本發(fā)明涉及生物工程，具體涉及一種骨破壞模型的構(gòu)建方法。

背景技術(shù)：

1、馬爾尼菲籃狀菌(talaromycesmarneffei,tm)是真菌界、子囊菌門(mén)、散囊菌綱、散囊菌目、發(fā)菌科、籃狀菌屬中唯一已知的對(duì)包括人類在內(nèi)的哺乳動(dòng)物具有致病性的溫度雙相型真菌。馬爾尼菲籃狀菌病(talaromycosis,tms)是由tm感染所引起的侵襲性真菌病，主要流行于亞洲熱帶和亞熱帶。該疾病局限于上呼吸道或下呼吸道、骨骼、關(guān)節(jié)和腸道，且能在多個(gè)器官系統(tǒng)中傳播，導(dǎo)致局部或播散性感染。

2、骨破壞是tms常見(jiàn)的臨床表現(xiàn)，上世紀(jì)80年代廣西醫(yī)科大學(xué)鄧卓霖教授首次在國(guó)內(nèi)報(bào)道tm感染存在骨破壞現(xiàn)象，該現(xiàn)象好發(fā)于脊柱、長(zhǎng)骨部位。隨著病情的進(jìn)展或是治療的延誤，約有30％的tm患者會(huì)出現(xiàn)嚴(yán)重的病理性骨折，1年內(nèi)致死率可達(dá)20％，永久性致殘率可達(dá)50％。不僅給患者家庭帶來(lái)巨大的痛苦，還造成了嚴(yán)重的社會(huì)經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。

3、目前，tm感染其他器官或播散性感染的模型均涉及免疫抑制過(guò)程，在臨床病例相關(guān)的報(bào)道中可見(jiàn)非hiv感染的病例，而未見(jiàn)tm導(dǎo)致的骨破壞伴隨hiv感染的病例報(bào)道。同時(shí)，tm骨破壞常因無(wú)法明確病因而無(wú)法得到針對(duì)性的治療，耽誤診療進(jìn)程，造成嚴(yán)重的后果。故有必要建立非免疫抑制tm骨破壞模型來(lái)了解非免疫抑制狀態(tài)下tm所致的骨破壞情況和探索其致病機(jī)制。

4、因此，亟需構(gòu)建一種骨破壞模型。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、為開(kāi)發(fā)一種骨破壞模型來(lái)了解非免疫抑制狀態(tài)下tm所致的骨破壞情況和探索其致病機(jī)制，本發(fā)明提供了一種骨破壞模型的構(gòu)建方法。本發(fā)明的構(gòu)建方法能夠進(jìn)一步闡明tm骨破壞發(fā)生的分子機(jī)制，為深入挖掘tm骨破壞機(jī)制提供了工具基礎(chǔ)，同時(shí)能促進(jìn)抗tm骨感染藥物和疫苗的試驗(yàn)研究和制備開(kāi)發(fā)。

2、本發(fā)明的上述目的是通過(guò)以下技術(shù)方案給予實(shí)現(xiàn)的：

3、一種骨破壞模型的構(gòu)建方法，所述構(gòu)建方法包括：采用tm標(biāo)準(zhǔn)株frr2161對(duì)4-5周齡的c57bl/6n小鼠進(jìn)行脛骨內(nèi)注射感染，獲得非免疫抑制小鼠馬爾尼菲籃狀菌骨破壞模型。

4、優(yōu)選地，將tm標(biāo)準(zhǔn)株frr2161制備成tm標(biāo)準(zhǔn)株frr2161懸液后進(jìn)行脛骨內(nèi)注射感染。

5、優(yōu)選地，所述tm標(biāo)準(zhǔn)株frr2161懸液濃度為0.8×108cfu/ml-1.2×108cfu/ml。

6、優(yōu)選地，所述tm標(biāo)準(zhǔn)株frr2161懸液濃度為108cfu/ml。

7、優(yōu)選地，所述的tm標(biāo)準(zhǔn)株frr2161的懸液注射劑量為8μl-12.5μl。

8、優(yōu)選地，所述的tm標(biāo)準(zhǔn)株frr2161的懸液注射劑量為10μl。

9、優(yōu)選地，所述的tm標(biāo)準(zhǔn)株frr2161懸液制備過(guò)程為：將tm標(biāo)準(zhǔn)株frr2161活化后，將菌落刮下后接種于吐溫20-dd水溶液，混勻后離心棄上清液，將菌體沉淀，清洗后加入pbs后震蕩混勻，得到tm標(biāo)準(zhǔn)株frr2161懸液。

10、優(yōu)選地，脛骨內(nèi)注射感染后飼養(yǎng)小鼠28天-30天。

11、優(yōu)選地，所述飼養(yǎng)環(huán)境為溫度為18℃-25℃，飼養(yǎng)過(guò)程中采取12/12h晝夜循環(huán)。

12、本發(fā)明還提供了一種藥物篩選的方法，可將待篩選藥物作用于骨破壞模型，篩選出可以改善或緩解骨破壞現(xiàn)象的藥物。

13、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果在于：

14、1、本發(fā)明首次成功建立一種骨破壞模型，所提供的構(gòu)建方法契合于非免疫抑制小鼠，為本領(lǐng)域技術(shù)人員進(jìn)一步開(kāi)展具體臟器的真菌感染模型提供了思路。

15、2、本發(fā)明所提供的一種骨破壞模型的構(gòu)建方法，在非免疫抑制動(dòng)物體內(nèi)構(gòu)建的tm骨破壞模型模擬了真菌在人體骨組織內(nèi)部的動(dòng)態(tài)過(guò)程，為tm骨感染的診斷和針對(duì)性治療提供了模型基礎(chǔ)，同時(shí)為深入挖掘tm骨破壞機(jī)制提供了工具基礎(chǔ)。

16、3、本發(fā)明所提供的一種骨破壞模型的構(gòu)建方法，為研究tm骨破壞提供了工具模型，拓寬了研究思路。尤其是tm作為一種溫度雙向型真菌，其致病機(jī)理不同于病毒或者細(xì)菌，本發(fā)明所提供的tm骨破壞模型進(jìn)一步為tm骨破壞發(fā)生的分子機(jī)制研究提供了充分的依據(jù)和堅(jiān)實(shí)的前期基礎(chǔ)。

17、4、本發(fā)明所提供的一種骨破壞模型的構(gòu)建方法，建模周期較短，模型穩(wěn)定，加快了后期基于該模型的試驗(yàn)研究進(jìn)度并提高實(shí)驗(yàn)的成功率，減少人力、物力、財(cái)力的投入，進(jìn)而為篩選tm骨感染的藥物應(yīng)用提供了工具基礎(chǔ)。

技術(shù)特征：

1.一種骨破壞模型的構(gòu)建方法，其特征在于，所述構(gòu)建方法包括：采用tm標(biāo)準(zhǔn)株frr2161對(duì)4-5周齡的c57bl/6n小鼠進(jìn)行脛骨內(nèi)注射感染，獲得非免疫抑制小鼠馬爾尼菲籃狀菌骨破壞模型。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的骨破壞模型的構(gòu)建方法，其特征在于，將tm標(biāo)準(zhǔn)株frr2161制備成tm標(biāo)準(zhǔn)株frr2161懸液后進(jìn)行脛骨內(nèi)注射感染。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的骨破壞模型的構(gòu)建方法，其特征在于，所述tm標(biāo)準(zhǔn)株frr2161懸液濃度為0.8×108cfu/ml-1.2×108cfu/ml。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的骨破壞模型的構(gòu)建方法，其特征在于，所述tm標(biāo)準(zhǔn)株frr2161懸液濃度為108cfu/ml。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的骨破壞模型的構(gòu)建方法，其特征在于，所述的tm標(biāo)準(zhǔn)株frr2161的懸液注射劑量為8μl-12.5μl。

6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的骨破壞模型的構(gòu)建方法，其特征在于，所述的tm標(biāo)準(zhǔn)株frr2161的懸液注射劑量為10μl。

7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的骨破壞模型的構(gòu)建方法，其特征在于，所述的tm標(biāo)準(zhǔn)株frr2161懸液制備過(guò)程為：將tm標(biāo)準(zhǔn)株frr2161活化后，將菌落刮下后接種于吐溫20-dd水溶液，混勻后離心棄上清液，將菌體沉淀，清洗后加入pbs后震蕩混勻，得到tm標(biāo)準(zhǔn)株frr2161懸液。

8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的骨破壞模型的構(gòu)建方法，其特征在于，脛骨內(nèi)注射感染后飼養(yǎng)小鼠28天-30天。

9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的骨破壞模型的構(gòu)建方法，其特征在于，所述飼養(yǎng)環(huán)境為溫度為18℃-25℃，飼養(yǎng)過(guò)程中采取12/12h晝夜循環(huán)。

10.一種藥物篩選的方法，其特征在于，包括：利用權(quán)利要求1-9任一項(xiàng)骨破壞模型構(gòu)建方法構(gòu)建骨破壞模型，將待篩選藥物作用于骨破壞模型，篩選出可以改善或緩解骨破壞現(xiàn)象的藥物。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明涉及生物工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及了一種骨破壞模型的構(gòu)建方法，采用TM標(biāo)準(zhǔn)株FRR2161對(duì)4?5周齡的C57BL/6N小鼠進(jìn)行脛骨內(nèi)注射感染，獲得非免疫抑制小鼠馬爾尼菲籃狀菌骨破壞模型。本發(fā)明首次成功建立非免疫抑制小鼠馬爾尼菲籃狀菌骨破壞模型，通過(guò)在小鼠體內(nèi)構(gòu)建TM骨破壞模型，模擬了真菌在脛骨內(nèi)部的動(dòng)態(tài)過(guò)程，為研究TM在機(jī)體發(fā)生的骨感染狀態(tài)提供模型基礎(chǔ)，同時(shí)為深入挖掘TM骨破壞機(jī)制提供了工具基礎(chǔ)，為篩選TM骨感染的藥物應(yīng)用提供了新思路。

技術(shù)研發(fā)人員：曾高峰,宗少暉,韋入菲,陳欣穎,滕益霖
受保護(hù)的技術(shù)使用者：廣西醫(yī)科大學(xué)
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2025/1/2