專利名稱:牛副流感病毒的合成基因的制作方法
本發(fā)明是有關(guān)生產(chǎn)抗牛Ⅲ類付流感病毒(PI-3)疫苗，這種病毒分類是付粘病毒，尤其是編碼的PI-3蛋白的合成DNA基因可以以在此公開了的方法生產(chǎn)出來。這些基因可透過轉(zhuǎn)錄細胞來生產(chǎn)所選擇的病毒蛋白，可應(yīng)用于疫苗，診斷動物或其他的生物蛋白。合成基因本身將用作為一種診斷劑。
牛Ⅲ號付流感病毒也稱之為PI-3或載熱病毒，是在牛的急性呼吸道病癥的綜合癥開始出現(xiàn)時的主要因素在病理上和經(jīng)濟上是有相當影響。載熱綜合病癥在PI-3病毒染下開始出現(xiàn)，通常在家畜運輸或牧菌所引起的感染。例如巴斯德氏multocida莫類或巴斯德氏溶血菌類結(jié)果是產(chǎn)生載熱綜合癥。由于體重減輕、昂貴治療和延遲了供應(yīng)市場所帶來的每年經(jīng)濟損失估計在七千五百萬美元。一種類似的病
毒所感染給羊，出現(xiàn)一種類似于載熱綜合癥呼吸系統(tǒng)疾病。
病毒疫苗包括活的減毒疫苗已成功使用了大約20年，例如由巴斯德氏multocida菌和巴德氏haemolytico菌中經(jīng)化學(xué)變異菌種而獲得的活的細菌疫苗已在美國4923545文件中(庫塞拉)公開。
予防付流感病毒的疫苗研究已是受到現(xiàn)行疫苗有限效力所限制，部份是由于來自存在的抗體或其它病毒疫苗抑制的影響。另外，采用活的病毒疫苗于繁殖動物上可能會對胎兒有影響并常造成流產(chǎn)。
最近在配制一種信息RNA(m RNA)分的雙鏈DNA雙分子復(fù)本時已有可能生產(chǎn)一種合成基因。按這種方法生產(chǎn)的合成基因?qū)⒕幋a成所選擇的信息核糖核酸轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物蛋白。這個基因工程工藝的一個實例已所選擇的信息核糖核酸轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物蛋白。這個基因工程工藝的一個實例已公開在美國專利4，357，421中，其中它被用來生產(chǎn)流感血細胞凝集素蛋白的合成基因。流感病毒不包括脫氧核糖核酸而含有一種分段逆枝的病毒的核糖核酸(VRNA)基因組，它們在感染時產(chǎn)生病毒信息核糖核酸m RNA和產(chǎn)生出另外病毒核糖核酸(v RNA)模板。流感病毒基因組具有可分的類別，也就是每個基因是以一種病毒核糖核酸后分離片卉形式出現(xiàn)，它們分別轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生信息核糖核酸。這個工藝由Emtage及其它人公開，分離的病毒核糖核酸作為一種模板。應(yīng)用在有意義的合成基因上。
現(xiàn)在有可能構(gòu)成一種合成或脫氧核糖核酸的(DNA)碎片，它相應(yīng)于一種病毒基因，這基因位于PI-3病毒不可分的反鏈(負鏈)病毒核糖核酸基因組上。得到了用病毒感染的細胞而信息核糖核酸-病毒和宿主RNA兩者會被其它的細胞組分離。互補在原來的信息核糖核酸上的雙鏈合成的脫氧核糖核酸分子由此形成。這種互補的脫氧核糖核酸(CDNA)群，無性繁殖成反向轉(zhuǎn)錄的脫氧核糖核酸基因庫，由此基因庫可以選擇病毒的特殊基因。有意義的病毒基因例如在互逆雜交和雜化物選擇轉(zhuǎn)錄作用條件，被確定并被分離出來。一旦有重大意義病毒基因被確定，它被嵌入在一個合適的載體，這個載體用來轉(zhuǎn)錄一合適表示基因的宿主，這種被表示蛋白可以作為配制疫苗，診斷劑和其它的亞單位。
該發(fā)明目的是提供一方法，由此可以構(gòu)成一種與一般在牛付流感Ⅲ類病毒，一種付粘病毒，基因組上所發(fā)現(xiàn)的基因相應(yīng)的合成基因。與此目的密切相關(guān)的是確定及分離這種合成基因，其編碼為一特殊毒靶蛋白，例如一種象血細胞凝集毒抗原蛋白。
發(fā)明另一目的是為經(jīng)濟地生產(chǎn)用合成基因編碼的病毒靶蛋白，以在轉(zhuǎn)錄宿主中表達所擇的合成基因。
發(fā)明還有一目的是提供一種生產(chǎn)脫氧核糖核酸系列一種方法，從而可以確定蛋白氨基酸系列，以構(gòu)成合成肽。
另外，打算使用該發(fā)明工藝生產(chǎn)有特征的脫氧核糖核酸探測物及肽特征劑。
下述縮略語在敘述個發(fā)明過程中會用到bp 堿基對BSA 牛類免疫血漿清蛋白CDNA 反向轉(zhuǎn)錄的脫氧核糖核酸ci 居里cm 厘米d ATP 脫氧腺苷三磷酸d CTP 脫氧胞苷三磷酸d GTP 脫氧鳥苷三磷酸d TTP 脫氧胸苷三磷酸DTT 二硫蘇糖醇DNA 脫氧核糖核酸EDTA 乙二胺四乙酸GUSCN 硫代氰酸胍HA 血細胞凝集素HEPER N-2-羥乙基哌嗪-N′-2-乙烷磺酸IU 國際單位M 克分子MDBK 馬丁-達爾比牛腎細胞MET 蛋氨酸m M 毫克分子m RNA 信息核糖核酸
NC 殼包核酸蛋白oligo(d A) 由少量(通常2-20)脫氧腺苷分子組成聚合物oligo(DT) 由少量(通常2-20)脫氧胸苷分子組成的聚合物32P 放射磷質(zhì)量數(shù)32% 百分比PI-3 牛Ⅲ類付流感病毒pipes 哌嗪乙烷硫酸poly-A 聚脫氧腺苷poly-c 聚脫氧脫苷poly-g 聚脫氧鳥苷RNA 核糖核酸r RNA 核蛋白核糖核酸SDS 十二烷基硫酸鈉(去垢劑)SSC 0.15克分子氯化鈉-0.015檸檬酸鈉TNE 10毫克分子三鹽酸(酸堿度8.0)100毫克分子氯化鈉，1.毫克分子依地酸(酸堿度8.0)Tris-ECI 三鹽酸t(yī) RNA 轉(zhuǎn)移核糖核酸U 單位v/v 體積/體積VRNA 病毒核糖核匹2w/v 重量/體積x 氨基酸殘留物附圖簡單說明圖1四頁篇幅說明用該發(fā)明方法無性繁殖的牛類付流感病毒血凝素CDNA的DNA系列，包括限制酶分裂圖。
圖2是把圖1無性繁殖的CDNA限制醢列成表。
圖3把1 HA CDNA基因的DNA系列轉(zhuǎn)錄成相應(yīng)的氨基酸系列。
圖4將圖1的HA CDNA基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物HA蛋白概推斷氨基酸系列。
在敘述本發(fā)明時，涉及“m RNA”和“CDNA”，都意味著涉及整個的核糖核酸或脫氧核糖核酸分子或是分別涉及它們?nèi)魏紊飳W(xué)意義部分，也就是說，意圖是使這個發(fā)明方法即就一個完整的病毒的信息核糖核酸而言，又就這病毒的信息核糖酸分子分支部分而言付諸實施。例如，可要求編碼實際的蛋白亞單位或其一部分或編碼成實際上的抗原部位的病毒基因部份分離，編碼及構(gòu)成細胞。
