專利名稱：細胞活素功能異常的調(diào)節(jié)和診斷的制作方法
細胞活素是一類能夠提高正常細胞包括淋巴細胞之功能的天然大分子細胞產(chǎn)物，細胞功能的提高又可反過來傳遞稱為“免疫監(jiān)視”的預期性質(zhì)。然而，因細胞活素生產(chǎn)和/或體內(nèi)組織分布不正常引起的失調(diào)，可最終導致或加重人體的各種疾病。本發(fā)明描述了從生物學上中和失調(diào)之細胞活素和淋巴激活素的潛在損傷作用的簡便方法。通過以特定給藥劑量慎重使用某些dsRNA，盡可能地減輕進一步的器官損傷，并使宿主的病情得以恢復。
細胞活素和淋巴激活素(由淋巴細胞產(chǎn)生的或針對淋巴細胞的)功能異常是與嚴重的人體疾病進行性聯(lián)系的。在本文第一次公開前尚沒有提出有效的療法。盡管對于體細胞的正常功能是不可缺少的(如對于骨髓、免疫系統(tǒng)、關(guān)節(jié)功能、肺功能等)，但細胞活素生產(chǎn)的異常也直接關(guān)系到病情加速發(fā)展及發(fā)病。
細胞活素產(chǎn)生上的異常包括(a)由不能正常產(chǎn)生某些細胞活素的細胞不適當?shù)厣a(chǎn)，(b)由天然產(chǎn)生這些大分子的細胞過量產(chǎn)生，(c)產(chǎn)生不正常的多肽，如在其引起活性或細胞靶范圍改變的氨基酸序列上有細微錯誤的效應物細胞活素分子;以及(d)在組織分布或細胞內(nèi)濃度上的異常，以致在沒有造成細胞損傷的情況使細胞對其存在不能耐受。
異常淋巴活素和人體疾病的特定例子(A)腫瘤壞死因子(TNF)。TNF是一種巨噬細胞/單核細胞衍生的免疫介導物，已發(fā)現(xiàn)與膿毒性休克、惡病質(zhì)、移植物抗宿主疾病(piguet et al.，J.of Experimental Medicine，1987，Vol.166，pp.1280-1289)、寄生蟲感染、血管病及惡性腫瘤有關(guān)聯(lián)。具體地說，其水平增加與臨床預后不良有關(guān)。
TNF還可刺激細胞產(chǎn)生其他細胞毒性因子，后者又可引起其他細胞甚至腦細胞(如某些少突神經(jīng)膠質(zhì)細胞的炎癥，或致使細胞死亡?；加蠬IV感染的病人TNF升高(每毫升大于50微微克，同時表現(xiàn)有發(fā)育歷程和智力的進行性減退(Mintz et al.，Am.Journal Diseases of Children，1989，Vol.143，pp.771-774)。白細胞介素(特別是IL-1)可促進TNF產(chǎn)生，從而患病者常常在不是單一的，而是一組環(huán)境條件下出現(xiàn)通過某種類型的生物學級聯(lián)效應誘導的異常(如上定義的)淋巴激活素。
本發(fā)明的目的，即治療目的在于從生物學上中和或在各種水平上控制不能共存于同一個體的一定范圍的異常淋巴激活素。
惡性腫瘤病人體內(nèi)TNF水平可增加到正常上限以上，且在兒童中可高達每升約40毫微克(Saarinen，et al.，Cancer Research，1990，Vol.50，pp.592-595)。
(B)干擾素。γ干擾素產(chǎn)生增加是HIV感染胸腺衍生之細胞的特征(Arya et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，1985，Vol.82，pp.8691-8695)。伴有濾泡溶解的HIV感染的患病淋巴結(jié)顯示有高水平的γ干擾素產(chǎn)生量(Emile et al.，Journal of Clinical Investigation，Vol.86，pp.148-159)。干擾素水平高的病人要比與之相對應的一組含有可檢測量但較低水平淋巴激活素之病人的臨床預后要差。因此，淋巴激活素產(chǎn)生異常(如上文限定的)可使自然傾向恢復的疾病呈現(xiàn)更嚴重的病理學改變。
