專利名稱：用于遏制光暴露導(dǎo)致的異常皮膚細(xì)胞的形成的試劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于遏制光暴露導(dǎo)致的異常皮膚細(xì)胞的形成的試劑 。
背景技術(shù)：
近年來，光暴露如陽光照射對皮膚的影響正成為嚴(yán)重的世界問題。特別地，在美國、歐洲和澳大利亞，皮膚癌發(fā)病率的增加已成為嚴(yán)重的問題。皮膚癌增加的因素之一是由于臭氧層被氯氟烴破壞引起的日常生活中紫外線暴露的量日益增加。當(dāng)今的世界中，不可能避免光暴露導(dǎo)致的形成異常皮膚細(xì)胞的風(fēng)險，特別是光致癌的風(fēng)險(即，光暴露如紫外線暴露誘導(dǎo)的皮膚癌)。
傳統(tǒng)上，用手術(shù)治療、化療和放療組合治療皮膚癌。但是，取決于皮膚癌的檢測時機和癥狀的程度，皮膚癌通常可能未被有效治療，并且治療可能產(chǎn)生相當(dāng)?shù)娜粘Ｉ钬?fù)擔(dān)。 這些問題顯著地降低了個體的生活質(zhì)量(QOL)。因此，強烈需要建立預(yù)防皮膚癌發(fā)生的方法。
傳統(tǒng)上，對紫外線導(dǎo)致的皮膚癌的預(yù)防通過已知方法來進(jìn)行，其中，使用含有紫外線吸收劑(如甲氧基肉桂酸辛酯、丁基甲氧基二苯甲酰甲烷和二苯甲酮(benzophenone)) 和紫外線散射劑(如二氧化鈦和氧化鋅)的外用藥來保護(hù)皮膚抵擋紫外線。
但是，雖然紫外線吸收劑和紫外線散射劑能預(yù)防紫外線暴露，有報道稱這些試劑具有不利影響，例如皮膚刺激(irritation)。換句話說，雖然這些試劑能抑制光暴露導(dǎo)致的異常皮膚細(xì)胞的形成，但這些試劑具有由于接觸性刺激等而導(dǎo)致病癥的潛勢。
此外，含有上述成分的這些藥物必須在紫外線暴露之前應(yīng)用到皮膚上，因為目的是預(yù)防皮膚對紫外線的暴露。因此，在紫外線吸收劑和紫外線散射劑的情況下，如果使用者忘記將這些試劑應(yīng)用至皮膚或者由于出汗等原因這些試劑從皮膚上被移除時，就不能預(yù)防皮膚的紫外線暴露，導(dǎo)致誘導(dǎo)DNA損傷。所以，不能避免光暴露導(dǎo)致的形成異常皮膚細(xì)胞的風(fēng)險。
因此，如果可通過對皮膚沒有不利影響的成分抑制皮膚組織中異常細(xì)胞的形成， 甚至當(dāng)皮膚直接暴露給陽光例如紫外光時也可抑制的話，這將是抵擋異常皮膚細(xì)胞形成的有效預(yù)防性手段，其是用紫外光吸收劑或紫外光散射劑無法實現(xiàn)的。在這些情況下，存在對開發(fā)能遏制皮膚組織中光暴露導(dǎo)致的異常皮膚細(xì)胞的形成且不導(dǎo)致皮膚刺激等的預(yù)防性試劑的強烈需求。
同時，嘌呤核酸，例如磷酸腺苷具有下述效果保濕和預(yù)防或減輕皺紋(見專利文獻(xiàn)I);預(yù)防或減輕色素沉著(見專利文獻(xiàn)2);促進(jìn)膠原產(chǎn)生(見專利文獻(xiàn)3)等等，并且已經(jīng)作為對皮膚具有化妝品和藥物有益效果的成分引起關(guān)注。
此外，已知一些關(guān)于嘌呤核酸的抗癌效果的文獻(xiàn)，其中調(diào)研了對化學(xué)物質(zhì)誘導(dǎo)的癌細(xì)胞生長的遏制(見非專利文獻(xiàn)I和2)。但是，這些調(diào)研沒有實際驗證嘌呤核酸對陽光例如紫外光導(dǎo)致的癌細(xì)胞的效果。僅通過腹腔給藥研究了其效果，這并非使用者易于利用的。
如上文所述，對于光致癌和(皮膚)外用嘌呤核酸之間的關(guān)系還沒有進(jìn)行過研究， 嘌呤核酸外用時如何影響對光暴露導(dǎo)致的異常皮膚細(xì)胞的形成的遏制、或?qū)庵掳┑念A(yù)防或治療是完全未知的。