PI-3病毒按組織學(xué)，血清學(xué)，生物化學(xué)性質(zhì)分類是一種付粘病毒。付粘病毒是“核糖核酸病毒”并且不含有脫氧核糖核酸。它們的遺傳學(xué)信息只僅僅包含在一單枝，連續(xù)(或未被分割的)一塊核糖核酸內(nèi)?；诤颂呛怂峄蚪M反向技，付粘病毒族成員表現(xiàn)出一種重現(xiàn)戰(zhàn)略。付粘病毒核糖核酸重現(xiàn)必然伴有在與病毒同時出現(xiàn)的轉(zhuǎn)錄酶絡(luò)合物上，由單一的觸媒劑產(chǎn)生的反支模型的分支基因組的信息核糖核酸物質(zhì)。在這些已研究過的系統(tǒng)中，每個信息核糖核酸都與多核糖核蛋白同時發(fā)生聚腺苷反應(yīng)并通常編碼成單一的病毒蛋白。
雖然幾種病毒結(jié)構(gòu)蛋白已經(jīng)確定下來了，但已很少再去研究PI-3型再現(xiàn)了。例如，Shibuta和其它的人的“牛類付流感三型病毒的特征”“微生物免疫學(xué)”第23卷617-628頁(1979)和Guskey等人的“人付流感Ⅲ型病毒高的增長率和提純及病毒結(jié)構(gòu)蛋白的初始分析”。J.Gen“病毒生物學(xué)”54卷115頁-123頁(1981)?，F(xiàn)有技術(shù)還未揭示有關(guān)細胞內(nèi)的蛋白或病毒信息核糖核酸物質(zhì)的情況。另外，除了在此公開外轉(zhuǎn)錄和編碼測定PI-3信息核糖核酸還沒有開始。
在此所公開的發(fā)明，使人們能做成一種單個的合成基因或做成相應(yīng)于處在未被分割的負枝的PI-3病毒的核糖核酸的一個基因上的脫氧核糖核酸片。合成基因或碎片編碼為PI-3病毒蛋白或它們的一個部份并包括了一雙鏈脫氧核糖核酸基因，其是編碼在蛋白或它們的一個部份的復(fù)型。合成基因可以用來生產(chǎn)有意義的蛋白或“靶”蛋白?！鞍小钡鞍自诖藢⒂脕肀砻饔幸饬x的病毒蛋白和由所表達的合成基因所產(chǎn)生的蛋白這兩方面。但是也應(yīng)該理解的是所表達的蛋白許也在不重要方面不同于病毒蛋白或也許僅相應(yīng)于病毒蛋白一個部份或亞單位。
作為合成基因最初步驟，靶蛋白被確定下來。如果打算制備亞單位疫典典診斷劑時，靶蛋可用試驗來確定，它能加速受感染動物形成中合或保護抗體。在PI-3病毒情況下，保護抗體是針對著病毒血凝素(HA)，即基本結(jié)構(gòu)蛋白而產(chǎn)生的。血凝素(HA)蛋白在病毒表面上找到并使病毒在傳染過程開始附在細胞上。擬分離編碼血凝素蛋白基因，這樣它才能無性繁殖細胞并用來進行特別HA蛋白病毒生產(chǎn)。這種生物合成血凝素蛋白特別適用于疫苗。它將加速在被注射疫苗的動物本體上產(chǎn)生針對PI-3抗體而不會有受病毒感染危險，因為血凝素蛋白本身是不會有傳染性的。然而，有證據(jù)表明，其它結(jié)構(gòu)蛋白也會產(chǎn)生有影響抗體。一種疫苗或診斷劑的活性可能會在含有那些其它結(jié)構(gòu)蛋白的生物合成變種情況下進一步增加，例如，結(jié)構(gòu)融合蛋白這是一種病毒表面蛋白，它須要負責與細胞融合以期受到感染并具有使這病毒的核糖核酸轉(zhuǎn)移到這些細胞上的性質(zhì)。我們希望結(jié)構(gòu)融合蛋白會包含在一種疫苗或類似物中。
受到病毒感染的宿主細胞可用適宜方式得到。最好是馬丁一達包爾比牛賢臟細胞用作宿主細胞，因為它們保證病毒重現(xiàn)在很高水平，細胞用病毒感染并用一般細胞培養(yǎng)技術(shù)制備。
核糖核酸可適宜方式由細胞中收集。Chirgwim等人的“硫氰酸胍-Cs CI方法”生物化18輝卷5294-5299頁(1979)，在例1中更為詳細描述這種方法可被采用。整個核糖核酸也就是宿主信息核酸，轉(zhuǎn)移核糖核酸和核蛋白體核糖核酸以及病毒核糖核酸和信息核糖核酸會被分離或重新被恢復(fù)。
影響真核生物的各種病毒的信息核酸自然以多腺苷酸形出現(xiàn)。一在把m RNA和其它細胞成分或分或和其它RNA分離時，最好利用這一特點。為了分離多腺苷信息脫氧核糖核酸，全部再現(xiàn)的核糖核酸大部份就近地在少量脫氧胸苷酸的纖維體上分離。然而，如果須要的話，也可用其它方法分離信息核糖核酸。
用逆轉(zhuǎn)錄作用技術(shù)，由多腺苷酸信息核糖酸構(gòu)成雙鏈的雜交的核糖核酸/脫氧核糖核酸分子是有可能的。酶的逆轉(zhuǎn)錄作用，朝著脫氧核糖核酸聚合酶的一個核糖核酸將在每個每分每分子上合成一個與核糖核酸鏈上互補的脫氧核糖核酸新鏈。這個轉(zhuǎn)化作用要求出現(xiàn)一個雙鏈成長點或的初始的初始點，一個少量胞苷分子雜化在信息核糖核酸的3/聚脫氧腺苷終端會形成這樣初始點，在雙鏈成長點，逆轉(zhuǎn)錄作用開始合成逆轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)錄的脫氧核酸，產(chǎn)生雙鏈的信息核糖核酸/逆轉(zhuǎn)錄脫氧核糖核酸雜化子。
接著，每個雙鏈分子的信息核糖核酸鏈以一種完全脫離逆轉(zhuǎn)錄脫氧核糖核糖核酸方式水解式消除，例如，核糖核酸鏈在堿性水解作用下水解或與核糖核酸酶一起水解，或在熱變性作用時由逆轉(zhuǎn)錄脫氧核糖核酸中消除，結(jié)果是一個單鏈逆轉(zhuǎn)錄脫氧核糖核酸，它是一個在3′端帶有發(fā)夾環(huán)的自身初始點結(jié)構(gòu)。
可采用逆轉(zhuǎn)作用技術(shù)或另外的脫核酸聚合酶象E.Coli脫氧核糖核酸聚合酶(E.C.2.7.7.7)或使用一種脫氧核糖核酸聚合酶k lenow法(用胰蛋白酶分子時形成)使單鏈逆轉(zhuǎn)錄脫氧核糖核酸分子被轉(zhuǎn)變成雙鏈的逆轉(zhuǎn)錄脫氧核糖核酸。任何這些醢隨著在實際上雙鏈發(fā)夾端的初始轉(zhuǎn)變作用，將構(gòu)成一種和第一個單鏈逆轉(zhuǎn)錄脫氧核糖核酸分子互補的第二個脫氧核糖核酸分子互補的第二個脫氧核糖核酸鏈。最終分子基本上是具有保留的單鏈發(fā)夾端的雙鏈逆轉(zhuǎn)錄脫氧核糖核酸，在用SL核酸酶(E.C.2.1.30.1)處理這些分子時，一個單鏈的特殊核酸酸，單鏈發(fā)夾端被調(diào)整。結(jié)果產(chǎn)生一群與最初的一群與最初的一群信息核糖核酸分子互補的雙鏈的逆轉(zhuǎn)錄脫氧核糖核酸分子。
大家記得，在這個工藝中作為模板的核糖核酸分子，包括病毒和宿主信息核糖核酸兩者，因此，用上述敘述的方法所制備的逆轉(zhuǎn)錄脫氧核糖核酸群是頗為不均勻的。逆轉(zhuǎn)錄脫氧核糖核酸克隆產(chǎn)生能夠確定重大意義逆轉(zhuǎn)錄脫氧核糖核酸基因的儲庫或基因存儲庫，而研究中心的CDNA亦可從其中被確定出來。
CDNA克隆儲存庫是用把CDNA基因插入一適當?shù)乃拗鞯霓D(zhuǎn)化作用的適當?shù)妮d體上方法制備。對于該程序中這個階段，宿主一載體將根據(jù)在控制中簡易性及切片中一致性而選擇，另外，載體將包含單一限制核酸內(nèi)切酶識別部位，這個部位最好對于CDNA和水解載體同聚物拖尾下再成形是合適的，例如，原粒載體，p BR322，對于E.COLI轉(zhuǎn)錄作用是合適的，隨著Pst1限制核酸內(nèi)切酶水解生成一種線性的脫氧核糖核酸分子。這種線分子用末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶(E.C.2.7.7.31)和脫氧嘌呤核苷三磷酸會在載體上拖尾生成聚脫氧胸腺嘧啶核苷尾。采用末端的脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶和脫氧三磷酸胞苷，聚脫氧胞苷酸poly-c尾可以加在CDNA分子上，在載體上的聚脫氧胸腺核苷尾與在CDNA上的聚脫氧胞苷互補。