(C)白細胞介素。在具有嚴重圍產(chǎn)期并發(fā)癥的情況下，嬰幼兒的β-IL-1水平升高(280±116微微克/ml;Miller et al.，Journal of Pediatrics，1990，Vol.117，pp.961-965)。這些研究表明骨髓漿中IL-1，IL-6和TNF與圍產(chǎn)期的臨床并發(fā)癥有關(guān)。IL-1的濃度與瘧疾的嚴重程度有關(guān)(Kwitetkowski et al.，Lancet，Vol.336，pp.1201-1204，November 17，1990)。TNF產(chǎn)生量的暫時增加是對瘧疾感染的正常反應，但TNF產(chǎn)生量過高則預示病人可能腦內(nèi)瘧疾感染及致命性結(jié)局。
(D)淋巴激活素產(chǎn)生異常所造成的其他代謝或細胞病理表現(xiàn)。檢測異常改變的常規(guī)生物化學方法是通過檢測淋巴激活素敏感性細胞內(nèi)途經(jīng)完成的，即檢測2′-5′寡腺苷酸途徑(有時也稱為2′-5′寡腺苷酸體系或簡稱2-50AS)?？蓹z測不同類型細胞中的這一途徑，這些不同類型的細胞則可用2或3色流動細胞計數(shù)法或梯度離心法等不同方法進行分級分離。特定紊亂可同時存在于T4輔助/誘導細胞、T8抑制/胞毒性細胞、NK(天然殺傷)細胞、B細胞(參予抗體產(chǎn)生)、CT(胞毒性T細胞)或ADCC(抗體依賴性胞毒細胞)。這些改變可受細胞外TNF、干擾素(α、β、γ)或IL-1、2、3、4、5、6、7、8等的影響，而這些可單獨作用或協(xié)同作用或通過放大“級聯(lián)”發(fā)揮作用。
患類風濕病(關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性狼瘡)的病人有典型的可檢測的干擾素血癥(用生物檢測法測得每毫升大于6IU，用RIA法測得每毫升大于1IU)。反之，當病人漸漸產(chǎn)生干擾素特異性抗體時，他們可以只有未危及內(nèi)臟的非活動性類風濕病(Von Wussow et al.，Rheumatology International，1988，Vol.8，pp.225-30)。本發(fā)明的一個目的是發(fā)展抗體的功能上或使用上的等同物，即“細調(diào)”細胞外細胞活素水平使之達到對宿主相對無毒性并可產(chǎn)生醫(yī)療上的益處。
檢測關(guān)節(jié)炎病人滑液中的相關(guān)細胞活素，特別是TNF和IFN，結(jié)果支持組織損傷與淋巴激活素活性間相互關(guān)系結(jié)論(Hopkins et al.，Clinical and Experimental Immunology，1988，Vol.73，pp.88-92)。
攻擊性激活免疫感受態(tài)細胞甚至可導致與IL-2受體及TNF水平升高有關(guān)的脈管炎癥。這種情況可能在最近文獻中描述的包括冠狀動脈損傷的Kawasakai氏病中顯得尤為突出(Japanese Journal of Allergology，Vol，39，pp.118-123，1990，F(xiàn)eb.)。
過渡激活的免疫感受態(tài)細胞(如T細胞介導的細胞毒性)還可侵害肌細胞，引起肌炎和肌群的炎性疾病。本說明書中，I顯示2-5OAS途徑功能的生化失調(diào)與肌肉的炎性病變及神經(jīng)痛有關(guān)，并顯示經(jīng)從生物學上中和異常改變的細胞活素可有效地控制這些癥狀。
本文所述方法中使用的dsRNA可以是多聚肌苷酸和多聚胞苷酸的復合物，其中多聚胞苷酸可含有一定比例的尿嘧啶堿基或鳥嘌呤堿基，如5個有1個至30個中有1個這樣的堿基(poly I.poly(C4-29X＞U或G))。
dsRNA可以有通式rIn·r(C11-14，U)n或rIn·r(C12，U)n。下文討論 dsRNA的其他適當例子。
術(shù)語“錯配dsRNA”是指其中配對鏈間氫鍵鍵合(堿基堆積)相對完整的dsRNA，即其中每29個連續(xù)堿基對殘基中平均有不到1個堿基對中斷。據(jù)此，“錯配dsRNA”應是可以理解的。
本發(fā)明優(yōu)選的錯配dsRNA是基于選自poly(Cn，U)和poly(Cn，G)的共多聚核苷酸，其中n是4-29的正整數(shù)，并且所說共多聚核苷酸是通過修飾rIn·rCn，以沿著多聚核糖胞苷酸(rCn)鏈摻入未配對堿基(尿嘧啶或鳥嘌呤)而形成的多聚核糖肌苷酸和多聚核糖胞苷酸之復合物的錯配類似物。另外，dsRNA可以是通過修飾多聚核糖肌苷酸(rIn)的核糖基骨架，如摻入2′-O-甲基核糖基殘基而從poly(I)·poly(C)dsRNA衍生的dsRNA。錯配復合物也可以與賴氨酸和纖維素等RNA穩(wěn)定聚合物復合。這些rIn·rCn的錯配類似物最好是Carter和Ts′o在美國專利US 4，130，641和US 4，024，222中所述的通式為rIn·(C11-14，U)n或rIn·r(C29，G)n的類似物。本文所述的dsRNA一般均適于按照本發(fā)明的方法使用。優(yōu)選的錯配dsRNA是可以凍干粉末形式制得的，HEM Pharmaceuticals Corporation Rockville，MD，USA的rIn·(C11-14，U)n或AMPLIGEN 。
用于本發(fā)明的錯配dsRNA的其他例子包括poly(I)·poly(C4，U)poly(I)·poly(C7，U)poly(I)·poly(C13，U)poly(I)·poly(C22，U)poly(I)·poly(C20，G)poly(I)·poly(C29，G)和poly(I)·poly Cp23G＞p適用于本發(fā)明的另一類dsRNA是具有限定結(jié)構(gòu)的短dsRNA，如有下列通式的寡核苷酸5′鎖區(qū)-(I)n-鎖區(qū)3′3′鎖區(qū)-(C)m-鎖區(qū)5′其中m和n各自大于5并小于100，I是一磷酸肌苷，C是一磷酸胞苷，且其中一條鏈上的鎖序列(locks)互補于另一條鏈上的鎖序列，或具有下列結(jié)構(gòu)的寡核苷酸5′鎖區(qū)-〔(I)xA〕j-鎖區(qū)3′3′鎖區(qū)-〔(C)yU〕k-鎖區(qū)3′其中X和Y各自大于5并小于25，j和k各自至少為1并小于10 I和C定義同上，A是I以外的核苷酸，且U是有與A配對之堿基的核苷酸。
另外，短寡核苷酸可具有下列結(jié)構(gòu)5′(I)n-絞鏈區(qū)-(C)m 3′其中n、m、I和C定義同上。
這些寡核苷酸可以有使一條鏈不與相對鏈中的核苷酸互補的取代。這些寡核苷酸最好通過互補異聚體的內(nèi)部定位得以穩(wěn)定化，且期望鎖區(qū)或絞鏈或兩者含有互補異聚體區(qū)域。另外這些寡核苷酸最好有單鏈尾部。PCT/US89/02172中已詳細地描述了這些寡核苷酸。
IL、TNF-α和IFN都是免疫調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)，但它們的失調(diào)可最終導致組織病變。IL-1和TNF共有包括熱原性、激活T細胞及激活中性白細胞在內(nèi)的活性。在患有類風濕性關(guān)節(jié)炎和其他炎性疾病的病人體內(nèi)見有高水平的上述蛋白質(zhì)。
本發(fā)明人在雄性Spraque-Dawley大鼠(體重300-400克)身上觀察到，給予大腸桿菌脂糖(每公斤2mg)，如所預期的那樣，于60分鐘或更短時間內(nèi)出現(xiàn)典型的TNF峰值(從0至＞50，000單位/ml)。此后短期內(nèi)占相當比例的動物出現(xiàn)乏力、發(fā)燒、脫水等病癥，以至死亡。然而，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，如果預先或其后用錯配dsRNA(1-20mg/kg)處理動物，使之血內(nèi)水平達到1-200μg/ml，則動物可以存活并只有輕微、短暫的患病征象。因此，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)以一定程序給予一定量的dsRNA可從生物學上中和某些與宿主發(fā)病有關(guān)的淋巴激活素作用。
