專利名稱：水溶性喜樹堿類似物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及水溶性喜樹堿的類似物，包含抑制腫瘤細(xì)胞所需量的這種類似物的藥物組合物，以及在需用這種藥物的動物體內(nèi)抑制對這種類似物敏感的腫瘤細(xì)胞的生長的方法。
真核細(xì)胞內(nèi)的DNA螺旋結(jié)構(gòu)帶來了一些局部解剖學(xué)的問題，細(xì)胞組織必須破裂以便用其遺傳物質(zhì)作為一種模板。DNA鏈的分離對細(xì)胞演變過程諸如DNA復(fù)制和轉(zhuǎn)錄是十分重要的。由于真核DNA是通過染色體蛋白組成染色質(zhì)，所以其末端被束縛，如果不借助于各種改變解剖學(xué)的酶的幫助，其兩條鏈不能解鏈。長期以來人們已認(rèn)識到，沿著DNA螺旋的轉(zhuǎn)錄或復(fù)制復(fù)合體的增長通過一個轉(zhuǎn)點(diǎn)而變得方便，轉(zhuǎn)點(diǎn)解除了這些過程中產(chǎn)生的扭轉(zhuǎn)張力。局部異構(gòu)酶就是能夠改變真核細(xì)胞中DNA解剖學(xué)的酶。這些酶對各種重要的細(xì)胞功能和細(xì)胞增生是井然有序的。
在真核細(xì)胞中存在有兩種類型的局部異構(gòu)酶，類型Ⅰ和類型Ⅱ。局部異構(gòu)酶Ⅰ是分子量大約為100，000的單體酶。該酶與DNA相連接導(dǎo)致一種暫時的單鏈斷裂，使雙螺旋解鏈(或允許其解鏈)，隨后在脫離DNA鏈前斷裂口重新修復(fù)。
局部異構(gòu)酶Ⅱ是由兩個相同的分子量為170，000的亞單元組成。局部異構(gòu)酶Ⅱ使兩條螺旋鏈暫時斷裂并使另一個雙鏈段通過該斷裂口。
喜樹堿是從中國特有的Camptothecaaccuminata(喜樹)樹和印度特有的Nothapodytesfoetida樹中得到的一種水不溶的細(xì)胞毒生物堿。喜樹堿和其幾種相近的同類物是唯一已知能抑制局部異構(gòu)酶Ⅰ的一類化合物。
重要的商業(yè)用溶瘤細(xì)胞劑如足葉乙甙(etoposide)阿霉素(doxorubicin)和mitoxantrone，以及其它在發(fā)展的溶瘤細(xì)胞劑的主要目標(biāo)是抑制局部異構(gòu)酶Ⅱ。喜樹堿(和它的已知同類物)對局部異構(gòu)酶Ⅱ沒有任何作用，而已知的局部異構(gòu)酶Ⅱ抑制劑中沒有一種對局部異構(gòu)酶Ⅰ有任何明顯的作用。
由于臨床效果不佳，不可接受的劑量限定的毒性，不可預(yù)期毒性，水溶性不好和/或不可接受的儲存期限的穩(wěn)定性，人們還沒有證明喜樹堿和它的已知的局部異構(gòu)酶Ⅰ抑制同類物作為溶瘤細(xì)胞劑對臨床藥物發(fā)展具有吸引力。因此，需要有一種能避免喜樹堿和其它已知的有關(guān)局部異構(gòu)酶Ⅰ抑制同類物的不期望性質(zhì)的局部異構(gòu)酶Ⅰ抑制劑。本發(fā)明的化合物能滿足這一需要。
本發(fā)明涉及式(Ⅰ)化合物或其可藥用的鹽，水合物或溶劑合物
其中X為羥基;氫;氰基;-CH2NH2或甲?；?
R為氫(當(dāng)X為氰基時);CH2NH2或甲酰基;
或者R為-CHO或-CH2-R1(當(dāng)X為氫或羥基時);
R1為-O-R2;-S-R2;-N-R2(R3);或-N+-R2(R3)(R4)，但如果R1為-N+-R2(R3)(R4)，該化合物就可與一個可藥用的負(fù)離子相結(jié)合。
R2，R3和R4是相同或不同的，且選自H;C1-6烷基;C2-6羥烷基;C1-6二烷基氨基;C1-6二烷基氨基-C2-6烷基;C1-6烷基氨基-C2-6烷基;C2-6氨基烷基或一個3-7元未取代或取代的碳環(huán);而當(dāng)，R為-N-R2(R3)時，R2和R3可以同時接到同一個氮原子上形成一個取代的或未取代的雜環(huán)，該雜環(huán)可以含有其它雜原子。
本發(fā)明也涉及下式化合物
式(Ⅱ)化合物用于制備式(Ⅰ)化合物，術(shù)語“碳環(huán)”是指一個完全飽和的，部分飽和的或完全不飽和的環(huán)系。
較好的式(Ⅰ)化合物包括這些化合物，其中當(dāng)X為羥基時，R為二甲基氨基甲基，N-嗎啉基甲基，N-甲基哌嗪基甲基，(4′-哌啶)N-哌啶基甲基，(2′-羥乙基)氨基甲基，三甲基銨甲基，環(huán)己基氨基甲基，N-甲基苯胺基甲基，乙氧基甲基，環(huán)丙基氨基甲基，N，N-二甲基氨基乙氧基甲基，N，N-二甲基氨基乙硫基甲基，N，N-二甲基氨基乙基氨基甲基，氰基甲基，氨基乙基或甲?；］^好的式(Ⅰ)化合物也包括這些化合物，其中當(dāng)R為氫時，X為氰基，甲?；虬被谆?，其它較好的式(Ⅰ)化合物為這些化合物，其中X為氫，而R為二甲基氨基甲基或N-嗎啉基甲基。特別好的是其中R為二甲基氨基甲基的式(Ⅰ)化合物，尤其是其S-異構(gòu)體。
本發(fā)明還涉及一種藥物組合物，其中包含一個有效的，腫瘤細(xì)胞生長抑制量的式(Ⅰ)化合物和一種惰性可藥用載體或稀釋劑。
本發(fā)明也涉及抑制對式(Ⅰ)化合物敏感的腫瘤細(xì)胞生長的方法，其中包括給受所述腫瘤細(xì)胞之害的動物(包括人)服以有效的，腫瘤細(xì)胞生長抑制量的這種化合物。
我們知道，由于式(Ⅰ)化合物的E環(huán)上的不對稱碳原子(即20號碳原子)，化合物將出現(xiàn)光學(xué)異構(gòu)體。較好的異構(gòu)體是S-異構(gòu)體，但R-異構(gòu)體和外消旋混合物(外消旋物)也包括在式(Ⅰ)化合物的范圍內(nèi)。
可藥用的鹽和它們的制備，對本專業(yè)技術(shù)人員是熟知的。較好的式(Ⅰ)化合物的可藥用鹽包括醋酸鹽，甲烷磺酸鹽和鹽酸鹽諸如單和二鹽酸鹽，以及式(Ⅰ)化合物的堿金屬鹽如鈉鹽，其E環(huán)內(nèi)酯經(jīng)受了堿的水解。
可藥用的季銨鹽中的負(fù)離子對本專業(yè)技術(shù)人員是熟知的。其中R1為-N+-R2(R3)(R4)的式(Ⅰ)化合物的較好的可藥用的鹽包括甲烷磺酸鹽和氯化物。
式(Ⅰ)化合物可以形成水合物或溶劑化物。本技術(shù)領(lǐng)域?qū)I(yè)人員都知道，荷電化合物與水冷凍干燥時形成水合物，或在溶液中濃縮時與合適的有機(jī)溶劑形成溶劑化物。
式(Ⅱ)化合物可以按照概括在實施例22中的方法制備。
式(Ⅰ)化合物可以經(jīng)過Mannich反應(yīng)從10-羥基喜樹堿制備。10-羥基喜樹堿與甲醛和一級或二級胺縮合(Mannich反應(yīng))得到了除化合物(其中X為氫，氰基或甲?；琑1為-N-R2(R3)，而R2和R3相同，并都為氫)以外的所有式(Ⅰ)化合物?；蛘撸蓪?0-羥基喜樹堿進(jìn)行甲?；?Duff反應(yīng))，得到9-甲?；?10-羥基喜樹堿，然后與胺縮合，再進(jìn)行氰基硼氫化鈉化學(xué)還原或催化還原(Pd/C，H2)，得到與經(jīng)由Mannich反應(yīng)相似的產(chǎn)物，以及其中R1為-N-R2(R3)而R2和R3一樣且都為H的化合物。R1為-N+-R2(R3)(R4)而R2，R3和R4不是氫的式(Ⅰ)化合物通過用烷基化試劑處理其中R1為-N-R2(R3)的相應(yīng)的式(Ⅰ)化合物制備。本Mannich反應(yīng)由Magarian等人公開發(fā)表，J.Pharm.Sci.，56，987(1967)。Duff反應(yīng)由Duff等人公開發(fā)表，J.Chem.Soc.，547(1941)。
R1為O-R2或S-R2的式(Ⅰ)化合物可以通過在惰性溶劑如二甲基甲酰胺中將9-二甲基氨基甲基-10-羥基喜樹堿或它的鹽與合適的醇或硫醇加熱而制備。當(dāng)使用游離堿時，加入少量強(qiáng)酸如鹽酸。當(dāng)Mannich反應(yīng)混合物中存在有醇或硫醇，并加入了強(qiáng)酸時，或胺組分處于強(qiáng)酸鹽形式時，也可以直接地從Mannich反應(yīng)混合物中得到這些衍生物。
X為氫、氰基、甲?；虬被谆氖?Ⅰ)化合物可以通過鈀催化羰基化反應(yīng)從式(Ⅱ)化合物制備。三氟甲磺酸芳基酯(aryltriflates)的鈀催化羰基化反應(yīng)，發(fā)表在下述文獻(xiàn)中Cacchi等人，TetrahedronLetters，27，3931，5541，(1986);Petrakis等人，J.Amer.Chem.Soc.，109，2831(1987)及Chatani等人，J.Org.Chem.，51，4714(1986)。
制備式(Ⅰ)化合物的起始原料，即10-羥基喜樹堿，是一種與喜樹堿存在于同一植物的天然產(chǎn)物〔參見Wani等人，J.Org.Chem.，34，1364(1969)〕。已經(jīng)從喜樹堿存在的植物中分離出了10-甲氧基喜樹堿，并且通過與氫溴酸回流可以將其轉(zhuǎn)化成10-羥基喜樹堿。喜樹堿本身也可以通過先還原其吡啶環(huán)，再用四醋酸鉛氧化而轉(zhuǎn)化成10-羥基喜樹堿〔參見YakultHonshaK.K.，于1982年6月30日提出的日本專利申請9005188〕。外消旋的10-羥基喜樹堿也可以按Wani等人的方法制備，J.Med.Chem.，23，554(1980)。有關(guān)喜樹堿的許多合成方法已有報導(dǎo)。參見如Hutchinson，Tetrahedron，37，1047(1981)及Suffness和Coldel的綜述，“TheAlkaloids.ChemistryandPharmacology”，Brossi，A.，Vol.25，AcademicPress，OrlandoFloride，73(1985)。生產(chǎn)在20位碳原子外消旋的喜樹堿的最實用的路線(在下文稱作Wani路線)由Wani等人作了描述，J.Med.Chem.，23，554(1980)。式(Ⅰ)化合物的應(yīng)用a細(xì)胞毒性R為二甲基氨基甲基的式(Ⅰ)化合物的醋酸鹽(S異構(gòu)體)(下文中稱作“化合物1S”)在各種培養(yǎng)細(xì)胞系上顯示出很強(qiáng)抗增生活性(表1)。在八種體外培養(yǎng)的人結(jié)腸腫瘤細(xì)胞系系列中，化合物1S的細(xì)胞毒性效能是非常一致的。當(dāng)短暫暴露于藥物時(2小時)，50%抑制的濃度范圍為0.12-2.1μg/ml，如果使藥物在培養(yǎng)基中保留整整七天，在此期間細(xì)胞會發(fā)生增生的，這時IC50值的范圍為3.9-75ng/ml。
三株嚙齒動物腫瘤細(xì)胞系和兩株“正?！眹X動物細(xì)胞系對化合物1S的敏感性也進(jìn)行了評價。用在人結(jié)腸腫瘤細(xì)胞試驗中所用的終點(diǎn)同樣的試驗，對K12/Tr大鼠結(jié)腸癌和大鼠腎和腸上皮細(xì)胞系進(jìn)行了評價。這些嚙齒動物細(xì)胞與最不敏感的人結(jié)腸腫瘤細(xì)胞系CACO-2和WIDR在敏感性方面是相似的。小鼠腫瘤細(xì)胞系L1210白血病和B16黑色素瘤，對于化合物1S不比人直腸腫瘤細(xì)胞系更敏感。事實上，B16黑色素瘤細(xì)胞系似乎比所試驗的其它細(xì)胞系敏感性小得多。值得注意，B16和L1210在帶瘤小鼠體內(nèi)治療試驗中對化合物1S都是非常敏感的。
用于評價表1所列的細(xì)胞系對化合物1S的細(xì)胞毒性的方案一般如下細(xì)胞系以單層培養(yǎng)物形式使用和保存在最小必需培養(yǎng)基(GrandIslandBiologicalCo.，GrandIsland，N.Y.)中，該最小必需培養(yǎng)基補(bǔ)充10%胎牛血清，保存在含5%CO2的濕潤的37℃培養(yǎng)箱中。在無菌條件下使各種濃度的式(Ⅰ)化合物反應(yīng)2小時，接著吸出介質(zhì)，或連續(xù)暴露在其中。將平皿于37℃在CO2培育箱中培育7天。吸出介質(zhì)，固定細(xì)胞并用乙醇和Geisma染劑染色。用一個影像分析器掃描平皿來測定存活細(xì)胞密度。相對于沒有藥物存在時培育的細(xì)胞，測定增生百分抑制，而50%抑制濃度(IC50)用內(nèi)插法測定。
表1化合物1S對培養(yǎng)物中腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒性細(xì)胞系 IC50(μg/ml)2小時暴露持續(xù)暴露人結(jié)腸腫瘤細(xì)胞系SW-6200.120.0065SKCO-10.230.0039SW-9480.260.016DLD-10.440.015LOVO0.580.0097HT-290.580.016CACO-21.70.075WIDR2.10.025嚙齒動物腫瘤細(xì)胞系L1210白血病1.4n.d.