這種產(chǎn)物(在這實例中，CDNAS拖成的poly-C和線性載體上拖成的poly-G)然后會混合并在加熱和慢慢冷卻時退火形成插在原始pst I(抽樣部位Ⅰ)限制部1的具有CDNA基因重建質(zhì)粒。在退火基礎(chǔ)上，插入的CDNA每一端的一個鏈將有相應(yīng)于Pst Ⅰ位置上的缺口。一旦這種重建的質(zhì)粒放到轉(zhuǎn)移作宿主細胞內(nèi)，宿主細胞會修復(fù)這個缺口，在插入的基因任一端重建pst Ⅰ位置。為進一步進行操作，這種組建允許使用pst Ⅰ限制核酸內(nèi)切酶經(jīng)常切割CDNA基因。
有幾種可以把CDNA基因插入載體中所采用的可供選擇的程序。例如，用適當脫氧核糖核酸連接酶可以把碎片和鏈分子連在一起。換句話說，同聚物拖尾可以用來在每個碎片末端生成互補的poly-A多聚腺苷酸和poly-T多聚胸腺嘧啶核糖核酸順序。
因此構(gòu)成嵌合質(zhì)?；蜉d體用作在使用載體于適宜轉(zhuǎn)化作用的轉(zhuǎn)移細胞上E.Coli實際是非常適合于作轉(zhuǎn)錄作用宿主，但其它有機物，例Bacillus subtilis應(yīng)用適宜的載體選擇因此CDNA構(gòu)成的克隆儲存庫，包含有病毒特殊基因克隆會確定下來并被分離。
一個僅包含病毒特殊克隆的分支克隆存儲庫，也就是，把具有病毒特殊基因或脫氧核糖核酸碎片采用不同的雜化技術(shù)來形成轉(zhuǎn)移宿主細胞。除了質(zhì)量數(shù)32放射磷dcTP三磷酸脫氧胞苷用來為獲得放射性示的CDNE外，采用上述方法，由感染病毒和由未參感染馬丁一達爾比牛腎細胞制備出單鏈CDNA示蹤物。由在先構(gòu)成的CDNA儲存庫中的E.coli克隊隆細胞在硝酸纖維過濾物中長大并形成復(fù)制的過濾物，菌落被溶解并釋放出來的核酸穩(wěn)定在過濾物上，放射性示蹤物雜化在過濾物上的克隆的CDNA上。未結(jié)合的示蹤物被去除之后，病毒的特殊菌落，也就是包含相應(yīng)于一個病毒基因CDNA的菌落用放射圖顯示會被確定下來。采用細胞加病毒CDNA示蹤物雜化的過濾物正面讀到正面茵落而不是采用細胞信息核糖核酸示蹤物雜化重現(xiàn)過濾物上正面讀到正面菌落是病毒特殊的CDNA克隆。僅僅這些克隆需要在下面敘述的鑒定工藝中予以研究。
為了簡化篩選工藝，互逆雜化(或菌落交叉雜化)分析會被來確定在相應(yīng)于分離的病毒特殊的CDNA克隆儲存庫范圍內(nèi)的單獨幾組克隆。這一步也可不求因為在轉(zhuǎn)錄作用和直接表達及接著免疫判定，例如采用單克隆抗體免疫判定可以被確定。下來然而，由于在儲存庫中會有大量克隆更為有效是這將會使這工藝過程整體化，此時在形成在那個組范圍內(nèi)交叉雜化的多組克隆并因此幾組克隆會被認為包含上述病毒基因片。
互逆雜化，一種單一病毒特殊的克隆用Pst1(產(chǎn)品抽樣試驗Ⅰ)水解釋放出CDNA插。這個插片然后被分開用32P放射性示蹤，并在將所有在PI-3 CDNAⅢ型牛類付流感病毒CDNA儲存庫針對的克隆雜交。和示蹤物雜交的所有克隆，定義成組A。第二示蹤物由未雜化克隆之一衍生出來，并且這過程重復(fù)到形成組B等等，直到多個組形成，并克隆按可能或所要求的范圍分類，在此所討論的Ⅲ型牛類付流感病毒實例5中組A和C包含大量的克隆，并且基于與m RNA信息核糖核酸大量的另外種付粘病毒模板的類似物(Roeenblatt等人的“脫氧核酸互補于Measles病毒，編碼在血細胞凝集素和Matrix蛋白上的信息核糖核酸的克隆和特征”J.Virology 42卷790-797頁(1982)這些假定編碼病毒殼包核酸蛋白基因和血細胞凝集素蛋白基因，分別如表1所示。
諾爾森點跡分析法使用每個組的克隆模型來決是每個克隆組編碼。在這個技術(shù)方面，克隆會和相應(yīng)信息核糖核酸原始粒子有關(guān)，單個的克隆模糴用放射性同住素示蹤并被用來作為決定由吸附到硝酸纖維過濾物上的受感染細胞的病毒信息核糖核酸的示蹤物。病毒m RNAs例如由電泳法測定所表明的六種不同的poly-A RNA類(標志成RNA1-6)在PI-3類感細胞中找到。模擬感染細胞是根據(jù)感染細胞的同擇程序制備，不增加病毒制劑。使用水泡性口膜類病毒m RNAs，或其它已知大小的m RNAs的分子量。
正如表1中所示，六種牛類流感病毒PI-3的poly-A的RNA編碼能力大致與六種病毒結(jié)構(gòu)蛋白有關(guān)，并與病毒基因組所確定的總的編碼能力有關(guān)。組A示蹤物(m RMAI)雜化在相應(yīng)于假想的存在的殼包核酸m RMA位置上并且組C示蹤物(m RNA3)雜化在相應(yīng)于假想存在的血細胞凝集素HA的m RNA上。沒有觀察到未受感的宿主細胞雜化在m RNA上。
雜化選擇和體外病毒m RNA的轉(zhuǎn)化作用可用來確證編碼的轉(zhuǎn)譯功能，并且因此確定單個克隆并且因此確定單個克克隆編碼轉(zhuǎn)譯的病毒載體蛋白，也就是HA蛋白。在這些程序中，來自受病毒感染的poly-Am RNA。和控制細胞在一種m RNA依賴于非細胞轉(zhuǎn)化系統(tǒng)中可以比較它們直接特病毒蛋白合成能力。
來自每個類別中克隆質(zhì)粒CDNA被分離出來并且被固定在硝化纖維這濾器上。微由受病毒感染細胞或模擬感染細胞(控制細胞)衍生出來的poly-Am RNAs與這濾界面CDNA雜化。專門雜化在每個固定丁的CDNAs上的m RNAs由這濾物中析出并轉(zhuǎn)移到體外。應(yīng)用一種技術(shù)象聚丙烯酰胺膠電泳(PAGE)轉(zhuǎn)化作用產(chǎn)物分析來確定相對于每個克隆類的CDNA編碼的病毒蛋白克隆鑒定。用體外表達蛋白的固定分析法也是理想的，因為體內(nèi)產(chǎn)生糖基化蛋白將不會在體外被糖基化，并且因此將不會在凝膠的上述位置上遷移。在PI-3實例中，類A克隆選擇一個蛋白的m RNA，這個蛋白與PI-3殼包核酸蛋白同時遷移。類C克隆選擇直接合成一個蛋白的m RNA，這個蛋白與HA蛋白同時遷移。沒有特殊的病毒蛋白會在由模拚感染控制細胞m RNA的轉(zhuǎn)化產(chǎn)物中探測出來。
另外編碼靶蛋白克隆的特征是用限制酶分析和/或核苷酸系列確定。如希望構(gòu)成一種僅編碼靶蛋白的一個特殊位置的基因，象包含一種活性蛋白抗原方面的部份，這一步將具有特殊意義和重要性。另一方面，這個情況會用來設(shè)計和構(gòu)成一種相應(yīng)于靶蛋白活性方面合成蛋白或用于研究和合理設(shè)計抗病毒藥物。這些特征性的工藝過程用慣用的方法和技術(shù)來實施。這些圖表示p 1-3 HA的特征論述結(jié)果。備1表示如上所的克隆基因的DNA分列。備2列出基因的限制酶部份。備3是HA基因DNA系列的轉(zhuǎn)化作用。備4將形成HA蛋白予計的氨基酸系列，它是用計算機得出的基因CDNA系列分析。