其后本發(fā)明人進一步鑒定了一組患有再發(fā)性發(fā)燒和淋巴結(jié)腫大的個體。其中有的還有下述病毒感染的證據(jù)。本發(fā)明人用ELISA法檢測它們血液內(nèi)升高的循環(huán)IL-1和TNF蛋白質(zhì)，并同時證明了淋巴激活素激活的細胞內(nèi)生化途徑(2′-5′寡腺苷酸合成酶)的高活性，后者作為其終末介導物用以激活蛋白質(zhì)核糖核酸酶L。該2′-5′-寡腺苷酸/核糖核酸酶L途徑圖解顯示于本發(fā)明人的歐洲專利申請0285263 A3的圖2中，并已使用Carter等人所述的方法(The Lancet，1286-1292(June6，1987)估測了該途徑的活性。
這一研究工作涉及到與肌一關(guān)節(jié)炎癥有關(guān)的細胞活素依賴性途徑中的代謝高活性。在Charlotte，North Carolina就16個可估測的個體進行了核糖核酸酶L活性的研究，得到下示結(jié)果16個個體中有10個提高了核糖核酸酶L活性(范圍160-500)16個個體中有3個顯示正常核糖核酸酶L活性(62，67，94)16個個體中有3個顯示低核糖核酸酶L活性(7，44，58)為便于分類，將測定值大于100者定為升高，60至100為正常，小于60為降低。臨床觀察顯示，有最高核糖核酸酶L含量的實驗個體表現(xiàn)有最嚴重的神經(jīng)痛，中度升高的個體表現(xiàn)有混合病癥。而核糖核酸酶L水平最低者則表現(xiàn)有腦病變，證明存在以識別能力缺乏為特征的中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能失調(diào)。有正常核糖核酸酶L水平的個體表現(xiàn)有輕度慢性疲勞，并且能夠工作或回到學校學習，故這些病人都有相對好的臨床狀態(tài)。


圖1顯示巨大細胞/HHV-6檢測的結(jié)果，其中包括將嚴重病人的外周血細胞培養(yǎng)10天，并用抗HHV-6的單克隆抗體著染。作為dsRNA處理時間的函數(shù)，記錄HHV-6陽性細胞的百分比。配對t試驗表明HHV-6陽性細胞的降低具有統(tǒng)計學上的意義(P＜0.01，2個邊的)。檢測約進行80周，并在dsRNA治療前進行初次檢測。
附圖1顯示患有嚴重神經(jīng)痛、肌肉痛及復發(fā)性發(fā)熱的病人血細胞(淋巴細胞)中該途徑活性過度升高情況。當外周血中該途徑趨于正常時，病人腦功能癥狀加重，提示這些特殊病人體內(nèi)定位在中樞區(qū)域(腦部)的細胞活素產(chǎn)生失調(diào)要比損傷外周體組織之分子的產(chǎn)生失調(diào)更為明顯。
使病人體內(nèi)錯配dsRNA水平達到與本發(fā)明人所發(fā)現(xiàn)的實驗動物體內(nèi)有效的相似血液水平后，50%以上的病人改變了臨床狀態(tài)，并且如實驗動物一樣，其細胞內(nèi)2-5A生化途徑的異常情況也趨于正常。
有很大比例的被檢病人并發(fā)有與免疫系統(tǒng)細胞密切相關(guān)之人皰疹病毒(HHV-6)的感染(Levy et al，Virology，1990，Vol.178，pp，113-121)。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)(如圖1所示)，接受dsRNA的個體還同時顯示有循環(huán)HHV-6滴度降低，以及與HIV(愛滋病病毒)具有有限結(jié)構(gòu)同源性的反轉(zhuǎn)錄病毒的水平降低。
在合作的實驗室實驗中，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)事實上HHV-6可使人血細胞中包括TNF和IL-1在內(nèi)的各種細胞活素的量幾乎與本發(fā)明人所發(fā)現(xiàn)的dsRNA能在動物或人體內(nèi)生物學中的量差不多。
分兩部分對細胞活素異常進行了分析。第一部分(A)是分析HHV-6感染人細胞后釋放的IL-1-β蛋白質(zhì)。
誘導劑 所產(chǎn)生的IL-1量(pg/ml)A.HHV-6 3，400B.脂多糖(陽性對照) 5，300C.未刺激的(陰性對照) 725第二部分中分析了HHV-6感染人細胞后釋放的TNF-α蛋白質(zhì)。
