專利名稱：木菠蘿種子凝集素的生產(chǎn)工藝及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于凝集素的制備及應(yīng)用技術(shù)領(lǐng)域。
凝集素(Jaealin)是一種非免疫來(lái)源的，能結(jié)合糖和凝集細(xì)胞以及沉淀糖復(fù)合物的蛋白質(zhì)或糖蛋白。在已有技術(shù)中，國(guó)外一些研究人員已從幾個(gè)不同國(guó)家和地區(qū)，如菲律賓馬尼拉、日本沖繩島、新加坡、印尼、巴西及南非等地所產(chǎn)的木菠蘿種子中提取了凝集素，定名為Jacalin，其方法是將木菠蘿種子經(jīng)烘干、磨碎、攪拌、沉淀、離心透析、冷凍干燥得凝集素粗品，將粗品經(jīng)Sepharose G-100柱凝膠過(guò)濾;收集主峰、超濾，再經(jīng)免疫球白A-葡聚糖4B柱進(jìn)行親和層析，最后用半乳糖洗脫得Jacalin精品，其純化過(guò)程復(fù)雜，工藝流程長(zhǎng)，成本高。目前有關(guān)Jacalin的應(yīng)用僅局限于科學(xué)研究。
本發(fā)明的目的是從海南島、廣西等地產(chǎn)的木菠蘿種子中分離純化凝集素，定名為HN.Jacalin，并對(duì)HN Jacalin的性質(zhì)、血凝作用，對(duì)細(xì)胞增殖的影響，對(duì)免疫球蛋白的專一性進(jìn)行研究，制備抗HN Jacalin單克隆抗體、HN Jacalin親和層析柱，以及用HN Jacalin來(lái)研究和分泌初乳(colostram)中的分泌型免疫球蛋白A(SIgA)，并對(duì)Jacalin的進(jìn)一步利用進(jìn)行開(kāi)發(fā)研究。
本發(fā)明的技術(shù)方案是①HN Jacalin的純化，取新鮮海南省產(chǎn)木菠蘿種子，37℃烘干、磨碎，加入PH7.2、內(nèi)含0.2M Nacl的0.01M的磷酸緩沖液(PBS)其重量體積比為10%(g/ml)在4℃下連續(xù)攪拌24小時(shí)，(5000轉(zhuǎn)/分)離心30分鐘，取上清液加固體硫酸銨至60%飽和度，4℃靜置12小時(shí)，10000轉(zhuǎn)/分離心30分鐘取沉淀，用相同的PBS透析，將(經(jīng)3～4天)透析后的樣品冷凍干燥，即為HN Jacalin粗品。將粗品直接加到Sepharose 4B柱(瑞典，Pharmacia公司產(chǎn)品)上進(jìn)行親和層析，再用0.8M半乳糖(galactose)洗脫就得到HN Jacalin純品。②海南木菠蘿種子凝集素-葡聚糖(HN Jacalin-Sepharose 4B)親和層析柱的制備。
將Sepharose-4B懸浮于0.5M的碳酸鹽緩沖液，冰塊降溫，加溴化氰(CNBr)，用濃NaOH溶液調(diào)pH至恒定為pH 11，10～15分鐘后用砂芯漏斗快速過(guò)濾，取沉淀用預(yù)冷的10～20倍碳酸鹽緩沖(pH9.5～10)洗滌，懸浮于0.2M碳酸鹽緩沖液中(pH10)，加等體積的含HN-Jacalin的同樣碳酸鹽緩沖液，使pH恒定在pH8.5～9.5之間，室溫?cái)嚢柽^(guò)夜，砂芯漏斗過(guò)濾，用蒸餾水充分洗滌，再用0.1M pH9.0的甘氨酸緩沖液洗滌，水洗，備用。
③初乳SIgA的純化。
合并新鮮收集的人初乳，在3000轉(zhuǎn)/分離心30分鐘，去除脂肪和細(xì)胞碎片，用pH4.52%冰醋酸，將去脂肪初乳酸化以沉淀酪蛋白，離心(5000轉(zhuǎn)/分)去沉淀，上清液用0.1N NaOH將pH調(diào)至7.0，冷凍干燥后對(duì)pH7.2，0.01M pB-0.15M NaCl(PBS)透析。將透析后無(wú)細(xì)胞去脂去酪蛋白的乳清加至HN Jacalin-sepharose 4B柱上，用PBS洗柱至收集液的280nm紫外光吸收小于0.02，改用0.8M D-半乳糖洗脫，洗脫液去鹽去糖后超濾，冷凍干燥即為初乳中的SIgA。
利用本發(fā)明所述生產(chǎn)工藝純化的HN Jacalin經(jīng)HPLC鑒定為單一峰，經(jīng)PH4.3的PAGE也顯示單一區(qū)帶，但經(jīng)PH8.3的不連續(xù)PAGE顯示多帶，等電聚焦后也在PH5-8范圍顯示多帶。HN Jacalin的兩亞基以非共價(jià)鍵結(jié)合，分子量分別為12KD和14.5KD，等電點(diǎn)為PH5-8，分子中酸性氨基酸殘基較多，半胱氨酸含量極少，不存在二硫鍵。