參考備1，DNA系列和限制酶識別和解理部份完全詳細表示出來了。按照慣例，DNA系列在5′至3′方向上讀出。在這個備上所示的HACDNA插入物是在長度方向堿基對1675，其包括用于克隆的poly-G和poly-C拖尾。沒有這拖尾，這個CDNA克隆表示由PI-3 HAm RNA衍生出來的堿基1633?？寺〈砹嘶旧贤暾腍AmRNA復(fù)件的CDNA;由所感染細胞所獲得的HAmRNA排列初始圍表示出僅僅大約10到15堿基在基因5′端不見了。備1基因編碼蛋氨酸基(Met)的第一個轉(zhuǎn)化作用起點密碼(ATG)在順序40位置找到，雙仃密碼(TAGTAG)在靠近克隆基因(位置1486)3′端找到，因此，這是清楚的，備1代表了一個幾乎完整的病毒HAmRNA復(fù)制件，并且也許是m RNA編碼區(qū)域全部蛋白。
另外起始編碼也許處于病毒m RNA向上方的部份，所以不可能在備1中表示出來。大部份真核生物病毒m RNAs用含m RNA蛋白體結(jié)合部位出現(xiàn)的5′非編碼堿基鏈來表示其特征。備1所表示的基因假想存在的未編碼5-序列大約是40磣堿基長。另外，如上指出約10到15堿基看來脫離了CDNA排列。
非編碼的3′序列特征在于在DNA序列位置1492上，緊接在仃室密碼之后，標準的多聚腺苷符號(AAATAA)。這個順序(備1線下)表明poly-A拖尾附加在體內(nèi)的m RNA上。
備2列出所有可能的備1克隆的CDNA基因中限制酶或煮核酸內(nèi)切酶部份。表中數(shù)據(jù)DNA序列用電子計算機分析得到。第一縱行表明的是限制酶識別部位或隔離部位，并第三行用堿基號碼確定在系列中每個酶位置。除非酶縮寫在括號里，數(shù)字代表隔離部位5′邊。括號說明對于已知特別酶的識別部位。酶實際上會隔離主不同部位。這些字母代表大述氨基酸。
A-腺嘌呤C-胞嘧啶G-鳥嘌呤J-腺嘌呤或腺嘧啶K-鳥嘌呤或胸腺嘧啶L-腺嘌呤或胸腺嘧啶M-胞嘧啶或鳥嘌呤N-腺嘌呤，胞嘧啶，鳥嘌呤或胸腺嘧啶P-腺嘌呤或鳥嘌呤Q-胞嘧啶或胸腺嘧啶T-胸腺嘧啶備3表明備1的DNA系列轉(zhuǎn)化到相應(yīng)的氨基酸系列。按照慣例，氨基酸系列由氨基端讀到羧基端。備1中所示CDNA克隆特征在于一個開放轉(zhuǎn)移碼由位置1485，在此可看到一雙仃編碼所有其它閱讀移碼都被分列的多次仃頓編碼出現(xiàn)而分成塊。
(備3)由位置40核苷酸初始蛋氨酸殘余物估計在位置1486終端或仃頓編碼上。由這個CDNA基因譯成多肽密碼包含予測的482氨基酸殘基(見備4)并且有予測分子量54，142道爾頓。這個值低于由病毒中分離出的HA蛋白所觀察到的分子量，這個值似乎是在沒有糖化作用時所期望的。備4中所示的HA多予測的氨基系列(靶蛋白)假定的用實線劃出的糖基化作用部(天冬氨酸-黃苷一絲氨酸，或天冬氨酸一黃苷-蘇氨酸)。
水療法分折已展示了蛋白內(nèi)的幾個親水區(qū)域和畏水區(qū)域。在蛋白羧基終端(殘基445至482)的畏水區(qū)具有重要意義。這個蛋白具有如病毒HA那樣的蛋白膜特征。這個終端的畏水分列在備4中用斷績線表示出來。
如已確定邯蛋白CDNA基因，然后該基因被嵌入一合適表達載體上。由專門工藝要求(也就是凈化產(chǎn)量)產(chǎn)品穩(wěn)定性(也就是對蛋白酶敏感性)及產(chǎn)品毒性及或抑制性決定造樣或構(gòu)成于這個目的的一種合適載體標準。表達載體和宿主造樣將受到在這個技術(shù)領(lǐng)域：
中工作的人的知識和技術(shù)水平限制。
在評定CDNA基因表達的載體的合適程度時一定要使用一種適合方法來決定靶蛋白表面。在判定載體蛋白時，可使用各種標準免疫測定方法即可采用免疫學(xué)又可采用射線顯影術(shù)。針對鈍粹的靶蛋白又針對研究中的病毒，也就是針對免疫測定應(yīng)用中的每種病毒蛋白，微克隆抗體可以制備出來。
研究中的CDNA基因插入到所選擇的表達載體上所形成的重新結(jié)合質(zhì)粒用于轉(zhuǎn)移隨后繁殖出來的宿主上。目的是，當轉(zhuǎn)移宿主在相應(yīng)條件下培養(yǎng)在一合適中間體上時，靶會積蓄蛋白。中間體和條件將由轉(zhuǎn)移宿主決定并且選擇將受到在這個技術(shù)領(lǐng)域：
中工作的人的知識和技術(shù)限制。蛋白表達產(chǎn)物在受到質(zhì)粒相鄰啟動基因區(qū)的影響下將由繁殖的合成基因編上碼。載體最好預(yù)先疲安排好并選擇好，以便包括一個強的啟動基因，適用于有意義基因的最全的表達。所表達的蛋白會確定或基本上確定出有意義病毒蛋白，可以代表那蛋白一部份或是轉(zhuǎn)移并合蛋白。這個“轉(zhuǎn)移合并蛋白”是兩種合并基因或是它們的碎片，也表達產(chǎn)物的肽就是合并轉(zhuǎn)移產(chǎn)物的肽。用本發(fā)明方法產(chǎn)生出來的轉(zhuǎn)移合并蛋白將包括所有或部分病毒靶蛋并在轉(zhuǎn)移作用載體或宿主RNA上位于相鄰于有意義的基因的一個基因氨基酸系列。轉(zhuǎn)移合并蛋可以予料將其有免疫活性。用通常使用方法會得元蛋白產(chǎn)物。例如宿主細胞可被分離或分解或含有排出蛋白的清液可以收集起來。蛋白可以由溶菌產(chǎn)物或上清液中用分子籃篩色譜法高壓液體色譜法，高壓液體色譜法或免疫色譜法分離或提純。特別用于載體蛋白的微克隆抗體可用在最后提及純方法中。
被提純多肽將是一種抗原，并且可以作為一種疫苗使用。當作為疫苗使用時，在一合適的佐劑盅中，合物合成抗原將在實驗的動物或人體上產(chǎn)生對靶蛋白抗體，因此得到保護，不受到病毒影響。一般來說，用皮下注射或肌肉由注射，靜脈注射，口服或噴霧把疫苗打入抗體中。
CDNA本身在各種環(huán)境中，如經(jīng)感染的動物的血液中存在化驗時是很有用的。例如動物的m RNA會被分離，并在一固定的板面上固定住。如果病毒m RNA存在，具有化學(xué)上的或放射性的示蹤的覲病毒或靶蛋白的CDNA將會把有標記的病毒CDNA粘在實驗的m RNA上。未被粘上的CDNA被去掉之后，被粘上的CDNA可以用色度法射線顯影術(shù)等被判定出來。
而且，采用本發(fā)明方法做出面成的CDNA基因核苷酸分別基礎(chǔ)上將有可能設(shè)計或構(gòu)成典，基因的核苷酸系列可以轉(zhuǎn)化成如圖3和4中相應(yīng)的表達蛋白的氨基酸系列，蛋白本身也可用化學(xué)合成，或?qū)⑷氚械鞍滓粋€或多個活體或抗原部位的少量肽可以或合成出來。
下面的舉例并不意味對此所描述的發(fā)明加以限制。
原種溶液和用在舉例中培養(yǎng)基介質(zhì)如下所述制備第一個鏈CDNA合成介質(zhì)三個-HLE(PH8.3) 0.01M氯酸鉀 60.00MM氯酸鎂 10.00MM.
