專利名稱：由松子外殼中提取生理活性物質(zhì)的方法和以該提取物為主要粗材料制備的抗傳染病藥物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及由諸如黑松、紅松、白松樹和松子外殼中提取包括酸性多糖在內(nèi)的生理活性物質(zhì)的方法和抗傳染病藥物，其中上述提取物為一個主要粗提物。
多年以來，就把松子看做為高營養(yǎng)價值的食用堅果而提供為食品。
特別是，由松子中提取的松子油被認為是含生理活性的營養(yǎng)成分。另外某些地區(qū)含松子的松果，出于健康的考慮以煎劑形式利用。無論那種情況，眾所周知松子或松果都含某些高生理活性的物質(zhì)。
采用上述物質(zhì)，本發(fā)明的發(fā)明者進行了開發(fā)和研究工作，以擴大松子和松果的應(yīng)用范圍。例如，發(fā)展了提取松子油的技術(shù)或由松子堅硬外殼中取出松子的技術(shù)。
此外，提取松子油殘渣的榨餅及除去松子的外殼通過沸水煎煮，即所謂沸水提取處理，上述提取處理所得的溶液用濾紙過濾，該濾液減壓濃縮即看到里面所含的物質(zhì)。做為這個試驗的結(jié)果，發(fā)明者發(fā)現(xiàn)了一種多糖，該多糖有明顯高生理活性，特別是活化白血球中的粒性白血球的功能。
由松子外殼中有效地提取有明顯活化功能的酸性多糖是本發(fā)明的目的之一。為此目的，除去松子外殼的油脂，為進行堿性溶液提取處理將其浸泡于堿性溶液，然后調(diào)解提取液的pH度。提取液用離心機處理得到提取物沉淀。上述沉淀提取物通過過濾處理再使其濃縮。濃縮的提取液冷凍干燥后成為粒狀酸性多糖。這樣，在松子外殼中提取回收一個主要成分。
換言之，本發(fā)明的特征為通過去脂處理使松子外殼的油脂和低聚物除去，然后為進行堿性溶液提取向其中加入堿溶液。在提取處理后所得的提取液，調(diào)解其pH度，這樣，就從松子外殼中提取得到酸性多糖。
多次試驗的結(jié)果證明，白松子勝過其他黑松和紅松子，是最好的一種適用于本發(fā)明意圖的松子。
另外也證明，11月中采集的白松子外殼是最好的。
松子外殼是非常堅硬的，總是很難由松子中將其有效地分出。然而，本發(fā)明者成功的發(fā)明了一個特殊的粉碎方法，使之很容易除去松子外殼。也證明，如果根據(jù)需要對由松子分離出來的外殼進行干燥，且粉碎成適于提取的程度，本發(fā)明的工作效率得到大大提高。
應(yīng)用于本發(fā)明提取處理的堿性溶液選自有機氯化物或無機氯化物的堿性溶液。然而，考慮到提取液和提取物的后處理，氨水可通過加熱處理很容易除掉堿性而被認為是最理想的。
堿性溶液的堿化度取決于松子的種類或含量。已證明pH7或者pH7以上是合乎需要的，pH7.5-10之間最適合。
本發(fā)明的提取工作開始于將粉碎成要求大小的松子浸入堿性溶液的工序。
應(yīng)用于提取的堿性溶液的量沒有特殊限制，但推薦使用量為松子的五倍。普通溫度使用的堿性溶液在高溫下也允許使用。
通過過濾或類似的處理由松子分離的提取液，用減壓濃縮或類似的處理濃縮到適當(dāng)?shù)臐舛?。然后用諸如鹽酸或類似的酸調(diào)解pH。最后，經(jīng)過冷凍干燥得到粒狀的酸性多糖。
由本發(fā)明的方法得到和回收的粒狀酸性多糖有一點其本身的氣味。粒狀物為褐色并很易溶于水。
酸性多糖的提取方法在以下優(yōu)選實施方案的基礎(chǔ)上加以闡明制備在中華人民共和國吉林省渾江市11月中旬收集的白松樹的松子，用于實施方案。
做為本發(fā)明工序的預(yù)處理，10kg的松子外殼用大約4升甲醇洗滌。松子中的油脂和低聚物被除掉。
下一步，在上面預(yù)處理中洗過的松子浸泡在大約4升沸水中。這種熱水提取處理重復(fù)做三次，每次6小時。所得粗提物溶液用濾紙過濾，除去不溶物。錳崛∫杭躚古ㄋ?。所甸Tㄋ躋河 倍于上述濃縮液的乙醇稀釋，所得沉淀物溶于蒸餾水，通過透析處理除去低聚物，最后回收所謂熱水提取物。
此外，6升濃度為0.8%的氨水加到上述熱水提取處理過的剩余殘渣中，在45℃攪拌3小時再分離提取液。殘渣再用氨水提取處理。第一次和第二次的提取液混合在一起用濾布過濾。