K12/Tr結(jié)腸癌3.90.084B16黑色素瘤n.t.*0.62嚙齒動物"正常"細(xì)胞系NRK52E鼠腎上皮1.20.052IEC-6鼠腸上皮3.90.017＊n.t.＝未試驗對各種式(Ⅰ)化合物對生長在懸浮液培養(yǎng)物中的L1210白血病細(xì)胞的細(xì)胞毒性進(jìn)行了評價，(表2)將細(xì)胞持續(xù)暴露，無性繁殖于含0.2%Noble瓊脂的培養(yǎng)基。于37℃在CO2培育箱培育3天后，用能使特異細(xì)胞存活的formazan染劑給菌落染色，24小時后，用調(diào)節(jié)得可鑒定含50個細(xì)胞以上的菌落的菌落記數(shù)器(Biotran Ⅱ，New Brunswick Scientific Co.，Edison，NJ)記數(shù)。用內(nèi)插法測定降低50%單細(xì)胞無性生殖效能的濃度(IC50)。式(Ⅰ)化合物的IC50值為12-690nM，即表示細(xì)胞毒活性的IC50值。有關(guān)的天然產(chǎn)物10-羥基喜樹堿的IC50為18nM。式(Ⅰ)細(xì)胞毒化合物是純化的局部異構(gòu)酶Ⅰ的強(qiáng)抑制。劑正如下述有關(guān)體內(nèi)活性的部分表明的，許多式(Ⅰ)化合物，盡管一般不如10-羥基喜樹堿細(xì)胞毒性高，但它們在體內(nèi)對L1210白血病具有抗腫瘤活性，這種活性等于或者高于10-羥基喜樹堿。例如，化合物1S就體外對L1210白血病細(xì)胞的細(xì)胞毒性效能而言，比10-羥基喜樹堿低約3倍，但它顯示出體內(nèi)腫瘤細(xì)胞生長抑制活性，這種活性在各種嚙齒動物可移植的腫瘤模型中高于10-羥基喜樹堿。

b.體內(nèi)腫瘤細(xì)胞生長抑制最初，用腹膜內(nèi)(ip)植入L1210白血病的小鼠來評價式(Ⅰ)化合物體內(nèi)抗腫瘤活性?；衔?S和化合物4S-13S在各自的最大耐受劑量水平使患腫瘤的小鼠壽命延長了＞40%。三種化合物-化合物1S、6S和11S是特別有效的，使壽命延長＞200%，并且得到長期不患腫瘤的幸存者。在結(jié)構(gòu)上與10-羥基喜樹堿相關(guān)的式(Ⅰ)化合物中有許多化合物的活性都高于天然產(chǎn)物10-羥基喜樹堿。對于其中兩種化合物-化合物7S和13S，所試驗的最高劑量都沒毒性，因此這些化合物在更高劑量水平可能有更大活性。然而，在試驗的劑量下，這些化合物是有活性的。
基于化合物1S在體內(nèi)的高活性和效能(即低的最大耐受劑量)，在各種接種的小鼠腫瘤模型中對之進(jìn)行了評價。在各種動物腫瘤模型包括白血病和各種組織型實體腫瘤中，化合物1S在其最大耐受劑量具有高的活性?；衔?S的活性譜總結(jié)在表3中?？梢钥闯?，對于大多數(shù)腫瘤模型具有高度活性，只有一種模型，腹膜內(nèi)結(jié)腸癌26證明對該藥物幾乎是無效的。還有兩種皮下模型，結(jié)腸癌26和Madison肺癌，證明對該藥物效果不太明顯，即在這些模型中，當(dāng)用化合物1S處理皮下接種腫瘤小鼠時，有明顯的中等活性，即大于70%腫瘤生長抑制。在另一種皮下sc腫瘤模型中顯示出高活性(大于90%抑制)。值得注意，化合物1S腹膜內(nèi)給藥，不僅對腹膜內(nèi)腫瘤模型而且對在靜脈(ⅳ)或皮下接種了腫瘤的小鼠體內(nèi)也顯示出高活性。在一些腫瘤模型中，包括腹膜內(nèi)和靜脈接種P388和L1210白血病以及靜脈和皮下接種Lewis肺癌，治療活性是明顯的。在動物腫瘤模型中，化合物1S的活性水平和活性譜比最廣譜的已知抗腫瘤藥如環(huán)磷酰胺，順氯氨鉑和阿霉素都好。
表4較詳細(xì)地總結(jié)了這些接種小鼠腫瘤模型研究的結(jié)果，其中給出了在最佳時間以化合物1S的最佳劑量和最佳方案給藥所達(dá)到的存活期延長(ILS)或可測量的(即皮下)實體腫瘤生長抑制百分率。表4還給出了對于這些腫瘤模型用天然產(chǎn)物母體化合物喜樹堿和10-羥基喜樹堿進(jìn)行比較研究所獲得的結(jié)果。這些結(jié)果是通過間歇時間(即每隔3天或6天)進(jìn)行腹膜內(nèi)或靜脈給化合物1S而得到的。在某些情況下，這些結(jié)果是通過最佳治療方案獲得的，其中化合物1S在一天治療中以分散劑量方式(每隔3小時一次，共4次)給藥，關(guān)于這一點(diǎn)將在后面更詳細(xì)地描述。由于喜樹堿和10-羥基喜樹堿在水介質(zhì)中的不溶解性，它們總是懸浮液腹膜內(nèi)給藥。
從表4明顯地看出，所有三種化合物對各種動物腫瘤模型具有廣譜活性。對幾種腫瘤模型，化合物1S顯示出較高活性，這些腫瘤模型包括ipL1210白血病，ipB16黑色素瘤，ivP388白血病，ivL1210白血病，scLewis肺瘤，scB16黑色素瘤，scB16黑色素瘤/F10亞系，sc結(jié)腸癌51以及scMadison肺癌。10-羥基喜樹堿對ip接種的腫瘤模型是非常有效的，但對接種腫瘤部位遠(yuǎn)離給藥部位的腫瘤模型來說其活性較差;這種藥對sc接種的實體腫瘤模型至多顯示微弱活性。這看來并非由于10-羥基喜樹堿的溶解性不好所致，因為喜樹堿與之有相同的不溶解性，但對某些sc腫瘤模型是非常有效的。這很可能是由于10-羥基喜樹堿的芳香羥基對第一次排泄結(jié)合(firstpassconjugation)和膽排泄是敏感的，因此，該化合物就不能在系統(tǒng)循環(huán)中達(dá)到足夠濃度。值得注意，化合物1S也具有10-羥基，它對sc及iv腫瘤模型卻具有高活性。這可能是由于化合物1S的9位存在堿性側(cè)鏈，它可以通過空間阻礙、氫鍵或形成內(nèi)鹽來抑制10-羥基的代謝。10-羥基喜樹堿對ip結(jié)腸瘤26是高活性的，而該腫瘤模型對化合物1S不敏感，對喜樹堿敏感性也極小。然而，對于同樣腫瘤采用sc接種時，10-羥基喜樹堿沒有活性，而化合物1S具有中等活性。
除了表4所示的化合物1S的高活性和廣譜性外，當(dāng)該化合物口服時，也能保持完全抗腫瘤活性。這可用sc接種Lewis肺癌的小鼠來說明并詳述于后?；衔?S的另一特性是對P388白血病細(xì)胞亞系保持活性，如下所述該亞系對多種抗腫瘤藥物具有抗性。癌癥化療學(xué)中的一個主要問題是抗性細(xì)胞群的出現(xiàn)?？剐约?xì)胞群對最初有效的用藥方案以及二線治療方案均沒有反應(yīng)，利用抗性細(xì)胞不產(chǎn)生交叉抗性的藥物，應(yīng)該對癌癥治療具有重大影響。
化合物1S對于已試驗過的每種腫瘤模型的活性詳述如下ip腫瘤模型表5給出了在各種治療方案中對經(jīng)過ip接種腫瘤的小鼠ip或sc給化合物1S時的活性。數(shù)據(jù)表明了化合物1S對6種ip接種的腫瘤模型所用劑量與抗腫瘤效果的依賴關(guān)系。
P388白血病對ip接種P388白血病的小鼠在第1和第5天給藥時，化合物1S在其最大耐受劑量15mg/kg時產(chǎn)生200%的ILS，包括4/6長期存活者(治愈)，較低劑量也具有延長存活期125%和92%的高活性。這種高活性被下面描述的另一實驗(見表8)所證實，該實驗中，最大耐受量產(chǎn)生了228%LLS，并有2/6長期存活者這樣，化合物1S對帶有ip接種P388白血病的小鼠具有治療活性。
L1210白血病對ip接種L1210白血病的小鼠在第1和第5天ip給藥時，化合物1S具有可重現(xiàn)的活性。表5所示的典型試驗中，在最大耐受量15mg/kg時得到219%ILS，并且2/6治患。用兩個較低劑量時也看到了好的活性。按照這一方案，通過研究其它8個劑量的反應(yīng)，對化合物1S進(jìn)行了評價。在這些試驗中用最大耐受劑量得到的ILS百分率和長期存活率如下44%(0/6)，＞300%(5/6)，119%(0/6)，156%(1/6)，138%(0/6)，156%(2/6)，350%(2/6)及138%(1/6)。這樣，8/9試驗中化合物1S產(chǎn)生了大于100%ILS而6/9試驗中存在長期存活者。
B16黑色素瘤在本腫瘤模型中，化合物1S明顯地優(yōu)于喜樹堿和10-羥基喜樹堿(見表4)，該藥以其最大耐受劑量15mg/kg在第1，5，9和13天ip給藥時可產(chǎn)生152%ILS。這一結(jié)果得到了第二次試驗(試驗的最高劑量9.6mg/kg，產(chǎn)生130%ILS)的支持。
B16黑色素瘤/F10亞系B16黑色素瘤的F10亞系是通過單細(xì)胞無性繁殖選擇的這種腫瘤中的一種高轉(zhuǎn)移性亞系。化合物1S以其最大耐受劑量15mg/kg在第1，5，9和13天ip給藥后，產(chǎn)生105%ILS。對兩個較低劑量，其活性(ILS增加大于40%)是明顯的。
M5076肉瘤M5076肉瘤是一種轉(zhuǎn)移性網(wǎng)狀組織細(xì)胞肉瘤它存在于C57BL/6小鼠的卵巢中，它已確定作為一種移植腫瘤。
當(dāng)化合物1S以sc及ip方式給藥時，ip接種的這種腫瘤對它是敏感的。按照兩種給藥途徑，采用在第1，5和9天，每隔3小時一次，一天4次的分劑量方案給藥，得到的活性實際上是一樣的，98%ILS和105%ILS。這種方案(描述于后)在許多腫瘤模型中對化合物1S來說可以認(rèn)為是最佳的。通過另外三組對ip接種M5076肉瘤的小鼠的劑量-反應(yīng)研究。對化合物1S進(jìn)行了評價。在這些研究中，采用下列方式給藥在第1，5和9天ip一次給藥(75%ILS，其中1/8治愈)，在第1，5，9和13天ip一次給藥(71%ILS，其中1/8治愈，及在第1，5和9天sc一次給藥(57%ILS)。至于對iv和sc腫瘤模型(如下所述)，當(dāng)按分散劑量治療方案給藥時，化合物1S對ipM5076肉瘤可以認(rèn)為是最有效的。但是，不管給藥方式如何，化合物1S對這一腫瘤模型有可重現(xiàn)的活性。
結(jié)腸癌26結(jié)腸癌26是一種高侵襲和轉(zhuǎn)移性的不分化的結(jié)腸腫瘤模型。按照試驗方案，這種腫瘤在對化合物1S最大耐受劑量下證明是不易產(chǎn)生療效的。
iv腫瘤模型對患有全身(iv接種的)白血病或Lewis肺癌的小鼠以ip或iv給藥后化合物1S的活性表示在表6中。這些研究清楚地表明化合物1S的劑量反應(yīng)和方案相關(guān)性。對三種腫瘤模型中的每一種，化合物1S都顯示出治療活性。
P388白血病P388白血病當(dāng)iv植入時一般比ip接種時具有低得多的藥物敏感性。然而，化合物1S在第1和第5天(以其最大耐受劑量與否)給藥時對ivP388白血病具有高活性，無論是ip給藥(279%ILS，其中2/6治愈)還是iv給藥(250%ILS，其中2/6治愈)。在對該腫瘤模型第三個試驗中，化合物1S在第1和第5天以最大耐受劑量15mg/kgip給藥時，產(chǎn)生125%ILS，其中1/6治愈。
L1210白血病化合物1S對iv植入L1210白血病證明是有可重現(xiàn)的高活性的。通過iv給藥對這種腫瘤模型進(jìn)行了廣泛的方案相關(guān)研究。如表6所示，以分散劑量方式給藥在較寬的劑量范圍得到了較高的活性。當(dāng)在第2和第6天以單劑量或4次劑量(3小時間隔)通過iv給藥時，可以看出治療活性。除了表6所示數(shù)據(jù)外，還對iv接種L1210白血病的小鼠通過iv給化合物1S進(jìn)行了10次劑量-反應(yīng)研究。結(jié)果如下第2和第6天給藥，得到171%ILS，其中2/6治愈;第2和第6天給藥，3小時間隔，一日4次，得到大于300%的ILS，6/6治愈;在第2和第6天給藥，6小時間隔，一日3次，得到200%ILS，其中2/7治愈;第2和第6天給藥，12小時間隔，一日2次，得到229%ILS，其中2/7治愈;從第2天到第6天一次性給藥，得到143%ILS和129%ILS;從第2天到第6天分兩次給藥，12小時間隔，得到193%ILS和171%ILS;在第2天給單劑量，得到114%ILS;以及在第2天，3小時間隔，分4次給藥，得到244%ILS，其中1/6治愈。當(dāng)按3小時間隔方案給藥時，化合物1S顯示出最好的效果。每日給藥不如每隔4天給藥效果好。從這些研究中得到的最佳方案可用于某些實體腫瘤，如上述的ipM5076肉瘤，和下述腫瘤。在各種腫瘤系統(tǒng)中，若將化合物1S采用分散劑量(即隔3小時一次，分4次)方案給藥，那么活性可以增加，并且有效劑量范圍更寬。
