本發(fā)明涉及一種制備含高濃度va-dha酯、va-epa酯和vd3-dha酯、vd3-epa酯組合物的方法。
背景技術(shù):
:魚油是指富含epa(二十碳五烯酸)、dha(二十二碳六烯酸)的魚體內(nèi)的油脂。普通魚體內(nèi)含epa、dha數(shù)量極微,只有寒冷地區(qū)深海里的魚,如三文魚、沙丁魚等體內(nèi)epa、dha含量極高。深海魚油就是來自深海魚類脂肪的提取物。其可降低人體血液中的低密度脂蛋白,減少血液的黏稠度,防止血液斑塊形成,具有降低血液脂肪、治療心腦血管疾病的輔助作用。魚肝油(codliveroil)為人類生長發(fā)育所必須的維生素(va、vd)的主要來源,主要用于防治維生素a(va)和維生素d(vd)缺乏引起的皮膚干燥、毛囊角化、干眼病、夜盲癥、佝僂病等病癥,對人類健康和生長發(fā)育有著十分重要的作用。魚肝油為自海產(chǎn)魚肝臟中制得的魚肝油提取物,將制得的魚肝油粗品經(jīng)0℃冷凍,脫去部分固體脂肪后,用精煉食用植物油獲取濃度較高的魚肝油,其主要成分為va和vd,還含有其他維生素、ω-3脂肪酸(如dha、epa)、烷氧基甘油醚、角鯊烯等活性成分。但這種提取物的純度一般不太高。目前市售的一些魚肝油是化學合成的維生素a、d與魚油的混合物,然而這種混合物不容易被人體吸收。技術(shù)實現(xiàn)要素:本發(fā)明的目的在于提供一種制備含高濃度va-dha酯、va-epa酯和/或vd3-dha酯、vd3-epa酯的組合物的方法。本發(fā)明目的通過如下技術(shù)方案得以實現(xiàn)。一種制備含高濃度va-dha酯、va-epa酯和/或vd3-dha酯、vd3-epa酯的組合物的方法,包括下述步驟:1)將高純度的dha、epa酯魚油,與堿反應(yīng),得到dha、epa酸;2)將步驟1)中得到的dha、epa酸與氯化試劑反應(yīng),得到dha、epa的酰氯。3)取步驟2)中得到的酰氯與維生素a醇和/或d3醇反應(yīng),得到高純度維生素a-dha酯和維生素a-epa酯組合物和/或d3-dha酯和維生素d3-epa酯組合物。根據(jù)本發(fā)明,所述步驟1)中,所述高純度dha、epa酯魚油為dha+epa占脂肪酸比例大于80%,更優(yōu)選大于85%。所述堿可為氫氧化鈉、氫氧化鉀等,所述堿優(yōu)選溶于溶劑中,所述溶劑可為水、乙醇、或乙醇和水的混合物等;所述乙醇和水的體積比優(yōu)選為乙醇:水=1.2:1-15:1,所述堿溶液的濃度可為0.5mol/l-3mol/l;所述反應(yīng)溫度優(yōu)選為30-80℃,反應(yīng)時間優(yōu)選為30-120min。反應(yīng)條件優(yōu)選為:機械攪拌,充氮,遮光。根據(jù)本發(fā)明,所述步驟1)中,反應(yīng)后,用有機溶劑和水萃取,得到dha、epa酸,優(yōu)選的,用有機溶劑和水萃取后,進行干燥,過濾,濃縮,得到dha、epa酸;根據(jù)本發(fā)明,所述步驟2)中,所述氯化試劑可為二氯亞砜。反應(yīng)溫度優(yōu)選為40-80℃,回流時間優(yōu)選為2-6h。根據(jù)本發(fā)明,所述步驟3)中,所述反應(yīng)溫度優(yōu)選為15-45℃,反應(yīng)時間優(yōu)選為1-5h。根據(jù)本發(fā)明,所述步驟3)中,反應(yīng)后,將產(chǎn)物用層析柱分離純化,得到本發(fā)明所述組合物。所述的層析柱用硅膠填充,洗脫液優(yōu)選為石油醚、乙醚、乙酸乙酯。根據(jù)本發(fā)明,所述方法優(yōu)選包括如下步驟:1)取高純度(dha+epa占脂肪酸比例大于85%)的dha、epa酯魚油,加入堿液反應(yīng),用有機溶劑和水萃取,干燥,過濾,濃縮,得到dha、epa酸;2)上步獲得的酸,滴加二氯亞砜,加熱回流,濃縮,得到高純度dha、epa的酰氯。3)取步驟2)獲得的酰氯,加入維生素a醇或d3醇,反應(yīng)得到高純度維生素a-dha酯和維生素a-epa酯組合物或d3-dha酯和維生素d3-epa酯組合物。4)步驟3)獲得的酯上層析柱分離純化,得到合成產(chǎn)品。本發(fā)明提供了由上述制備方法得到的含有va-dha酯、va-epa酯、和/或vd3-dha酯、vd3-epa酯的組合物。通過本發(fā)明方法得到的組合物中,維生素a-dha酯和維生素a-epa酯組合物和/或d3-dha酯和維生素d3-epa酯組合物占脂肪酸比例大于80%,優(yōu)選大于85%。這種高純度的組合物可以用作藥物使用。本發(fā)明組合物相對于目前普通市售魚肝油更容易被人體吸收。并且本發(fā)明組合物可大批量生產(chǎn),制造成本低。附圖說明圖1為實施例3中得到的組合物的液相分析特征圖譜。具體實施方式以下用具體的實施例對本發(fā)明作進一步的說明,將有助于對本發(fā)明的優(yōu)點有更好的了解。但實施例不限定本發(fā)明的保護范圍。實施例1含高濃度va-dha酯和va-epa酯組合物的制備方法,包括下述步驟:1)取50g高純度的dha、epa酯魚油(dha+epa占脂肪酸比例大于85%),加入0.5mol/l的氫氧化鈉乙醇水溶液(乙醇:水=4:1)1l,充氮、攪拌,于30℃避光反應(yīng)120min。用200ml純化水和600ml正己烷萃取,干燥,過濾,濃縮,得到dha、epa酸;2)取上步獲得的酸15g,在0-5℃下緩慢滴加氯化亞砜4ml,再加熱至40℃,回流反應(yīng)3h,濃縮,得到高純度dha、epa的酰氯;3)取步驟2)獲得的酰氯5g,在0-5℃下緩慢滴加維生素a4g,滴加完后加熱至20℃反應(yīng)2h,干燥,過濾,得到油狀物即為含高純度va-dha酯和va-epa酯組合物。4)用硅膠100g(300目)裝柱,加入步驟3)獲得的油狀物(1g)的石油醚(1ml)溶液,用石油醚:乙酸乙酯=10:1(v/v)洗脫,收集洗脫液,濃縮,得到含高濃度va-dha酯和va-epa酯組合物。實施例2含高濃度vd3-dha酯和vd3-epa酯組合物的制備方法,包括下述步驟:1)取50g高純度的dha、epa酯魚油(dha+epa占脂肪酸比例大于85%),加入2mol/l的氫氧化鉀乙醇水溶液(乙醇:水=4:1)1l,充氮、攪拌,于65℃避光反應(yīng)60min。用200ml純化水和300ml正己烷萃取,干燥,過濾,濃縮,得到dha、epa酸;2)取上步獲得的酸15g,在0-5℃下緩慢滴加氯化亞砜4ml,再加熱至20℃,回流反應(yīng)4h,濃縮,得到高純度dha、epa的酰氯;3)取步驟2)獲得的酰氯5g,在0-5℃下緩慢滴加維生素d34g,滴加完后加熱至20℃反應(yīng)4h,干燥,過濾,得到油狀物即為含高純度vd3-dha酯和vd3-epa酯組合物。4)用硅膠100g(300目)裝柱,加入步驟3)獲得的油狀物(1g)的石油醚(1ml)溶液,用石油醚:乙酸乙酯=10:1(v/v)洗脫,收集洗脫液,濃縮,得到含高濃度vd3-dha酯和vd3-epa酯組合物。實施例3含高濃度va-dha酯、va-epa酯和vd3-dha酯、vd3-epa酯組合物制備方法,包括下述步驟:1)取50g高純度的dha、epa酯魚油(dha+epa占脂肪酸比例大于85%),加入3mol/l的氫氧化鉀乙醇水溶液(乙醇:水=15:1)1l,充氮、攪拌,于65℃避光反應(yīng)120min。用200ml純化水和800ml正己烷萃取,干燥,過濾,濃縮,得到dha、epa酸;2)取上步獲得的酸15g,在5-10℃下緩慢滴加氯化亞砜4ml,再加熱至20℃,回流反應(yīng)4h,濃縮,得到高純度dha、epa的酰氯;3)取步驟2)獲得的酰氯5g,在0-5℃下緩慢滴加維生素a4g,維生素d34g,滴加完后加熱至80℃反應(yīng)6h,干燥,過濾,得到油狀物即為含高純度va-dha酯、va-epa酯和vd3-dha酯、vd3-epa酯組合物。4)用硅膠100g(300目)裝柱,加入步驟3)獲得的油狀物(1g)的石油醚(1ml)溶液,用石油醚:乙酸乙酯=10:1(v/v)洗脫,收集洗脫液,濃縮,得到含高濃度va-dha酯、va-epa酯和vd3-dha酯、vd3-epa酯組合物。對合成的組合物進行液相分析,特征圖譜如圖1,其中,峰1為維生素a的dha和epa的酯,峰2為vd3的epa的酯,峰3為vd3的dha的酯。實施例4:動物試驗試驗一本發(fā)明va-dha酯、va-epa酯和vd3-dha酯、vd3-epa酯組合物對小鼠免疫功能的影響研究30只icr小鼠,隨機分為三組,每組10只。