引用列表
專利文獻(xiàn)
PTL I :日本未審查的專利公開No. 2006-225271
PTL I :日本未審查的專利公開No. 2006-206575
PTL I W0 2005/34902
非專利文獻(xiàn)
NPL I Cancer Letters 6(1979)pp. 291-300
NPL 2 Euro. J. Cancer Clin. Oncol. Vol. 24(1988)pp. 1491-1497發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個目的是提供用于遏制光暴露如紫外光暴露導(dǎo)致的異常皮膚細(xì)胞形成(特別地，皮膚癌的發(fā)展)的試劑。
本發(fā)明的發(fā)明人進(jìn)行了深入的研究，力圖實現(xiàn)上述目的，并且發(fā)現(xiàn)，嘌呤核酸，例如磷酸腺苷，可降低光暴露導(dǎo)致的皮膚細(xì)胞中的DNA突變，并且施加遏制由光暴露導(dǎo)致的異常皮膚細(xì)胞形成的效果，特別地，預(yù)防光致癌的效果，這通過誘導(dǎo)被突變的細(xì)胞的凋亡而實現(xiàn)；并且，嘌呤核酸當(dāng)在光暴露之前和之后應(yīng)用至皮膚時均可有效抑制或預(yù)防光暴露導(dǎo)致的異常皮膚細(xì)胞的形成，特別地，皮膚癌的發(fā)展。本發(fā)明通過進(jìn)一步的研究基于上述發(fā)現(xiàn)而完成。
特別地，本發(fā)明提供了下文所述的發(fā)明。
第I項一種嘌呤核酸，用于遏制光暴露導(dǎo)致的異常皮膚細(xì)胞的形成，其中所述嘌呤核酸是外用的。
第2項如第I項所述的嘌呤核酸，其是選自單磷酸腺苷及其鹽構(gòu)成的組中的至少一個成員。
第3項如第I或2項所述的嘌呤核酸，其中對異常皮膚細(xì)胞的形成的遏制伴隨DNA 修復(fù)或?qū)NA突變的遏制。
第4項如第I 3項中任一項所述的嘌呤核酸，其中對異常皮膚細(xì)胞的形成的遏制伴隨誘導(dǎo)凋亡。
第5項如第I 4項中任一項所述的嘌呤核酸，其中對異常皮膚細(xì)胞的形成的遏制是對皮膚腫瘤的預(yù)防。
第6項如第5項所述的嘌呤核酸，其中對皮膚腫瘤的預(yù)防伴隨對皮膚腫瘤的起始 (initiation)的遏制。
第7項如第5或6項所述的嘌呤核酸，其中對皮膚腫瘤的預(yù)防伴隨對皮膚腫瘤的促進(jìn)的遏制。
第8項如第5 7項中任一項所述的嘌呤核酸，其中對皮膚腫瘤的預(yù)防目的在于預(yù)防皮膚癌。
第9項如第I 8中任一項所述的嘌呤核酸，其中所述嘌呤核酸以每cm2皮膚面積O. 01至IOmg的量皮膚應(yīng)用。
第10項如第I 9中任一項所述的嘌呤核酸，其以每天2至5次的頻率皮膚應(yīng)用。
第11項如第I 10中任一項所述的嘌呤核酸，其中所述光是UV-B0
第12項如第I 11中任一項所述的嘌呤核酸，其中所述嘌呤核酸通過在光照射之前或之后應(yīng)用至皮膚而使用。
第13項一種用于遏制光暴露導(dǎo)致的異常皮膚細(xì)胞的形成的組合物，所述組合物包含作為活性成分的嘌呤核酸。
第14項如第13項所述的組合物，包含基于所述組合物總重而言為O. 5至20wt% 的量的選自由單磷酸腺苷及其鹽組成的組中的至少一個成員。
第15項如第13或14項所述的組合物，作為外用藥、準(zhǔn)外用藥或化妝品產(chǎn)品。
第16項一種遏制光暴露導(dǎo)致的異常皮膚細(xì)胞的形成的方法，所述方法包括向其中由于光暴露已發(fā)展出或者可能發(fā)展出DNA突變的皮膚區(qū)域皮膚應(yīng)用有效量的嘌呤核酸。
第17項一種遏制光暴露導(dǎo)致的異常皮膚細(xì)胞的形成的方法，所述方法包括步驟
