專利名稱：水果多酚及其生產(chǎn)方法以及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及水果多酚；其生產(chǎn)方法；和各自包含所述多酚作為有效組分的抗氧化劑、降血壓藥劑、抗誘變劑、抗變態(tài)反應(yīng)藥劑和防齲藥劑。
在結(jié)出可食用果實(shí)如蘋果、梨、桃等的薔薇科樹木的生長過程中，通常在五月中旬到七月中旬時(shí)，要進(jìn)行多余果實(shí)的“蔬果”。在該蔬果時(shí)，除去成串或成簇的未成熟果實(shí)，而將其中的一部分留下。結(jié)果，大量未成熟果實(shí)經(jīng)蔬果被處理掉而未被利用。這些未成熟果實(shí)與成熟果實(shí)相比非?？啵颐總€(gè)未成熟果實(shí)的斷面表面容易變成褐色。這種事實(shí)表明未成熟果實(shí)中存在大量的多酚化合物。
已經(jīng)知道多酚化合物作為植物的次級(jí)代謝產(chǎn)物以眾多的種類和巨大的數(shù)量存在于植物界。其中的某些多酚化合物因其多種多樣的生理學(xué)活性，自過去在藥物學(xué)領(lǐng)域到近年的食品化學(xué)領(lǐng)域均引起人們的關(guān)注。
其中，茶多酚(兒茶素類)特別引起注意并正在對(duì)其進(jìn)行集中的研究。人們認(rèn)識(shí)到這種茶多酚具有很廣泛的生理學(xué)活性如抗菌活性、抗病毒活性、抗氧化活性、抗誘變活性、抗癌活性、抑制血小板凝結(jié)的活性、抑制血壓升高的活性、抑制血糖升高的活性、降低血液膽固醇的活性、防齲活性、抗變態(tài)反應(yīng)活性、改善腸內(nèi)菌叢的活性、除臭活性等(日本專利申請(qǐng)公開Nos.214183/1988，6499/1990，178320/1992等)。
因此，已知例如從茶葉中提取的多酚具有廣泛的生理學(xué)活性。
本發(fā)明的一個(gè)目的是提供具有各種生理學(xué)活性并不同于從茶葉中提取的多酚的水果多酚。
本發(fā)明的另一目的是提供有效且經(jīng)濟(jì)地生產(chǎn)上述水果多酚的方法。
根據(jù)本發(fā)明，提供了經(jīng)壓榨和/或提取薔薇科的未成熟果實(shí)，特別是未成熟蘋果、未成熟梨或未成熟桃，然后純化所得的果汁或提取物而得到的水果多酚。
根據(jù)本發(fā)明，還提供了生產(chǎn)水果多酚的方法，包括，壓榨和/或提取薔薇科的未成熟果實(shí)，特別是未成熟的蘋果、未成熟梨或未成熟的桃，然后純化所得的果汁或提取物以得到多酚部分。
根據(jù)本發(fā)明，還提供了一種包含通過壓榨和/或提取薔薇科的未成熟果實(shí)，特別是未成熟蘋果、未成熟梨或未成熟的桃，然后純化所得的果汁或提取物而得到的水果多酚作為有效組分的抗氧化劑。
根據(jù)本發(fā)明，還提供了一種包含以具有血管緊張肽轉(zhuǎn)化酶I抑制活性的水果多酚作為有效組分的降血壓藥劑，所述多酚是經(jīng)壓榨和/或提取薔薇科的未成熟果實(shí)，特別是未成熟蘋果、未成熟的梨或未成熟的桃，然后純化所得的果汁或提取物而得到的。
根據(jù)本發(fā)明，還提供了一種包含以具有能夠抑制致癌物質(zhì)的誘變性的活性的水果多酚作為有效組分的抗誘變劑，所述多酚是經(jīng)壓榨和/或提取薔薇科的未成熟果實(shí)，特別是未成熟的蘋果、未成熟的梨或未成熟的桃，然后純化所得的果汁或提取物而得到的。
根據(jù)本發(fā)明，還提供了一種包含以具有透明質(zhì)酸酶抑制活性的水果多酚作為有效組分的抗變態(tài)反應(yīng)藥劑，所述多酚是經(jīng)壓榨和/或提取薔薇科的未成熟果實(shí)，特別是未成熟的蘋果、未成熟的梨或未成熟的桃，然后純化所得的果汁或提取物而得到的。
根據(jù)本發(fā)明，還提供了一種包含以具有葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶抑制活性的水果多酚作為有效組分的防齲藥劑，所述多酚是經(jīng)壓榨和/或提取薔薇科的未成熟果實(shí)，特別是未成熟蘋果、未成熟梨或未成熟桃，然后純化所得的果汁或提取物而得到的。


圖1是表示HPLC色譜和未成熟蘋果多酚各峰的UV光譜比較圖。
圖2是分別表示將所述提取物加至反應(yīng)系統(tǒng)中的一個(gè)星期之后，形成的過氧化類脂(peroxylipid)的量(在500nm處的吸收度)與未成熟或成熟“富士”(Fuji)蘋果提取物的加入濃度之間的關(guān)系圖。
圖3是分別表示在將所述多酚部分加至反應(yīng)系統(tǒng)中的一個(gè)星期后，形成的過氧化類脂的量(在500nm處的吸收度)與未成熟或成熟“富士”蘋果的多酚部分的加入濃度之間的關(guān)系圖。
圖4是表示在將各種多酚化合物分別加至各反應(yīng)系統(tǒng)中的一個(gè)星期后，形成的過氧化類脂類的量(在500nm處的吸收度)。
圖5是分別表示在將所述多酚部分加至反應(yīng)系統(tǒng)一個(gè)星期后，形成的過氧化類脂的量(在500nm處的吸收度)與每種未成熟蘋果的多酚部分的加入濃度之間的關(guān)系圖。
圖6是分別表示在將所述多酚部分加至反應(yīng)系統(tǒng)一個(gè)星期后，形成的過氧化類脂的量(在500nm處的吸收度)與每種未成熟果實(shí)的多酚部分的加入濃度之間的關(guān)系圖。
圖7是分別表示未成熟或成熟“富士”蘋果多酚部分的血管緊張肽轉(zhuǎn)化酶I(下文稱為ACE)抑制活性圖。
圖8是表示以各種數(shù)量將每種多酚部分B加至反應(yīng)系統(tǒng)后，各種多酚部分B的ACE抑制活性圖。
圖9是表示以各種數(shù)量將每種多酚化合物加至反應(yīng)系統(tǒng)后，各種多酚化合物的ACE抑制活性圖。
圖10是表示用分光光度計(jì)測量的，所分離多酚部分的吸收光譜圖。
圖11是表示縮合鞣質(zhì)分子量的GPC測量結(jié)果圖。
圖12是本發(fā)明水果多酚所含的ACE抑制物質(zhì)的結(jié)構(gòu)式。
圖13是表示各種多酚對(duì)Trp-P-2的抗誘變活性圖。
圖14是表示蘋果鞣酸和棓酸表?xiàng)攦翰杷貙?duì)苯并[a]芘的抗誘變活性圖。
圖15是表示各種水果提取物的透明質(zhì)酸酶抑制活性圖。
圖16是表示抗變態(tài)反應(yīng)藥劑(色甘酸鈉)和蘋果鞣酸的透明質(zhì)酸酶抑制活性圖。
圖17是表示當(dāng)將各種水果多酚部分分別加至各反應(yīng)系統(tǒng)后，形成的不可溶葡聚糖的量與加入的水果多酚部分的量之間的關(guān)系圖。
圖18是表示當(dāng)將各種多酚化合物加至各反應(yīng)系統(tǒng)后，形成的不可溶葡聚糖的量與加入的多酚化合物的量之間的關(guān)系圖。
根據(jù)本發(fā)明的水果多酚是一種經(jīng)壓榨或提取薔薇科的未成熟果實(shí)，特別是未成熟蘋果、未成熟梨或未成熟桃，然后將所得的果汁或提取物純化而得到的多酚。純化的進(jìn)行是通過用吸附劑處理果汁或提取物，由吸附劑所吸附的果汁或提取物部分(下文將該部分稱為“吸附部分”)含有水果多酚。用無水醇(如乙醇)洗脫吸附部分，從而得到純化的多酚部分。
然后將該多酚部分濃縮，從而可得到液體的多酚產(chǎn)物。
若使上述得到的濃縮物經(jīng)噴霧干燥或冷凍干燥，則可得到粉末狀多酚產(chǎn)物。
本發(fā)明中所用的起始材料是薔薇科的果實(shí)。具體地講，蘋果、梨、桃等是優(yōu)選的，而蘋果是特別優(yōu)選的。所述果實(shí)可以是成熟或未成熟的，但未成熟果實(shí)是特別優(yōu)選的，因?yàn)樗鼈兒休^大總量的多酚化合物，也因?yàn)樗鼈兒写罅烤哂懈鞣N生理學(xué)活性的各種多酚化合物。
下面針對(duì)壓榨方法進(jìn)行描述。在一種壓榨方法中，先洗滌起始材料；然后在加入或不加入亞硫酸的情況下，壓碎并壓榨洗滌過的材料，得到果汁；優(yōu)選的是，向其中加入果膠溶解酶；然后使所得的混合物經(jīng)離心、過濾等以得到澄清的果汁。
下面描述提取方法。在一種提取方法中，將洗滌過的材料與醇(如乙醇或甲醇)混合；將混合物壓碎；將所得材料浸漬并壓榨，或回流，以對(duì)其進(jìn)行提?。粚⑻崛∥餃p壓濃縮以除去醇；然后將濃縮物離心并過濾，或者用有機(jī)溶劑(如己烷或氯仿)分配并過濾以得到澄清的提取物。
下面描述純化上面得到的果汁或提取物的方法。使上面得到的澄清果汁或澄清提取物通過裝有吸附劑的柱子，由此吸附劑吸附多酚部分，所述吸附劑能選擇性地吸附所述果汁或提取物中所含的水果多酚，并且通過洗脫劑的使用能釋放所吸附的多酚。[吸附劑的實(shí)例是苯乙烯-二乙烯基苯型的合成樹脂、陰離子交換樹脂和十八烷基-化學(xué)鍵合的硅膠(ODS)]。然后使蒸餾水通過該柱進(jìn)行洗滌，然后使20-100％醇(如乙醇)溶液，優(yōu)選約50％醇溶液通過該柱，由此洗脫并回收多酚部分。減壓濃縮所得的多酚溶液以除去醇，由此可得到水果多酚的液體產(chǎn)物(優(yōu)選向其中加入有機(jī)酸如蘋果酸等)。在加入或不加入粉化輔助劑如糊精等的情況下，使該液體產(chǎn)物經(jīng)噴霧干燥或冷凍干燥，由此可得水果多酚的粉末產(chǎn)品。
由本發(fā)明人證實(shí)，本發(fā)明得到的水果多酚絕大多數(shù)由(1)簡單的多酚化合物如咖啡酸衍生物、對(duì)香豆酸衍生物、黃烷-3-醇類(兒茶素類)、黃酮醇類(五羥黃酮苷類)、二氫查耳酮類(根皮素苷類)等和(2)高分子多酚化合物如縮合鞣質(zhì)等組成。
因此，認(rèn)為本發(fā)明中得到的水果多酚具有各種生理學(xué)功能，本發(fā)明人已進(jìn)行了廣泛的研究。結(jié)果，首先發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明的水果多酚含有大量能抑制亞油酸(一種植物油)氧化的成分。因此，本發(fā)明的水果多酚作為一種抗氧化劑是非常有效的。
接著發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明的水果多酚含有大量能抑制ACE(這是一種與血壓升高有關(guān)的酶)功能的成分。因此，本發(fā)明的水果多酚作為降血壓藥劑也是非常有效的。
進(jìn)行了進(jìn)一步的研究以鑒定本發(fā)明水果多酚中所含的ACE抑制成分。結(jié)果證實(shí)，ACE抑制成分是由圖12所示的結(jié)構(gòu)式所代表的縮合鞣質(zhì)。