Lewis肺癌Lewis肺癌是一種高轉(zhuǎn)移性的未分化肺癌，它已經(jīng)被廣泛地用于藥物評價。這種腫瘤模型對許多已知的抗腫瘤藥物是難以奏效的，當(dāng)使用這種模型作為一個篩選體系時，只有很少幾種化合物被鑒別是有活性的?；衔?S對這種化學(xué)難以奏效的腫瘤模型是有治療作用的，其中腫瘤是通過iv接種，并在肺中形成腫瘤結(jié)節(jié)。對于這種腫瘤模型的治療活性是一個不尋常的發(fā)現(xiàn)。
從所有三種iv接種的腫瘤模型看出，當(dāng)通過ip和iv給藥時，化合物1S對全身腫瘤是非常有效的。
sc腫瘤模型用10種實體腫瘤模型對化合物1S進(jìn)行評價，在這些模型中腫瘤是通過sc植入的，給藥途徑是通過ip，iv或口服(po)。在這些模型中，抗腫瘤活性是通過腫瘤植入部位腫瘤生長的抑制程度來估價的。腫瘤的測量一般是在腫瘤植入2-3周進(jìn)行，這時在未處理過的對照動物體內(nèi)大腫瘤(大于500mm3)是明顯的。對于高轉(zhuǎn)移性實體腫瘤，存活時間也可用來測定藥物活性。對于轉(zhuǎn)移性較小的腫瘤模型，未處理動物的存活時間是高度可變的，并且動物可帶著很大腫瘤長期存活，這些腫瘤往往潰爛并感染，化合物1S對10種sc實體腫瘤模型中的8種具有高的有效性，在其最大耐受劑量時，對腫瘤生長的抑制率超過了90%(表7)。對高轉(zhuǎn)移性腫瘤(包括Lewis肺癌、B16黑色素瘤、B16黑色素瘤/F10亞系以及M5076肉瘤)的腫瘤生長的完全抑制伴隨著壽命延長。即使對于較小反應(yīng)的腫瘤模型(Madison肺癌和結(jié)腸瘤26)，化合物1S在其最大耐受劑量時明顯具有大于70%抑制腫瘤生長的活性。
Lewis肺癌這種高轉(zhuǎn)移性肺腫瘤是所試驗的腫瘤模型中對化合物1S最敏感的。用于Lewis肺癌已經(jīng)被廣泛地用于抗腫瘤藥研究，并且對大多數(shù)已知抗腫瘤藥物是難以奏效的，所以這是一個不尋常發(fā)現(xiàn)。當(dāng)在第1，5，9和13天以15或9mg/kg量ip給藥時，化合物1S可完全抑制實際試驗的所有小鼠的Lewis腫瘤生長。在最大耐受量時，有4/8的小鼠被治愈。在測定腫瘤時(14天)，未處理的對照組的腫瘤平均體積為1685mm3。在第二個試驗中，化合物1S在第1，5和9天采用iv和po給藥。按兩種給藥途徑，都可得到99%腫瘤生長抑制(TGI)，其中半數(shù)或更多動物在測定時間(13天)觀察不到腫瘤跡象。而且，以最大耐受劑量按兩個給藥途徑給藥，效果實際上是相同的，說明了口服給藥，化合物1S具有良好的生物利用度。在本試驗中，腫瘤實際上是在植入部位生長，這表明對這種腫瘤模型最好的療法，是通過ip給藥治療，或者要取得治療活性，需要進(jìn)行較長時間的持續(xù)治療。
B16黑色素瘤這種轉(zhuǎn)移性黑色素瘤模型已被廣泛地用于評價和篩選抗腫瘤藥物。當(dāng)sc植入時，這種腫瘤對多數(shù)抗腫瘤藥物是難以奏效的。對sc接種B16黑色素瘤的小鼠，通過三組劑量反應(yīng)研究，對化合物1S進(jìn)行評價。當(dāng)將化合物1S以其最大耐受量在第1，5和9天以單劑量給藥(ip或iv)時，在兩次試驗中都可產(chǎn)生99%腫瘤生長抑制(TGI)，其中多數(shù)動物在16或14天沒有任何可測量的腫瘤存在，而此時的對照小鼠腫瘤大小平均為864和758mm3。當(dāng)按上述最佳分散劑量治療方案給藥時，化合物1S在較寬劑量范圍內(nèi)可產(chǎn)生腫瘤生長完全抑制。這與在其它腫瘤模型中獲得的結(jié)果一致。在sc B16黑色素瘤模型中，腫瘤實際上在所有試驗動物體內(nèi)都生長，而且沒有治愈者。然而，在這一轉(zhuǎn)移性腫瘤模型中，可看到與腫瘤生長完全抑制同時存在的壽命延長。按照分散劑量方案，得到52%ILS，而在第1，5和9天把24mg/kg作為單劑量ip給藥，可使壽命延長39%。按后一種方案，iv給藥得到53%ILS。
B16黑色素瘤/F10亞系為增加轉(zhuǎn)移性而選擇的B16黑色素瘤的這種亞系，在其對化合物1S的敏感性方面與其母體B16黑色素瘤相似。在第1，5，9和13天以最大耐受劑量ip給藥后，腫瘤生長得到了完全的抑制。在第1，5和9天以兩種劑量iv給藥，得到97%腫瘤生長抑制。在這些試驗中，腫瘤是在第16天測量，對照小鼠的腫瘤非常大，平均為1927和1196mm3。在所有治療組中實際上都生長有腫瘤并且沒有治愈。然而，以25mg/kg ip給藥存活期增加了70%(ILS)，以同樣的劑量iv給藥得到38%的ILS。
ADJ-PC6漿細(xì)胞瘤這種腫瘤模型與多發(fā)性骨髓瘤這種人體癌最接近。這種模型對于在第1，5，9和13天ip給藥的化合物1S是高度敏感的。在第19天測量腫瘤，對照小鼠的平均腫瘤大小為828mm3。在最大耐受量或低于此量時，分四個劑量組給藥，化合物1S產(chǎn)生大于90%的腫瘤生長抑制。在三個劑量組中的每一個高劑量給藥時，有1/8長期不帶腫瘤的存活者。由于這一腫瘤不是高度轉(zhuǎn)移性的，所以沒有測定平均存活時間。
M5076肉瘤sc植入的M5076肉瘤對化合物1S是非常敏感的，在最大耐受量或低于此量時有3個劑量組產(chǎn)生大于90%TGI。在第17天時測量腫瘤，此時對照腫瘤平均大小為1045mm3。在第1，5，9和13天ip給藥，對這種模型，該藥物不是治愈性的，而是存活期延長31%。
乳腺癌16/C這種乳瘤模型是可移植的C3H小鼠的自發(fā)乳瘤亞系。化合物15在第1，5，9和13天以最大耐受量10mg/kg ip給藥后可抑制96%腫瘤生長。第19天時測量腫瘤，此時對照小鼠的平均腫瘤大小為630mm3。在按同樣的治療方案進(jìn)行的第二個試驗中，化合物1S對乳腺癌16/C產(chǎn)生了73%腫瘤生長抑制(TGI)。由于這種腫瘤不是高轉(zhuǎn)移性的，所以沒有進(jìn)行動物存活試驗。
結(jié)腸腺癌38這種非轉(zhuǎn)移性的結(jié)腸腫瘤模型已經(jīng)廣泛地用于藥物評價，并且被認(rèn)為是藥物更難以奏效的腫瘤模型之一?；衔?S在第3，10，17和24作為單劑量或按分散劑量方案ip給藥。之所以選擇較長的治療方案是因為這種實體腫瘤生長緩慢。在第31天時測量腫瘤，而未治療的對照組的平均值只有349mm3。如對于其它腫瘤模型，化合物1S以分散劑量給藥時是更有效的，在兩個劑量組均產(chǎn)生了大于90%的抑制。好的活性(89%TGI)對于單劑量方案也是明顯的。
結(jié)腸腺癌51這是另一種生長緩慢的、證明對多數(shù)抗腫瘤藥物難以奏效的結(jié)腸腫瘤模型。用于這種模型的治療方案與結(jié)腸腺癌38相似?；衔?S對結(jié)腸腺癌51是有效的，采用單劑量給藥方案產(chǎn)生88%TGI，而采用分散劑量給藥后產(chǎn)生92%TGI。如對其它腫瘤，當(dāng)采用分散劑量方案時，化合物1S在較寬劑量范圍有效，在第24天測量結(jié)腸腺癌51，此時對照腫瘤平均為766mm3。
Madison肺癌Madison肺癌，與Lewis肺癌一樣，是一種具有高轉(zhuǎn)移活性的、生長迅速的未分化腫瘤模型。與Lewis肺癌不同，Madison肺癌對化合物1S不是高度敏感的。在第1，5和9天以最大耐受量按單劑量方案iv給藥，實際上沒有產(chǎn)生腫瘤生產(chǎn)抑制(28%TGI)。按照同樣的治療方案通過ip給藥來進(jìn)行另外兩個試驗，化合物1S僅產(chǎn)生50%和23%TGI。然而，按照最佳分散劑量方案采用iv給藥時，化合物1S確實顯示出抗Madison肺癌活性，以其最大耐受量給藥，得到85%TGI。按這一治療方案采用ip給藥時，該藥的有效性略有降低(以最大耐受量給藥得到74%TGI)。對兩個獨(dú)立的試驗，在第12或第13天測定Madison肺腫瘤，此時對照小鼠腫瘤的平均大小分別為1571和942mm3，這反映了這種腫瘤的迅速生長率。這樣，既使對于難以奏效的腫瘤，按最佳治療方案服用化合物1S，也可以導(dǎo)致明顯的腫瘤生長抑制。
結(jié)腸癌26對這一高侵襲性和轉(zhuǎn)移性的未分化結(jié)腸腫瘤，當(dāng)在第1，5，9和13天以其最大耐受量ip給藥時，化合物1S僅產(chǎn)生邊界的腫瘤生長抑制(72%TGI)。在第19天進(jìn)行腫瘤測量，此時對照腫瘤平均大小為1052mm3。若按最佳分散劑量方案給藥，化合物1S是否能對這一腫瘤模型顯示出好的活性尚不清楚。對多種藥物具有耐藥性的亞系雖然癌癥治療學(xué)中最主要的問題是普通瘤對所有可利用化療試劑或聯(lián)合治療方案的內(nèi)在不敏感性，而另一個主要問題是從先前敏感的腫瘤中出現(xiàn)了耐藥性腫瘤細(xì)胞?；加小盎瘜W(xué)敏感的”腫瘤諸如非小細(xì)胞肺癌、卵巢腺癌、急性非淋巴細(xì)胞白血病、乳癌及某些淋巴癌的多數(shù)病人可經(jīng)過聯(lián)合治療方案得到緩解，聯(lián)合方案已經(jīng)確立作為對這些不同疾病的一線治療方案。然而，在多數(shù)情況下，病人會產(chǎn)生疾病的復(fù)發(fā)，并且，既使采用高度深入細(xì)致的聯(lián)合方案，也會使誘發(fā)預(yù)后有意義緩解的能力大大降低。在特征上，這些復(fù)發(fā)腫瘤證明對那些藥物是難以奏效的。這些藥物在結(jié)構(gòu)和/或機(jī)理上與最初用來誘發(fā)緩解的藥物無關(guān)。這種對多種藥物具有耐藥性的現(xiàn)象，許多試驗室目前正在深入細(xì)致地研究。最近結(jié)果表明對多種藥物耐藥性(mdr)基因的擴(kuò)大和表達(dá)和mdr基因產(chǎn)物(P170膜糖蛋白)的存在與多種藥物耐藥性有關(guān)。P170原意是作為具有令人難以置信的多樣化的底物專一性的溢出物轉(zhuǎn)移泵。最近文章指出，在某些預(yù)先未處理過的腫瘤如嗜鉻細(xì)胞瘤和結(jié)腸腺癌中mdr基團(tuán)的有力表達(dá)對于這些腫瘤內(nèi)在的藥物難以奏效的遺傳表型至少有部分是敏感的。
因此，鑒別新試劑是重要的，而這些新試劑對多種藥物具有耐藥性的遺傳表型的腫瘤保持有高度活性。這些試劑對于化學(xué)敏感性腫瘤治療的進(jìn)一步發(fā)展可能是具有希望的(即，或者對先前治療過的病人表現(xiàn)出效力或作為一線聯(lián)合方案中的一個組分殺死m(xù)dr亞群)，這些試劑對現(xiàn)在非敏感性腫瘤也可能是有希望，這些腫瘤由于mdr基因的inate表達(dá)而對可利用的藥物不敏感。在這一方面，喜樹堿已經(jīng)證明是不尋常的，它是少數(shù)幾種天然產(chǎn)物細(xì)胞毒劑中的一種，這些細(xì)胞毒劑對呈現(xiàn)mdr遺傳表型的非常特征的腫瘤亞系，即對阿霉素、長春新堿、安吖啶(amsacrine)橢圓玫瑰樹堿或mitoxantrone具有抗性的P388亞系還沒有出現(xiàn)交叉抗藥性。由于對多種藥物具有耐藥性細(xì)胞系呈現(xiàn)交叉抗藥性的多數(shù)藥物是堿性的，因此，我們可以期望如在化合物1S中那樣，在喜樹堿分子中引入一堿性側(cè)鏈而得到一個化合物，這種化合物可被P170糖蛋白轉(zhuǎn)移到細(xì)胞外，這樣證明了對mdr基因表達(dá)的腫瘤的無效性。
用接種P388和其耐阿霉素和mitoxantrone的亞系的小鼠對化合物1S進(jìn)行評價(表8)。阿霉素和絲裂霉素C用來作為比較。P388/阿霉素和P388/mitoxantrone保持了對化合物1S的敏感性。這些對多種藥物耐藥的細(xì)胞系對阿霉素表現(xiàn)出預(yù)期的抗藥性。P388/阿霉素對絲裂霉素C也具有抗藥性。這樣，化合物1S對具有對多種藥物耐藥的細(xì)胞系保持有抗腫瘤活性，這正是喜樹堿的一個特性。
化合物1的外消旋體上述所有生物學(xué)研究都是用化合物1的S型異構(gòu)體進(jìn)行的，C-20構(gòu)型存在于天然的喜樹堿和10-羥基喜樹堿分子之中。通過全合成制備了化合物1的外消旋體，并評價其對ip接種P388白血病小鼠的抗腫瘤活性(表9)?；衔?的外消旋體(下文稱作化合物1RS)對P388白血病是具有高活性的，在第1和5天按29mg/kg劑量給藥后，得到165%ILS，其中1/6長期存活。盡管活性并不完全與化合物1S相同(參見表5和8)，但化合物1RS對這一腫瘤模型具有良好活性。
化合物1S的不同形式的鹽由于9位上堿性側(cè)鏈的存在，化合物1S是水溶性的，堿性側(cè)鏈可與酸如乙酸、鹽酸和甲磺酸形成鹽。在表2至9中所描述的試驗或者是用化合物1S的乙酸鹽或者是用其鹽酸鹽進(jìn)行的?？扇苄问降幕衔?S也可以通過化合物1S的E環(huán)內(nèi)酯的堿性水解形成該化合物的水溶性堿金屬羧酸鹽形式來制備。化合物1S的乙酸鹽、鹽酸鹽、二鹽酸鹽和鈉鹽的直接比較是用iv接種L1210白血病的小鼠進(jìn)行的(表10)。這些化合物在第1和第5天以5%葡萄糖溶液iv給藥。二鹽酸鹽通過加入過量鹽酸而形成，這可能是由于B環(huán)中喹啉氮以及二甲基氨基甲基的氮質(zhì)子化的結(jié)果。每種鹽形式對這種腫瘤模型都是有活性的100%ILS(乙酸鹽)，175%ILS(鹽酸鹽)133%ILS(二鹽酸鹽)以及208%ILS(鈉鹽)。三種酸的鹽是等效的，即它們具有相同的最大耐受劑量15mg/kg。然而，鈉鹽按其最大耐受劑量54mg/kg給藥時，其效力約低3.5倍。
表3化合物1S對動物腫瘤模型的活性譜腫瘤模型最大耐受量時的活性ip腫瘤模型P388白血病+++L1210白血病+++B16黑瘤++B16黑瘤/F10亞系++M5076肉瘤++結(jié)腸癌26-(iv腫瘤模型)P388白血病+++L1210白血病+++Lewis肺癌+++(sc腫瘤模型)Lewis肺癌+++B16黑瘤++B16黑瘤/F10亞系++ADJ-PC6漿細(xì)胞瘤++M5076肉瘤++乳腺癌16/C++結(jié)腸腺癌38++結(jié)腸腺癌51++Wadison肺癌+結(jié)腸癌26+化合物1S每隔3或6天通過ip或iv給藥，在腫瘤植入后1-3天開始，進(jìn)行2-4個療程。
+++＝治療性的(＞200%壽命增加(ILS))++＝＞100%壽命增加(ILS)或＞90%腫瘤抑制(TGI)+＝＞50%ILS或＞70%TGI-＝＜50%ILS或＜70%TGI
表4化合物1S與喜樹堿和10-羥基喜樹堿對動物腫瘤模型的活性比較腫瘤模型化合物IS喜樹堿10-羥基喜樹堿壽命增加(ILS)或腫瘤生長抑制(TGI)ip腫瘤模型P388白血病治療性的治療性的治療性的L1210白血病治療性的172%ILS94%ILSB16黑瘤152%ILS36%ILS95%ILSB16黑瘤/F10亞系105%ILS68%ILS100%ILSM5076肉瘤105%ILS81%ILS98%ILS結(jié)腸癌2625%ILS50%ILS治療性的iv腫瘤模型P388白血病治療性的75%ILS40%ILSL1210白血病治療性的136%ILS100%ILSLewis肺癌治療性的未試驗未試驗sc腫瘤模型Lewis肺癌治療性的92%TGI4%TGIB16黑瘤100%TGI78%TGI未試驗B16黑瘤/F10亞系100%TGI90%TGI58%TGIADJ-PC6漿細(xì)胞瘤100%TGI100%TGI76%TGIM5076肉瘤100%TGI100%TGI66%TGI乳腺癌16/C96%TGI99%TGI61%TGI結(jié)腸腺癌3896%TGI100%TGI未試驗結(jié)腸腺癌5192%TGI75%TGI未試驗Madison肺癌85%TGI63%TGI33%TGI結(jié)腸癌2672%TGI66%TGI37%TGI給出的活性是在最大耐受量時得到的，藥物通過ip或iv使接種腫瘤小鼠服用，在腫瘤植入以后1-3天開始，每隔3或6天給藥，進(jìn)行2-4個療程。值的測量是基于完全劑量反應(yīng)研究中各組中的6-8只小鼠的存活時間中值和平均腫瘤體積。
表5化合物1S對帶有ip植入腫瘤的小鼠的活性腫瘤模型治療方案/給劑量(mg/ILS長期存活者藥途徑Kg/注射)(%)P388白血病A/ip30毒性的15>2004/67.51253.892L1210白血病A/ip25毒性的152192/691385.4813.231B16黑色素瘤B/ip25毒性的1515291005.4523.243B16黑色素瘤/B/ip25毒性的F10亞系151059685.4633.237M5076肉瘤C/ip10毒性的5毒性的2.51051.2751/80.62701/8M5076肉瘤C/sc10毒性的5毒性的2.5981.2701/80.6236結(jié)腸癌26B/ip40毒性的20毒性的1025552.57治療方案是A＝第1和5天給藥;B＝第1，5，9和13天給藥;C＝第1，5和9天給藥，每3小時一次，每天4次。
壽命增加(ILS)基于各組中的6～8只小鼠相對于未處理對照的中值存活時間。長期存活者是指對于白血病45天，對于固體腫瘤60天不受腫瘤影響的。
表6化合物1S對帶有iv植入腫瘤小鼠的活性腫瘤模型治療方案/給藥劑量(mg/ILS長期存活者途徑Kg/注射)(%)P388白血病A/ip252792/61513291005.4583.242P388白血病A/iv25毒性的192502/614145101107.965L1210白血病A/ip25毒性的151711/691365.4933.257L1210白血病D/iv40毒性的24>3004/7141578.61295.271L1210白血病E/iv6毒性的3.6>3005/72.2>3001/71.32432/70.78186Lewis肺癌B/ip25毒性的15>2007/791111/75.4373.216治療方案是A＝在第1和5天給藥;B＝在第1，5，9和13天給藥;
D＝在2和6天給藥;E＝在第2和6天給藥，每隔3小時一次，每天4次。
壽命增加(ILS)基于各組中的6～8只小鼠相對于未處理對照的中值存活時間。
長期存活者是指對于白血病45天，對于固體腫瘤60天不受腫瘤影響的。
表7化合物1S對帶有sc植入腫瘤小鼠的活性腫瘤模型治療方案/給藥劑量(mg/TGI沒有明顯腫瘤途徑Kg/注射)(%)的小鼠Lewis肺癌B/ip25毒性的15 100 8/8*9 99 7/8**5.4682/83.231Lewis肺癌F/iv25995/815953/89931/85.4874/8Lewis肺癌F/po45毒性的27994/816901/89.7892/85.851B16黑色素瘤F/ip24997/814573/88.6633/85.2201/83.1632/8B16黑色素瘤F/iv25毒性的15997/89966/85.4793/83.2542/8B16黑色素瘤C/ip61007/73.61007/72.2922/81.3641/80.78461/8
表7(續(xù))化合物1S對帶有sc植入腫瘤小鼠的活性腫瘤模型治療方案/給藥劑量(mg/TGI沒有明顯腫瘤途徑Kg/注射)(%)的小鼠B16黑色素瘤/B/ip251007/8F10亞系15879575.4623.252B16黑色素瘤/F/iv25976/8F10亞系15977/89602/85.4341/83.2221/8ADJ-PC6B/ip25毒性的漿細(xì)胞瘤 15 100 7/7***9 100 8/8***5.4 92 4/8***3.2933/8M5076肉瘤B/ip25毒性的151008/89986/85.4923/83.2642/8乳腺癌B/ip20毒性的16/C10965/85612/82.5591/8結(jié)腸腺癌G/ip24894/73814785/78.6553/75.201/73.102/7
表7(續(xù))化合物1S對帶有sc植入腫瘤小鼠的活性腫瘤模型治療方案/給藥劑量(mg/TGI沒有明顯腫瘤途徑Kg/注射)(%)的小鼠結(jié)腸腺癌38H/ip6965/73.6936/72.2744/71.3684/70.78532/7結(jié)腸腺癌51G/ip24883/814761/88.6531/85.2363.134結(jié)腸腺癌51H/ip3.6924/82.2894/81.3883/80.78731/80.4737Madison肺癌F/iv24281/8120621301.50Madison肺癌C/iv3毒性的1.5853/80.75631/80.38410.190
表7(續(xù))化合物1S對帶有sc植入腫瘤小鼠的活性腫瘤模型治療方案/給藥劑量(mg/TGI沒有明顯途徑Kg/注射)(%)的腫瘤的小鼠B/ip20毒性的結(jié)腸癌2610725392.538治療方案是B＝在第1，5，9和13天給藥;C＝在第1，5和9天給藥，每隔3小時一次，每天4次，F(xiàn)＝在第1，5和9天給藥;G＝在第3，10，17和24天給藥，H＝在第3，10，14和24天給藥，每隔3小時一次，每天4次。
＊4/8長期不受腫瘤影響的存活者＊＊2/8長期不受腫瘤影響的存活者＊＊＊1/8長期不受腫瘤影響的存活者腫瘤生長抑制(TGI)基于各組中7或8只小鼠，相對于未處理對照的平均腫瘤體積。腫瘤在第12～19天測量(但結(jié)腸51在第24天，結(jié)腸38在第31天測量)。在所有試驗(有兩個除外)中，所有未處理對照小鼠(每組21或24只)都具有可測量腫瘤。對于B16/F10，按方案F，21/24對照小鼠具有可測量腫瘤。在對于結(jié)腸腺癌38的試驗中，19/21對照小鼠具有可測量腫瘤。
表8P388白血病多重抗藥亞系對化合物1S缺乏交叉抗藥性化合物劑量P388P388/阿霉素P388/Mitoxantrone(mg/kg,ip,ILSNCKILSNCKILSNCK天 1 and 5)(%)(log)(%)(log)(%)(log)化合物25毒性的毒性的毒性的152286.51766.01075.792116.5902.2793.65.41283.5330572.13.2671.0140290阿霉素92336.5140705.41564.6190403.21725.3240001.91675.1240001.21173.019000絲裂霉素7.51785.5520.51045.54.51564.6621.01366.52.71283.5520.5541.81.61062.6480.32901.0831.7290140壽命增加(ILS)基于各組中6只小鼠的平均存活時間。由于存活時間是腫瘤細(xì)胞對數(shù)的線性函數(shù)，所以凈腫瘤細(xì)胞殺死(NCK)是按標(biāo)準(zhǔn)方法從平均存活的時間計算。由于耐mitoxantrone亞系具有比其它兩種用于本試驗的細(xì)胞系較長doubling時間所以有較小的ILS，并具有比P388或耐阿霉素的細(xì)胞系大的NCK。
表9化合物1S外消旋混合物對接種ipP388白血病小鼠的活性化合物劑量ILS長期存活者(mg/kg,ip,(%)天:1&5)lRS291651/6141357.2803.630將106細(xì)胞通過ip植入動物體內(nèi)。壽命增加(ILS)基于各組中的6只小鼠相對于未處理對照的平均存活時間。長期存活者是指45天不受腫瘤影響。
表10不同鹽形式的化合物1S對接種ivL1210白血病小鼠的活性比較化合物劑量ILS(mg/kg,ip,(%)天:1&5)lS25毒性的乙酸鹽151009835.4673.250lS鹽酸鹽25毒性的1517591255.4923.250lS二鹽酸鹽25毒性的151339835.4503.250lS鈉鹽90毒性的54208321331910012676.533用106個細(xì)胞通過iv對動物接種。壽命增加(ILS)基于各組6只小鼠相對于未處理的對照的平均存活時間。
藥物組合物和治療方法本發(fā)明的藥物組合物包含一種抑制腫瘤細(xì)胞生長有效量的式(Ⅰ)化合物和一種惰性的可藥用載體或稀釋劑。這些組合物制備成適合于非腸道給藥或口服給藥的劑量單位形式。
式(Ⅰ)化合物以常規(guī)劑型服用，這些劑型是按照常規(guī)方法將治療有效量(即腫瘤生長有效抑制量)的式(Ⅰ)化合物(“活性成分”)與標(biāo)準(zhǔn)藥物載體或稀釋劑混合制成的。為了得到所期望的合適的制劑，制造程序可以包括混合、造粒和壓片或溶解各種成分。
使用的藥用載體可以是，例如，固體或者液體。固體載體的例子有乳糖、石膏粉、蔗糖、滑石粉、明膠、瓊脂、果膠、阿拉伯膠、硬脂酸鎂、硬脂酸及類似物。液體載體的例子有糖漿、花生油、橄欖油、水以及類似物。相似地，載體或稀釋劑可以包括技術(shù)上熟知的延時物質(zhì)，諸如單獨(dú)的或與蠟一起使用的單硬脂酸甘油酯或二硬脂酸甘油酯、乙基纖維素、羥丙基甲基纖維素、甲基丙烯酸甲酯以及類似物。
可以使用很多種藥物形式。這樣，如果使用的是固體載體，可將制劑壓片、以粉末或小丸形式置于硬膠囊中或制成園形或菱形錠劑。固體載體的用量可有很大變化，但最好約在25mg-1g之間。如果使用的是液體載體，可將制劑做成糖漿、乳液、軟膠囊、裝在安瓿或藥瓶中的無菌注射液或懸浮液、或非水液體懸浮液。
為了得到穩(wěn)定的水溶液劑型，可將式(Ⅰ)化合物可藥用的鹽溶于有機(jī)酸或無機(jī)酸的水溶液，例如0.3M琥珀酸或更好是檸檬酸溶液。如果不能使用可溶性鹽形式，可將式(Ⅰ)化合物溶于合適的共溶劑或其結(jié)合物中。這些合適的共溶劑的例子包括乙醇、丙二醇、聚乙二醇300、聚山梨酸酯80、甘油以及類似物，其濃度為總體積的0～60%。但是，合適的共溶劑并不僅限于此。
藥物組合物也可以是將活性成分的鹽溶于合適的含水載體諸如水或等滲的鹽或葡萄糖溶液。對于9位上無堿性側(cè)鏈的那些式(Ⅰ)化合物諸如化合物2S和10S(結(jié)構(gòu)見表2)，通過E環(huán)內(nèi)酯堿性水解可以形成一種可溶性堿金屬羧酸鹽。化合物1S的鈉鹽可作為例子。
可以理解，用于本發(fā)明組合物的式(Ⅰ)化合物的實際首選劑量將隨下述諸條件而變化所用的特殊復(fù)合體、配制的特殊組合物、給藥方式以及治療的特殊部位、宿主和疾病。對于給定的一系列條件，最佳劑量可以由技術(shù)人員按照上述試驗數(shù)據(jù)用常規(guī)劑量測定方法來確定。對于非腸道給藥，一般所用劑量每天約為20-150mg/m2體表面積，給藥1-5天，最好每隔4周進(jìn)行重復(fù)，共4個療程。對于口服給藥，一般所用劑量約為每天20-150mg/m2體表面積，給藥1-5天按適當(dāng)?shù)拈g隔重復(fù)數(shù)個療程。
按照本發(fā)明，抑制對式(Ⅰ)化合物敏感的動物腫瘤細(xì)胞生長的方法，包括給患有所述腫瘤的宿主動物服用抑制腫瘤生長有效量的式(Ⅰ)化合物。如上所述，治療期間，活性成分通過非腸道或口服每天給藥，所給劑量選為約20-150mg/m2體表面積，給藥1-5天，按適當(dāng)?shù)拈g隔重復(fù)數(shù)個療程。
下述實例闡明(a)用于評價各種式(Ⅰ)化合物對移植小鼠腫瘤模型的活性的實驗方案，(b)用于本發(fā)明的藥物配方的式(Ⅰ)化合物的化學(xué)制備以及治療方法，以及(c)本發(fā)明的供口服和非腸道給藥的藥物配方。
無須進(jìn)一步說明，相信本領(lǐng)域?qū)I(yè)人員能夠按上面所述，而充分實施本發(fā)明。因此，下述實例僅僅是用于說明本發(fā)明，而絕不是對本發(fā)明范圍的限制。
實例Ⅰ.用于移植小鼠腫瘤模型的實驗方案用于評價式(Ⅰ)化合物抗腫瘤活性的實驗方案早已被確立，并且被專業(yè)人員廣泛應(yīng)用在臨床前腫瘤模型中進(jìn)行藥物活性的評價。這些研究通常是依據(jù)國家癌癥研究所建立的、并由Geran等人在“CancerChemotherapyReports，Part3，Vol，3，1-103，1972.”上所述的實驗方案而實施的。
A).腹膜內(nèi)腫瘤模型在這些研究中所應(yīng)用的腫瘤，是通過在同種小鼠中連續(xù)接種而傳代保持的，這些腫瘤包括有P388白血病和其對阿霉素，及對mitoxanrone耐藥的亞系，L1210白血病，B16黑色素瘤、B16黑色素瘤/F10亞系、M5076肉瘤和結(jié)腸癌26。對各種白血病，這些腫瘤是在DBA/2小鼠傳代保持的。M5076肉瘤、B16黑色素瘤和它的F10亞系是在C57Bl/6小鼠中傳代保持的，而結(jié)腸癌26BALB/C小鼠中傳代保持的。白血病和M5076肉瘤可以腹水細(xì)胞懸浮劑連續(xù)地移植到腹膜內(nèi)，而B16黑色素瘤系和結(jié)腸癌26可以皮下實體腫瘤而連續(xù)移植。
在治療試驗中，腫瘤被無菌地從授體小鼠中移出，并制備成懸浮液，通過腹膜內(nèi)植入到受試動物中。用于結(jié)腸癌26的試驗動物是雌性BALB/c小鼠(20～25克)。用于其它腫瘤模型的試驗動物是同種的雌性F1雜種B6D2F1小鼠(C57Bl/6×DBA/2)。接種物用量隨腫瘤類型而變化P388白血病每只小鼠接種106個細(xì)胞，L1210白血病每只小鼠接種105或106個細(xì)胞，M5076肉瘤每只小鼠接種5×106個細(xì)胞。在B16黑色素瘤系和結(jié)腸癌26的植入實驗中，取自授體小鼠的皮下腫瘤被切碎，并在特氟隆一玻璃勻漿器中磨均勻，得到一種腫瘤漿。接種物用量是0.5毫升10%(重量體積)的B16黑色素瘤系的勻漿和0.5毫升5%(重量體積)結(jié)腸癌26的勻漿。腫瘤接種后，小鼠隨機(jī)分組，每組有6～8只小鼠。在每次試驗中，有3組未處理的對照小鼠。將藥物溶解或懸浮在適宜的水載體中，并在一定的劑量范圍內(nèi)，通過各種給藥途徑和方案給藥。動物裝在鞋盒狀的籠中，并每天監(jiān)視其死亡率，L1210監(jiān)視30天，P388監(jiān)視45天，B16、M5076和結(jié)腸26監(jiān)視60天。活性的終點(diǎn)就是平均存活時間，存活期相對于未給藥的對照組有所延長。如果存活期延長大于和等于40%，則認(rèn)為此藥物在這些腫瘤模型中是有效的。
B.靜脈腫瘤模型在本研究中使用的腫瘤，包括P388白血病，L1210白血病和Lewis肺癌，都是通過在同種小鼠中連續(xù)接種傳代而保持的，對白血病使用的小鼠為DBA/2，對Lewis肺癌為C57Bl/6小鼠。白血病以腹水細(xì)胞懸浮液連續(xù)地移植到腹膜內(nèi)，而Lewis肺癌可以皮下實體瘤而連續(xù)移植。在治療試驗中，腫瘤被無菌地從授體小鼠中移出，并制備成懸浮劑而植入試驗動物中，對每種腫瘤試驗動物都是同種雌性F1雜種B6D2F1小鼠(C57Bl/6×DBA/2)。接種物用量隨腫瘤類型而異P388白血病每只小鼠接種106個細(xì)胞，L1210白血病每只小鼠接種105或106個細(xì)胞，Lewis腫瘤接種0.25毫升10%(重量/體積)，Lewis肺癌勻漿的制備如上述B16黑色素瘤。腫瘤接種后，小鼠隨機(jī)地分組，每組有6～8只小鼠。在每次試驗中，有三組未處理的對照小鼠。
藥物溶解或懸浮在適宜的水賦形劑中，并在一種劑量范圍內(nèi)，以各種治療方案，腹膜內(nèi)或靜脈給藥。動物裝在鞋盒狀籠中，并每天監(jiān)視死亡率，對L1210監(jiān)視30天，P388監(jiān)視45天，Lewis肺癌監(jiān)視60天。活性的終點(diǎn)就是平均存活時間和存活期相對于未處理的對照組有所增長。如果可延長存活期大于和等于40%，則認(rèn)為此藥物對這些腫瘤有活性。
C.皮下腫瘤模型在本研究中應(yīng)用的腫瘤是通過在同種小鼠中連續(xù)接種傳代而保持的C57Bl/6適用于Lewis肺癌、B16黑色素瘤及其F10亞系、M5076肉瘤和結(jié)腸腺癌38;BALB/c適用于結(jié)腸癌26、ADJ-PC6漿細(xì)胞瘤、Madison肺癌和結(jié)腸腺癌51;C3H用于乳腺癌16/C。除了M5076肉瘤是以腹水細(xì)胞懸浮液，腹膜內(nèi)移植以保持傳代外，所有腫瘤都是以皮下實體腫瘤連續(xù)移植的。
在治療試驗中，腫瘤被無菌地從授體小鼠中移出，制備成為用來皮下植入試驗動物的制品。對Lewis肺癌、B16黑色素瘤及其F10亞系、M5076肉瘤和結(jié)腸腺癌38，試驗動物是同種雌性F1雜種B6D2F1小鼠(C57Bl/6×DBA/2)。ADJ-PC6漿細(xì)胞瘤和結(jié)腸癌26是用雌性BALB/c小鼠評價的。Madison肺癌和結(jié)腸腺癌51是用同種的雌性F1雜種CD2F1小鼠(BALB/c×DBA/2)來評價的。乳腺癌16/C是用雌性C3H小鼠評價的。接種物隨腫瘤而不同。結(jié)腸腺癌38是用套針以2毫米碎片而植入。M5076肉瘤和ADJ-PC6漿細(xì)胞瘤是以細(xì)胞懸浮物植入的，每只小鼠分別植入5×106和2×106個細(xì)胞。結(jié)腸癌26、結(jié)腸腺癌51、Lewis肺癌、Madison肺癌和B16黑色素瘤及其F10亞系是以按上述方法制備的腫瘤勻漿0.5毫升植入的，勻漿濃度為10%(重量體積)，而結(jié)腸癌26勻漿濃度是5%(重量體積)。腫瘤接種后，小鼠隨機(jī)分組，每組有7或8只小鼠。在每次試驗中，有3組未處理的對照小鼠。
藥物溶解或懸浮在適宜水賦形劑中，在某個劑量范圍內(nèi)以各種給藥途徑和活療方案給藥。動物裝在鞋盒狀籠中，每天監(jiān)視死亡率。當(dāng)未處理的對照動物長有大的可以測量的腫瘤(通常大于500毫米3)時，所有動物的腫瘤是用游標(biāo)尺測徑器測量垂直直徑，腫瘤體積按下式計算長度×(寬度)2×0.5。腫瘤測量的時間根據(jù)不同種腫瘤的不同增長速度而決定。增長速度最快的腫瘤，例如Lewis和Madison肺癌，B16黑色素瘤及其F10亞系，是在第12天和16天之間測量的。生長較慢的腫瘤的測量時間比較晚些M5076肉瘤是17天，乳腺癌16/c是16或19天，ADJ-PC6漿細(xì)胞瘤和結(jié)腸癌26是19天，結(jié)腸腺癌51是24天，結(jié)腸腺癌38是31天?；钚缘母鱾€終點(diǎn)相對于未處理對照組的腫瘤體積和腫瘤生長抑制百分比的平均值，以及測量那天，有多少不可觸知腫瘤的動物數(shù)量。如果以最大或低于可耐受的劑量給藥，產(chǎn)生大于和等于70%腫瘤生長抑制作用，則認(rèn)為此藥物對這些腫瘤模型有活性。
對于具有高度轉(zhuǎn)移性的腫瘤，包括Lewis和Madison肺癌，結(jié)腸癌26和B16黑色素瘤及其F10亞系，帶病小鼠也要監(jiān)測存活時間。對于低轉(zhuǎn)移的腫瘤模型，測量腫瘤的大小，處死帶瘤小鼠。用這種方法，存活期延長大于和等于30%，藥物的活性就被認(rèn)為是明顯的。
Ⅱ.式(Ⅰ)化合物的合成在下列合成實例中，溫度是以攝氏溫度(℃)表示。除非另有說明，所有的起始原料可以從商業(yè)市場得到。
實例1(20S)1，2，6，7-四氫喜樹堿的制備喜樹堿(32.0克，0.092摩爾)與鉑和乙酸(1.6升)混合。此喜樹堿是從Tainjain-SK&F公司(天津.中國)購得。鉑是由8.0克無定形二氧化鉑在800毫升乙酸中，并在1個大氣壓的氫氣下預(yù)先還原1.5小時而制得。還原反應(yīng)在1個大氣壓的氫氣下進(jìn)行8.5小時，同時劇烈地攪拌混合物。在反應(yīng)接近結(jié)束時，理論量的氫氣(略大于4.1升)被吸收，并且氫氣的吸收明顯地減慢。此反應(yīng)用氫氣流脫氣約10分鐘，然后通過用乙酸(200毫升)洗過的硅藻土墊過濾。
所得到的溶液直接用于實例2所述的反應(yīng)中。
實例2(20S)10-羥基喜樹堿的制備向?qū)嵗?所制備的劇烈攪拌的1，2，6，7-四氫喜樹堿溶液中一次加入四乙酸鉛(64克，0.144摩爾)。此反應(yīng)物在氬氣下攪拌30分鐘，所有的四乙酸鉛溶解。濃縮得到一種膠質(zhì)殘余物，此殘余物用冰水(1升)研磨而得到淡褐色固體。將固體過濾出來，再用冰水(200毫升)洗滌，用橡膠板壓干并空氣干燥過夜。根據(jù)高效液相色譜法(HPLC)分析(Whatman Partisil 5 ODS3 RacⅡ60%(H3OH/H2O)，所得到部分濕產(chǎn)物含有44.3%10-羥基喜樹堿，26.9%10-乙酰氧基喜樹堿和23.1%喜樹堿。
此粗混合物與1.7升50%含水乙酸混合，并回流過夜。將反應(yīng)物冷卻，濃縮至大約50～100毫升。加用冰水(1升)，然后過濾出沉淀物，再用冰水(200毫升)洗滌，用橡膠板壓干，高真空下干燥2天，得到21.16克產(chǎn)物。根據(jù)HPLC分析，此產(chǎn)物含有70.9%10-羥基喜樹堿，1.2%10-乙酰氧基喜樹堿和21.3%喜樹堿。
實例3(20S)9-二甲基氨基甲基-10-羥基喜樹堿乙酸鹽的制備用實例2所述的10-羥基喜樹堿(20克，經(jīng)測定含有62%10-羥基喜樹堿，因而含有12.4克，34.1毫摩爾10-羥基喜樹堿)與乙酸(620毫升)、37%的甲醛水溶液(12.4毫升，大約149毫摩爾)和40%二甲胺水溶液(12.4毫升，大約109毫摩爾)混合，并攪拌大約18小時，薄層色譜法(TLC)(硅膠，9∶1的二氯甲烷/甲醇)測定表明有一些殘留的起始物。這種體系適用于跟蹤10-羥基喜樹堿的消失，而不適用于產(chǎn)物形成的監(jiān)測。再加入37%甲醛水溶液(6毫升，大約72毫摩爾)和40%二甲胺水溶液(6毫升，大約53毫摩爾)，并繼續(xù)攪拌24小時。將反應(yīng)物濃縮至干，用0.5%乙酸水溶液(1升)研磨，過濾，固體物再用0.5%乙酸水溶液(500毫升)洗滌。干的固體物重6.3克，用HPLC(Whatman Partisil 10 ODS3 50%CH3OH/H2O，保留時間9分鐘)得到94%回收的喜樹堿。合并的含水濾液用乙酸乙酯(3×600毫升)和石油醚(600毫升)提取，然后凍干。
粗殘余物的色譜法是注入在溶劑A中的所得物(溶劑A是99%水、1%乙酸)(600毫升)，通過一個裝有680克Whatman Partisil 40 ODS 3的50毫米×600毫米的鋼柱，以350毫升/分鐘的速度進(jìn)行34分鐘線性梯度洗脫從100%溶劑A洗脫至40%溶劑B(溶劑B是99%甲醇，1%乙酸)。色譜法是在410nm監(jiān)測并且以每一升作為一個餾分收集。用分析型HPLC(Whatman Partisil 10 ODS 3 50% CH3OH/H2O，保留時間9分鐘)測定，將純度大于或等于99%的組分收集在一起、濃縮、再溶解在最小量的0.5%乙酸水溶液中，凍干，得到10.58克(62%)標(biāo)題產(chǎn)物。
IR(KBr)3400，2960，1740，1650，1590 cm-1.1H NMR(CDCl3/CD3OD)1.04(t，3，J＝7Hz，C18)，1.96(q，2，J＝7Hz，C19)，2.01(s，3，CH3CO2)2.50(s，6，(CH3)2NH)，4.20(s，2，ArCH2N)，5.28(d，1，J＝19Hz，C17)，5.29(s，2，C5)，5.50(d，1，J＝19Hz，C17)，7.42(d，J＝9Hz，C11)，7.67(s，1，C14)，8.05(d，J＝9Hz，C12)，8.51(s，C7). 計算 C23H23N3O51 HOAc 1 H2O(mw＝515.5)C，58.24;H，5.67;N，8.15.測定C，58.55;
H5.22;N，8.54.Pb分析<14.5ppm.
用HPLC(參見上述)測定大于90%純度的另外標(biāo)題產(chǎn)物濃縮至干，干燥物與其它批次分離出的類似產(chǎn)物一起再次進(jìn)行色譜分離。
實例4(20S)9-嗎啉代甲基-10-羥基喜樹堿乙酸鹽的制備如實例2所述制備的10-羥基喜樹堿(100毫克，0.27毫摩爾)，37%甲醛水溶液(0.5毫升)，嗎啉(0.1毫升)和2∶1乙酸/乙醇(10毫升)混合，攪拌過夜。10-羥基喜樹堿發(fā)生了反應(yīng)(TLC，硅膠，9∶1 CH2Cl2/CH3OH)，反應(yīng)物濃縮至干，溶解在大約5毫升含有幾滴乙酸的水中，不溶物過濾出。將濾液凍干。凍干物進(jìn)行色譜分離(15毫米×250毫米硅膠中壓液相色譜(MPLC)，用含有0～2%甲醇的二氯甲烷洗脫)得到一殘余物，此殘余物溶解在稀乙酸水溶液中，凍干，得到53毫克(38%)標(biāo)題化合物。
IR(KBr)3400，3100，2960，2920，2840，1740，1650，1590cm-1H NMR(CDCl3/CD3OD)1.94(q，2，J＝7Hz，C19)，2.73(m，4，嗎啉基CH2N)，3.83(m，4，嗎啉基 -CH2O)4.19(s，2，ArCH2N)，5.26(s，2，C5)，5.25(d，1，J＝16Hz，C17)，576(dl，J＝16Hz，C17)，7.27(s，1，C14)，7.40(d，1，J＝8Hz，C11)，8.07(dl，J＝8Hz，C12)，8.36(s，1，C7). 計算 C25H25N3O6CH3CO2H(mw＝525.6)C，61.71;H，5.95;N，8.00.測定C，61.30;H，5.44;N，8.35.
實例5(20S)9-N-甲基哌嗪基甲基-10-羥基喜樹堿乙酸鹽的制備實例2所述制備的10-羥基喜樹堿(100毫克，0.27毫摩爾)，2∶1醋酸/乙醇(10毫升)，37%甲醛水溶液(0.5毫升)和N-甲基哌嗪(0.1毫升)混合，攪拌20小時。10-羥基喜樹堿已反應(yīng)(tlc9∶1 CH2Cl2/CH3OH)，反應(yīng)物濃縮，溶解在水(50毫升)中，用乙酸乙酯(5×20毫升)和石油醚(20毫升)洗滌將水相凍干。殘余物再溶解在稀乙酸水溶液中，在中壓液相色譜進(jìn)行分離(Whatman Partisil 40 ODS3 9毫米×250毫米柱)，用含有0.02%乙酸的0-20%甲醇水溶液洗脫。所需產(chǎn)物合并，并濃縮，將殘余物凍干，得到67毫克(46%)標(biāo)題化合物。IR(KBr)3400，2960，2910，1740，1650，1590cm-1.1H NMR(CDCl/CDOD)1.89(q，2，J＝7Hz)，2.02(s，>3，CH3CO2H)，2.37(s，3，NCH3)，2.65(m，8，哌啶子基 -CH2)，4.21(s，2，ArCH2)，5.26(s，2，C5)，5.30(d，1，J＝16Hz，C17)，5.71(d，1，J＝16Hz，C17)，7.45(d，1，J＝7Hz，C11)，8.05(d，1，J＝7Hz，C12)，8.47(s，1，C7).
計算 C26H28N4O51 1/2 HOAc 1/4 H2O(mw＝528.1);C，61.41;H，6.01，N，10.61測定C，61.62;H，5.74;N，10.93.
實例6(20S)9-(4′-哌啶基哌啶)甲基-10-羥基喜樹堿乙酸鹽的制備實例2所述制備的10-羥基喜樹堿(100毫克，0.27毫摩爾)，4-哌啶子基哌啶(100毫克，0.60毫摩爾)，37%甲醛水溶液(0.5毫升)和2∶1乙酸/乙醇(10毫升)混合攪拌20小時。10-羥基喜樹堿已反應(yīng)(tlc，硅膠，9∶1CH2Cl2/CH3OH)，反應(yīng)物濃縮，溶解在1%乙酸水溶液中，過濾，凍干。用MPLC(Whatman Partisil 40 ODS3，9毫米×250毫米柱)進(jìn)行色譜分離，先用水(100毫升)，然后用0～80%甲醇(溶在0.02%乙酸水溶液)洗脫，凍干后得到44毫克(30%)標(biāo)題化合物。IR(KBr)3400，2940，1745，1660，1590 cm-1.1H NMR(CDCl3/CD3OD)(t，3，J＝7Hz，C18)，1.3-3.3(m，19，哌啶C19)，4.11(s，2，CH2N)，5.21(s，2，C5)，5.25(d，1，J＝16Hz，C17)，5.70(d，1，J＝16Hz，C17)，7.85(d，1，J＝7Hz，C11)，7.59(s，1，C14)，8.00(d，1，J＝7Hz，C12)，8.35(s，1，C7).計算C31H36.N4O51 1/2 H2O(mw＝631.7)C，58.94;
H，6.22;N，8.81.測定C，59.02;H，6.44;N，8.53.
實例7(20S)9-(2′-羥基氨基)甲基-10-羥基喜樹堿乙酸鹽的制備實例2所述制備的10-羥基喜樹堿(200毫克，0.55毫摩爾)，多聚甲醛(16毫克，0.55毫摩爾)，乙醇胺(61毫克，1.1毫摩爾)和乙酸(6毫升)一起攪拌48小時，大部分10-羥基喜樹堿已發(fā)生反應(yīng)。反應(yīng)物濃縮，再溶解在稀釋乙酸(200毫升)中，用乙酸乙酯(4×30毫升)和石油醚(30毫升)洗滌，將所得水溶液凍干。粗凍干物溶解在水(50毫升)中。中壓液相色譜MPLC(WhatmanPartisil40ODS3，15毫米×250毫米柱)分離，用水(100毫升)，再用0～10%甲醇(在0.02%乙酸水溶液中)洗脫，凍干后得到88毫克(33%)的標(biāo)題化合物。
IR(KBr)3400，2980，2940，1750，1570cm-1.1H NMR(CDCl3/CD3OD)7Hz，C18)，1.89(q，2，J＝7Hz，C19)，2.00(s，3，HOAc)，3.03(m，2，CH2NH)，3.75(m，2，CH2OH)，4.49(s，ArCH2NH)，5.24(s，2，C5)，5.30(d，1，J＝16，C17)，5.70(d，1，J＝16Hz，C17)，7.41(d，1，J＝8Hz，C11)，7.61(s，1，C14)，8.00(d，1，J＝8Hz，C12)，8.48(s，1，C7). 計算 C23H23N3O6HOAc 1 7/8H2O(mw＝531.3)C，56.52;H，5.83;N，7.91測定C，56.07;
H，5.40;N，8.27.
實例8(20S)9-三甲基銨甲基-10-羥基喜樹堿甲烷磺酸鹽的制備按實例3制備的9-二甲基氨基甲基-10-羥基喜樹堿乙酸鹽(65毫克，0.14毫摩爾)溶解在二氯甲烷(大約70毫升)中，然后過濾。濾液與甲磺酸甲酯(1毫升)混合，冷卻，在氬氣流中部分濃縮。4小時后，此溶劑濃縮至一半體積，并冷卻。濾出沉淀物，溶解在水(10毫升)中，先用乙酸乙酯(3×10毫升)，再用石油醚(10毫升)洗滌，凍干，得到50毫克(60%)標(biāo)題化合物。IR(KBr)3400，2950，2900，1760，1660，1600 cm-1.1H NMR(CDCl/CDOD)2.01(q，2，J＝7Hz，C19)，2.78(s，>3，CH3SO3)，2.94(s，9，N(CH3)3)，4.72(s，2，ArCH2N)，5.20(s，2，C5)，5.22(d，1，J＝16Hz，C17)，5.67(d，1，J＝16Hz，C17)，7.62(d，J＝7Hz，C11)，7.71(s，C14)，8.16(d，1，J＝7Hz，C12)，8.89(s，1，C7). 計算 C24H25N3O5CHSOH測定C，49.36;H，5.15;N，7.53.
實例9(20S)9-甲酰基-10-羥基喜樹堿的制備按實例2制備的10-羥基喜樹堿(100毫克，0.27毫摩爾)，六亞甲基四胺(0.80克，5.5毫摩爾)和三氟乙酸(TFA)(15毫升)在氬氣氛中回流20小時。反應(yīng)物濃縮，與水(15毫升)混合，并攪拌1小時。加入水(75毫升)，加入碳酸氫鈉調(diào)節(jié)PH至8.4。水相用乙酸乙酯(3×75毫升)洗滌，用3N鹽酸酸化至PH值為1.5，然后用乙酸乙酯15×75毫升)提取。合并有機(jī)提取物，用1N鹽酸(5×75毫升)、水(75毫升)和飽和的鹽水(25毫升)洗滌，再濃縮。殘余物用閃式色譜法純化(1厘米×15厘米硅膠，與粗產(chǎn)物預(yù)先吸附在1厘米×1厘米的硫酸鈉填塞物)。產(chǎn)物用1%甲醇在二氯甲烷的溶液洗滌，得到50毫克(47%)的標(biāo)題化合物。通過在大約含25%甲醇的二氯甲烷中慢慢冷卻而分級沉淀并在氮?dú)饬髦袧饪s，而得到供分析的純試樣。
IR(KBr)3400，3100，2950，1755，-11(t，3，J＝7Hz，C18)，1.96(d，2，J＝7HzC19)，5.32(d，1，J＝14Hz，C17)，5.33(s，2，C5)，5.68(d，1，J＝14Hz，C17)，7.50(d，1，J＝9Hz，C11)，7.67(s，1，C14)，8.33(d，1，J＝9Hz，C12)，9.34(s，1，C7)，10.85(s，1，CHO).計算C21H16N2O6l H2O(mw＝410.38)C，61.46;H，4.42;
N，6.83.測定C，61.09;H，4.17;N，6.52.
實例10(20S)9-環(huán)丙基氨基甲基-10-羥基喜樹堿鹽酸鹽的制備將按實例2制備的10-羥基喜樹堿(254毫克，0.7毫摩爾)，37%甲醛水溶液(1.0毫升)，環(huán)丙胺(400毫克、0.7毫摩爾)、冰醋酸(16毫升)和乙醇(8毫升)的混合物在室溫下攪拌過夜，然后真空下濃縮至干。殘余物用水研磨，過濾，干燥得到260毫克(75%產(chǎn)率)標(biāo)題化合物醋酸鹽，此化合物用0.1N鹽酸研磨可轉(zhuǎn)化為標(biāo)題化合物鹽酸鹽。
分析 (C24H23N3O5C，55.01;H，5.57;N，8.02.測定C，54.94;H，5.18，N，1(m，1)，4.6(s，2)，4.8(s，2)，5.2(s，2)，7.2(s，1)，7.5(q，2)，8.6(s，1).
實例11(20S)9-乙氧基甲基-10-羥基喜樹堿的制備將按實例2制備的10-羥基喜樹堿(364毫克，1.0毫摩爾)，二甲胺鹽酸鹽(90毫克，1.1毫摩爾)和37%甲醛水溶液(1.5毫升)的混合物在95%乙醇(25毫升)中回流5.5小時。將反應(yīng)物濃縮至很小體積，收集沉淀的產(chǎn)物并干燥。用硅膠色譜法純化，以含3%甲醇的二氯甲烷洗脫得到85毫克(20%產(chǎn)率)的標(biāo)題化合物。
分析 (C23H22N2O6).
計算C，62.08;H，5.27;N，6.29.測定C，61.80;H，5.22;N，6.12.FAB 質(zhì)譜 m/e 423(MH+).1HNMR(DMSO)0.85(t，3)，1.1(t，3)，1.9(m，2)，3.5(s，2)，4.8(s，2)，5.2(s，2)，5.4(s，2)，7.2(s，1)，7.7(m，2)，8.6(s，1).
實例12(20S)9-(N-甲基苯胺甲基)-10-羥基喜樹堿的制備將按實例2制備的10-羥基喜樹堿(254毫克，0.7毫摩爾)，37%甲醛水溶液(1.0毫升)和N-甲基苯胺(0.75毫升，0.7毫摩爾)與冰醛酸(16毫升)和乙醇(8毫升)的混合物，在室溫下攪拌40小時。濃縮成油狀物后，用硅膠色譜法，用含1，2和3%甲醇的二氯甲烷洗脫，可得到部分純化產(chǎn)物。此產(chǎn)物組份中仍含有N-甲基苯胺。用硅膠MPLC柱進(jìn)一步純化，產(chǎn)物用含2%甲醇的二氯甲烷洗脫。將產(chǎn)物各組份合并，并在真空下濃縮，得到77毫克(24%)的黃色固體的標(biāo)題化合物。
分析(C28H25N3O55.47;N，8.32. Found C，66.97;H，5.69;N，7.91. DCI質(zhì)譜m/e 484(MH+).1H NMR(CDCL)2)，5.5(q，2)，6.9(m，5)，7.5(s，1)，7.9(q，2)，8.4(s，1).
實例13(20S)9-環(huán)己基氨基甲基-10-羥基喜樹堿鹽酸鹽的制備將按實例2制備的10-羥基喜樹堿(364毫克，1.0毫摩爾)，37%甲醛水溶液(1.5毫升)，環(huán)己胺(1.3毫升，10毫摩爾)與冰醋酸(25毫升)和乙醇(12毫升)的混合物在室溫下攪拌過夜，并真空濃縮至干，殘余物用反相柱(MPLC)純化，用含有0.02%冰醋酸的15%甲醇水溶液洗脫。濃縮至很小體積并凍干，可得到成為乙酸鹽的標(biāo)題化合物(250毫克，47%)。此乙酸鹽加入0.1N鹽酸可轉(zhuǎn)化成標(biāo)題化合物鹽酸鹽，此鹽用過濾法收集。
分析(C27H29N3O5H2O). 計算 C，60.93;H，6.11，N，7.89. 測定 C，1.0-2.0(m，10)，3.1(s，1)，4.5(s，2)，5.2(s，2)，5.4(s，2)，7.2(s，1)，7.9(q，2)，8.9(s，1).
實例14(20S)9-N，N-二甲基氨基乙基-氧甲基-10-羥基喜樹堿鹽酸鹽的制備將依實例21制備的9-二甲基氨基甲基-10-羥基喜樹堿游離堿(100毫克，0.2毫摩爾)與含有3滴3N鹽酸的2-二甲基氨基乙醇(4毫升)混合物在氬氣中在80℃加熱24小時。半固體狀反應(yīng)混合物用水(5毫升)和異丙醇(10毫升)處理，攪拌并過濾，得到60毫克(59%)標(biāo)題化合物。
分析(CHNOHCl58.77;H，5.72;N，8.25.測定C，58.94，H，4.92;N，1(s，6)，3.3(s，2)，4.1(s，2)，5.2(s，2)，5.4(s，2)，7.3(s，1)，7.4(d，1)，8.0(d，l)，8.7(s，1).
實例15(20S)9-N，N-二甲基氨基乙基-硫代甲基-10-羥基喜樹堿鹽酸鹽的制備將基本上按實例18制備的9-二甲基氨基甲基-10-羥基喜樹堿鹽酸鹽(100毫克，0.2毫摩爾)和2-二甲基氨基乙硫醇(13毫升)的混合物在氬氣中于85℃加熱5小時。不溶的固體物(過量硫醇)過濾除去，濾液在真空中濃縮成為油狀殘余物，此殘余物用反相MPLC純化。產(chǎn)物用含5%和10%的甲醇水溶液洗脫，得到45毫克(41%)黃色固體標(biāo)題化合物。
分析(C25H28N3O5S49.34;H，5.79;N，6.90.測定C，48.98;H，5.82;N，1(s，6)，4.4(s，2)，5.3(s，2)，7.1(d，1)，7.2(s，1)，7.6(d，1)，8.2(s，1).
實例16(20S)9-N，N-二甲基氨基乙基-氨基甲基-10-羥基喜樹堿二鹽酸鹽的制備按實例2制備的10-羥基喜樹堿(364毫克，1.0毫摩爾)，N，N-二甲基乙二胺(100毫克，1.1毫摩爾)，37%甲醛水溶液(1.5毫升)與冰醋酸(25毫升)和乙醇(10毫升)的混合物，在室溫下攪拌64小時。溶劑在真空下除去，固體殘余物用水(10毫升)和含有3N鹽酸(3ml)的異丙醇(10毫升)處理，收集較細(xì)的沉淀固體，用異丙醇洗滌，干燥，得到218毫克(40%產(chǎn)率)標(biāo)題化合物。
分析(C25H28N4O5N，10.42. 測定 C，55.91;H，5.72;N，9.86.1H NMR(CDOD)5.1(m，4)，5.4(q，2)，7.3(d，1)，7.5(s，1)，7.8(d，1)，8.4(s，1).
實例17(20R，S)-9-二甲基氨基甲基-10-羥基喜樹堿乙酸鹽的制備此標(biāo)題化合物按實例3所述制備，不同之處是起始物是根據(jù)Wani等人(J.Med.Chem，23，554，(1980))的方法制備的外消旋10-羥基喜樹堿實例18(20S)9-二甲基氨基乙基-10-羥基喜樹堿單鹽酸鹽的制備將按實例3所述制備、經(jīng)分析為2.5當(dāng)量乙酸和0.75當(dāng)量水的9-二甲基氨基甲基-10-羥基喜樹堿乙酸鹽(8.5克，以分子量為585計算為14.5毫摩爾)溶解在0.1N鹽酸(170毫升，17毫摩爾)中，凍干，在高真空下抽吸3天，得到8.3克標(biāo)題化合物。
J＝7.5)，1.98(q，2，J＝7.5)，2.95(s，6)，4.77(s，2)，5.33(s，2)，5.36(d，1，J＝16)，5.62(d，1，J＝16)，7.59(d，1，J＝9)，7.66(s，l)，8.20(d，1，J＝9)，8.86(s，1).分析.(CHNO1HCl計算C，53.96;H，5.91;N，8.21;Cl，6.92.測定C，53.68;H，5.61;N，8.16;Cl，6.84.
實例19(20S)9-二甲基氨基乙基-10-羥基喜樹堿二鹽酸鹽的制備將按實例3制備的9-二甲基二甲基氨基甲基-10-羥基喜樹堿乙酸鹽(0.389克，由HPLC分析為1.07毫摩爾)溶解在0.4N鹽酸(6毫升，2.4毫摩爾)中，凍干并在高真空下抽吸40小時，得到0.269克的標(biāo)題化合物。
1H NMR(CDCl3/CD3OD).
(q，2J＝7.5)，3.01(s，6)，4.85(s，2)，5.31(d，1，J＝16)，5.36(s，2)，5.65(d，1，J＝16)，7.64(d，1，J＝9)，7.73(s，1)，8.23(d，1，J＝9)，9.07(s，1).
分析(CHNO50.37;H，5.70;N，7.66;Cl，12.93. 測定C，50.76;H，5.64;N，7.57;Cl，12.61.
實例20(20S)9-二甲基氨基乙基-10-羥基喜樹堿鈉鹽的制備將按實例3制備的9-二甲基氨基甲基-10-羥基喜樹堿乙酸鹽(100毫克，0.2毫摩爾)用0.1N氫氧化鈉(4.5毫升，0.45毫摩爾)處理，將此溶液通過HP-20樹脂柱(2×22厘米)。此樹脂用水(250毫升)洗滌。產(chǎn)物用1∶1的水和甲醇混合物洗脫。將含有產(chǎn)物的組份合并，濃縮至較小體積，凍干，得到98毫克(98%)的標(biāo)題化合物。IR(液體石蠟)-10.65(m，13)，1.8(m，2)，2.8(s，6)，3.0(m，2)，4.21(s，2)，4.5(s，2)，7.1(q，2)，7.2(s，1)，7.8(s，1).分析(C23H24N3O6Na5.57;N，8.60.測定C，56.21;H，5.65;N，8.44.
實例21(20S)9-二甲基氨基甲基-10-羥基喜樹堿游離堿的制備將按實例2制備的10-羥基喜樹堿(728毫克，2.0毫摩爾)與冰醋酸(50毫升)、乙醇(20毫升)、37%甲醛水溶液(3毫升)和40%二甲胺水溶液(3毫升)的混合物在室溫下攪拌20小時。溶劑在減壓下除去，殘余物在50℃高真空下加熱2小時，用異丙醇(10毫升)研磨，從而沉淀出黃色固體標(biāo)題化合物(561毫克，64%)。FAB質(zhì)譜m/e 422(MH+).
1H NMR(CDCl3/CD3OD)(s，6)，4.3(s，2)，5.2(s，2)，5.4(q，2)，7.6(s，1)，7.7(q，2)，8.5(s，l).