向已經(jīng)或者可能暴露于光的皮膚區(qū)域皮膚應(yīng)用有效量的嘌呤核酸；和
驗證在已向其皮膚應(yīng)用了所述嘌呤核酸的皮膚區(qū)域中異常皮膚細(xì)胞沒有形成。
第18項嘌呤核酸用于制造用于遏制光暴露導(dǎo)致的異常皮膚細(xì)胞的形成的試劑的用途。
根據(jù)本發(fā)明，可降低光暴露產(chǎn)生的皮膚細(xì)胞中DNA突變體的量，且有效抑制或預(yù)防光暴露導(dǎo)致的異常皮膚細(xì)胞的形成，特別是光致癌。因此，本發(fā)明提供了一種用于降低光暴露導(dǎo)致的形成異常皮膚細(xì)胞的風(fēng)險、特別是發(fā)展出皮膚癌的風(fēng)險的有效預(yù)防性手段。此外，因為本發(fā)明的用于遏制異常皮膚細(xì)胞形成的試劑具有DNA修復(fù)的作用和遏制突變的作用，因此當(dāng)所述試劑在光暴露之前或之后應(yīng)用至皮膚時，可以預(yù)料到對光暴露導(dǎo)致的異常皮膚細(xì)胞的形成、例如光致癌的遏制或預(yù)防。因此，所述試劑的常規(guī)使用允許遏制或預(yù)防光暴露導(dǎo)致的異常皮膚細(xì)胞的形成，而不必須在出外之前使用所述試劑，并且不導(dǎo)致皮膚刺激。
附圖
簡述
圖Ia圖Ia顯示了實施例I中對單磷酸腺苷對正常人上皮角化細(xì)胞中半胱天冬酶 (caspase)活性的影響的評估結(jié)果。
圖Ib圖Ib顯示了實施例I中對單磷酸腺苷對經(jīng)紫外光照射的人上皮角化細(xì)胞中半胱天冬酶活性的影響的評估結(jié)果。
圖2圖2顯示了實施例2中對單磷酸腺苷對經(jīng)紫外光照射的小鼠上皮角化細(xì)胞中 DNA突變(CPD)的影響的評估結(jié)果。
圖3圖3顯示了示出實施例3中每組小鼠背部的圖的結(jié)果，其中在不同的組中喂飼用紫外光從背后照射過的小鼠應(yīng)用測試溶液的組，向其應(yīng)用含有單磷酸腺苷的乙醇水溶液；應(yīng)用基質(zhì)的組，向其應(yīng)用乙醇水溶液；和無應(yīng)用的組，對其沒有應(yīng)用。
圖4圖4顯示了通過測量實施例3中每組中觀察到腫瘤的小鼠的種群比例(腫瘤發(fā)病率％ )獲得的結(jié)果，其中在不同的組中喂飼用紫外光從背后照射過的小鼠應(yīng)用測試溶液的組，向其應(yīng)用含有單磷酸腺苷的乙醇水溶液；應(yīng)用基質(zhì)的組，向其應(yīng)用乙醇水溶液； 和無應(yīng)用的組，對其沒有應(yīng)用。
具體實施方式
在本發(fā)明中，用嘌呤核酸來遏制光暴露導(dǎo)致的異常皮膚細(xì)胞的形成。
換句話說，在本發(fā)明中，嘌呤核酸用作遏制光暴露導(dǎo)致的異常皮膚細(xì)胞形成的試劑。所述試劑有時在本文中被稱為“本發(fā)明的試劑”。
此外，本發(fā)明的用于遏制光暴露導(dǎo)致的異常皮膚細(xì)胞的形成的組合物含有作為活性成分的嘌呤核酸。
在本申請文件中，光暴露導(dǎo)致的異常皮膚細(xì)胞的形成的例子包括皮膚腫瘤。
在本申請文件中，如對光暴露導(dǎo)致的異常皮膚細(xì)胞的形成的遏制和預(yù)防中，術(shù)語 “遏制”和“預(yù)防”可被解釋為具有相似的含義。
“對光暴露導(dǎo)致的異常皮膚細(xì)胞的形成的遏制”的例子包括“對皮膚癌的預(yù)防”。
在本申請文件中，術(shù)語“伴隨”表示“與另外的事件相關(guān)的事件的發(fā)生”。哪個事件是起因或結(jié)果并不重要，這些事件無須同時發(fā)生。