近年來進(jìn)行的許多研究表明，致癌物質(zhì)和誘變物質(zhì)之間有密切的聯(lián)系，因此，致癌性和誘變性之間有密不可分的聯(lián)系。因而，期望能抑制誘變性的物質(zhì)能夠預(yù)防致癌性。本發(fā)明人對(duì)本發(fā)明水果多酚是否具有抗誘變活性作了檢測，證明該多酚有所述活性。因此，本發(fā)明的水果多酚作為抗誘變藥劑是非常有效的。
透明質(zhì)酸酶是一種被認(rèn)為在結(jié)締組織重建中表現(xiàn)出某種細(xì)胞活性的酶。近年來完成的研究(Chem.Pharm.Bull.，33，p.642，1985；ibid.，33，p.5079，1985；ibid.，33，p.3787，1985；ibid.，33，p.5079，1985；和ibid.，40，p.1439，1992)表明，在合成的抗變態(tài)反應(yīng)藥劑(如，色甘酸鈉和tranilast)中，透明質(zhì)酸酶抑制活性與抑制組胺從肥大細(xì)胞中釋放的活性之間有密切的聯(lián)系。利用這種聯(lián)系，通過檢測天然產(chǎn)物的透明質(zhì)酸酶抑制活性而在所述產(chǎn)物中發(fā)現(xiàn)了數(shù)種抗變態(tài)反應(yīng)物質(zhì)。因此，本發(fā)明人對(duì)本發(fā)明的水果多酚是否具有透明質(zhì)酸酶抑制活性作了檢測，確證，該多酚具有此活性。因此，本發(fā)明的水果多酚作為抗變態(tài)反應(yīng)藥劑也是很有效的。
目前已證實(shí)，齲齒(被腐蝕的牙)是由口腔鏈球菌屬包括鏈球菌突變體引起的與細(xì)菌有關(guān)的疾病。在齲齒的發(fā)展過程中，認(rèn)為沉積物的形成是特別重要的因素。
這就是說由葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶(下文稱之為“GTase”)(該酶是一種由生齲菌產(chǎn)生的酶)的作用從食物中所含的蔗糖合成了粘性的且不可溶的葡聚糖；細(xì)菌經(jīng)所述的葡聚糖粘附在牙本質(zhì)上；所產(chǎn)生的沉積物引起齲齒。
因此，期望能夠抑制GTase作用的物質(zhì)可作為有效的防齲藥劑[Appl.Env.Microbiol.，59(4)，pp.968-973，1993；Biosci.Biotech.Biochem.，56(5)，pp.766-768，1992；Agric.Biol.Chem.，54(11)；pp.2925-2929，1990；和Chem.Pharm.Bull.，38(3)，pp，717-720，1990]。
因此，本發(fā)明人對(duì)于本發(fā)明的水果多酚是否具有對(duì)由S.sobrinus(典型的生齲菌)產(chǎn)生的產(chǎn)生不可溶的葡聚糖的GTase的抑制活性作了檢測，發(fā)現(xiàn)所述多酚有此活性。因此，本發(fā)明的水果多酚作為一種防齲劑也是很有效的。
下面，用更詳細(xì)的有關(guān)實(shí)施例描述本發(fā)明。然而，本發(fā)明并不限于這些實(shí)施例。實(shí)施例1未成熟的蘋果汁的組分分析使下列樣品進(jìn)行常規(guī)的組分分析。
樣品成熟的“富士”蘋果不用口袋生長的市售產(chǎn)品。
未成熟的“富士”蘋果在六月中旬采摘的樣品的處理用混合器將每種水果樣品壓碎，加入適量的偏亞硫酸氫鉀(一種抗氧化劑)。將所得的果汁離心并過濾以得到澄清的果汁。
測量項(xiàng)目和方法×每種果實(shí)的平均重量(n＝50)×得到的果汁率(％)×pH×酸度(g/l，以蘋果酸汁)×白利糖度(Brix)×總酚(ppm，以綠原酸汁)×總抗壞血酸×有機(jī)酸分析×糖類分析×金屬離子分析×游離氨基酸分析表1中列出了測量結(jié)果。
表1
<p>從表1中可以清楚地看出，未成熟蘋果汁和成熟蘋果汁之間在組成上有很大不同。在未成熟蘋果汁中，特別是總酚、總抗壞血酸、有機(jī)酸(特別是奎尼酸)、金屬離子和游離氨基酸(尤其是天冬酰胺、苯丙氨酸和γ-氨基丁酸)很豐富。同時(shí)，在未成熟蘋果汁中，糖幾乎沒有。
接著，使未成熟蘋果中所含的多酚經(jīng)HPLC進(jìn)行組分分析。
作為多酚樣品，使用了使未成熟蘋果提取物經(jīng)固相提取(見實(shí)施例2)而得到的純化多酚。
圖1列出了分析結(jié)果。
從圖1中可以清楚地看出，未成熟蘋果中所含的樣品多酚絕大多數(shù)由咖啡酸衍生物(綠原酸等)、對(duì)香豆酸衍生物、黃烷-3-醇類(兒茶素、表兒茶素等)、黃酮醇類(五羥黃酮苷類)和二氫查耳酮類(根皮素苷類，特別是根皮苷)組成。其中大量含有綠原酸、兒茶素、表兒茶素和根皮苷。實(shí)施例2未成熟果實(shí)中多酚的抗氧化活性起始材料用下列起始材料。
成熟的蘋果不用袋子生長的市售產(chǎn)品未成熟蘋果在六月中旬采集的。
“富士”平均重量＝4.97g(n＝50)“Tugaru”平均重量＝7.80g(n＝50)“Jonagold”平均重量＝3.86g(n＝50)“Hokuto”平均重量＝3.32g(n＝50)
“Ohrin”平均重量＝10.34g(n＝50)未成熟的梨在六月初采集的“Hohsui”平均重量＝8.98g(n＝50)未成熟的桃在六月初采集的“Akatuki”平均重量＝5.03g(n＝50)樣品的制備果汁樣品重復(fù)實(shí)施例1中的方法以得到澄清的果汁。
提取物樣品通過將400g起始材料與含1％HCl的甲醇一起勻漿，然后將所得的材料在回流條件下進(jìn)行提取(三次)，減壓濃縮提取物以除去甲醇，向其中加入氯仿以進(jìn)行分配(兩次)，回收水層，過濾水層，然后將蒸餾水加至濾液中，以達(dá)到200ml的總體積。
按需要，使果汁樣品和提取物樣品用Seppack C18進(jìn)行固相提取，以得到多酚部分。抗氧化活性的檢驗(yàn)方法使用下列抗氧化活性的檢驗(yàn)方法。
在一緊緊塞好的試管中，將5ml堿溶液(含4％亞油酸的乙醇)與4ml磷酸鹽緩沖液(pH＝7.0)和1ml樣品溶液混合。在光屏蔽下，將試管保持于50℃恒溫箱中。在相同條件下，也放置一含用乙醇代替亞油酸的試管(對(duì)照樣)和含樣品溶劑代替樣品的試管(空白樣)。
在貯存期間，隨時(shí)間的流逝采集反應(yīng)混合物的樣品，以便用異硫氰酸鹽方法(硫氰酸鐵法)定量地測定所形成的過氧化物的量。
檢測結(jié)果檢測未成熟富士蘋果提取物和成熟富士蘋果提取物的抗氧化活性。
將上述兩種提取物以1-1,000μl/g(亞油酸)的濃度分別加到反應(yīng)系統(tǒng)中。加入一星期后，測量形成的過氧化類脂的量(在500nm處的吸收度)。圖2中列出了其與加入的提取物濃度的關(guān)系。
如圖2所示，在未成熟的“富士”提取物和成熟的“富士”提取物中均可見到對(duì)亞油酸的抗氧化活性，但在未成熟“富士”提取物中，該活性更高。
接著，為了研究哪些物質(zhì)具有抗氧化活性用Sep-pack C18將未成熟的“富士”提取物和成熟的“富士”提取物分別大致分成兩部分，即部分A(非吸附的部分)和部分B(吸附的部分，多酚部分)。以1-1,000μl/g(亞油酸)的濃度，將提取物、部分A和部分B各自獨(dú)立地加到反應(yīng)系統(tǒng)中。加入一星期后，測量所形成的過氧化類脂的量(在500nm處的吸收度)。圖3中列出了它與提取物或部分A或B的量的關(guān)系。
從圖3中可以清楚地看出，成熟“富士”蘋果提取物的抗氧化活性是以提取物的部分B為基礎(chǔ)的。在未成熟“富士”蘋果的提取物中，部分A和部分B均具有抗氧化活性，但部分B的活性更高。
上述情況表明，成熟和未成熟“富士”蘋果提取物的抗氧化活性主要取決于存在于部分B中的化合物，即存在于部分B中的多酚化合物。
在蘋果中所含的簡單多酚化合物中，測量了市售的那些化合物的抗氧化活性。以0.2μM/g(亞油酸)的濃度將每種上述化合物加到反應(yīng)系統(tǒng)中。加入一星期后，測量所形成的過氧化類脂的量(在500nm處的吸收度)。圖4列出了各種多酚化合物加入一個(gè)星期后的吸收度。
圖4中，除上述多酚外，還包括對(duì)比物質(zhì)，即三種已知的抗氧化劑(BHA、BHT和維生素E)以及存在于上述部分A中的典型化合物(奎尼酸、蘋果酸和γ-氨基丁酸(GABA)]。
結(jié)果，在所述多酚化合物中，六種化合物(咖啡酸、綠原酸、(+)-兒茶素、(-)-表兒茶素、五羥黃酮和蕓香苷(五羥黃酮-3-rha)]具有與BHA和BHT相同的抗氧化活性。然而，象對(duì)香豆酸、根皮素和根皮苷這類多酚沒有抗氧化活性。此外，存在于部分A中的化合物不具有任何抗氧化活性。
通過(1)蘋果中存在的所述化合物的量和(2)其抗氧化活性之間的比較，可以判斷，未成熟蘋果提取物和未成熟蘋果汁所表現(xiàn)出的高抗氧化活性主要來源于綠原酸、(＋)-兒茶素和(－)-表兒茶素。
通過上述可證實(shí)，未成熟“富士”蘋果具有高抗氧化活性。此外，鑒定了表現(xiàn)所述活性，且存在于未成熟“富士”蘋果中的化合物。
繼而，還研究了除未成熟“富士”外的未成熟蘋果是否具有相同的抗氧化活性。
從各種未成熟蘋果(富士、Tugaru、Jonagold、Hokuto和Ohrin)的提取物分別制備部分B(多酚部分)。以1-500μl/g(亞油酸)的濃度將各部分加到反應(yīng)系統(tǒng)中。加入一星期后，測量所形成的過氧化類脂的量(在500nm處的吸收度)。圖5中列出了它與所加入部分的濃度的關(guān)系。圖5中，也包括未成熟“富士”的結(jié)果以進(jìn)行比較。
結(jié)果，每種蘋果均表現(xiàn)出高抗氧化活性，并且在蘋果種類之間在抗氧化活性方面基本上沒有差別。
此外，還研究了除未成熟蘋果外的其它未成熟果實(shí)的抗氧化活性。
從各種未成熟果實(shí)(富士蘋果，Hohsui梨和Akatuki桃)的提取物分別制備部分B(多酚部分)。以1-500μl/g(亞油酸)的濃度將各部分加到反應(yīng)系統(tǒng)中。加入一星期后，測量所形成的過氧化類脂的量(在500nm處的吸收度)。圖6中列出了它與所加入部分的濃度的關(guān)系。
結(jié)果，未成熟桃具有與未成熟蘋果大約相同的抗氧化活性，而未成熟梨具有相當(dāng)高的抗氧化活性，盡管該活性低于未成熟蘋果的活性。實(shí)施例3存在于未成熟果實(shí)中的多酚的ACE(血管緊張肽轉(zhuǎn)化酶I)抑制活性起始材料使用下列起始材料。
