活化蛋白)與ras依賴性信號化途徑相關(guān)。它與ras蛋白以催化方式相作用，并且體外測得正常P21蛋白的GTP水解速度提高100—200倍。不同的工作已表明，約1044個氨基酸的此蛋白中催化區(qū)處于羧基末端區(qū)(702—1044殘基)，還表明該區(qū)負(fù)責(zé)GAP蛋白與ras蛋白的相互作用(參見WO91/02749)。
現(xiàn)已證明針對GAP蛋白所謂“SH3”區(qū)的單克隆抗體中和非洲蟾蜍(Xenope)卵中致癌Ras蛋白的功能(Duchesne等，Science，259，525—528，1993)。
按1.1中描述的方法，可合成一種編碼相當(dāng)于此抗體之胞內(nèi)抗體(ScFv片段)的DNA序列(SEQ ID NO.2，11—250殘基，圖IB)。插入載體中的這種序列可以抑制腫瘤細(xì)胞中癌基因ras的轉(zhuǎn)化能力。
另外，申請人還更精確地鑒定了該抗體識別的表位。然后人工合成了這些表位，并可用于產(chǎn)生能用于實(shí)施本發(fā)明的新中和性抗體。
a)更精確地鑒定通過“表位掃描”技術(shù)進(jìn)行了鑒定。該技術(shù)是基于給定抗體可與5—15個氨基酸的肽相作用這一原理的。據(jù)此，通過制備一整套5—15個氨基酸的覆蓋肽(相當(dāng)于所研究抗原的全部序列)，可獲得順序表位的鑒定。該技術(shù)已用于確定GAP“SH3”區(qū)的功能性表位。為此，通過合成所有2種氨基酸的十肽進(jìn)行順序覆蓋，研究了該區(qū)域的全部。
—覆蓋肽的合成化學(xué)合成了覆蓋圖1片段之全部的35種肽。用固相Fmoc/叔丁基方法在獨(dú)立的兩種載體上進(jìn)行雙份合成(Cambridge Research Bio-chemicals的試劑盒)。
—顯示功能性表位用與過氧化物酶偶聯(lián)的兔抗鼠抗體進(jìn)行ELISA實(shí)驗(yàn)，揭示了Ac200抗體識別的功能性表位。使用的產(chǎn)色酶底物是連氮—雙—(3—乙基苯并噻唑啉磺酸)(ABTS)。
所得結(jié)果表明該抗體識別的表位如下—PVEDRRRVRAI—EISF—EDGWM可按本領(lǐng)域技術(shù)人員的常規(guī)技術(shù)使用這些表位，以產(chǎn)生中和ras作用的抗體。然后這些抗體或產(chǎn)生它們的雜交瘤，按以上描述的方法用于產(chǎn)生本發(fā)明的核酸序列和載體。實(shí)施例3從用Ki—Ras的高變區(qū)肽(2A和2B)免疫的小鼠脾提取mRNA，制備編碼抗Ki—ras胞內(nèi)抗體的核酸序列本實(shí)施例描述通過鑒定要中和的抗原、用此抗原或其優(yōu)選表位免疫、然后從所得抗體、其mRNA或雜交瘤制備核酸序列的方法，制備編碼本發(fā)明胞內(nèi)抗體(如ScFv片段)的核酸序列。
該實(shí)施例說明可將本發(fā)明應(yīng)用于所有抗原或所希望的表位，既使在針對所述抗原或表位的單克隆抗體不可得的情況下也可應(yīng)用本發(fā)明。
本實(shí)例中的靶抗原是Ki—ras蛋白。更準(zhǔn)確地講，用于免疫的抗原是相當(dāng)于Ki—ras蛋白末端25和24個氨基酸的肽，即如下2A和2B
—2A肽QYRLKKISKEEKTPGCVKIKKCIIM—2B肽KYREKNSKDGKKKKKKSKTKCIIM按免疫學(xué)常規(guī)技術(shù)用這些肽免疫小鼠后，取出脾臟，從mRNA制備cDNA。然后克隆編碼可變區(qū)的cDNA，這樣就構(gòu)建了表達(dá)ScFv的噬菌體文庫，這些ScFv相當(dāng)于所用小鼠匯總的全部。然后利用與柱和微滴定板的親和性，通過連續(xù)選擇步驟鑒定并分離識別2A和2B肽的胞內(nèi)抗體(ScFv片段)。
然后按照實(shí)施例1中描述的方法對這些ScFv進(jìn)行功能測試。
本實(shí)施例中提出的這種策略能有利地選擇癌基因Ki—Ras的特異性胞內(nèi)抗體，而不會影響其它Ras原癌基因。因此這種工具的選擇性不僅是細(xì)胞水平的(因?yàn)樵赗as轉(zhuǎn)化細(xì)胞中轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的去偶(de-couplage))而且是分子水平的。實(shí)施例4制備編碼抗—突變p53的胞內(nèi)抗體的核酸序列本實(shí)例描述針對p53突變蛋白的胞內(nèi)抗體(如ScFv片段)的編碼核酸序列的制備。這些胞內(nèi)抗體是從針對所述p53突變蛋白的不同單克隆抗體獲得的。
在大量腫瘤細(xì)胞中p53蛋白的編碼基因發(fā)生了變化(Caron deFronmentel和Soussi，Genes，4，1—15，1992)。通過單克隆抗體可以檢測到這種構(gòu)象變化(Milner和Cook，Virology，154，21—30，1986；Milner，Nature，310，143—145，1984)。
pAB240抗體識別p53蛋白的突變形式。
突變p53的特異抗體或與這種突變P53蛋白特異性相互作用的蛋白的ScFv片段在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，能在帶有突變p53的腫瘤中產(chǎn)生有益的效果。