DCTP 三磷酸脫氧胞苷 0.50MM.
DATP 脫氧三磷酸腺苷 0.50MM.
DGTP 脫氧三磷酸烏苷 0.50MM.
DTTP 三磷酸脫氧胸腺嘧啶核苷 0.50MM.
DTT 二硫酸糖醇 10.00MG.
OLIGO(DT)(12-18)由少量通常(12-18)脫氧胸腺嘧啶核苷分子組成聚合物 500MG/ML.
第二個鏈CDNA合成介質(zhì)HEPES N-2-羥基乙脂哌嗪乙烷硫酸(PH6.8) 0.2MM.
氯化鉀 60.00MM.
DCTP 三磷酸脫氧胞苷 0.50MM.
DATP 三磷酸脫氧腺苷 0.50MM.
DGTP 三磷酸脫氧烏苷 0.50MM.
DTTP 三磷酸脫氧胸腺嘧啶核苷 0.50MM.
Denhantt′s 溶液菲科爾 (TM)(Phanmacan′a Fin化學(xué)公司) 5.0g.
Polyvinylpyrrolidone 聚吡咯烷酮乙烯 5.0g.
BSA(Pentax Fraction V)
牛類、免疫血漿清蛋白 5.0g.
水 至500ML.
通過一放置Nalgene過濾器過濾，在-20℃保存例Ⅰ(宿主和病毒MRNA離析)原種病毒判備.馬丁-達爾比(Madin-Darby)(MDBK)腎細胞由美國標準菌庫(ATCC)12301 Parklawn Arenue，Rockville，Maryland 30852，獲得，并在最少是基本介質(zhì)中(變體)(Dulbecco變體)(“DMEM”)(Flow實驗公司)用10%胎牛血清(K、C生物制品)。Ⅲ型牛類付流感病毒(SF-4，VR 281菌種，由ATCC獲之)是兩次提純菌斑。用受感染的MDBK馬丁-達爾比牛腎細胞馬病毒-鹽水溶液在低感染多次重復(fù)下(0.01PFU/CELL胞斑形或單位/細胞)制備病毒原種受感染細胞在37℃大約3-4天長大到細胞病毒幾乎完成，令有病毒上清液獲之，分層及使用前在-70℃冷凍保藏。
在MDBK細胞上測定菌斑在2.0%(W/V)甲基纖維素半分離涂層條件下，在用2%胎牛血清50 Ⅰ、Ⅴ/ml國際單位盤尼西林和50Mg/ml鏈霉素DMEM最少是基本介質(zhì)幫助下滴到原種上。三天后出現(xiàn)了明顯的菌斑，在這時板被結(jié)晶紫色染上色斑并且數(shù)出菌斑。
氚化丁的Ⅲ型牛類、付流感病毒MRNA的制備在含有受過感染MDBK馬丁-達爾比牛腎細胞的T-150燒并內(nèi)，RNA在受感染后18小時在每毫升中有1.0MGD放線菌素條件下用每毫升3H-尿核苷中20NC Ⅰ居里單位代謝示蹤，這個時間是病毒MRNA合成最高峰。放線菌素D被用作阻止宿主DNA向RNA轉(zhuǎn)化作用，當VRNA核蛋白體核糖核酸接著向病毒MRNA轉(zhuǎn)化時，從而僅僅病毒mRNA變成被示蹤氚化的Ⅳ類牛付流感病毒mRNAS在加州吸附分析試驗中用作對比物并來決定PI-3載體的大小。
RNA的離析全的RNA使用Chirgwin etal生物化學(xué)18卷5294-5299頁(1979)硫氰酸胍-氯酸銫方法由受感染的MDBK馬丁一達爾比牛腎細胞中得到。按照這種方法由5個T-150燒并中10細胞在流入10ml硫氰酸胍(GUSCN)緩沖劑(5.0M GUSCN)0.0mM三-鹽酸(PH7.0)50.0m M EDTA.依地酸，5%(V/V)B-氫硫基乙醇用40TM肌氨酸(Ciba-Geigy公司)調(diào)整到2%(w/V)在原位被分離成層狀這種混合物被加熱到55℃保持5分鐘然后在冰中冷凍5分鐘。溶菌素在50m M EDTA依地酸分離成7.0ml5.7M Cscl并回轉(zhuǎn)容器溶動中(25，000R PM每分鐘速率)在15，000Xg，20℃下5小時離折。全部的RNA由離心管底部以一種小丸體被回收到。RNA小丸體在Oligo(d T)少量脫氧胸腺嘧啶核苷分子組成的聚合物纖維素體上進一步碎化成包合聚脫氧腺m RNA采用Avi v和Leder Proc.Na H.Acad.Sci.USA69卷1408-1412頁(1972年)。
除了細胞是用鹽水浸染而不是用病毒-鹽水溶液浸染外，RNA用上述方法由復(fù)制感染的MDBK馬丁-達爾比牛腎細胞中離折出來。由復(fù)制感細胞中分離出來RNA用于例Ⅳ和例Ⅴ中以作一比較的目的。
例Ⅱ(CDNA分子合成)互補于在例Ⅰ中分離的聚脫氧腺苷m RNA的DNA用5.0μg poly-Am RNA聚脫氧腺苷信息共核糖核酸在100μl第一1鏈CDNA合成介質(zhì)在37℃保溫10分鐘來合成。接看，每μg m RNA加進12單位鳥類成髓細胞白血病病毒(AMV)逆轉(zhuǎn)錄酶(生活科學(xué)公司)。這個混合物在42℃保溫45分鐘，在變中凍5分鐘然后在100℃再加熱3分鐘。在一微量驅(qū)蟲劑中以15，000xg離心2分鐘至脫落蛋白分離出去。
雙鏈CDNA用在100μl第二鏈CDNA合成介質(zhì)合有100μl第一鏈反應(yīng)上清液反上清液200μl培養(yǎng)基由單鏈CDNAE.Coli DNA聚合酶(Klenow碎片)添加到合成所獲定的每μg單鏈CDNA中10單位濃度中。這個混合物在15℃保溫16小時。用單一的苯酚一氯仿進行萃取伎反應(yīng)仃止。
產(chǎn)物(雙鏈CDNA分子)脫并在兩個連續(xù)精胺沉淀及接著在乙醇沉淀中濃縮。在雙鏈反應(yīng)溶液中的雙鏈CDNA在0℃(冰里)30分鐘10mM精胺存在時被沉淀的CDNA用一微量驅(qū)蟲劑在15，000離心作用下5分鐘收集到。在含有10mM精胺溶液中小丸粒被再懸浮。在0℃放置30分鐘后，沉淀物用如前述離心方法收集。沉淀的CDNA在400mM乙酸鈉和10mM乙酸鎂中再懸浮，然然后用2.5體積乙醇在-70℃沉淀。
雙鏈CDNA產(chǎn)物與SL核酸酶一起溶解至單鏈或發(fā)夾端脫離，CDNA在50μl體積的0.3M Nacl，0.03M乙酸鈉，0.003M Ence(PH 4.5)和10單位SL核酸酶中，在37℃放置30分鐘。雙鏈CDNA反應(yīng)產(chǎn)物脫鹽并用精胺沉淀物濃縮。
例Ⅲ(CDNA庫的結(jié)構(gòu))由在例Ⅱ中受病毒感染的細胞的mRNA制備的CDNA族在放置于具有30單位終端脫氧核糖核酸轉(zhuǎn)移酶時被拖尾，在含有250mM二甲胂胛(PH-7.2)，2.0mM Co Cl，1.0mM DTT二硫蘇糖醇和1.0mM dCTP三磷酸脫氧苷反應(yīng)緩沖劑中于25℃15分鐘產(chǎn)生具有聚脫氧腺苷拖尾的CDNA分子。PBR322(“腦研究進展”第322期)質(zhì)粒載體與Pst I限制核酸內(nèi)切酶一起在32℃水解16個小時產(chǎn)生出線狀DNA分子。這些線狀分子是用dGTP脫氧三磷烏苷使用拖尾CDNA中所用的同樣程序拖尾出來的聚脫氧胸腺嘧啶核苷。拖尾poly-G載體分子和poly-C拖尾CDNAs混合并用下述保溫方法退火70℃置30分鐘，37℃置150分鐘和22℃置30分鐘，為了形成插在原來的Pst Ⅰ限制部位具有CDNA基因重建的質(zhì)粒。這種結(jié)構(gòu)允許在Pst Ⅰ切除掉CDNA基因。在這個例子中形成的嵌合質(zhì)粒用于E.Coli k-12菌種Ac 80(由L.Bopp.通用電器供應(yīng))細胞，其由Kushner Proc.of the Int′l Symposium of Gen.Eng.生物醫(yī)藥Pren(1978)所談的用磷酸鈣共同沉淀方法所得之。被轉(zhuǎn)錄的E.Coli細胞構(gòu)成含有CDNA插片細胞庫。