未成熟蘋果與實(shí)施例2中所用的相同。
樣品的制備用與實(shí)施例2中相同的方法制備“提取樣品”和“多酚部分”。ACE抑制活性的檢驗(yàn)方法用常規(guī)方法進(jìn)行ACE抑制活性的檢驗(yàn)。
將樣品溶液加到市售的ACE溶液中以進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)；然后，加入Bz-Gly-His-Leu作為底物以引起反應(yīng)；用鄰苯二醛標(biāo)記由該反應(yīng)形成的His片段；然后測量所得溶液的熒光強(qiáng)度(Ex.360nm，Em.490nm)。
用下列公式表達(dá)樣品溶液的ACE抑制活性{1－(S－SB)/(C－CB)}×100(％)其中S檢驗(yàn)溶液的熒光強(qiáng)度，C對(duì)比溶液的熒光強(qiáng)度，其中用水代替樣品，SBS空白樣的熒光強(qiáng)度(空白樣含有代替酶的水)，和CBC空白樣的熒光強(qiáng)度(空白樣含有代替酶的水)。檢測結(jié)果用Sep-pak C18將未成熟“富士”蘋果提取物和成熟“富士”蘋果提取物分別分成未吸附的部分(部分A)和多酚部分(部分B)，測量每部分的ACE抑制活性。圖7中列出了結(jié)果。
結(jié)果，在未成熟和成熟蘋果中，部分B均表示出高的ACE抑制活性。特別是，未成熟蘋果的部分B表現(xiàn)出100％的抑制作用。為了更詳細(xì)地比較未成熟和成熟蘋果的部分B的ACE抑制活性，在改變加到上述反應(yīng)系統(tǒng)中的每種部分B的量時(shí)，檢測兩種部分B的ACE抑制活性的改變。結(jié)果列于圖8。
結(jié)果，成熟蘋果部分B的表現(xiàn)50％抑制作用的濃度，即IC50為約3μl。相反，未成熟蘋果部分B的IC50為0.1μl或更低。因此，未成熟蘋果的部分B表現(xiàn)出很高的ACE抑制活性。
在除富士的各種蘋果中也觀察到了未成熟蘋果的高ACE抑制活性。
如上述所看到的那樣，未成熟蘋果含有具高ACE抑制活性的化合物，而該化合物是多酚。隨便提一句，未成熟梨和未成熟桃的ACE抑制活性比未成熟蘋果的低。
接著，測量存在于未成熟蘋果中并且作為純產(chǎn)品容易得到的各種簡單多酚的ACE抑制活性，具體地說，以各種濃度將各多酚加到反應(yīng)系統(tǒng)中，然后檢測所述多酚的ACE改善活性的改變。結(jié)果列于圖9。
圖9包括茶兒茶素類(已知茶兒茶素類具有ACE抑制活性)的ACE抑制活性以用于比較。圖9中，(-)-棓酸表?xiàng)攦翰杷?EGCg)和(-)-棓酸表兒茶素(ECg)的IC50值分別為0.3mM和2mM，且它們有高的ACE抑制活性。據(jù)報(bào)道，GABALONG茶(日本茶商用的一個(gè)商標(biāo)名)，其中，通過加工提高GABA濃度，在使用SHRs(自發(fā)性的高血壓大鼠)的試驗(yàn)中表現(xiàn)出降血壓活性，但在本試驗(yàn)中，GABA沒有表現(xiàn)出ACE抑制活性。
同時(shí)，存在于未成熟蘋果中的多酚在高濃度時(shí)，表現(xiàn)出ACE抑制活性。但其IC50值很低，并且甚至對(duì)于表現(xiàn)出最高活性的五羥黃酮，IC50也只有約5mM那樣低。因此，未成熟蘋果多酚表現(xiàn)出遠(yuǎn)低于EGCg和ECg的ACE抑制活性。
因此，以存在于未成熟蘋果部分B中的所有多酚均為EGCg這一假設(shè)為基礎(chǔ)，用EGCg的校準(zhǔn)曲線計(jì)算存在于部分B中的總多酚量。該量約為15,000ppm，計(jì)算出部分B中的多酚濃度以EGCg計(jì)為33.82mM。用該計(jì)算值，在圖9中描制出部分B的活性曲線，該曲線表明部分B具有比EGCg高的ACE抑制活性(IC50＝0.2mM)。實(shí)際上，部分B既不含EGCg也不含ECg，且如上所述，未成熟蘋果中的簡單多酚沒有顯著的ACE抑制活性。圖9中觀察到的未成熟蘋果部分B的高ACE抑制活性被認(rèn)為是由于部分B中共存有其它未鑒定的多酚。實(shí)施例4鑒定存在于未成熟蘋果多酚中的ACE抑制化合物樣品用與實(shí)施例3中相同的方法得到未成熟“富士”蘋果提取物，然后使該提取物經(jīng)固相提取以得到多酚部分。用該多酚部分作為下列的樣品。檢驗(yàn)方法將樣品溶液裝入Sephadex LH-20柱。用蒸餾水洗滌該柱。然后，以先用20-60％甲醇(用HCl酸化)，然后用70％丙酮(用HCl酸化)這樣的順序進(jìn)行洗脫以得到多酚部分。
使所得的多酚部分分別經(jīng)HPLC進(jìn)行組分分析，測量總酚并檢驗(yàn)ACE抑制活性。按需要也可測量吸收光譜并進(jìn)行凝膠滲透色譜(gelpermeation chromato graphy)。檢驗(yàn)結(jié)果用Sephadex LH-20柱進(jìn)行分級(jí)分離，以便分離其它多酚樣品中具有ACE抑制作用的化合物。使由洗脫得到的各部分經(jīng)HPLC進(jìn)行簡單多酚的組分分析及ACE抑制試驗(yàn)。若60％甲醇作為洗脫液通過該柱時(shí)，可洗脫所有的簡單多酚。同時(shí)，所有的具有ACE抑制作用的化合物均在下一種洗脫液，即70％丙酮中。