下一步，9.5升的濾液在40℃減壓濃縮至150ml。通過鹽酸處理將濾液pH度調(diào)至5.4並加以冷凍干燥，即得到4.5g褐色粒狀酸性多糖。
在上述處理的提取液中所得粒狀多糖有一種其本身獨具的味道，其1%(W/V)溶液的pH度為4.5-6.0。
測定了上述酸性粒狀多糖的砷和重金屬的含量。結(jié)果表明，兩者的含量分別小于2ppm和30ppm。大腸桿菌群是極少的，一般細菌數(shù)小于1000/g。
以下圖表說明本發(fā)明的提取處理
提取的酸性多糖的活化功能試驗敘述如下為了確定由堿性提取液得到的酸性多糖的生理化功能，使用了以下的方法。
首先，人外周血做為試驗活化功能的靶源以生理鹽水液稀釋兩倍量。稀釋液積累于Fiooll-Hypague層(比重為1.077)，以離心機在1500轉(zhuǎn)/分處理30分鐘。紅血球和多型核白細胞部分由混合物低層取出。
上述紅血球和多型核白細胞部分用生理鹽水洗滌，並用前面離心處理制備的血清稀釋。所得到的稀釋混合物積累于Mono-PolyResolvingMediumFicoll-Hypogue層(比重1.114)並在1，500轉(zhuǎn)/分離心處理30分鐘。收集含有多形核白細胞的中間層。其次，上述中間層用非血清RPMI1640培養(yǎng)液洗滌兩次，得到作為靶源的純化多形核白細胞部分。多形核白細胞的純度大于95%。
在上面處理的基礎(chǔ)上得到的靶源加入熱水提取的多糖(按表Ⅰ)以及用堿溶液提取的酸性多糖Ⅰ和Ⅱ並確定其生理活化功能。做為一個確定的方法，Klebanoff和Clark的方法(J.Lab.Clin.Med.89675，686，1977)在稍加修改后應(yīng)用。
即，1×106PCS的多形核白細胞懸浮于0.5ml非血清RPMI1640培養(yǎng)液中，上述培養(yǎng)液含有各種濃度的試驗物質(zhì)(熱水提取的多糖，堿溶液提取的酸性多糖Ⅰ和Ⅱ以及作為對照的TAK，CM-TAK)以及8×10-6M放射活性Na125I(IuCi/mL)。
在37℃孵育處理1小時，接著用生理鹽水洗滌，然后加5%冰凍的三氯醋酸。放在冰浴上20分鐘，然后，3，000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘，沉淀中的放射活性物質(zhì)(酸性不溶部分)用γ-射線計數(shù)器來測定。
表Ⅰ由松子外殼提取的酸性多糖對人周血多形核白細胞的活化功能類別提取物多形核白細胞的酸性不溶部分吸收的放射活性碘(pmol/107細胞/小時)濃度(μg/mL)多型核白細胞100231松子外殼熱水提取多糖1000460松子外殼堿性溶液提取多100451糖Ⅰ1000279松子外殼堿性溶液提取多100242糖Ⅱ1000369TAK10032100089CM-TAK100610007生理鹽水-7為對照-9注(1)TAK，CM-TAK是日本開發(fā)的一種具有強活性功能的抗腫瘤多糖注(2)TAK……(1→3)β-D-葡聚糖(CancerRes38，379-383，1987)是由糞產(chǎn)堿桿菌產(chǎn)粘液變種(IF013140)分離出來的CM-TAK……(羧甲基化TAK)(Euqop.J.Cancer.15，211-215，1979)正如在表-Ⅰ中看到的，按本發(fā)明的方法，由堿性提取液得到的酸性多糖強有力的活化多形核白細胞，並證明由本發(fā)明得到的酸性多糖可具有遠遠超過TAK，CM-TAK的活化功能，而TAK，CM-TAK被認為是日本發(fā)展的至今最強的抗腫瘤多糖。
其次，為了提供一個抗傳染藥，其中由前述處理法得到酸性多糖粒劑為主要粗品，應(yīng)用以下工序(1)和(2)。
(1)松子油加到2克所述酸性多糖粒中，使膠凝並做成膠囊。另一方面，(2)10克酸性多糖加到大約85mL水中，在50-60℃攪拌30分鐘使溶。接著加0.7克鹽和適量水至上述已溶的溶液中制成100毫升。
上述溶液在10000轉(zhuǎn)/分離心機上離心20分鐘，除去不溶物，在高壓滅菌器滅菌，最后得到滅菌的安瓿注射劑。