實例22(20S)10-羥基喜樹堿三氟甲磺酸鹽(三氟化物)的制備向按實例2制備的10-羥基喜樹堿(1.44克，4.0毫摩爾)在二甲基甲酰胺(40毫升)中的混合物中加入三乙胺(1.2克，12毫摩爾)，然后加入N-苯基-三氟甲基磺酸酰亞胺(2.0克，6毫摩爾)。反應(yīng)物在50℃下加熱3小時。真空下除去溶劑，殘余物用水研磨、過濾并干燥。按理論產(chǎn)率而獲得的粗品，在薄層層析(TLC)上基本上為一個斑點(diǎn)，表明有小量原有雜質(zhì)。用硅膠柱閃式色譜法純化少量試樣，用含2%甲醇的二氯甲烷洗脫產(chǎn)物。
分析(C21H15N2O7SF3).計算 C，50.81;H，3.05;
N，564. 測定C，51.38;H，3.42;N，4.99.1HNMR(CDCl3)7.6-7.9(m，2)，8.2(d，2)，8.5(s，l)FAB 質(zhì)譜 m/e497(MH+)，495(M-H)-實例23(20S)9-二甲基氨基甲基喜樹堿的制備
(20S)9-二甲基氨基甲基-10-羥基喜樹堿乙酸鹽的三氟甲基磺酸鹽按如下方法制備按實例3制備的9-二甲基氨基甲基-10-羥基喜樹堿乙酸鹽(482毫克，1毫摩爾)在N，N-二甲基甲酰胺(DMF)中的混合物在氬(40毫升)中，用2，6-二甲基吡啶(268毫克，2.5毫摩爾)和N-苯基三氟甲基磺酰亞胺(0.54克，1.5毫摩爾)處理。反應(yīng)混合物室溫下攪拌過夜。然后，往上述制成的三氟化物中加入三乙胺(0.4毫升，3.0毫摩爾)，乙酸鈀(8毫克，0.04毫摩爾)，三苯基膦(20毫克，0.08毫摩爾)和濃的甲酸(0.08毫升，2毫摩爾)。反應(yīng)在60℃加熱8小時。真空下除去溶劑，殘余物用少量的水研磨，過濾。干的粗不溶固體物重550毫克。用硅膠柱閃式色譜法純化，洗脫除去帶有三苯基磷酸鹽的某些三氟化物，而得到25毫克(7%)9-甲基喜樹堿，88毫克(20%)標(biāo)題化合物游離堿(含4%甲醇的二氯甲烷)和一些10-羥基喜樹堿的三氟甲基磺酸鹽(用含10%甲醇的二氯甲烷洗脫。用稀乙酸處理，一些標(biāo)題化合物可轉(zhuǎn)化為乙酸鹽。
分析(C25H27N3O6.2.5H2O). 計算 C，58.81;
H，6.12;N，8.23.測定C，58.60;H，5.88;N，7.88;
1HNMR(CDCl3)(s，2)，5.2(s，2)，5.4(q，2)，7.3(d，l)，7.5(d，l)7.6(2，1)，8.0(d，1)，3.3(s，1)質(zhì)譜 m/e 406(MH+)實例2410-氰基喜樹堿的制備將三丁基氰化錫(444毫克，1.4毫摩爾)和四(三苯磷)鈀(276毫克，0.6毫摩爾)在1，2-二氯乙烷(20毫升)的溶液在氬氣下加熱回流2小時，形成鈀-錫-氰化物絡(luò)合物。然后加入按實例22制備的10-羥基喜樹堿的三氟甲基磺酸鹽(266毫克，0.6毫摩爾)，繼續(xù)回流3.5小時。將反應(yīng)物濃縮至其原有體積的三分之一，用等體積的二乙醚研磨·收集沉淀出的黃色固體并干燥，得到82%粗品產(chǎn)率的標(biāo)題化合物(183毫克)。用閃式色譜法純化后，用含2%甲醇的二氯甲烷洗脫，得到115毫克(67%)標(biāo)題化合物。
分析 (C21H15N3O4.1/2H2O 計算 C，65.96;
H，4.22;N，10.99.
測定 C，65.89;H，4.06;N，10.66.1HNMR(CDCl3-MeOD4)(q，2)，7.7(s，1)，7.7-8.4(m，3)，8.6(s，1).
質(zhì)譜 m/e 374(MH+)實例25(20S)10-甲酰基喜樹堿的制備在用火焰烘干的燒瓶中，裝入按實例22制備的10-羥基喜樹堿三氟甲基磺酸鹽(100毫克，0.22毫摩爾)，新蒸餾出的四氫呋喃(THF)(10毫升)和四(三苯磷)鈀(10毫克，9毫摩爾)。將一氧化碳?xì)馀萃ㄈ敕磻?yīng)物中3分鐘，然后反應(yīng)混合物用一個裝有一氧化碳?xì)馇虻娜尤?，浸?0℃的油浴中。邊攪拌并使用一注射器泵，邊在4小時內(nèi)滴加入Bu3SnH(0.73毫升)在無水四氫呋喃(3毫升)的溶液。然后，真空下除去溶劑，殘余物用閃式色譜法(1～2%甲醇，二氯甲烷)純化，最后再用Chromatotron(HarrisonResearch，Palo.Alto，California)純化。用含2%甲醇的二氯甲烷洗脫出標(biāo)題化合物(20毫克，24%)。
分析(C21，H16，N2O5.1-1/3H2O). 計算 C，61.84;H，4.69;N，6.86.
測定.C，61.83;H，4.53;N，6.37.
1H NMR(CDCl3)s，2)，5.4(q，2)，7.7(d，1)，7.8-8.3(m，3)，8.5(s，1)，9.9(s，1). 質(zhì)譜 m/e 377(MH+).
實例26(20S)10-氨基甲基喜樹堿乙酸鹽的制備將依實例24制備的10-氰基喜樹堿(160毫克，0.4毫摩爾)在冰醋酸(45毫升)中的溶液用活潑的蘭尼鎳處理，并在10磅/英寸2(1785.8克/厘米2)的壓力下氫化7小時。催化劑通過特制過濾槽過濾除去，濾液真空下濃縮。固體殘余物用反相柱中壓色譜法純化，用含10%甲醇的水洗脫產(chǎn)物。凍干后，可得到25毫克(15%)吸濕的標(biāo)題化合物。
分析(C23H23N3O6.6H2O). 計算C，50.63;H，6.46;N，7.73.
測定C，50.11;H，6.57;N，7.64.
15.2(s，2)，5.4(s，2)，7.5(s，1)，7.7-8.1(m，3)，8.6(s，1).
實例27(20S)10-氨基甲基喜樹堿乙酸鹽的制備將依實例24制備的10-氰基喜樹堿(160毫克，0.42毫摩爾)的冰醋酸(45毫升)溶液用活潑的蘭尼鎳處理，并在10磅/英寸2(1785.8克/厘米2)的壓力下氫化7小時。催化劑通過特制過濾器(95%SiO2)，真空下濃縮，用反相柱純化。產(chǎn)物用含10%甲醇的水(含有0.02%乙酸)洗脫。收集各組份后，濃縮至較小體積并凍干，得到26毫克(14%)標(biāo)題化合物。
分析(CHNOH，6.46;N，7.73.
測定C，50.11;H，6.57;N，7.64.
15.2(s，2)，5.5(s，2)，7.5(s，1)，8.0(m，3)，8.6(s，1).
實例28(20S)9-嗎啉代甲基喜樹堿的制備將1毫摩爾依實例23制備的10-羥基-9-嗎啉代甲基喜樹堿的三氟甲基磺酸鹽的無水二甲基甲酰胺(DMF)(25毫升)溶液與三乙胺(0.4毫升)，二乙酸鈀(8毫克，0.04毫摩爾)，P3(20毫克，0.08毫摩爾)和99%甲酸(0.08毫升，2毫摩爾)反應(yīng)。此反應(yīng)在氬氣中于60℃加熱6小時，真空下濃縮，用水處理。所需的標(biāo)題化合物和主要付產(chǎn)物，9-甲基喜樹堿，沉淀析出(300毫克)，過濾收集，用硅膠閃式色譜法純化。9-甲基喜樹堿可通過含1%甲醇的二氯甲烷洗脫而分離析出(45毫克，13%)。用含2%甲醇的二氯甲烷洗脫而得到標(biāo)題化合物(93毫克，20%)。
分析(C25H25N3O565.78;H，5.74;N，9.20.
測定C，65.87;H，5.96;N，9.00.
質(zhì)譜 m/e 448(MH+)1(m，4)，3.7(m，4)，4.0(s，2)，5.3(3，2)，5.6(q，2)，7.5(d，1)，7.6(s，1)，7.7(d，1).8.2(d，1)，9.0(s，1).
實例29(20S)10-羥基-9-氰基甲基喜樹堿的制備將依實例8制備的9-三甲基銨甲基-10-羥基喜樹堿甲磺酸鹽(0.42克，0.8毫摩爾)與95%乙醇(35毫升)和氰化鈉(1.26克，25毫摩爾)的混合物，在氬氣氛中，回流3小時。溶劑在真空下除去。加入水(20毫升)，用3N鹽酸將PH值調(diào)至1.5。收集沉淀的粗固體物，干燥。用閃式硅膠柱色譜法純化。產(chǎn)物用含4%和5%甲醇的二氯甲烷洗脫，得到110毫克(33%)的標(biāo)題化合物。
分析(CHNO60.75;H，4.58;N，9.66.
測定C，60.63;H，4.64;N，9.60.
10.9(t，3)，1.8(m，2)，4.2(s，2)，5.2(s，2)，5.3(q，2)，7.5(d，1)，7.6(s，1)，7.9(d，1)，8.4(s，1).
實例30(20S)10-羥基-9-氨基甲基喜樹堿乙酸鹽的制備將依實例29制備的60毫克(0.15毫摩爾)10-羥基-9-氰基甲基喜樹堿的冰醋酸(30毫升)溶液，用大約1克(濕重)的活潑蘭尼鎳處理，在10磅/英寸2(1785.8克/厘米2)的壓力下氫化6小時。過濾除去催化劑，濾液在真空下濃縮成為固體殘余物。然后將濃縮的過濾物溶解在水中，用反相柱色譜法純化，用含10%甲醇的水(含有0.02%冰醋酸)洗脫產(chǎn)物。收集所要的組份。濃縮至較小體積，凍干過夜，得23毫克(33%)的標(biāo)題化合物。
分析CHNOH，6.90;N6.38.
測定C，43.82;H，6.89;N，5.79.
15.0(3，2)，5.1(s，2)，5.4(s，2)，7.2(s，1)，7.5(q，2)，8.4(s，1).
Ⅲ.藥物組合物實例實例A非經(jīng)腸胃給藥的組合物為制備適用于注射給藥的本發(fā)明的非經(jīng)腸胃給藥的藥物組合物。將100毫克式(Ⅰ)化合物的水溶性鹽與10毫升0.9%無菌鹽水混合，將此混合物分裝成適用于注射給藥的一個劑量單位。
實例B口服藥物組合物為制備本發(fā)明的口服藥物組合物，將100毫克式(Ⅰ)化合物與750毫克乳糖混合，將此混合物分裝成一口服劑量單元中，例如硬膠囊，以適用于口服給藥。
權(quán)利要求
1.制備藥物組合物的方法，組合物中包括一種腫瘤細(xì)胞生長抑制有效量的活性組份和一種惰性可藥用載體或稀釋劑，該方法特征在于包括將此活性組份和惰性藥用載體或稀釋劑摻和，其中所述的組合物是用于抑制對此活性成份敏感的動物腫瘤細(xì)胞的生長，其中活性成份是下式化合物或其可藥用鹽、水合物或溶劑化物，
其中X是羥基、氫、氰基、-CH2NH2或甲?；划?dāng)X是氰基、CH2NH2或甲?；鶗r，R是氫，或當(dāng)X是氫或羥基時，R是-CHO或-CH2R1；R1是-O-R2；-S-R2；-N-R2(R3)或-N+-R2(R3)(R4)，倘若R1是-N+-R2(R3)(R4)，此化合物則可與一個可藥用的負(fù)離子相結(jié)合；R2、R3和R4可相同或不同，且可選自H、C1-6烷基、C2-6羥烷基、C1-6二烷基氨基、C1-6二烷基氨基-C2-6烷基、C1-6烷基氨基-C2-6烷基、C2-6氨基烷基或一個三至七員的未取代或取代的碳環(huán)；并且當(dāng)R1是-N-R2(R3)時，R2和R3基團(tuán)可和與它們相連的氮原子一起形成取代或未取代的雜環(huán)，此雜環(huán)也可含有其它雜原子。
2.權(quán)利要求1的制備方法，其中X是羥基，而R是二甲基氨基甲基、N-嗎啉代甲基、N-甲基哌嗪基甲基、(4′-哌啶)N-哌啶基甲基、(2′-羥基乙基)氨基甲基、三甲基銨甲基、環(huán)己基氨基甲基、N-甲基苯胺基甲基、乙氧基甲基、環(huán)丙基氨基甲基、N、N-二甲基氨基乙氧基甲基、N、N-二甲基氨基乙硫基甲基、N、N-二甲基氨基乙基氨基甲基、氰基甲基、氨基乙基或甲?；?或者R是氫而X是氰基、甲酰基或氨基甲基;或者X是氫而R是二甲基氨基甲基或N-嗎啉代甲基。
3.權(quán)利要求1的制備方法，其中化合物是S異構(gòu)體。
4.權(quán)利要求1的制備方法，其中化合物是外消旋混合物。
5.權(quán)利要求3的制備方法，其中X是羥基而R是二甲基氨基甲基。
6.權(quán)利要求5的制備方法，其中化合物是乙酸鹽。
7.權(quán)利要求5的制備方法，其中化合物是單鹽酸鹽、二鹽酸鹽或鈉鹽。
8.權(quán)利要求1的制備方法，其中的組合物是口服劑型。
9.權(quán)利要求1的制備方法，其中的組合物是非經(jīng)腸胃劑型。
全文摘要
水溶性喜樹堿類似物、包括此類似物的藥物組合物和需要時在動物體內(nèi)抑制對此類似物敏感的腫瘤細(xì)胞生長的方法。
文檔編號A61K31/47GK1083817SQ93107879
公開日1994年3月16日 申請日期1993年6月28日 優(yōu)先權(quán)日1987年12月1日
發(fā)明者杰弗里·查爾斯·貝姆, 肯尼恩·喬治·霍爾登, 威廉·丹尼斯·金斯布里, 悉尼·邁克爾·赫克特, 蘭德爾·基思·約翰遜 申請人:史密絲克萊恩貝克曼公司