在本發(fā)明中，嘌呤核酸是嘌呤、具有嘌呤核作為骨架的多種衍生物及其鹽的合稱術(shù)語。在本發(fā)明中用作為活性成分的嘌呤和具有嘌呤核作為骨架的多種衍生物的例子沒有特別限制，只要它們是藥物可接受的或化妝品可接受的即可。其特定例子包括腺嘌呤、 鳥嘌呤、其脫氨化合物(次黃嘌呤和黃嘌呤)、腺苷、鳥苷、肌苷、磷酸腺苷(單磷酸腺苷，例如2’ -單磷酸腺苷、3’ -單磷酸腺苷和5’ -單磷酸腺苷；二磷酸腺苷，例如5’ - 二磷酸腺苷；和三磷酸腺苷，例如5’ -三磷酸腺苷)、磷酸鳥苷(單磷酸鳥苷，例如3’ -單磷酸鳥苷和5’ -單磷酸鳥苷；二磷酸鳥苷，例如5’ - 二磷酸鳥苷；和三磷酸鳥苷，例如5’ -三磷酸鳥苷)、腺苷酸基琥拍酸(adenylosuccinate)、黃嘌呤核苷酸、肌苷酸、黃素腺嘌呤二核苷酸 (FAD)、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)等等。這些中，具有優(yōu)秀的遏制或預(yù)防光暴露導(dǎo)致的異常皮膚細(xì)胞的形成的作用的那些的例子包括，優(yōu)選磷酸腺苷；更優(yōu)選單磷酸腺苷；尤其優(yōu)選5’ -單磷酸腺苷(AMP)。
此外，嘌呤核酸的鹽形式?jīng)]有特別限制，只要其是藥物可接受或化妝品可接受的即可。其特定例子包括堿金屬鹽，例如鈉鹽和鉀鹽；堿土金屬鹽，例如鎂鹽、鈣鹽和鋇鹽；堿性氨基酸鹽，例如精氨酸和賴氨酸；銨和銨鹽，例如，三環(huán)己基銨鹽；和多種烷醇胺鹽，例如單乙醇胺、二乙醇胺、三乙醇胺、單異丙醇胺、二異丙醇胺和三異丙醇胺。這些中，優(yōu)選堿金屬鹽，進(jìn)一步優(yōu)選鈉鹽。
這些嘌呤核酸可單獨使用，或者以作為用于遏制光暴露導(dǎo)致的異常皮膚細(xì)胞的形成的試劑的活性成分的兩種或多種的任意組合而使用。
包含嘌呤核酸作為活性成分并且用于遏制光暴露導(dǎo)致的異常皮膚細(xì)胞的形成的本發(fā)明的組合物中，嘌呤核酸的含量可根據(jù)嘌呤核酸的類型、制劑形式、想要的效果等等而合適地確定。特別地，組合物中嘌呤核酸的含量為基于組合物總重而言O(shè). 5至20wt%，優(yōu)選O. 5至IOwt %,更優(yōu)選I至IOwt %,進(jìn)一步優(yōu)選I至7wt %,及尤其優(yōu)選2至5wt %。通過滿足上述含量范圍，可更有效地抑制或預(yù)防異常皮膚細(xì)胞的形成。
可通過除了嘌呤核酸之外還組合藥物可接受的或化妝品可接受的基質(zhì)或載體，以多種形式制備本發(fā)明的用于遏制光暴露導(dǎo)致的異常皮膚細(xì)胞的形成的試劑。傳統(tǒng)用于針對皮膚的外用制備物的任何已知基質(zhì)或載體可用作為藥物可接受的或化妝品可接受的基質(zhì)和載體。
此外，如果需要的話，可用于針對皮膚的外用制備物的多種添加劑可添加至本發(fā)明的用于遏制光暴露導(dǎo)致的異常皮膚細(xì)胞的形成的試劑中。此類添加劑的例子包括表面活性劑、著色材料(染料和色素)、調(diào)味材料、防腐劑、殺菌劑(抗細(xì)菌劑)、增稠劑、抗氧化劑、 螯合劑、冷卻劑、除臭劑、保濕劑、紫光線吸收劑、紫外線散射劑、維生素、植物提取物、收斂劑、抗炎劑(消炎劑)、增白劑、細(xì)胞活化劑、血管舒張劑、血循環(huán)促進(jìn)劑、皮膚功能促進(jìn)劑等坐寸ο
本發(fā)明的用于遏制光暴露導(dǎo)致的異常皮膚細(xì)胞的形成的試劑外用于已經(jīng)或可能暴露于光例如紫外線的皮膚區(qū)域時，施加抵擋光暴露導(dǎo)致的異常皮膚細(xì)胞的形成的預(yù)防性作用。因此，本發(fā)明的用于遏制光暴露導(dǎo)致的異常皮膚細(xì)胞的形成的試劑作為針對皮膚的外用制備物制備，其可每日使用，例如外用藥，準(zhǔn)外用藥或化妝品產(chǎn)品(例如護(hù)膚產(chǎn)品)。