實(shí)施例5抗乳頭瘤病毒的胞內(nèi)抗體的編碼DNA序列的克隆和表達(dá)本實(shí)例描述編碼抗人乳頭瘤病毒(HPV)蛋白的胞內(nèi)抗體(ScFv片段)之DNA序列的克隆和表達(dá)。
靶病毒蛋白為E6蛋白。該蛋白是由HPV16和18病毒產(chǎn)生的，這兩種病毒與90％的婦女宮頸癌有關(guān)，并在癌前上皮損傷中得以鑒定(Riou等，Lancet 335(1990)117)。E6基因產(chǎn)物大大減小HPV陽性細(xì)胞中野生p53的量(一種抗癌基因)導(dǎo)致腫瘤形成(Wrede等，Mol.Carcinog.4(1991)171)。在其它腫瘤中，以不同的機(jī)制抑制p53突變(參見實(shí)例4)或與諸如MDM2的蛋白結(jié)合。
文獻(xiàn)中已描述了E6蛋白的序列(Hawley—Nelson等，EMBO J.8(1989)3905；Munger等，J.Virol.63(1989)4417)?？捎谩氨砦粧呙琛?參見實(shí)施例2)鑒定該蛋白特定區(qū)域，然后用于按實(shí)施例3中描述的方法免疫小鼠。然后按前述方法制備抗人乳頭瘤病毒(HPV)E6蛋白的胞內(nèi)抗體(ScFv片段)的編碼DNA序列。體內(nèi)表達(dá)后通過下列方式顯示該序列的實(shí)用性—提高表達(dá)E6的細(xì)胞中野生p53的比率，—HPV轉(zhuǎn)化的細(xì)胞形態(tài)回復(fù)，—阻斷E6對p53的反式激活作用，和—抑制E6對角化細(xì)胞和人成纖維細(xì)胞的轉(zhuǎn)化。實(shí)施例6從用tat、rev和NCP7蛋白活性區(qū)的肽免疫的小鼠脾提取mRNA，制備抗HIV胞內(nèi)抗體的編碼核酸序列。
本實(shí)施例描述通過鑒定要中和的抗原、用此抗原或其優(yōu)選表位免疫、然后從所得抗體、其mRNA或雜交瘤制備核酸序列的方法，制備編碼本發(fā)明胞內(nèi)抗體(如ScFv片段)的核酸序列。
本實(shí)施例說明可將本發(fā)明應(yīng)用于所有抗原或所希望的表位，既使在針對所述抗原或表位的單克隆抗體不可得的情況下也可應(yīng)用本發(fā)明。
本實(shí)例中的靶抗原是HIV病毒的tat、rev和NCP7蛋白。更準(zhǔn)確地講，用于免疫的抗原是下列6，9和16個氨基酸的肽，相當(dāng)于這些蛋白負(fù)責(zé)與mRNA相互作用的區(qū)域(tat和rev)或負(fù)責(zé)RNA二聚化的區(qū)域(NCP7)—tat肽RKKRRQRRR—rev肽RQARRNRRRRWRERQR—NCP7肽RAPRKK按免疫學(xué)常規(guī)技術(shù)用這些肽免疫小鼠后，取出脾臟，從mRNA制備cDNA。然后克隆編碼可變區(qū)的cDNA，這樣就構(gòu)建了表達(dá)ScFv的噬菌體文庫，這些ScFv相當(dāng)于小鼠匯總的全部。然后利用與柱和微滴定板的親和性，通過連續(xù)選擇步驟鑒定并分離識別tat、rev和NCP7肽的胞內(nèi)抗體(ScFv片段)。
然后測試這些ScFv阻斷HIV病毒的感染周期的能力。
SEQ ID NO1TCA AGG AGA CAG TCT ATA AGA AAT ACC TAT TCG ACG GCA GCC GCT GGA 48Ser Arg Arg Gln Ser Ile Arg Asn Thr Tyr Ser Thr Ala Ala Ala Gly1 5 10 15TTG TTA TTA CTC GCG GCC CAG CCG GCC ATG GCT CAG GTG AAA CTG CAG 96Leu Leu Leu Leu Ala Ala Gln Pro Ala Met Ala Gln Val Lys Leu Gln20 25 30CAG TCA GGA GCA GGC TTA GTG CAG CCT GGA AGG TCC CTG AAA CTC TCC 144Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg Ser Leu Lys Leu Ser35 40 45TGT GTA GTC TCT GGA TTC ACT TTC AGT AAC TAT GGA ATG AAC TGG ATT 192Cys Val Val Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ash Tyr Gly Met Asn Trp Ile50 55 60CGC CAG ACT CCA GGG AAG GGA CTG GAG TGG GTT GCA TAC ATT AGT AGT 240Arg Gln Thr Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Tyr Ile Ser Ser65 70 75 80GGT AGC AGT TAC CTC TAC TAT GCA GAA ACG GTG AAG GGC CGA TTC ACC 288Gly Ser Ser Tyr Leu Tyr Tyr Ala Glu Thr Val Lys Gly Arg Phe Thr85 90 95ATC TCC AGA GAC AAT GCC AAG AAC ACC CTG TAC CTG CAA ATG ACC AGT 336Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Thr Ser100 105 110CTG AGG TCT GAA GAC ACT GCC TTG TAT TAC TGT GCA AGA CAT GAG GGT 384Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys Ala Arg His Glu Gly115 120 125ACG GGT ACC GAC TTC TTT GAT TAC TGG GGC CAA GGG ACC ACG GTC ACC 432Thr Gly Thr Asp Phe Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr130 135 140GTC TCC TCA GGT GGA GGC GGT TCA GGC GGA GGT GGC TCT GGC GGT GGC 480Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly145 150 155 160GGA TCG GAC GTT GAG CTC ACC CAG TCT CCA CAT TCC CTG TCT GCA TCT 528Gly Ser Asp Val Glu Leu Thr Gln Ser Pro His Ser Leu Ser Ala Ser165 170 175CTG GGA GAA ACT GTC TCC ATC GAA TGT CTA GCA AGT GAG GGC ATT TCC 576Leu Gly Glu Thr Val Ser Ile Glu Cys Leu Ala Ser Glu Gly Ile Ser180 185 190AAT TAT TTA GCG TGG TAT CAG CAG AAG CCA GGG AAA TCT CCT CAG CTC 624Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Gln Leu195 200 205CTG ATC TAT TAT GCA AGT AGC TTG CAG GAT GGG GTC CCA TCA CGG TTC 672Leu Ile Tyr Tyr Ala Ser Ser Leu Gln Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe210 215 220AGT GGC AGT GGA TCT GGC ACA CAG TTT TCT CTC AAG ATC AGC AAC ATG 720Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Ser Leu Lys Ile Ser Asn Met225 230 235240CAA CCT GAA GAT GAA GGG GTT TAT TAC TGT CAA CAG GCT TAC AAG TAT 768Gln Pro Glu Asp Glu Gly Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Ala Tyr Lys Tyr245 250 255CCT TCC ACG TTT GGA GCT GGC ACC AAG CTG GAA ATA AAA CGG GCG GCC 816Pro Ser Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Ala Ala260 265 270GCA GAA CAA AAA CTC ATC TCA GAA GAG GAT CTG AAT TAA TAA GAA TTC 864Ala Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Asn * * Glu Phe275 280 285ACT GGCThr Gly 870290SEQ ID NO2TTA TTA CTC GCG GCC CAG CCG GCC ATG GCC CAG GTC CAA CTG CAG GAG 48Leu Leu Leu Ala Ala Gln Pro Ala Met Ala Gln Val Gln Leu Gln Glu1 5 10 15TCA GGA CCT GGC CTA GGG CAG CCC GCA CAG AGC ATT TCC ATA ACC TGC 96Ser Gly Pro Gly Leu Gly Gln Pro Ala Gln Ser Ile Ser Ile Thr Cys20 25 30ACA GTC TCT GGT TTC TCA TTA AGT AGC TAT GGT GTA CAC TGG GTT CGC 144Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Ser Tyr Gly Val His Trp Val Arg35 40 45CAG TCT CCA GGA AAG GGT CTG GAG TGG CTG GGA GTG ATA TGG AGA GGT 192Gln Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu Gly Val Ile Trp Arg Gly50 55 60GGA GGC ACA GAC TAC AAT GCA GCC TTC ATG TCC AGA CTG AGC ATC ACC 240Gly Gly Thr Asp Tyr Asn Ala Ala Phe Met Ser Arg Leu Ser Ile Thr65 70 75 80AAG GAC AAC TCC AAG AGC CAA GTT TTC TTT AAA TTG AAC AGT CTG CAA 288Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Phe Lys Leu Asn Ser Leu Gln85 90 95CCT GAT GAC ACT GCC ATG TAC TAC TGT GCC AAA AGG GGT GGC CCG GGG 336Pro Asp Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala Lys Arg Gly Gly Pro Gly100 105 110TAT TTC GAT GTC TGG GGC CAA GGG ACC ACG GTC ACC GTC TCC TCA GGT 384Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly115 120 125GGA GGC GGT TCA GGC GGA GGT GGC TCT AGC GGT GGC GGA TCG GAC ATT 432Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser Gly Gly Gly Ser Asp Ile130 135 140GAG CTC ACC CAG TCT CCA GCC TCC CTA TCT GCA TCT GTG GGA GAA ACT 480Glu Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Glu Thr145 150 155 160GTC ACC ATG ACA TGT CGA GCA AGT GAG AAT ATT TAC AGT AAT TTA GCA 528Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser Glu Asn Ile Tyr Ser Asn Leu Ala165 170 175TGG TAT CAG CAG AAA CAG GGA AAG TCT CCT CAG CTC CTG GTC TAT GCT 576Trp Tyr Gln Gln Lys Gln Gly Lys Ser Pro Gln Leu Leu Val Tyr Ala180 185 190GCA ACA AAA CCA GGA AAT GGT GTG CCA TCA AGG TTC AGT GGC AGT GGA 624Ala Thr Lys Pro Gly Asn Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly195 200 205TCA GGC ACA CAA TTT TCT CTG AAG ATC AAC AGC CTG CAG CCT GAA GAT 672Ser Gly Thr Gln Phe Ser Leu Lys Ile Asn Ser Leu Gln Pro Glu Asp210 215 220CTT GGG AAC TAT TAC TGT CTA CAT TTT TAT GGG ACT CCG TAT AGG TTC 720Leu Gly Asn Tyr Tyr Cys Leu His Phe Tyr Gly Thr Pro Tyr Arg Phe225 230 235 240GGC GGG GGC ACC AAG CTG GAA ACG AAA CGG GCG GCC GCA GAA CAA AAA 768Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Thr Lys Arg Ala Ala Ala Glu Gln Lys245 250 255CTC ATC TCA GAA GAG GAT CTG AAT TAA TAA GAA TTC ACT GGC 810Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Asn * * Glu Phe Thr Gly260 265 270
權(quán)利要求
1.含有一種細(xì)胞內(nèi)結(jié)合蛋白(PIL)之編碼基因的核酸序列，所述編碼基因受一種在哺乳動物細(xì)胞中有功能的啟動子控制。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的核酸序列，其特征在于它編碼作用于細(xì)胞增殖、代謝物合成、蛋白合成、DNA復(fù)制和/或轉(zhuǎn)錄、或病毒感染周期的細(xì)胞內(nèi)結(jié)合蛋白。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2的核酸序列，其特征在于細(xì)胞內(nèi)結(jié)合蛋白是細(xì)胞內(nèi)抗體或片段和/或這種抗體的衍生物。
4.根據(jù)權(quán)利要求3的核酸序列，其特征在于細(xì)胞內(nèi)結(jié)合蛋白是抗體的Fab或F(ab)’2片段。
5.根據(jù)權(quán)利要求3的核酸序列，其特征在于細(xì)胞內(nèi)結(jié)合蛋白是一種肽，它至少含有通過一肽接頭連接的相當(dāng)于抗體輕鏈可變區(qū)結(jié)合位點(diǎn)的肽和相當(dāng)于抗體重鏈可變區(qū)結(jié)合位點(diǎn)的肽。
6.根據(jù)權(quán)利要求1—6之一的核酸序列，其特征在于在哺乳動物細(xì)胞中有功能的啟動子選自病毒啟動子、細(xì)胞啟動子或人工啟動子。
7.根據(jù)權(quán)利要求1—6之一的核酸序列，其特征在于它結(jié)合在載體中。
8.根據(jù)權(quán)利要求7的核酸序列，其特征在于它結(jié)合在病毒載體中。
9.在其基因組中含有權(quán)利要求1—8之一的核酸序列的缺陷重組病毒。
10.根據(jù)權(quán)利要求9的缺陷重組病毒，其特征在于它選自逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒、腺相關(guān)病毒、痘苗病毒和HSV病毒。
11.缺陷重組病毒，其特征在于在其基因組中含有一種核酸序列，該核酸序列至少含有編碼細(xì)胞內(nèi)抗體或片段和/或這種抗體的衍生物的基因。
12.根據(jù)權(quán)利要求11的缺陷重組病毒，其特征在于細(xì)胞內(nèi)抗體是一種肽，它至少含有通過一種肽接頭連接的相當(dāng)于抗體輕鏈可變區(qū)結(jié)合位點(diǎn)的肽和相當(dāng)于抗體重鏈可變區(qū)結(jié)合位點(diǎn)的肽。
13.根據(jù)權(quán)利要求11或12的缺陷重組病毒，其特征在于細(xì)胞內(nèi)抗體是一種針對細(xì)胞增殖中相關(guān)靶細(xì)胞的元件的抗體。
14.根據(jù)權(quán)利要求13的缺陷重組病毒，其特征在于細(xì)胞內(nèi)抗體是針對癌基因或針對癌基因信號化途徑之因子的抗體。
15.根據(jù)權(quán)利要求14的缺陷重組病毒，其特征在于癌基因選自myc、myb、ras、fos、jun和erb癌基因。
16.根據(jù)權(quán)利要求11—15的缺陷重組病毒，其特征在于它選自逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒、腺相關(guān)病毒、痘苗病毒和HSV病毒。
17.含有至少兩種根據(jù)權(quán)利要求1的核酸序列的載體，特別是病毒載體，其中核酸序列編碼抗一利或多種抗原的不同表位的細(xì)胞內(nèi)結(jié)合蛋白。
18.含有至少一種根據(jù)權(quán)利要求1—8之一的核酸序列或根據(jù)權(quán)利要求9—17之一的重組病毒的藥物組合物。
19.根據(jù)權(quán)利要求18的藥物組合物，其特征在于它含有脂質(zhì)體形式、與核蛋白、脂類或葡聚糖的復(fù)合物形式、或天然形式的權(quán)利要求1—8之一的至少一種核酸序列。
20.根據(jù)權(quán)利要求19的藥物組合物，其特征在于它含有至少一種根據(jù)權(quán)利要求5的核酸序列。
21.根據(jù)權(quán)利要求18的藥物組合物，其特征在于它含有至少一種根據(jù)權(quán)利要求12的重組病毒。
22.根據(jù)權(quán)利要求21的藥物組合物，其特征在于重組病毒選自腺病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒、或腺相關(guān)病毒。
23.權(quán)利要求1的核酸序列在制備用于治療癌癥的藥物組合物中的用途。
24.權(quán)利要求1的核酸序列在制備用于治療病毒感染的藥物組合物中的用途。
全文摘要
本發(fā)明涉及核酸序列，含有它們的載體，及其治療用途，特別是基因治療用途。更具體講，本發(fā)明涉及含有細(xì)胞內(nèi)結(jié)合蛋白(PIL)編碼基因的核酸序列，和它們的基因治療應(yīng)用，它們結(jié)合或不結(jié)合在適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)載體中。
文檔編號A61K38/00GK1126491SQ9419244
公開日1996年7月10日 申請日期1994年6月15日 優(yōu)先權(quán)日1993年6月16日
發(fā)明者F·施維格霍夫爾, B·托科奎 申請人:羅納-布朗克·羅萊爾股份有限公司