例Ⅳ(特殊病毒克隆鑒定)包含特殊病毒基因克隆用際蹤由mRNA逆轉(zhuǎn)錄所衍生出來的CDNA操測物方法由不同的菌落雜交來鑒定，mRNA即是由守P I-3病毒感染式是模型感染MDBK馬丁一達爾比牛腎細胞用例Ⅰ程序提取出來。放射性示的單鏈CDNA合成用例Ⅱ中所述方法得到，除非P dc T P三磷酸脫氧胞苷在混合反應(yīng)中取代dc T P。
無性繁殖E.Coli細胞用例Ⅲ制備，在覆蓋在Luria瓊脂板硝化纖維過濾器的復(fù)制酶做出來。用0.5M NaoH把所得到切菌落溶解，然后釋放出來的核酸在80℃一個真空爐中加熱60分鐘固定在過濾器上。含有溶解E.Coli菌落的過濾器用在5 X Denhardt′s試劑(也就是，在上述給定的5倍濃度中)5 X SSC 0.15M氯化鈉-0.015檸檬酸鈉100ug/ml變性沙門精液，50%甲酰胺和DNA在42℃下保溫24小時放射性示蹤物的雜交作用產(chǎn)生無性繁殖的CDNA，用過濾器在2 X Denhardt′s試劑，5 X SSC〔0.15M氯化鈉-0.015檸檬酸鈉(PH7.0)〕，50ug/me沙門精液DNA，50%甲酰胺，7.5%硫化葡聚糖，特殊的放射示蹤物既對于MDBK馬丁一達爾牛腎細胞m RNA又對于MDBK+PI-3m RNA用保溫方法來進行。保溫是在42℃下置24小時。游離的示蹤物在2倍SSC(0.15M氯化鈉-0.15M)檸檬酸鈉加上0.1% SDC十二烷基硫酸鈉(去垢劑)清洗過濾物時及接著用0.1×SSC和0.1% SDS清洗中剝落。特殊病毒克隆用放射自顯影來確定。與含有病毒分別示蹤物不同地雜交產(chǎn)生的菌落也就方法僅用MDBK馬丁一達爾比牛腎細胞+PI-3m RNA示蹤物雜交產(chǎn)生的過濾物正面菌落和用MDBK m RNA示蹤物雜交產(chǎn)生的雙重過濾物反面菌落被確定并再分篩來確認病毒特征。
例Ⅴ(互逆雜交作用)Ⅳ例中特殊病毒CDNA克隆用Roznblatt etal.互補牙編碼血細胞集素和基質(zhì)蛋白Measls病毒m RNA的DNA的無性繁殖和特征。J.Virolgy病毒學(xué)42卷790-797頁(1982)互逆雜交方法分類?？寺NA用Pst I限制酶水解辦法由其中之一的特殊病毒CDNA克隆的PBR322載體中剝離。受到限制的DNA在1.5%瓊脂糖凝膠中分離作用下解體產(chǎn)生線狀PBR322質(zhì)粒DNA和插片物CDNA.插片物CDNA由凝膠中洗脫并用32p-d CTP切口轉(zhuǎn)錄程序射線示蹤.Maniutis其它人Proc，Natl.Acad.Sci美國72卷1184-1188頁(1975)采用(曾在Bethsda研究實驗中使用過)切口轉(zhuǎn)錄試劑件。放射性示蹤的CDNA示蹤物用于在PI-3 CDNA庫針對所有病毒-特殊性克隆采用下述方法雜化作用中。菌落同時凝聚在主瓊脂鏈上并硝化纖維過濾物凝聚在第二個瓊脂鏈并隨后長大。在過濾物上菌落用Hanahan和Meselson方法“基因”第10卷63-67頁(1980)用堿來分離。中合作用之后，DNA用烘干方法固定在過濾物上。這些菌落DNA吸印用Grunstein和Hogness中所描述的32P示蹤物雜合，Proc.Natl.Aead.Sci U.S.A72卷3961-3965頁(1975)接著雜合作用，過濾物放射自顯影。這些與示蹤物雜合的克隆成為PI-3A類。
第二個示蹤物用同樣方法由非雜化類來制備。雜化過程不斷重復(fù)直至所有克隆根據(jù)逆雜化分析理論又分成六組。表1說明已知道的每類克隆號數(shù)CDNA插入物大約尺寸，相應(yīng)m RNA大概尺寸m RNA分子和暫時編碼測定。
表1(以逆雜化作用關(guān)系為基礎(chǔ)的P1-3 CDNA克隆分類)組號 A B C D E斑蹤物 6～8 5～2 3～5 5～4 6～6克隆 38 8 10 3 5插入物 500 400 500 400 500尺寸范圍 ～1500bp ～1300bp ～1600bp ～1300bp ～1000bp相對的 RNA5 RNA4 RNA3 RNA6 ？mRNAmRN 大小 1600 1900 1950 1190 ？(體基)mRNA分子量0.55 0.64 0.65 0.41 ？(×10逆爾頓)編碼測定 NC F(？) HA M P(？)1.10 P1～3特別克隆不可能用互逆雜合分析來分類(Nc病毒粒子;F融合;HA血細胞凝聚集;M基質(zhì);P磷蛋白)例Ⅵ (Northern斑點分析)
相應(yīng)mRNAs(再互逆雜化作用)確定每個CDNA克隆類，應(yīng)用Northenr斑點分析法。CDNA插入物由組A～D的單個克隆中剝落開用32P示蹤使用的例Ⅴ中所述的用于CDNA示蹤物方法，切口轉(zhuǎn)錄作用。載體RNA由受P1～3病毒感染和模擬感染的MDBK細胞用14%乙二醛和50%二甲亞砜于5%磷酸鈉(PH60)中在50℃變性1小時。m RNAS是(使用20×SSC)用毛細管作用轉(zhuǎn)錄到一硝化纖維過濾物上斑。
轉(zhuǎn)錄后，過濾物在65℃烘干兩小時，冷卻到室溫然后放進5 X SSC中15分鐘。然后用一含有予雜化緩沖劑袋密封起來(緩沖劑5X Denhardt′s試劑，5 X SSC，50%甲酰胺和100μg/ml變性沙門精液DNA)并在42℃水池中保溫4小時。然后過濾物被切成小片，每個小片有PI-3m RNA和 。這些小片放進含有雜化作用緩沖劑的單個小袋中(2X Denhardt′ss，5X SSC，50%甲酰胺和1.0mM葡聚糖硫酸脂。50μg/me變性沙門精液DNA和1.0mM焦磷酸)每個小片和已配制出來的32p示蹤物雜化，這種32p示蹤物在放入袋之前放進沸騰水池加熱5分鐘產(chǎn)生變性。雜化作用是在其放入42℃水池中保溫20小時時進行的。接著，過濾物用1.0X SSC和0.1%SSC沖洗(洗四次，每次15分鐘)。下面它們進行放射性自顯影。在例1中制備到的氚化丁的PI-3m RNA電脈在吸口部于上述硝化纖維過濾物的平行點線上并用EN Hame照射(TM技術(shù)手冊)(新英格蘭核公司)熒光圖照相術(shù)使之顯影作為一種內(nèi)部標記和控制。顯影采用Kodak XAR(技術(shù)手冊)膠卷用增光屏在-70℃下曝光至48小時，直到圖象可見到。