將上面得到的具有ACE抑制作用的化合物進(jìn)行蒸餾以除去溶劑。將剩余物冷凍干燥以得到粉末狀的具有ACE抑制作用的化合物。所述化合物易溶于水(溶液為橙色)且100ml多酚部分(部分B)的產(chǎn)量為約0.7g。
將上述粉末溶解于水中，并用分光光度計(jì)測量溶液的吸收光譜。結(jié)果示于圖10。
所得光譜在280nm處具有最大的吸收度，且形狀與(+)-兒茶素或(-)-表兒茶素的相似。將上述溶液在120℃高壓滅菌處理10分鐘。處理過程中，溶液變紅，認(rèn)為花色素已形成。這些結(jié)果有力地說明上述具有ACE抑制作用的化合物是已知為縮合鞣質(zhì)的原花青素類(procyanidins)(兒茶素類的規(guī)則聚合物)。從Sephadex LH-20柱的洗脫情況和HPLC的洗脫情況看，估計(jì)所述化合物不是二聚物之類(如原花青素B2)的聚合物而是更高的聚合物。
因此，用GPC測量具ACE抑制作用的化合物的分子量。一般認(rèn)為用GFC(凝膠過濾色譜法)在含水系統(tǒng)(在含水系統(tǒng)中GFC通常用于蛋白質(zhì)等)中測量多酚化合物的分子量很困難，因?yàn)槎喾踊衔镆允杷I或氫鍵的形式，與柱中的填料有很強(qiáng)的親和力。因此，用吡啶/乙酐將每個(gè)具有ACE抑制作用的化合物中的酚羥基乙?；员闶姑總€(gè)所得物質(zhì)溶于有機(jī)溶劑中，并在有機(jī)溶劑(THF)中，使所得物質(zhì)進(jìn)行GPC分析。結(jié)果示于圖11。
在圖11中，色譜上有一個(gè)單寬的峰。通過使用聚苯乙烯同時(shí)制備的分子量校準(zhǔn)曲線，計(jì)算出具有ACE抑制作用的化合物的平均分子量為約2,000。
還鑒于本文沒有解釋的其它試驗(yàn)的結(jié)果(如用甲苯-α-硫醇的部分分解、FAB-MS測量)，試驗(yàn)性地估計(jì)出具有ACE抑制作用的化合物的結(jié)構(gòu)式，并示于圖12。
從上文可以判斷出，所述具有ACE抑制活性的化合物屬于縮合鞣質(zhì)類。
測量多酚部分和70％丙酮洗脫液，即使多酚部分經(jīng)Sephadex LH-20分級(jí)分離得到的縮合鞣質(zhì)類部分的總酚量，并將兩個(gè)量進(jìn)行比較。結(jié)果列于表2。
表2總酚量(ppm以兒茶素計(jì))分級(jí)分離前分級(jí)分離后分級(jí)分離前(％)(總多酚) (縮合鞣質(zhì)類) 分級(jí)分離后未成熟的蘋果提取物 22,80010,80047.3成熟的蘋果提取物1,34077057.5從表2中清楚地看出，所述縮合鞣質(zhì)類約占存在于未成熟蘋果中的總多酚的一半，并且是存在于所述多酚中占最大量的組分。
計(jì)算所述縮合鞣質(zhì)類對(duì)ACE的IC50，該值很低(以重量計(jì)，約為EGCg的IC50值的1/10或更低)。因此，本發(fā)明的具有ACE抑制作用化合物有很高的ACE抑制活性。
從上述結(jié)果判斷出，可以用未成熟蘋果的多酚作為有效的ACE抑制藥劑。實(shí)施例5生產(chǎn)未成熟果實(shí)的多酚用壓碎機(jī)將約50Kg的未成熟蘋果(5-10g/蘋果)壓碎，同時(shí)加入適量的SO2，然后用油壓機(jī)壓榨。將約50ppm的果膠溶解酶加到所得的果汁中，將混合物離心或用硅藻土過濾，并進(jìn)一步進(jìn)行精細(xì)微過濾以得到35l的澄清果汁。使澄清的果汁通過用苯乙烯-二乙烯基苯型的工業(yè)用合成吸附劑樹脂(6l)填充的柱子。然后，使6l含0.1％HCl的水通過該柱以除去糖類。此后，使含0.1％HCl的50％的乙醇通過柱子以得到3l含主要多酚的部分。
用蒸發(fā)器減壓濃縮該部分，以得到1.5l濃縮的部分。用噴霧干燥器干燥濃縮的部分以得到228.2g未成熟蘋果的多酚粉末產(chǎn)物。
回收率(％)數(shù)據(jù)如下柱中的回收率95.6％噴霧干燥的回收率93.0％果汁的回收率0.65％
果汁多酚的粉末回收率88.9％實(shí)施例6未成熟果實(shí)多酚的抗誘變活性在該實(shí)施例中，用改進(jìn)的ames方法(Mutation Research，Vol.31，p.347，1975)測量抗誘變活性。起始材料和樣品的制備與實(shí)施例2、3和4中所用的相同。下文將實(shí)施例4中得到的縮合鞣質(zhì)類稱為“蘋果鞣酸”?？拐T變活性的檢驗(yàn)方法將抗誘變化合物[苯并(a)芘或Trp-P-2]溶液與磷酸鹽緩沖液、樣品溶液、S9-mix和沙門氏菌(通過過夜培養(yǎng)鼠傷寒沙門氏菌(Salmonella typhimurium)TA98或TA100而得到的溶液)混合。將混合物于37℃培養(yǎng)2天。計(jì)數(shù)所得的菌落數(shù)。基于以幾何級(jí)數(shù)表達(dá)的換算法，每種多酚的用量為1和300μg/板。用下列公式計(jì)算抗誘變活性抗誘變活性(％)＝{(C－B)－(S－B)}÷(C－B)×100其中S檢測溶液的菌落數(shù)C對(duì)照樣的菌落數(shù)，其中用水代替樣品，和B空白樣的菌落數(shù)，其中用水代替樣品和誘變化合物。結(jié)果圖13和圖14中，分別列出了各種多酚和蘋果鞣酸對(duì)Trp-P-2和苯并[a]芘的抗誘變活性。在圖13和圖14中，縱坐標(biāo)軸表示抗誘變活性(％)，以與空白樣所表現(xiàn)的相同的抗誘變性為100％。橫坐標(biāo)軸表示每板的樣品量。
結(jié)果，蘋果鞣酸抑制各誘變劑的誘變性依賴于蘋果鞣酸的誘變性，且該抑制效果等于或高于棓酸表?xiàng)攦翰杷氐囊种菩Ч?。在本?shí)施例的試驗(yàn)中，約17μg(約合51μg棓酸表?xiàng)攦翰杷?的蘋果鞣酸對(duì)1μgTrp-P-2，約37μg(約合56μg棓酸表?xiàng)攦翰杷?的蘋果鞣酸對(duì)5μg苯并[a]芘均表現(xiàn)出50％的抗誘變活性。即，蘋果鞣酸含有大量強(qiáng)烈抑制誘變劑(致癌劑)的誘變性的化合物。因此，本發(fā)明所得到的水果多酚也是一種很有效的抗誘變藥劑。實(shí)施例7存在于未成熟果實(shí)中的多酚的透明質(zhì)酸酶抑制活性在本實(shí)施例中，測量了透明質(zhì)酸酶抑制活性，以用其作為抗變態(tài)反應(yīng)活性的指示劑。起始材料和樣品的制備與實(shí)施例6中所用的相同。透明質(zhì)酸酶抑制活性的檢驗(yàn)方法以改進(jìn)的J.Biol.，Vol.250，p.79，1975中描述的方法為基礎(chǔ)，進(jìn)行透明質(zhì)酸酶抑制活性的測量。即，將樣品溶液加到市售的透明質(zhì)酸酶溶液中，并進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)。向其中加入一種化合物48/80(組胺釋放劑(histamine releasant))溶液，在37℃將透明質(zhì)酸酶活化。然后加入透明質(zhì)酸溶液作為底物，并進(jìn)行反應(yīng)。
使由上述反應(yīng)產(chǎn)生的N-乙?；咸前方?jīng)Elson-Morgan方法顯色。在586nm處測量該顏色的吸收度。用下列公式計(jì)算透明質(zhì)酸酶抑制活性(％)
透明質(zhì)酸酶抑制活性(％)＝{(C－CB)－(S－SB)}÷(C－CB)×100其中S檢測溶液的吸收度C對(duì)照樣的吸收度，其中用緩沖液代替樣品SBS空白樣的吸收度(空白樣不含酶)，和CBC空白樣的吸收度(空白樣既不含樣品也不含酶)。結(jié)果圖15列出了各種水果提取物的透明質(zhì)酸酶抑制活性，圖16列出了色甘酸鈉和蘋果鞣酸的透明質(zhì)酸酶抑制活性。
結(jié)果，各種水果提取物和蘋果鞣酸均表現(xiàn)出其濃度依賴性的透明質(zhì)酸酶抑制活性。圖16中，列出了色甘酸鈉的透明質(zhì)酸酶抑制活性作為對(duì)比。色甘酸鈉的IC50(表現(xiàn)出50％抑制作用的濃度)約為0.051mg/ml，而蘋果鞣酸的IC50為約0.086mg/ml并與色甘酸鈉的IC50相近。
因此，該多酚(蘋果鞣酸)含有大量抑制透明質(zhì)酸酶(與I型變態(tài)反應(yīng)有關(guān)的酶)活性的化合物。因此，本發(fā)明所得到的水果多酚也是一種非常有效的抗變態(tài)反應(yīng)藥劑。實(shí)施例8存在于未成熟水果中的多酚的葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶抑制活性在本實(shí)施例中研究了水果多酚對(duì)GTase[該酶由蔗糖產(chǎn)生不可溶的葡聚糖，且是由S.sobrinus(一種典型的防齲菌)產(chǎn)生的]的抑制活性。起始材料和樣品的制備與實(shí)施例6和7中所用的相同。所用的細(xì)菌Streptococcus sobrinus ATCC 33478GTase的制備按如下制備S.sobrinus的GTase。
將S.sobrinus在TTY培養(yǎng)基[Agric.Biol.Chem.，54(11)，PP.2925-2929，1990]中于37℃培養(yǎng)18小時(shí)。進(jìn)行離心以除去細(xì)菌細(xì)胞并得到上層清液。向該上層清液中加入硫酸銨至50％飽和。然后，進(jìn)行離心以回收所得的沉淀。將沉淀再溶于0.05M磷酸鹽緩沖液(pH6.5)中。用相同的緩沖液將所得溶液滲析。滲析液中的GTase用羥磷灰石色譜法純化并分離。用約0.4M磷酸鹽緩沖液洗脫該GTase(能形成不可溶的葡聚糖)。用含GTase的洗脫液進(jìn)行下列試驗(yàn)。檢驗(yàn)GTase抑制活性的方法將純化的GTase溶液和樣品溶液加到1ml底物溶液(含2％蔗糖、0.1％疊氮化鈉和40μM葡聚糖T10的0.1M磷酸鹽緩沖液)中。加水稀釋以達(dá)到2ml的總體積。使所得溶液在37℃反應(yīng)18小時(shí)。按在550nm處的吸收度所表達(dá)的濁度，測量由該反應(yīng)形成的不可溶葡聚糖的量，并用下列公式計(jì)算不可溶葡聚糖的形成率(％)。