本發(fā)明的用于遏制光暴露導(dǎo)致的異常皮膚細(xì)胞的形成的試劑的劑型沒有特別限制，只要其可應(yīng)用至皮膚即可。其例子包括糊劑、摩絲(mousses)、軟凝膠、液體、乳液、混懸劑、乳膏、油膏、凝膠、片層劑(sheets)、氣溶膠、噴霧、擦劑等等。這些劑型中,優(yōu)選液體、乳液和凝膠。這些劑型根據(jù)相關(guān)商業(yè)領(lǐng)域中的常用方法制備。
特別地，本發(fā)明的用于遏制光暴露導(dǎo)致的異常皮膚細(xì)胞的形成的試劑用于預(yù)防光暴露誘導(dǎo)的皮膚腫瘤或皮膚癌的目的。在本發(fā)明中，誘導(dǎo)將被本發(fā)明抑制或預(yù)防的異常皮膚細(xì)胞形成的光的類型沒有特別限制。其例子包括自然陽光、紫外線和放射線，優(yōu)選為紫外線，更優(yōu)選為UV-B。特別地，本發(fā)明的用于遏制光暴露導(dǎo)致的異常皮膚細(xì)胞的形成的試劑尤其適用于預(yù)防暴露于陽光中含有的紫外線(尤其是UV-B)誘導(dǎo)的光致癌。
此外，當(dāng)本發(fā)明的用于遏制光暴露導(dǎo)致的異常皮膚細(xì)胞的形成的試劑用于預(yù)防光致癌時，將被本發(fā)明預(yù)防的皮膚癌的種類沒有特別限制，只要其是與光暴露相關(guān)而被誘導(dǎo)的即可。其特定例子包括黑色素瘤、基底細(xì)胞癌和鱗狀細(xì)胞癌。
本發(fā)明的用于遏制光暴露導(dǎo)致的異常皮膚細(xì)胞的形成的試劑應(yīng)用至已經(jīng)或可能暴露于光的皮膚區(qū)域。換句話說，本發(fā)明的用于遏制光暴露導(dǎo)致的異常皮膚細(xì)胞的形成的試劑可應(yīng)用至已經(jīng)暴露于光的皮膚區(qū)域、或在實際暴露于光之前應(yīng)用至可能暴露于光的皮膚區(qū)域。
當(dāng)本發(fā)明的用于遏制光暴露導(dǎo)致的異常皮膚細(xì)胞的形成的試劑應(yīng)用至皮膚時，可根據(jù)嘌呤核酸的類型和濃度、受試者的年齡和性別、應(yīng)用的皮膚區(qū)域、皮膚被暴露于或可能暴露于的光的量等等來確定其劑量和頻率，使得每日一次或者以每日2至5次的頻率對皮膚應(yīng)用合適的量。此外，本發(fā)明的用于遏制光暴露導(dǎo)致的異常皮膚細(xì)胞的形成的試劑可被設(shè)置為使得每cm2皮膚面積的嘌呤核酸的量為大約O. 01至IOmg,優(yōu)選O. I至5mg。
如從上文清楚可知的，嘌呤核酸可預(yù)防光致癌。因此，本發(fā)明的用于遏制光暴露導(dǎo)致的異常皮膚細(xì)胞的形成的試劑可用作為預(yù)防光致癌的試劑。當(dāng)嘌呤核酸用作為預(yù)防光致癌的試劑時，嘌呤核酸的類型和濃度、其它成分、劑型、應(yīng)用位點、應(yīng)用方法等等與針對用于遏制光暴露導(dǎo)致的異常皮膚細(xì)胞的形成的試劑所描述的相同。
嘌呤核酸可在由于光暴露已成為異常的皮膚細(xì)胞中誘導(dǎo)凋亡。因此，本發(fā)明的用于遏制光暴露導(dǎo)致的異常皮膚細(xì)胞的形成的試劑可用作為在由于光暴露已成為異常的皮膚細(xì)胞中誘導(dǎo)凋亡的試劑。當(dāng)嘌呤核酸用作為在由于光暴露已成為異常的皮膚細(xì)胞中誘導(dǎo)凋亡的試劑時，嘌呤核酸的類型和濃度、其它成分、劑型、應(yīng)用位點、應(yīng)用方法等等與針對用于遏制光暴露導(dǎo)致的異常皮膚細(xì)胞的形成的試劑所描述的相同。
嘌呤核酸可抑制皮膚癌的起始。因此，本發(fā)明的用于遏制光暴露導(dǎo)致的異常皮膚細(xì)胞的形成的試劑可用作為用于遏制皮膚癌的起始的試劑。當(dāng)嘌呤核酸用作為遏制皮膚癌的起始的試劑時，嘌呤核酸的類型和濃度、其它成分、劑型、應(yīng)用位點、應(yīng)用方法等等與針對用于遏制光暴露導(dǎo)致的異常皮膚細(xì)胞的形成的試劑所描述的相同。