單個病毒的m RNA給出初步的(在與病毒蛋白和其它的付粘病毒的尺寸關(guān)系相類的基礎(chǔ)上)編碼測是在這個例中，水洗性口膜炎病毒m RNAs用于標記以便確定PI-3 mRNA分子量。(Rose，J.及其它人例Ⅶ(雜化選擇和轉(zhuǎn)錄作用)對于組A和組C這些臨時編碼測定用雜化物選擇和體外病毒m RNA轉(zhuǎn)錄作用所確定。DNA質(zhì)粒(10μg)由組A和C的PI-3克隆中分離出來并用Cs Cl-溴乙錠離心作用來純化DNA在20μg I之-HCI(PH7.5)和1.0mM EDTA依地酸中加熱10分鐘至100℃然后馬上放到冰中冷卻而產(chǎn)生變性相當(當量濃度體積氫氧化鈉加進并且DNA溶液在25℃保溫20分鐘。在加入9.0ml 1.5M Nace，0.15M檸檬酸鈉和0.25M之HCI(PH8，0)溶液被中和。在2.0cm直徑硝纖維過濾物上(浸在3倍SSC中)用一真空管緩慢過濾，DNA被固定住。這個過濾物在25℃空氣干燥的1個小時，然后在-80℃真空爐中烘干兩小時。
干燥后，過濾物切成0.7cm小塊并放進一硅化處理30ml空中。50%(w/v)脫碘甲酰胺，20mM PIPES哌嗪乙烷硫酸.(PH6.4)，0.75M NaCl，1.0mM EDTA，依地酸(螯合劑)，1%(W/v)SDS十二烷化基硫酸鈉，5，0μg一單鏈沙門精液DNA和0.5μg E.Coli轉(zhuǎn)移RNA予雜化溶液加入之中。這溶液在37℃下保溫兩小時。予雜化緩沖劑分離出來并小片用不含轉(zhuǎn)移RNA和單股脫氧核糖核酸予雜化緩沖劑沖洗。
在雜化作用時，切成的過滬物與由受病毒感染的或模擬感染的MDBK馬丁一達爾比牛腎細胞分離出來的50μg整體細胞RNA一起置于100μI的50%(v/v)脫碘甲酰胺，20mM PIPES(PH6.4)哌嗪硫酸，0.75M Nace，1.0m M EDTA依地酸，1%(W/V)SDS十二烷基硫酸和1.0mM釩的絡(luò)合物于50℃保溫5小時。過濾物用TNE〔10毫克分子三倍的鹽酸(PH8.0)-100毫克分子Nace 1.0 mM依地酸(PH8.0)〕加上0.5% SDS.十二烷基硫酸鈉徹底沖洗，然后單獨用TNE沖洗。過濾物轉(zhuǎn)移到15ml定試管并加進30μl滅菌的水。結(jié)合的mRNA洗脫用沸騰方法在水槽中放置1分鐘來處理。樣品立刻放進液氮中冷凍，然后放到室溫解凍。過濾物扔掉。洗脫的RNA用碳酸氯仿，異戊醇進行提取然后在-70℃用乙醇沉淀。沉淀mRNA乙醇用離心方法和凍干方法收集。
每個洗脫的雜化選樣了的mRNA(用35 S-蛋氨酸)轉(zhuǎn)錄到無細胞Wheat Germ提取物IVT系統(tǒng)中(Bethesda研究實驗室)(新英格蘭核工程)。特殊病毒轉(zhuǎn)錄作用產(chǎn)物(蛋白)使用聚克隆免抗純化PI-3病毒血清進行免疫沉淀。免疫絡(luò)合物正如Rose Nature 279卷260頁(1979)所談一用吸附于蛋白一A聚丙烯酰胺(免疫泡TM Bio-Rad)與反應(yīng)混合物相分離。免疫沉淀的產(chǎn)物采用放置25μl緩沖劑(水中5%W/VSDS，6% V/V2-硫基乙醇)中沸騰5分鐘方法由吸收劑蛋白-A中脫落出來并在10% SDS-聚丙烯酰胺凝膠系統(tǒng)(SDS-PAGE)(Laemmli，Nature 227卷680-685頁1970)電脈。電脈后，凝膠電印到硝化纖維紙上(Bio-Rad)用EN Hame(TM)噴射法(新英格蘭核工程)進行熒光照相并且一周中24小時，使用科達Kodav，X-Omat AR(TM)膠卷(Kodak)在-70℃進行射線自顯影，直至圖象可見。
在控制時，病毒mRNA由與例1中所描述受牛的PI-3病毒感染的細胞中分離出來。全部分離出來的mRNA根據(jù)該例中前面所述體外轉(zhuǎn)錄程序被轉(zhuǎn)錄。轉(zhuǎn)錄作用產(chǎn)物(病毒和宿主兩者)使用聚克隆免抗純化PI-3病毒血清，這正如上所述確定病毒的特殊蛋白，而進行免疫沉淀。用這種方式所確定蛋白如在表Ⅱ(多肽控制)中所示?？梢钥吹接秒S后免疫沉淀法在體外轉(zhuǎn)錄所有的mRNA確定了三種病毒蛋白。它們之中兩種，血細胞凝集素(HA)和核衣殼蛋白(NC)與由雜化選擇的mRNAs轉(zhuǎn)錄的病毒特殊蛋白相符合。也就是，類A示蹤朝著具有65-70，000道爾頓分子量(相應(yīng)于68000道爾頓病毒核殼蛋白和65-67.000道爾頓控制類蛋白)一個蛋白合成的(雜化選樣)mRNAs類C示蹤朝著具有60，000道爾頓分子量(相應(yīng)于69，000道爾頓病毒血細胞凝集素蛋白和60，000道爾頓控制類蛋白)一個蛋白合成的雜化選樣的mRNAs。31，000道爾頓蛋白在相應(yīng)干35，000道爾頓病毒基質(zhì)蛋白的控制類中被確定出來，非病毒特殊多肽在與RNA一起由模擬感染細胞所編程序的小麥胚提取物中確定出來。
表Ⅱ(牛Ⅲ類付流感病毒多肽分子量)多肽符號 病毒多肽 控制多肽 雜化多肽L 180，000 ND NDP 79，00 ND NDHA 69，000 60，000 60，000NC 68，000 65-67，000 65-70，000F 55，000 ND NDM 35，000 31，000 ND1.用道爾頓表示的分子量素/2.ND＝“不定”3.病毒HA多肽與體外轉(zhuǎn)錄的HA多肽之間分子量不同是由于在體外產(chǎn)物中缺少糖基化作用。
4.核殼蛋白(NC)和基質(zhì)蛋白的未經(jīng)過糖基化作用，因此在SDS-PAGE凝膠中反映較小區(qū)別。
原則上，本發(fā)明涉及主體和操作模式已在上述說明書中闡明。然而，在此打算進行保護的發(fā)明將不包括限于已分開特殊形式，因這些內(nèi)容是看作闡述性的而不是限制性的。那些具有一般技術(shù)水平的人在不違背發(fā)明精神前提下可以知道之區(qū)別和變化。
權(quán)利要求
1.一個合成基因或DNA碎片特征在于a)偏碼牛Ⅲ類付流感病毒蛋白或其部分，及b)包括一雙鏈DNA基因，該基因是病毒RNA基因編碼在上述蛋白或其部分的一個復(fù)本。
2.權(quán)項1合成基因，其編碼牛Ⅲ類付流感病毒血細胞凝集素或其一部分。
3.權(quán)項2合成基因的DNA系列，該系列開始具有一起始密碼子，結(jié)束具有終端或停止密碼子，并且該DNA系列包括圖1所示的核苷酸系列或該系列部分。
4.權(quán)項2合成基因的DNA系列，該系列編碼一個具有圖4示氨基酸系列一多肽或其一部分。