其次，通過以下的試驗方法觀察由前述處理得到的抗傳染藥物的活性。
為了測定酸性多糖的抗傳染藥物的活性使用以下試驗(1)和(2)。
(1)試驗對抗大腸桿菌感染的效果0.25mg多糖粒劑或生理鹽水溶液指定給ddy小鼠(5周的雄鼠)，每組10-12只小鼠。在第二天4×106大腸桿菌劑移植入上述小鼠的腹部，24小時后記錄殘存小鼠數(shù)。
(2)試驗對抗病毒感染疾病的效果將上述10克感染液按指定次數(shù)注入被病毒感染的狗和貓的大腿肌肉內(nèi)或脊柱肩胛骨中間部，隨著時間的推移觀察到一般狀態(tài)和血液中白血球數(shù)目的變化。
對大腸桿菌感染小鼠的阻止活性以及抗病毒感染的貓的松弛病態(tài)，被看做抗傳染藥的指標(biāo)，觀察作用效果。結(jié)果如下(1)抗大腸桿菌感染的效果如表Ⅱ所列，如果小鼠腹部先用氨溶液提取物處理(上述提取物就是溶于生理鹽水的顆粒)，大腸桿菌的感染受到明顯抑制。
表…Ⅱ松子氨水提取物(粒狀酸性多糖)對大腸桿菌感染的保護作用藥物5天后小鼠存活數(shù)松子的堿性溶液提取物Ⅰ7/10(70%)Ⅱ5/10(50%)生理鹽水做對照1/12(8%)(2)抗致病病毒感染的效果松子外殼的氨水提取物注入貓和狗的脊柱肩胛骨附近的皮下，或者注入兩者的股骨部位的肌肉內(nèi)。結(jié)果，病毒性疾病(如杯狀病毒性舌炎、口炎、牙炎，細小病毒性貓白細胞減少，皰疹病毒性鼻-支氣管炎)都受到強烈抑制，能促進食欲、改善一般狀況，其中一些可完全痊愈。相反，藥物對非病毒引起的如乳癌或纖維肉瘤等疾病無效。
抗病毒的結(jié)果列于表Ⅲ
如前所述，本發(fā)明涉及由松子外殼中提取高活性的酸性多糖的方法。本發(fā)明者成功的發(fā)展了本提取物使用的有效范圍。以下為本方法的技術(shù)優(yōu)點。
(1)由至今被忽視的松子外殼中提取高生理活性的物質(zhì)已變?yōu)榭赡堋?br> (2)堿性溶液用做提取的一個方法。因此就可能無困難的重復(fù)這個方法，從而有價值的成分都能有效地被提取。
(3)用本發(fā)明提取回收的物質(zhì)是一種提供了活化多形核白細胞的酸性多糖。這個酸性多糖做為一種促進多形核白細胞活性的物質(zhì)是不會被取消的。多形核白細胞有防疫感染的功能。使其促活性功能用做藥物是有可能的。
特別是，像前面試驗所述，大腸桿菌對小鼠的感染受到抑制，貓和狗的病毒性疾病得到有效控制。
此外，做為本發(fā)明的抗感染藥由天然松子外殼中提取和回收，這個抗感染藥沒有產(chǎn)生任何強烈的、其他抗病毒藥已有的那種不利作用。與其他治療方法或其他有效的治療各種病毒性疾病的藥物合并使用也是可能的。
權(quán)利要求
1.一種提取生理活性物質(zhì)的方法，其中粒狀酸性多糖是主要成分，其特征在于，將松子外殼浸泡于堿性溶液，以堿性溶液進行提取處理，不溶物質(zhì)通過提取液的過濾來加以分離，通過分離處理得到的提取液在濃縮以后調(diào)解其PH度，上述提取液進行冷凍干燥，因而就提取到上述生理活性物質(zhì)，其中粒狀酸性多糖為主要成分。
2.一個抗傳染藥，其中通過權(quán)利要求1規(guī)定的方法提取得到酸性多糖是有效成分。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種提取生理活性物質(zhì)的方法，其中粒狀酸性多糖是一個主要成分。將松子外殼浸泡于堿性溶液以進行提取處理。得到的提取物以過濾來分離不溶物，然后將剩余的溶液濃縮，再調(diào)解pH。其中粒狀酸性多糖為其主要成的生理活性物質(zhì)通過冷凍干燥處理被提取出來。其中以提取方法所得酸性多糖為主要成分的抗傳染藥物提供了一種活化功能，到目前為止，這種活化功能勝過傳統(tǒng)抗腫瘤多糖對多形核白細胞的活化作用。
文檔編號A61K36/00GK1032170SQ8810672
公開日1989年4月5日 申請日期1988年9月16日 優(yōu)先權(quán)日1987年9月17日
發(fā)明者吉原將純, 坂上宏 申請人:吉原將純