嘌呤核酸可抑制對皮膚癌的促進(jìn)。因此，本發(fā)明的用于遏制光暴露導(dǎo)致的異常皮膚細(xì)胞的形成的試劑可用作為用于遏制對皮膚癌的促進(jìn)的試劑。當(dāng)嘌呤核酸用作為遏制對皮膚癌的促進(jìn)的試劑時，嘌呤核酸的類型和濃度、其它成分、劑型、應(yīng)用位點、應(yīng)用方法等等與針對用于遏制光暴露導(dǎo)致的異常皮膚細(xì)胞的形成的試劑所描述的相同。
此外，嘌呤核酸可降低光暴露導(dǎo)致的皮膚細(xì)胞中突變DNA的量以及促進(jìn)DNA修復(fù)。 因此，本發(fā)明的用于遏制光暴露導(dǎo)致的異常皮膚細(xì)胞的形成的試劑可以以上文所述的方式發(fā)揮作用，且可用作為用于修復(fù)DNA損傷、遏制DNA突變或降低DNA突變的試劑。當(dāng)嘌呤核酸用作為修復(fù)DNA損傷、遏制DNA突變或降低DNA突變的試劑時，嘌呤核酸的類型和濃度、 其它成分、劑型、應(yīng)用位點、應(yīng)用方法等等與針對用于遏制光暴露導(dǎo)致的異常皮膚細(xì)胞的形成的試劑所描述的相同。
實施例
下面將參照測試實施例和實施例來描述本發(fā)明。但是，本發(fā)明不限于這些實施例。 應(yīng)當(dāng)注意，除非另有指明，下述實施例等等中，以“ ”表示的指示含量的數(shù)字是重量百分比。
實施例I :在紫外光照射導(dǎo)致的突變體細(xì)胞中誘導(dǎo)凋亡的作用
本實施例檢測了用紫外線照射經(jīng)5’ -單磷酸腺苷二鈉(AMP2Na)處理過的人上皮細(xì)胞時半胱天冬酶活性的改變。
<測試方法>
使用EpiLife_KG2 培養(yǎng)基(由 Kurabo Industries Ltd.生產(chǎn)),在 IOcm 涂布有膠原的培養(yǎng)皿(由Asahi Glass Co. ,Ltd.生產(chǎn))中預(yù)培養(yǎng)人上皮角化細(xì)胞(購自Kurabo Industries Ltd.)，并將其以30，000個細(xì)胞/孔的密度接種進(jìn)涂布有膠原的96孔微孔板中。在EpiLIfe-KG2培養(yǎng)基中培養(yǎng)8小時后，培養(yǎng)基被EpiLife培養(yǎng)基(由Kurabo Industries Ltd.生產(chǎn))替換，接著再培養(yǎng)16小時。隨后，培養(yǎng)基被調(diào)節(jié)至多種濃度的含 AMP2Na的培養(yǎng)基替換。經(jīng)培養(yǎng)基處理2小時后，用PBS (磷酸鹽緩沖液)洗滌細(xì)胞，使用紫外光照射設(shè)備(HN-400，由ABE RIK0SHA生產(chǎn))，以30mJ/cm2的UV-B照射洗滌過的細(xì)胞。再次加入EpiLife培養(yǎng)基，接著培養(yǎng)6小時。隨后，使用SensoLyte RhllO半胱天冬酶3檢驗試劑盒(由AnaSpec，Inc.生產(chǎn))測量細(xì)胞中表達(dá)的半胱天冬酶3的活性。沒有用UV—B 照射過也沒有用AMP2Na處理過的細(xì)胞被用作為對照組。此外，為檢測AMP2Na影響正常細(xì)胞的半胱天冬酶活性的影響，測定沒有經(jīng)UV-B照射過但是用AMP2Na處理過的細(xì)胞的半胱天冬酶活性。
< 結(jié)果 >
圖Ia和Ib顯示了獲得的結(jié)果。結(jié)果清楚顯示，雖然未經(jīng)紫外光照射的細(xì)胞顯示與AMP2Na是否處理無關(guān)、半胱天冬酶活性基本沒有增加，但用AMP2Na處理時經(jīng)紫外光照射的細(xì)胞顯示出半胱天冬酶活性的顯著增加。
半胱天冬酶是在細(xì)胞中導(dǎo)致凋亡的半胱氨酸蛋白酶的成員。半胱天冬酶活性通常被認(rèn)為是測量凋亡活性的水平的指數(shù)。
細(xì)胞自身具有觸發(fā)凋亡殺死它們自身的機制，如針對損傷DNA的多種刺激(如X 射線和紫外光)的生物防御機制那樣。本測試還顯示在未經(jīng)紫外光照射的細(xì)胞中半胱天冬酶活性沒有改變，而無論是否用AMP2Na處理過細(xì)胞。這表明，AMP2Na不增加半胱天冬酶活性，且不誘導(dǎo)正常細(xì)胞中的凋亡。相反，從半胱天冬酶活性的增加清楚可知，在經(jīng)紫外光照射的細(xì)胞中誘導(dǎo)了凋亡。此外，本測試顯示出在紫外光照射之前用AMP2Na處理的細(xì)胞中活性進(jìn)一步增加，這表明在突變的細(xì)胞中誘導(dǎo)了凋亡。
實施例2 :對降低紫外光照射誘導(dǎo)的DNA突變的作用的評估
在該實施例中，正常小鼠上皮細(xì)胞被用紫外線照射，然后被培養(yǎng)于含AMP2Na的培養(yǎng)基中。使用環(huán)丁烷嘧啶二聚體(CPD)的量作為指數(shù)，檢測AMP2Na降低DNA突變的作用。
<測試方法>
在含F(xiàn)BS的MEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)源于正常小鼠上皮細(xì)胞的JB6細(xì)胞(購自ATCC)直至匯合。隨后，將4X IO5個培養(yǎng)的細(xì)胞接種進(jìn)具有含F(xiàn)BS(胎牛血清)的MEM(最小必需培養(yǎng)基)的3. 5cm皿中。接種之后的第二天，培養(yǎng)基被不含血清的MEM培養(yǎng)基替換，以進(jìn)行血清饑餓。隨后，培養(yǎng)基被PBS替換，接著以15mJ/cm2的UV-B照射。紫外光照射后，培養(yǎng)基被含有O. 01mM、0. ImM或ImM AMP2Na的不含血清的MEM培養(yǎng)基或不含AMP2Na的培養(yǎng)基(對照)替換。培養(yǎng)基替換后，于37°C以5% CO2培養(yǎng)細(xì)胞48小時，然后收集細(xì)胞。
使用FastPure (商標(biāo))DNA試劑盒(Takara Bio Inc.)從收集的細(xì)胞提取基因組 DNA。按照試劑盒手冊來進(jìn)行提取。
使用ELISA測量提取自每個細(xì)胞的基因組DNA中CPD的量。特別地，在100°C對提取的基因組DNA加熱10分鐘，并在冰上冷卻。隨后，將基因組DNA分配(50 μ L/孔)至涂布有硫酸魚精蛋白的96孔微孔板并干燥。第二天，用PBS-T (具有Tween 20的PBS)洗滌每個孔，將含F(xiàn)BS的PBS分配進(jìn)每個孔。然后孔在37°C保持30分鐘。接著，用PBS-T洗滌之后，將小鼠抗CPD抗體(購自Cosmo Bio Co.，Ltd.)分配進(jìn)每個孔，然后孔在37°C保持 30分鐘。用PBS-T洗漆之后,將經(jīng)生物素標(biāo)記的抗小鼠IgG(購自Southern Biotech)分配進(jìn)每個孔，并且孔在37°C保持30分鐘。洗滌孔之后，將經(jīng)鏈親和素標(biāo)記的辣根過氧化物酶分配進(jìn)每個孔，然后孔在室溫下保持30分鐘。隨后，用PBS-T和檸檬酸鹽磷酸鹽緩沖液洗滌孔，然后將含有過氧化氫和鄰苯二胺的檸檬酸鹽磷酸鹽緩沖液分配進(jìn)每個孔。孔在37°C 下保持30分鐘用于顏色發(fā)展。隨后，向孔中加入2M硫酸水溶液，以終止顏色發(fā)展反應(yīng)。隨后，測量492nm處的吸光度值，計算基因組DNA中CPD的量，以測定每種條件下CPD的改變率(CPD的相對量的變化；％ )，其中在不含AMP2Na的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的情況下CPD的量被指定為100%的值。
< 結(jié)果 >
圖2顯示了獲得的結(jié)果。結(jié)果顯示，在紫外光照射后向其中加入AMP2Na的細(xì)胞中 CPD的相對量較之對照組減少。這些結(jié)果因此證實了 AMP2Na減少紫外光照射導(dǎo)致的DNA突變。結(jié)果顯示，當(dāng)細(xì)胞被培養(yǎng)于含有O. ImM和ImM AMP2Na的培養(yǎng)基中時，CPD的相對量較之對照組的減少顯著，紫外光照射導(dǎo)致的DNA損傷顯著被遏制?；谏鲜鼋Y(jié)果，上述成分預(yù)計具有預(yù)防特別是癌發(fā)生的起始的效果。
應(yīng)當(dāng)注意，實施例I是使用細(xì)胞進(jìn)行的體外測試。在一種特別的應(yīng)用中，考慮到個體差異、皮膚可透過性和細(xì)胞可穿透性，必須要考慮調(diào)節(jié)AMP2Na的濃度至上文所述的體外使用的AMP2Na的濃度的大約10至1000倍。
實施例3 :對經(jīng)紫外線照射的小鼠中皮膚癌的預(yù)防性效果的評估
在本實施例中，用紫外線照射無毛小鼠，檢測了 AMP2Na抵擋小鼠的光致癌的預(yù)防性效果。
<測試方法>
5周齡雌性Hos = HR-I小鼠購自Japan SLC, Inc.，并且從7周齡開始在它們的背部進(jìn)行紫外線(UV-B)照射。紫外光照射(每次的照射量60mJ/cm2)以每日一次、一周五天進(jìn)行12周。
然后，制備含有溶解于其中的3% AMP2Na的20%乙醇水溶液(測試溶液)和不含 AMP2Na的20%乙醇水溶液(基質(zhì))。
在正常條件下喂飼經(jīng)紫外線照射的小鼠I周之后，在表I所示的條件下將小鼠分入3組(每組6只小鼠)并喂飼12周。
表I
權(quán)利要求
1.一種嘌呤核酸，用于遏制光暴露導(dǎo)致的異常皮膚細(xì)胞的形成，其中所述嘌呤核酸是外用的。
2.如權(quán)利要求I所述的嘌呤核酸，其是選自單磷酸腺苷及其鹽構(gòu)成的組中的至少一個成員。
3.如權(quán)利要求I或2所述的嘌呤核酸，其中對異常皮膚細(xì)胞的形成的遏制伴隨DNA修復(fù)或?qū)NA突變的遏制。
4.如權(quán)利要求I 3中任一項所述的嘌呤核酸，其中對異常皮膚細(xì)胞的形成的遏制伴隨誘導(dǎo)凋亡。
5.如權(quán)利要求I 4中任一項所述的嘌呤核酸，其中對異常皮膚細(xì)胞的形成的遏制是對皮膚腫瘤的預(yù)防。
6.如權(quán)利要求5所述的嘌呤核酸，其中所述對皮膚腫瘤的預(yù)防伴隨對腫瘤的起始的遏制。
7.如權(quán)利要求5或6所述的嘌呤核酸，其中所述對皮膚腫瘤的預(yù)防目的在于預(yù)防皮膚癌。
8.一種用于遏制光暴露導(dǎo)致的異常皮膚細(xì)胞的形成的組合物，所述組合物包含作為活性成分的嘌呤核酸。
9.如權(quán)利要求8所述的組合物，包含基于所述組合物總重而言為0.5至20wt%的量的選自由單磷酸腺苷及其鹽組成的組中的至少一個成員。
10.一種遏制光暴露導(dǎo)致的異常皮膚細(xì)胞的形成的方法，所述方法包括向其中可能由光暴露誘導(dǎo)DNA損傷的皮膚區(qū)域皮膚應(yīng)用有效量的嘌呤核酸。
全文摘要
本發(fā)明的目的是提供用于遏制光暴露如紫外線暴露誘導(dǎo)的皮膚細(xì)胞形成的試劑。該目的通過使用嘌呤核酸來遏制光暴露導(dǎo)致的異常皮膚細(xì)胞形成而實現(xiàn)。
文檔編號A61P35/00GK102985093SQ201180031370
公開日2013年3月20日 申請日期2011年6月24日 優(yōu)先權(quán)日2010年6月25日
發(fā)明者河村光章, 筱原茂生, 原野史樹, 青木彰寬, 上野繪理 申請人:大塚制藥株式會社