分別給予實施例3得到的組合物20ml/kg體重(高劑量組)、10ml/kg體重(低劑量組),對照組給予普通市售魚肝油(20ml/kg體重)(化學合成的維生素a、d與魚油的混合物)。每天灌胃一次,連續(xù)7天,于第7天記錄小鼠血清溶血素含量、脾臟及胸腺重量(見表1)。表1本發(fā)明組合物對小鼠免疫功能的影響*p<0.05,**p<0.01,與市售魚肝油對照組比較。由表1可見,與普通市售魚肝油相比,本發(fā)明va-dha酯、va-epa酯和vd3-dha酯、vd3-epa酯組合物,在小鼠體內(nèi)吸收更好,具有增強體質(zhì),助長發(fā)育,健腦、益智,提高免疫功能,促進小鼠免疫器官重量增加和血清溶血素增加等作用,具有提高免疫功能作用。試驗二本發(fā)明va-dha酯、va-epa酯和vd3-dha酯、vd3-epa酯組合物對小鼠視覺發(fā)育的影響研究40只雌性小鼠,在傍晚時以2:1比例,20只雄性小鼠同籠交配,次晨查到陰栓者記為孕0天。將孕鼠隨機分為四組,每組10只。分別給予實施例3中得到的組合物2.5ml/kg體重(高劑量組)、0.5ml/kg體重(中劑量組)、0.1ml/kg體重(低劑量組),對照組給予市售植物油維生素ad制劑(2.5ml/kg體重)(僅含有維生素a、d,不含有dha和epa)。每天灌胃一次。每組母鼠自孕0天起,飼以合成飼料。孕5天起,每兩天按體重相應(yīng)調(diào)整灌胃量。分娩后,母鼠灌胃量增為孕期的1.5倍。記錄仔鼠開眼日齡,視覺發(fā)育實驗于16日齡進行,抓住仔鼠尾部,頭朝下,使之面部和前腿朝向一個平面的邊緣,逐漸縮短距離,如果在觸須觸及邊緣之前用前爪抓住了邊緣,證明視覺發(fā)育正常,反之為不正常,記錄各組仔鼠視覺發(fā)育正常數(shù)(見表2)。表2本發(fā)明組合物對仔鼠視覺發(fā)育的影響分組仔鼠數(shù)量開眼日齡(日)視覺發(fā)育正常率高劑量組6013.0±0.5﹡90.3%﹡中劑量組6013.2±0.6﹡90.0%﹡低劑量組6014.5±0.388.3%﹡對照組6014.9±0.358.3%*p<0.05,與植物油維生素ad制劑對照組比較。與市售植物油維生素ad制劑對比,本發(fā)明的高、中劑量組仔鼠的開眼日齡早于低劑量組和對照組,差異有顯著性(p<0.05);高、中、低劑量組16日齡視覺發(fā)育正常百分比高于對照組,差異亦有顯著性意義(p<0.05)。說明本發(fā)明的va-dha酯、va-epa酯和vd3-dha酯、vd3-epa酯組合物能顯著促進仔鼠視覺發(fā)育。試驗三藥代動力學30只新西蘭大白兔,雄性,體重2.5-3.0kg,隨機分為三組,每組10只。采用灌胃給予實施例3得到的組合物5ml/kg體重(試驗組),普通市售魚肝油5ml/kg體重(對照組)(化學合成的維生素a、d與魚油的混合物),生理鹽水(空白組)。給藥后于0.5,1,2,3,4,5,6,7,8,10,12,24h耳緣靜脈取血3.0ml。采用lc/ms方法對血藥濃度進行檢測。將每個時間點的濃度減去0時的血藥濃度,使用3p97藥代動力學程序處理血藥濃度數(shù)據(jù),用非房室模型估算藥動學參數(shù),數(shù)據(jù)mean±sd表示。spss16.0統(tǒng)計學分析(見表3-5)。表3va-dha酯、va-epa酯和vd3-dha酯、vd3-epa酯加和血藥濃度表4藥動學參數(shù)結(jié)構(gòu)參數(shù)單位試驗組對照組aucmg·h·ml-152.0839.03cmaxug/ml489.78431.70tmaxh57表5血藥濃度的獨立t檢驗統(tǒng)計學分析auc值:對照組和試驗組t檢驗結(jié)果兩兩之間有顯著性差異,即生物利用度有顯著性差異。cmax值:對照組和試驗組t檢驗結(jié)果兩兩之間有顯著性差異,說明血液中的吸收有差異性,血藥濃度達到最高值有差異性。tmax:對照組和試驗組t檢驗結(jié)果兩兩之間有顯著性差異,說明血液中的吸收速度有差異性,血藥濃度達到最高峰的時間有差異性。綜上所述,本發(fā)明va-dha酯、va-epa酯和vd3-dha酯、vd3-epa酯組合物,比普通市售魚肝油的生物利用度高,在血液中的吸收速度快,吸收率高。當前第1頁12