不可溶葡聚糖的形成率(％)＝(SS－SB)÷(CS－CB)×100其中SS樣品的吸收度SB樣品空白樣的吸收度(該空白樣不含酶)，CS對(duì)照樣的吸收度(不含樣品)，和CB對(duì)照樣的空白樣的吸收度(該空白樣不含樣品且不含酶)。結(jié)果圖17列出了各水果提取物的多酚部分的GTase抑制活性，圖18列出了各多酚化合物的GTase抑制活性。在圖17和18中，縱坐標(biāo)軸表示不可溶葡聚糖的形成率(％)，認(rèn)為對(duì)照樣(不含樣品)的形成率(％)為100％。橫坐標(biāo)軸表示加到反應(yīng)系統(tǒng)中的樣品或多酚的量(體積或濃度)。
如圖17所示，各種水果提取物的多酚部分，特別是未成熟“富士”蘋果和未成熟“Niitaka”梨的多酚部分表現(xiàn)出顯著的GTase抑制活性。成熟“富士”蘋果對(duì)GTase的IC50為約50μl，而未成熟“富士”蘋果對(duì)GTase的IC50為約0.7μl。因此，未成熟蘋果具有比成熟蘋果高約70倍的GTase抑制活性。
接著研究包括蘋果中所存在的各種多酚化合物的GTase抑制活性。如圖18所示，在蘋果中所存在的多酚化合物中，綠原酸和根皮苷各自具有很低的GTase抑制活性。同時(shí)，兒茶素類，表兒茶素單體具有很低的GTase抑制活性，但由估計(jì)的圖12的結(jié)構(gòu)式所代表的高分子表兒茶素聚合物(表明為圖18中的蘋果鞣酸)有高的GTase抑制活性。圖18中也列出了棓酸表兒茶素(一種綠茶中所存在的典型的兒茶素并已知為一種GTase抑制物質(zhì))[Agric.Biol.Chem.，5(11)，pp.2925-2929，1990；Chem.Pharm，Bull.，38(39)，pp，717-720，1990]的結(jié)果。用圖18所作的計(jì)算，棓酸表兒茶素對(duì)GTase的IC50為約200ppm，而蘋果鞣酸對(duì)GTase的IC50為約2ppm。因此，蘋果鞣酸有比棓酸表兒茶素高約100倍的GTase抑制活性。從這些結(jié)果，認(rèn)為圖17中所看到的未成熟“富士”蘋果的高GTase抑制活性是歸因于蘋果鞣酸的存在。
因此，本發(fā)明所得到的水果多酚含有高GTase抑制活性的化合物，因而也是一種很有效的防齲藥劑。
權(quán)利要求
1.一種經(jīng)壓榨和/或提取薔薇科的未成熟果實(shí)，然后純化所得的果汁或提取物而得到的水果多酚。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的水果多酚，其中薔薇科的未成熟果實(shí)是蘋果、梨或桃。
3.一種生產(chǎn)水果多酚的方法，該方法包含壓榨和/或提取薔薇科的未成熟果實(shí)，然后純化所得的果汁或提取物以得到多酚部分。
4.根據(jù)權(quán)利要求3的方法，其中薔薇科的未成熟果實(shí)是蘋果、梨或桃。
5.一種抗氧化劑，它包含作為有效組分的通過壓榨和/或提取薔薇科的未成熟果實(shí)，然后純化所得的果汁或提取物而得到的水果多酚。
6.根據(jù)權(quán)利要求5的抗氧化劑，其中薔薇科的未成熟果實(shí)是蘋果、梨或桃。
7.一種降血壓藥劑，它包含作為有效組分的具有血管緊張肽轉(zhuǎn)化酶I抑制活性的水果多酚，該多酚是通過壓榨和/或提取薔薇科的未成熟果實(shí)，然后純化所得的果汁或提取物而得到的。
8.根據(jù)權(quán)利要求7的降血壓藥劑，其中薔薇科的未成熟果實(shí)是蘋果、梨或桃。
9.一種抗誘變劑，它包含作為有效組分的具有突變抑制活性的水果多酚，該多酚是通過壓榨和/或提取薔薇科的未成熟果實(shí)，然后純化所得的果汁或提取物而得到的。
10.根據(jù)權(quán)利要求9的抗誘變劑，其中薔薇科的未成熟果實(shí)為蘋果、梨或桃。
11.一種抗變態(tài)反應(yīng)藥劑，它包含作為有效組分的具有透明質(zhì)酸酶抑制活性的水果多酚，該多酚是通過壓榨和/或提取薔薇科的未成熟果實(shí)，然后純化所得的果汁或提取物而得到的。
12.根據(jù)權(quán)利要求11的抗變態(tài)反應(yīng)藥劑，其中薔薇科的未成熟果實(shí)為蘋果、梨或桃。
13.一種防齲藥劑，它包含作為有效組分的具有葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶抑制活性的水果多酚，該多酚是通過壓榨和/或提取薔薇科的未成熟果實(shí)，然后純化所得的果汁或提取物而得到的。
14.根據(jù)權(quán)利要求13的防齲藥劑，其中薔薇科的未成熟果實(shí)為蘋果、梨或桃。
全文摘要
本發(fā)明提供了通過壓榨和/或提取薔薇科的未成熟果實(shí)，然后純化所得的果汁或提取物而得到的水果多酚。本發(fā)明還提供了各自包含以經(jīng)壓榨和/或提取薔薇科的未成熟果實(shí)，然后純化所得的果汁或提取物而得到的水果多酚作為有效組分的抗氧化劑、降血壓藥劑、抗誘變劑、抗變態(tài)反應(yīng)藥劑和防齲藥劑。本發(fā)明的水果多酚具有各種生理學(xué)活性，如抗氧化活性、ACE抑制活性、抗誘變活性、透明質(zhì)酸酶抑制活性及GTase抑制活性。
文檔編號(hào)A61P39/06GK1121924SQ94115048
公開日1996年5月8日 申請(qǐng)日期1994年8月18日 優(yōu)先權(quán)日1993年12月6日
發(fā)明者田邊正行, 神田智正, 柳田顯郎 申請(qǐng)人:日加威士己株式會(huì)社