本發(fā)明所述HN-Jacalin是一種D-半乳糖(D-gol)和N-乙酰半乳糖胺(gol-Nac)特異結(jié)合的凝集素，能選擇性結(jié)合和沉淀人血清，初乳中的免疫球蛋白A(IgA)。初乳中高含量的分泌型免疫球蛋白A(SIgA)對(duì)免疫系統(tǒng)尚未發(fā)育完全的新生兒起被動(dòng)免疫作用，因此可以初乳為來(lái)源用HN-Jacalin親和層析來(lái)大量制備SIgA作為臨床藥物。離心后的正常人血清和病人的胸腹水經(jīng)用HN-Jacalin親和柱分離也能得出與HN-Jacalin結(jié)合的免疫球蛋白A(IgA)。
下面是
具體實(shí)施例方式①木菠蘿種子提取液烘干粉200g加入10%(W/V)0.01PBS(內(nèi)含0.2M、NaCl)PH7.2 20001，4℃下攪拌24小時(shí)，5000轉(zhuǎn)/分離心30分鐘，取上清液加固體(NH4)2SO4至60%飽和度，4℃靜置12小時(shí)，10000轉(zhuǎn)/分離心30分鐘，取沉淀，用相同的PBS透析，將經(jīng)3～4天透析后的HN-Jacalin粗品直接加到Sepharose 4B柱上進(jìn)行親和層析，再用0.8M galactose洗脫就得到HN-Jacalin純品，每100g木菠蘿種子烘干粉可得3.08g HN Jacalin蛋白。血凝活力(凝集新鮮人紅血球所需凝集素的最小濃度微克/毫升表示)0.056，每毫克蛋白活力17858。
②HN Jacalin-Sepharose 4B的制備30ml沉淀體積的Sepharose Cl 4B懸浮于30ml 0.5M PH11的碳酸鹽緩沖液，冰塊降溫，加1.5g CNBr，用濃NaOH溶液調(diào)PH至恒定為11，10～15分鐘后用砂芯漏斗快速過(guò)濾，用預(yù)冷的10～20倍碳酸鹽緩沖(PH9.5～10)洗滌，懸浮于30ml 0.2M碳酸鹽緩沖液中(PH10)，加等體積的含150mg HN Jacalin的同樣碳酸鹽緩沖液，使PH恒定在8.5～9.5之間，室溫?cái)嚢柽^(guò)夜，砂芯漏斗過(guò)濾，用蒸餾水充分洗滌，再用0.1M PH9.0的甘氨酸緩沖液洗滌，水洗，備用。
③初乳的純化，見(jiàn)技術(shù)方案。
權(quán)利要求
1.一種木菠蘿凝集素的生產(chǎn)工藝是取新鮮海南省或廣西省產(chǎn)的木菠蘿種子，經(jīng)烘干、磨碎、攪拌、沉淀、離心透析、冷凍干燥得HN-Jacalin粗品，其特征是將HN-Jacalin粗品直接加到Sepharose 4B柱上進(jìn)行親和層析，再用0.8M半乳糖洗脫，就得到HN-Jacalin純品。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的HN Jacalin，其特征是用純化的HN Jacalin和經(jīng)CNBr活化的Sepharose 4B，按通用的方法偶聯(lián)制成HN Jacalin-Sepharose 4B親和層析柱。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所制備的HN Jacalin-Sepharose 4B親和層析柱，其特征是用HN Jacalin-Sepharose 4B親和柱研究和分泌人初乳中的分泌型免疫球蛋白A(SIgA)并用SIgA生產(chǎn)臨床藥物和生化試劑。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所制備的HN Jacalin-Sepharose 4B親和柱，其特征是用HN Jacalin-Sepharose親和柱分離正常人血清和病人胸腹水中的免疫球蛋白A(IgA)，并用IgA生產(chǎn)臨床藥物和生化試劑。
全文摘要
本發(fā)明屬于凝集素的制備及應(yīng)用技術(shù)領(lǐng)域，其目的是從海南島等地產(chǎn)的木菠蘿種子中用Scpharose4B親和柱純化HN Jacalin，制備HNJacalin-Sepharose 4B親和柱，并用之純化人初乳中的SIgA、正常人血清和病人胸腹水中的IgA。本工藝所純化的HN Jacalin血凝活力為0.056微克/毫升，每毫克蛋白活力為17858。本發(fā)明所純化的SIgA和IgA，可用作臨床藥物和生化試劑。
文檔編號(hào)A61K39/395GK1073180SQ9210781
公開(kāi)日1993年6月16日 申請(qǐng)日期1992年11月6日 優(yōu)先權(quán)日1992年11月6日
發(fā)明者朱劍琴 申請(qǐng)人:南京大學(xué)