誘導劑 TNF量(pg/ml)A.HHV-6 1，825B.LPS 810C.未刺激的 190上表中指出了使用ELISA試劑盒，按照制造廠商(R和D Systems，Minneapolis，MN)推薦的方法檢測上清液中的細胞活素(IL-1和TNF-α)水平所得結(jié)果。向PBMC培養(yǎng)物中加入HHV-6(102TCID50/ml)，培養(yǎng)2-6天后檢測淋巴激活素/細胞活素水平。
它們在靶細胞水平上所發(fā)揮的作用在于持續(xù)損傷活細胞功能。更重要的是，病毒介導作用盡管是由于在與細胞活素產(chǎn)生無典型關(guān)聯(lián)的細胞和組織中產(chǎn)生“正常”淋巴激活素，但事實上是引起了細胞活素的功能失調(diào)狀態(tài)，因為浸沒于新釋放之細胞活素中的細胞不能夠抵擋它們的毒性作用并進而發(fā)生形態(tài)學和功能改變，導致病情加速發(fā)展。
因此，本發(fā)明人得出的結(jié)論是，在第一種情況下，中和這些毒性大分子的新機制可能是由于阻止其產(chǎn)生所致，或者是在靶細胞水平上(在此水平上它們可進一步損傷活細胞功能)中和它們的作用。
權(quán)利要求
1.調(diào)節(jié)與細胞活素異常產(chǎn)生有關(guān)之疾病病理學過程的方法，包括給具有細胞活素功能失調(diào)表現(xiàn)的病人使用保持體內(nèi)平衡有效量的dsRNA，使之足以恢復異常細胞活素釋放或中和對靶組織有毒害作用的細胞活素。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中細胞活素是白細胞介素、干擾素或腫瘤壞死因子。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中dsRNA是一種錯配的dsRNA。
4.根據(jù)權(quán)利要求3的方法，其中錯配dsRNA是與多聚尿苷酸復合的多聚腺苷酸。
5.根據(jù)權(quán)利要求4的方法，其中錯配dsRNA是多聚肌苷酸和多聚胞苷酸的復合物，且其中所說的多聚胞苷酸鏈內(nèi)5個堿基中有1個至30個中有1個為尿嘧啶或鳥嘌呤堿基。
6.根據(jù)權(quán)利要求5的方法，其中錯配dsRNA是rIn·r(C11-14，U)n，或錯配dsRNA含有rIn·r(C11-14，U)n的鍵合區(qū)域并表現(xiàn)出rIn·r(C11-14，U)n的有利于治療的比例性質(zhì)。
7.根據(jù)權(quán)利要求8的方法，其中錯配dsRNA的給藥量使每毫升病人全身循環(huán)血液達到2至1000μg錯配dsRNA的水平。
8.根據(jù)權(quán)利要求3的方法，其中dsRNA是有下列結(jié)構(gòu)式的短寡核苷酸5′鎖區(qū)-(I)n-鎖區(qū)3′3′鎖區(qū)-(C)m-鎖區(qū)5′其中m和n各自是大于5并小于100的整數(shù)，I是-磷酸肌苷，G是-磷酸胞苷;或5′鎖區(qū)-〔(I)xA〕j-鎖區(qū)3′5′鎖區(qū)-〔(C)yU〕k-鎖區(qū)3′其中x和y各自大于5并小于25，j和k各自至少為1并小于10I和C定義同上，A是I以外的核苷酸，U是與A堿基配對的核苷酸;或5′(I)n-絞鏈區(qū)-(C)m3′其中n、m、I和C定義同上，條件是一條鏈中的鎖區(qū)與相對鏈中的鎖區(qū)互補。
9.根據(jù)權(quán)利要求8的方法，其中寡核苷酸通過互補異聚體的內(nèi)部定位得以穩(wěn)定化，且鎖區(qū)或絞鏈區(qū)或兩者含有互補異聚體區(qū)域。
全文摘要
細胞活素作為天然大分子細胞產(chǎn)物可提高正常細胞功能，當其失調(diào)時可引起人體的多種疾病或使病情加重。以特定給藥劑量使用dsRNA時，可從生物學上中和失調(diào)之細胞活素和淋巴激活素的潛在損傷作用，并可使宿主的病情得以改善。
文檔編號A61P37/00GK1068738SQ92105778
公開日1993年2月10日 申請日期1992年7月15日 優(yōu)先權(quán)日1991年7月16日
發(fā)明者W·卡特 申請人:Hem藥物有限公司