5.權(quán)項1合成基因，其編碼牛的Ⅲ類付流感結(jié)構(gòu)融合蛋白或其的一部分。
6.權(quán)項1雙鏈DNA基因包括在一載體或質(zhì)粒中。
7.權(quán)項6的載體或質(zhì)粒，在它們之中上述的DNA基因編碼牛的Ⅲ類付流感血細胞凝集素，或其的一部分。
8.權(quán)項6的載體或質(zhì)粒，在它們之中上述的DNA基因編碼牛的Ⅲ類付流感結(jié)構(gòu)融合蛋白或其一部分。
9.權(quán)項1的雙鏈DNA基因包括在一宿主細胞中。
10.權(quán)項9的宿主細胞，其中上述DNA基因編碼牛的Ⅲ類付流感血細胞凝集素或其一部份。
11.權(quán)項9宿主細胞，其中上述DNA基因編碼牛的Ⅲ類付流感結(jié)構(gòu)融合蛋白或其一部份。
12.培養(yǎng)權(quán)項9上述的宿主細胞產(chǎn)生出合成的牛Ⅲ類付流感病毒蛋白或其一部分。
13.權(quán)項12的蛋白或其一部份，其包括圖4示氨基酸系列或其一部分。
14.構(gòu)成一種對于病毒載體蛋白的合成基因的方法，病毒載體蛋白被編碼在位于未被分割的牛的類付流感病毒負鏈病基因組的基因的予期位置上。該方法包括有a)分離大量具有編碼上述病毒蛋白基因的m RNA。b)用酶逆轉(zhuǎn)錄和低脫氧核苷酸初始分子由上述大量的m RNA構(gòu)成雙鏈的m RNA/c DNA雜化物。c)溶解或去掉上述雜化物的m RNA鏈。d)在步驟(c)之后由所保留下來的單鏈CDNA，用DNA多聚酶產(chǎn)生出基本上完整的雙鏈CDNA分子，并e)使用單鏈特殊核酸酶修整上述基本完整的雙鏈CDNA分子的單鏈端部位置。
15.權(quán)項14方法，用其中上述合成基因插放到適宜的載體上，適合的宿主與重組載體一起被轉(zhuǎn)錄，并轉(zhuǎn)錄宿主克隆到所生成的包含上述病毒載體蛋白合成基因的庫。
16.權(quán)項14方法，其中在步驟(a)分離的大量m RNA經(jīng)離心進一步分離多腺苷酸的m RNA。
17.權(quán)項16方法，其中上述步驟(b)的少量的脫氧核苷酸聚合物分子是將雜化到聚腺苷酸的m RNA的diqo(dt)分子。
18.權(quán)項14方法，其中，步驟(c)包含用堿基或核糖核酸溶解的m RNA鏈。
19.權(quán)是項14方法，在此方法中步驟c包含用熱變性作用由CDNA鏈分m RNA鏈。
20.權(quán)項14方法，在此方法中，合成基因至少編碼在上述病毒載體蛋白一個抗原部位上。
21.權(quán)項14方法，在此方法中，上述病毒載體胥白是牛Ⅲ類付流感病毒的血細胞凝集素。
22.權(quán)項21方法，此方法中上述蛋白基因基本上包括圖1示的核苷酸系列或其一部分。
23.權(quán)項21方法，在此方法中由上述合成基因產(chǎn)生的上述蛋白基本上包括圖4示氨基酸系列或其一部分。
24.權(quán)項14方法，在此方法中，上述病毒載體蛋白是牛的Ⅲ類付流感病毒結(jié)構(gòu)融合蛋白。
25.用權(quán)項14方法所產(chǎn)生出來的對于牛的Ⅲ類付流感病毒載體蛋白或至少上述病毒蛋白一抗原部位的合成基因。
26.權(quán)項25的合成基因其包含圖1這示的核苷酸系列或其一部分。
27.權(quán)項25的合成基因，其編碼在圖4示氨基酸系列或其一部分的一個多肽上。
28.權(quán)項25合成基因包含在一個載體或質(zhì)粒內(nèi)。
29.用權(quán)項28的載體或質(zhì)粒轉(zhuǎn)錄的一個宿主細胞并表達其中所包含的合成基因蛋白。
30.權(quán)項14方法，在此方法中，在確定上述合成基因核苷酸系列，將上述核苷酸轉(zhuǎn)錄到所表達蛋白的相應(yīng)氨基酸系列，及合成具有上述氨基酸系列或其一部分的肽的條件下，合成基因是用來形成或構(gòu)成一種疫苗或診斷劑合成肽。
31.生產(chǎn)協(xié)相應(yīng)于牛Ⅲ°類付流感病毒的載體蛋白一種病毒蛋白或其一部份方法包括a)構(gòu)成一種編碼上述載體蛋白或其一部份合成基因條件Ⅰ)分離大量的含有編碼上述病毒蛋白的基因的m RNA。Ⅱ)使用酶逆轉(zhuǎn)錄和低脫氧核苷酸引物分子由上述大量的m RNA來產(chǎn)生雙鏈m RNA/c DNA雜化物。Ⅲ)溶解或去除上述雜化物的m RNA鏈。Ⅳ)利用DNA聚合酶由在步驟c)之后保留的單鏈CDNA產(chǎn)生基上完整地雙鏈CDNA分子。Ⅴ)使用單鏈特殊的核酸酶修整上述基本上完整的雙鏈CDNA分子的單鏈端部位置。Ⅵ)把所得的雙鏈CDNA分子插入到載體內(nèi)并用重組載體轉(zhuǎn)體轉(zhuǎn)錄宿主。Ⅶ)無性繁殖所轉(zhuǎn)錄的宿主至形成一基因庫。b)確定并分離上述合成基因。c)將上述基因插入到一適宜表達載體上。d)包含上述合成基因重組載體轉(zhuǎn)錄一合適的宿主。e)無性繁殖所轉(zhuǎn)錄宿主。f)在適合于上述合成基因表達的一個介質(zhì)中培養(yǎng)上述宿主。g)在介質(zhì)和/或在轉(zhuǎn)錄宿主上累積上述病毒蛋白或其一部份。
32.權(quán)項31方法，在此方法中上述步驟g)中累積的病毒蛋白或其一部分被分離或提純。
33.權(quán)項31方法，在此方法中上述載體蛋白是牛的Ⅲ類付流感病毒血繃胞凝集素或多種它們的抗原部位。
34.權(quán)項33方法，在此方法中上述蛋白或其一個或多個抗原部位包括圖4示的氨基酸系列或其一部分。
35.機項31方法，在此方法中上述載體蛋白是牛Ⅲ類付流感病毒結(jié)構(gòu)融合白或它們的一或多個抗原部位。
36.權(quán)項3.1.方法，在此方法中所表達的蛋白適合用作一種疫苗或診斷劑。
37.在一種適宜的佐劑中權(quán)項36的蛋白包含在一種疫苗中。
38.權(quán)項31方法產(chǎn)生出一種牛的Ⅲ類付流感病毒蛋白或其一部份。
39.權(quán)項31方法，在此方法中所產(chǎn)生出來的病毒蛋白是一種包括所有的或部份的病毒載體蛋白的轉(zhuǎn)錄融合蛋白及由相鄰基因編碼的氨基酸系列。
專利摘要
發(fā)明公開了構(gòu)成一種用于產(chǎn)生病毒蛋白或其一部分的合成基因方法。該方法可用于負鏈RNA病毒基因組上組建基因，如流感病毒或副流感病毒基因于適當宿主上，用表達合成基因所制備的蛋白或其一部分，并用于疫苗或診斷目的。
文檔編號C12N15/00GK85100949SQ85100949
公開日1987年1月10日 申請日期1985年4月1日
發(fā)明者約翰·M·賴斯 申請人:W·R格雷斯公司導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan