本發(fā)明涉及一種外用制劑，更具體的說涉及一種改善松蘿酸透皮吸收的外用制劑及其應(yīng)用。

技術(shù)背景

松蘿酸為松蘿科(usneaceae)植物松蘿usneadiffractavain.和長(zhǎng)松蘿usnealongissimaach.的干燥地衣體。性質(zhì)：黃色斜方棱柱狀結(jié)晶(丙酮)。熔點(diǎn)204℃。旋光度+509.4°(c＝0.697，氯仿)。25℃時(shí)的溶解度(g/100ml水)<0.01，丙酮0.77，醋酸乙酯0.88，乙醇0.02，糖醛7.32，糖醇1.21?？苫瘜W(xué)合成或生物合成制得。

松蘿屬等許多地衣類植物都含有抗菌物質(zhì)，其中松蘿酸之抗菌作用尤為突出。其抗菌譜主要為革蘭氏陰性細(xì)菌及結(jié)核桿菌。在試管中松蘿酸對(duì)肺炎球菌、溶血性鏈球菌、白喉?xiàng)U菌、結(jié)核桿菌都有很強(qiáng)的抑菌作用，抑菌濃度為1-5μg/ml，至50μg/ml可完全抑制細(xì)菌的生長(zhǎng)。對(duì)金黃色葡萄球菌之抑制較上述細(xì)菌稍弱，但強(qiáng)于對(duì)革蘭氏陰性細(xì)菌之作用。右旋與左旋型的抗菌作用無大差別。但也有報(bào)告對(duì)革蘭氏陰性的百日咳桿菌、枯草桿菌、肺炎桿菌乃至大腸桿菌、變形桿菌有效者，對(duì)痢疾桿菌、傷寒桿菌則無效。在體外試驗(yàn)中，松蘿酸對(duì)人型結(jié)核桿菌有顯著的抑制作用，20-50μg/ml可獲得完全抑制，血清略能降低其效力。在體內(nèi)試驗(yàn)中(對(duì)豚鼠的實(shí)驗(yàn)性結(jié)核的治療)，一般認(rèn)為口服或腹腔注射有較好的療效，能限制結(jié)核病變的發(fā)展；也有人報(bào)告單用松蘿酸，對(duì)豚鼠實(shí)驗(yàn)性結(jié)核并無影響，但可增強(qiáng)鏈霉素的作用。在試管中，它與鏈霉素或異煙肼也有輕度的協(xié)同作用。對(duì)人的肺、腸結(jié)核，每日口服0.1-1.0g松蘿酸鈉鹽或evosin(一種含松蘿酸及縮酚酸的制劑)0.1-0.5g，可使結(jié)核病的某些癥狀如咳嗽、食欲減退、發(fā)熱或腸結(jié)核性腹瀉等，獲得好轉(zhuǎn)，甚至使結(jié)核菌的鏡檢轉(zhuǎn)陰，但觀察尚不夠完善，不能下最后結(jié)論。上述癥狀的好轉(zhuǎn)，似乎并非藥物對(duì)結(jié)核菌的直接作用，因口服后，血中達(dá)不到抑菌濃度的水平。有人認(rèn)為，它對(duì)人的結(jié)核病并無明顯療效。國內(nèi)用松蘿酸治療肺結(jié)核，曾觀察到有一定療效。對(duì)松蘿酸的抑菌作用原理，曾進(jìn)行過不少研究，有人認(rèn)為它能抑制蛋白質(zhì)的合成，也有認(rèn)為它與氧化磷酸化的斥聯(lián)有關(guān)。

以0.2-0.4％松蘿酸與破傷風(fēng)毒素或白喉毒素混合或在毒素注射后10分鐘內(nèi)注射，可使小鼠耐受2倍的毒素致死量。對(duì)豚鼠接種白喉稈菌后2小時(shí)，皮下注射松蘿酸2mg/kg，或事先將二者混合培養(yǎng)再接種于豚鼠，均有明顯的保護(hù)作用。小鼠實(shí)驗(yàn)性破傷風(fēng)桿菌感染，以松蘿酸與青霉素聯(lián)合應(yīng)用的效果最好。用紙碟法證明，d-松蘿酸0.5-5mg/ml有對(duì)抗噬菌體的作用。

松蘿酸對(duì)原蟲、陰道滴蟲也有抑制作用?？诜商}酸鈉100-150mg/kg對(duì)羊的血吸蟲、肝片吸蟲均有傷害及殺滅作用，肌肉注射可獲更好效果；對(duì)兔血吸蟲，由于其毒性較大，而用其衍生物-松蘿酸苯胺，口服200mg/kg/d，連服9天，亦獲得良好效果。

對(duì)部分肝切除的大鼠，喂食松蘿酸有促進(jìn)肝再生的作用。能降低離體大鼠橫膈對(duì)葡萄糖的利用及其糖元含量。麻醉貓靜脈注射松蘿酸鈉30mg/kg，可使血糖升高。d-松蘿酸能顯著抑制海星(ar-bacia)受精卵的分裂及磷的攝取，而對(duì)氧消耗則幾無影響。它還能抑制大鼠腹水瘤細(xì)胞(ah13ah7974)的粒線體內(nèi)α-甘油磷酸新四唑還原酶的活性。d-松蘿酸對(duì)離體豚鼠、蛙心均有抑制作用；對(duì)離體兔耳及蟾蜍下肢灌流，均有擴(kuò)張血管之作用；對(duì)離體兔腸有罌粟堿樣作用，麻痹腸管并拮抗氯化鋇、乙酰膽堿引起的痙攣；對(duì)兔、牛的子宮、支氣管及腸管亦有松弛作用。麻醉貓靜脈注射10mg/kg松蘿酸鈉，能迅速而顯著的增強(qiáng)其呼吸、較長(zhǎng)時(shí)間的提高通氣量、增加氧耗、升高體溫，這些都說明代謝增進(jìn)，有類似二硝基酚的作用，且毒性大于二硝基酚。

針對(duì)松蘿酸水溶解性不佳的問題，vesnanikolic′(人名)等采用β-環(huán)糊精及其衍生物hp-β-環(huán)糊精包封松蘿酸，發(fā)現(xiàn)通過分子包封可以改善松蘿酸在水中的溶解度，松蘿酸β-環(huán)糊精包合物的溶解度為0.3mg/cm3，hp-β-環(huán)糊精包合物的溶解度為4.2mg/cm3，而未形成包合物的松蘿酸溶解度為0.06mg/cm3。但是上述的包封處理僅適用于口服直接的應(yīng)用。目前還沒有找到適用外用制劑的改善松蘿酸水溶解性和吸收的方法，并發(fā)表在2013年的《包封及大環(huán)化合物雜志》(vesnanikolic′、mihajlostankovic′、ljubisanikolic′·gorannikolic′、snezˇanailic′-stojanovic′、mirjanapopsavin、sasˇazlatkovic′、tatjanakundakovi.journalofinclusionphenomenaandmacrocyclicchemistry.(2013)76：173–182.)上。

于吉臣以蛋黃粗磷脂作為原料分離提純得到e80(磷脂酰膽堿pc的含量在80％以上)以及深加工產(chǎn)品e98(磷脂酰膽堿pc的含量在98％以上)，并對(duì)兩種產(chǎn)品的質(zhì)量做出評(píng)價(jià)。結(jié)果表明，e98和膽固醇以70：30(mol：mol)為配方制備的脂質(zhì)體，可以包封松蘿酸藥量達(dá)1mg/50mg左右，脂質(zhì)體的粒徑為130±120nm，包封率在90％以上。將貯存一個(gè)月后的脂質(zhì)體再進(jìn)行質(zhì)量評(píng)價(jià)，發(fā)現(xiàn)脂質(zhì)體粒徑較以前有所變大。這和pc為中性磷脂有關(guān)，符合文獻(xiàn)報(bào)道的情況。包封率也有所下降(碩士論文，鄭州大學(xué)，2007年)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為了克服松蘿酸吸收困難和現(xiàn)有松蘿酸新型給藥系統(tǒng)載藥量小的問題，本發(fā)明提供了一種改善松蘿酸透皮吸收和促進(jìn)皮膚創(chuàng)傷愈合的外用制劑，所述外用制劑的配方為松蘿酸、蛋黃卵磷脂、卡波姆940、丙三醇、三乙醇胺、水。

改善松蘿酸透皮吸收的外用制劑的制備方法，包括以下步驟：

1)根據(jù)比例稱取松蘿酸原料、蛋黃卵磷脂、卡波姆940、丙三醇和三乙醇胺；

2)將氯仿溶解的10g/l松蘿酸原料與蛋黃卵磷脂混合，在50℃下反應(yīng)5h，減壓除去反應(yīng)溶劑，得到松蘿酸磷脂復(fù)合物；

3)將松蘿酸磷脂復(fù)合物中，加入適量丙酮洗滌除去復(fù)合物中的游離松蘿酸；

4)抽濾，收集沉淀，減壓干燥即為松蘿酸磷脂復(fù)合物；

5)將松蘿酸磷脂復(fù)合物用勻漿機(jī)將其高速分散到水中，再加入處方量的卡波姆940均勻鋪撒在水面，靜置12h使之完全分散；

6)加入三乙醇胺和丙三醇，混勻，補(bǔ)足水至處方量，得到松蘿酸磷脂復(fù)合物凝膠劑。

所述松蘿酸的反應(yīng)質(zhì)量濃度為10g/l。

所述松蘿酸的水溶物中含有的松蘿酸與蛋黃卵磷脂的質(zhì)量比為1:1；所述松蘿酸磷脂復(fù)合物的平均復(fù)合率大于85％。

所述的改善松蘿酸透皮吸收的外用制劑在制備促皮膚創(chuàng)傷愈合中的應(yīng)用。

本發(fā)明的有益技術(shù)效果是：本發(fā)明提供了一種改善松蘿酸透皮吸收和促皮膚創(chuàng)傷愈合的外用制劑，解決了松蘿酸溶解性差和現(xiàn)有松蘿酸新型給藥系統(tǒng)載藥量小的技術(shù)問題，同時(shí)提供了一種將松蘿酸應(yīng)用于外用制劑的技術(shù)方案。提供了一種松蘿酸用藥的新途徑。并且松蘿酸磷脂復(fù)合物凝膠劑在促皮膚創(chuàng)傷愈合中具有良好的活性。

附圖說明

圖1ua與磷脂物理混合物與ua磷脂復(fù)合物的電鏡觀察(a為物理混合，b為復(fù)合)；

圖2ua磷脂物理混合物(a組)與ua磷脂復(fù)合物(b組)系統(tǒng)¹h圖；

圖3松蘿酸不同脂類載體的單位面積累積滲透量(鼠皮)；

圖4松蘿酸不同脂類載體的單位面積累積滲透量(兔皮)。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1松蘿酸不同脂質(zhì)載體經(jīng)皮凝膠制劑的制備

1.樣品的制備

1.1松蘿酸磷脂復(fù)合物凝膠的制備

1.1.1不同洗脫溶劑對(duì)磷脂復(fù)合物復(fù)合率的影響

固定反應(yīng)時(shí)間、松蘿酸質(zhì)量濃度、松蘿酸：磷脂投料比，反應(yīng)溫度不變，考察不同洗脫溶劑種類對(duì)復(fù)合率的影響，結(jié)果見表1。

表1：不同洗脫溶劑對(duì)磷脂復(fù)合物復(fù)合率的影響

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明丙酮為最佳洗脫溶劑。

1.1.2不同反應(yīng)溶劑對(duì)磷脂復(fù)合物復(fù)合率的影響

固定洗脫溶劑、松蘿酸質(zhì)量濃度、反應(yīng)時(shí)間、松蘿酸：磷脂投料比，反應(yīng)溫度不變，考察不同反應(yīng)溶劑種類對(duì)復(fù)合率的影響，結(jié)果見表2。

表2：不同反應(yīng)溶劑對(duì)磷脂復(fù)合物復(fù)合率的影響

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明氯仿為最佳反應(yīng)溶劑。

1.1.3不同反應(yīng)時(shí)間對(duì)松蘿酸磷脂復(fù)合物復(fù)合率的影響

固定反應(yīng)溶劑、洗脫溶劑、松蘿酸質(zhì)量濃度、松蘿酸：磷脂投料比，反應(yīng)溫度不變，考察不同反應(yīng)時(shí)間對(duì)復(fù)合率的影響，結(jié)果見表3。

表8：不同反應(yīng)時(shí)間對(duì)磷脂復(fù)合物復(fù)合率的影響

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明4h是較為理想的反應(yīng)時(shí)間。

1.1.4藥物濃度對(duì)松蘿酸磷脂復(fù)合物復(fù)合率的影響

固定反應(yīng)溶劑、洗脫溶劑、反應(yīng)時(shí)間、松蘿酸：磷脂投料比，反應(yīng)溫度不變，考察不同松蘿酸質(zhì)量濃度對(duì)復(fù)合率的影響，結(jié)果見表4。

表4：藥物濃度對(duì)松蘿酸磷脂復(fù)合物復(fù)合率的影響

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明10mg/ml是松蘿酸比較理想的反應(yīng)濃度。

1.1.5反應(yīng)溫度對(duì)松蘿酸磷脂復(fù)合物復(fù)合率的影響

固定反應(yīng)溶劑、洗脫溶劑、反應(yīng)時(shí)間、松蘿酸質(zhì)量濃度、松蘿酸：磷脂投料比不變，考察不同反應(yīng)溫度對(duì)復(fù)合率的影響，結(jié)果見表5。

表5：反應(yīng)溫度對(duì)松蘿酸磷脂復(fù)合物復(fù)合率的影響

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，30℃和40℃的溫度條件均可以使制成品達(dá)到較理想的復(fù)合率。

1.1.6正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在單因素考察的基礎(chǔ)上，本實(shí)驗(yàn)根據(jù)松蘿酸的理化性質(zhì)，固定反應(yīng)溶劑為三氯甲烷20ml，洗脫溶劑為丙酮，以復(fù)合率和復(fù)合物中藥物含量作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，分別考察ua質(zhì)量濃度、松蘿酸磷脂投料比、反應(yīng)時(shí)間、反應(yīng)溫度四個(gè)實(shí)驗(yàn)因素，每個(gè)因素各取3個(gè)水平，采用l9(3⁴)表，對(duì)松蘿酸磷脂復(fù)合物進(jìn)行正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)。因素水平見表6，試驗(yàn)結(jié)果見表7。

復(fù)合率的計(jì)算：每號(hào)試驗(yàn)取圓底燒瓶精密稱重記錄重量，將一定量的藥物和蛋黃磷脂加入到圓底燒瓶中，用20ml反應(yīng)溶劑溶解后，在一定條件下反應(yīng)一定時(shí)間后，減壓除去反應(yīng)溶劑，放于玻璃干燥器中充分干燥后，稱定圓底燒瓶和藥物的總重，減去圓底燒瓶重即得(藥物+蛋黃磷脂)重量，再加入適量的洗脫溶劑，充分溶解其中的未形成復(fù)合物的游離藥物，將洗脫溶劑快速倒出進(jìn)行抽濾，收集沉淀，干燥后稱重得到游離藥物重，同時(shí)將圓底燒瓶中的復(fù)合物再次減壓干燥，蒸干所得物即為松蘿酸磷脂復(fù)合物。松蘿酸藥物的初始投料量與沉淀量之差即為與磷脂復(fù)合的藥物的量，從中計(jì)算出每號(hào)試驗(yàn)中藥物與磷脂的復(fù)合率，計(jì)算公式：松蘿酸磷脂復(fù)合物的復(fù)合率＝(w0-w)/w0×100％，式中，w0為松蘿酸初始投入量，w為松蘿酸的最終沉淀量。

復(fù)合物中藥物含量測(cè)定：稱取磷脂復(fù)合物5mg,用二氯甲烷5ml溶解后，加甲醇稀釋定容至50ml，0.45um微孔濾膜過濾后，285nm處測(cè)定峰面積值，計(jì)算藥物含量。

綜合評(píng)分：綜合評(píng)分＝復(fù)合率絕對(duì)值×0.5+復(fù)合物中藥物含量×0.5

表6因素水平

表7正交實(shí)驗(yàn)考察

直觀分析表明：比較各因素極差，松蘿酸磷脂復(fù)合物和藥物含量的影響因素從大到小為：b>a>c>d，比較各因素不同水平均值，確定最佳制備條件為：a2b1c3d3，即松蘿酸的質(zhì)量濃度為10g/l，投料比為1:1，反應(yīng)時(shí)間為5h，反應(yīng)溫度為50℃。

按照優(yōu)選條件制備松蘿酸磷脂復(fù)合物：按上述最佳條件將松蘿酸原料和蛋黃卵磷脂加入到反應(yīng)瓶中，用三氯甲烷反應(yīng)溶劑溶解后，在50℃下反應(yīng)5h，減壓除去反應(yīng)溶劑，充分干燥后，再加入適量丙酮洗滌除去復(fù)合物中的游離藥物，抽濾，收集沉淀，減壓干燥即為松蘿酸磷脂復(fù)合物，將其置于干燥器中保存，制備得到ua磷脂復(fù)合物。

ua磷脂復(fù)合物的含量測(cè)定：精密稱取ua磷脂復(fù)合物于50ml容量瓶中，先用5mlch2cl2溶解，再加甲醇稀釋定容至50ml，過濾后，進(jìn)行hplc檢測(cè)，進(jìn)樣20μl，于285nm波長(zhǎng)處檢測(cè)樣品的峰面積值，按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算，求出樣品中松蘿酸的含量。具體如表8所示。

表8ua磷脂復(fù)合物樣品含量測(cè)定數(shù)據(jù)

從表6的數(shù)據(jù)可知，每1g的pc中能夠包埋的松蘿酸0.934g?？鄢诎襁^程中的損失，因此，松蘿酸和pc的投料比以1:1為最佳。所以以松蘿酸和pc的投料比以1:1制備得到的產(chǎn)物為ua磷脂復(fù)合物。將ua磷脂復(fù)合物通過電鏡檢測(cè)和mr檢測(cè)，具體如圖1、2所示。

1.1.7松蘿酸磷脂復(fù)合物凝膠劑的制備

【制備方法】采用溶脹法。精密稱取采用松蘿酸和pc的投料比為0.8：1制備的ua磷脂復(fù)合物0.35g(相當(dāng)于0.127gua)，用勻漿機(jī)將其高速分散在15ml純化水中，再加入處方量的卡波姆940均勻鋪撒在水面，靜置12h使之完全分散，再分別稱取處方量的tea和甘油加入其中，混勻，補(bǔ)足純化水至處方全量，得到5.0229mg/g濃度的松蘿酸磷脂復(fù)合物凝膠劑，置于容器中密閉低溫保存，得到ua磷脂復(fù)合物凝膠。

精密稱取0.1g松蘿酸磷脂復(fù)合物凝膠劑，先用1ml三氯甲烷溶解，再定容至25ml，搖勻。取定容后的溶液2ml于10ml容量瓶中，用甲醇定容至10ml，用0.45um微孔濾膜過濾，進(jìn)樣20μl，于285nm處檢測(cè)樣品的峰面積值并記錄色譜圖，代入線性回歸方程，計(jì)算樣品中松蘿酸的含量。松蘿酸磷脂復(fù)合物凝膠劑樣品中松蘿酸的含量為：0.3629％。

1.2松蘿酸納米乳凝膠的制備

1.2.1松蘿酸納米乳的制備

【制備方法】采用混合法。稱取處方中的聚氧乙烯氫化蓖麻油rh40于三角錐形瓶中50℃下保溫使其溶解，將處方量的松蘿酸加入到其中充分混合均勻，然后將二乙二醇單乙基醚加入三角錐形瓶中混勻，最后加入中鏈甘油三酯和單亞油酸甘油酯于容器中，于37℃下恒溫振蕩直至藥物完全溶解混合均勻，即得到松蘿酸納米乳的濃縮液，將其置于4℃冰箱中密閉保存，臨用加水稀釋至一定倍數(shù)即得，得到ua納米乳。

精密稱取制備得到的松ua納米乳每份50mg，分別置于10ml容量瓶中，加入適量甲醇超聲10min溶解后定容至刻度，搖勻，用0.45μm微孔濾膜濾過，按uasmedds體外樣品hplc的測(cè)定方法，進(jìn)樣20μl，于285nm波長(zhǎng)處檢測(cè)樣品的峰面積值并記錄色譜圖，按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算，求出樣品中松蘿酸的含量。ua納米乳的含量為3.57％。

1.2.2松蘿酸納米乳凝膠的制備

【制備方法】采用溶脹法。精密稱取3.0g(相當(dāng)于ua0.1125g)松蘿酸納米濃縮乳，加純化水20ml稀釋混勻，再加入處方量的卡波姆940輕輕鋪撒在其表面，靜置過夜使其分散均勻，再分別精密稱取0.1699g三乙醇胺和0.25g丙三醇加入到凝膠中，混勻，補(bǔ)足純化水至處方全量，得到松蘿酸納米乳凝膠劑，置于4℃冰箱中密閉保存，制備得到ua納米乳凝膠。

分別精密稱取松蘿酸納米乳凝膠劑0.5g，共3份，先用1ml三氯甲烷溶解，再用甲醇定容至10ml，搖勻，超聲10min，用0.45um微孔濾膜過濾，進(jìn)樣20μl，于285nm處檢測(cè)樣品的峰面積值并記錄色譜圖，代入線性回歸方程，求出樣品中松蘿酸的含量。松蘿酸的含量為0.447％。

1.3松蘿酸凝膠的制備

【制備方法】采用溶脹法。精密稱取0.125gcp940均勻鋪撒在裝有適量純化水(約12.5ml)的燒杯中溶脹過夜，使其充分分散。然后先用適量的純化水將處方量的氫氧化鈉溶解，再加入處方量的松蘿酸，混勻后加入到燒杯中，加入稱量好的tea和丙三醇，攪勻后定量至25g，得到ua凝膠。

分別精密稱取0.1g松蘿酸凝膠劑三份，先用1ml三氯甲烷溶解后，再用甲醇定容至25ml，搖勻。移取2ml定容后的樣品溶液于10ml容量瓶中，用甲醇定容至10ml，微孔濾膜過濾后，進(jìn)樣20μl，于285nm處檢測(cè)樣品的峰面積值，代入線性回歸方程，求出樣品中松蘿酸的含量，松蘿酸凝膠劑樣品中松蘿酸含量為：0.387％。

實(shí)施例2松蘿酸不同脂質(zhì)載體凝膠劑的體外透皮吸收測(cè)定

1試驗(yàn)方法

體外經(jīng)皮透過實(shí)驗(yàn)用皮膚，以取自臨床上給藥部位的離體人皮為佳，但是人的皮膚不但不易得到，而且很難是條件保持一致，因此常常選用合適的動(dòng)物皮膚來代替。本研究采用小鼠皮膚及中型家兔的皮膚進(jìn)行松蘿酸不同脂質(zhì)載體制劑的體外透皮測(cè)定。

1.1主要試劑的配制

1.1.1ph7.4磷酸鹽緩沖液：精密稱取1.36g磷酸二氫鉀，加入79ml0.1mol/l的氫氧化鈉溶液，輕輕振蕩，混合均勻后加入純化水定容至200ml即可。

1.1.2生理鹽水：精密稱取0.90g氯化鈉，加入純化水定容至100ml。

1.1.3流動(dòng)相：精密稱取3.4g磷酸二氫鉀置于500ml容量瓶中，加入適量的純化水使其完全溶解，再加純化水定容至刻度線，最后加入1ml三乙胺，搖勻過濾后，放置于4℃冰箱密閉保存。

1.2離體皮膚制備

1.2.1家兔皮膚的制備

選取體重2.0～2.5kg的家兔，處死后取其腹部的皮，采用寵物剪毛器剪去皮上的長(zhǎng)毛后，進(jìn)一步用電剃須刀剃去剩余的毛，至皮膚裸露，務(wù)必使皮膚完好無損；除去皮下脂肪，得到厚度均勻的離體兔皮，浸入生理鹽水中于4℃下保存?zhèn)溆谩ｋx體兔皮須在一周內(nèi)使用，一般不超過4天。

1.2.2小鼠皮膚的制備

選取大小體重相接近的健康雄性小鼠，采用剪刀剪去較長(zhǎng)的毛發(fā)，然后用電動(dòng)剃須刀處理短毛發(fā)^[12]。用單背刀小心刮去皮下脂肪組織和粘連物，務(wù)必使皮膚完好無損，用生理鹽水反復(fù)沖洗干凈后，浸入0.9％氯化鈉溶液中于4℃冷凍保存待用，1周內(nèi)用完。

1.3體外透皮實(shí)驗(yàn)

采用直立式franz擴(kuò)散池進(jìn)行透皮試驗(yàn)。透皮儀擴(kuò)散面積：3.4cm²，有效透皮面積為1.431cm²，接受池容積為15ml，接受液為ph7.4磷酸鹽緩沖液。

選取完好的皮膚，將其剪長(zhǎng)寬2cm的正方形。接收池分別標(biāo)記為1、2、3號(hào)，并放置磁力攪拌子，將皮膚固定于擴(kuò)散池的供體池和接收池之間，使角質(zhì)層面向供體池。接收池中加滿ph7.4磷酸緩沖鹽作為接收介質(zhì)，并排出氣泡，使液面恰與皮膚接觸。分別精密稱取松蘿酸不同脂質(zhì)載體的制劑共3份，設(shè)置水浴溫度為32℃，磁力攪拌子以200rpm的速度攪，在0.5h、1h、3h、6h、9h、12h、24h各時(shí)間點(diǎn)在接受池取出1ml樣品于ep管中，同時(shí)補(bǔ)加1ml等溫、新鮮的ph7.4磷酸緩沖鹽于接受池中，再向ep管中加入甲醇1ml，搖勻。取定容后的樣品溶液于0.45μm微孔濾膜過濾，棄去初濾液，收集續(xù)濾液，進(jìn)樣20μl，在285nm處檢測(cè)樣品的峰面積值，并按式(1)計(jì)算單位面積累積透過量。

qn＝(cn×v0)/a(1)

式中a為皮膚有效擴(kuò)散面積，v0為接受池體積，cn為第n次取樣時(shí)藥物濃度的測(cè)量值。

1.4藥物在皮膚的滯留量的測(cè)定

取持續(xù)透皮24h的皮膚，用ph7.4磷酸鹽緩沖液反復(fù)清洗皮膚表面殘留物，并用濾紙將水分吸干；分別將各號(hào)皮膚剪碎，加入一定量的ph7.4磷酸鹽緩沖液勻漿，勻漿后超聲10min，再放入冰箱(4℃)靜置30min，8000r/min離心30分鐘，轉(zhuǎn)移上清液于離心管中，用磷酸緩沖液定容至2.5ml，再用甲醇定容至10ml，0.45μm微孔濾膜過濾后，取樣20μl，在285nm波長(zhǎng)下檢測(cè)樣品的峰面積。并按式(2)計(jì)算單位面積皮膚的滯留量(qs)。

qs＝cs×10/a(2)

式中cs為透皮24小時(shí)皮膚樣品溶液中藥物質(zhì)量濃度(μg/ml)，a為皮膚有效滲透面積(cm²)。

2松蘿酸不同脂質(zhì)載體經(jīng)皮凝膠制劑的體外透皮吸收數(shù)據(jù)的分析

2.1采用小鼠皮膚對(duì)松蘿酸不同脂質(zhì)載體的制劑進(jìn)行透皮實(shí)驗(yàn)的結(jié)果如表8、9、10、11、12所示。

表8ua凝膠單位面積累積透皮量數(shù)據(jù)(n＝3)

表9ua納米乳單位面積累積透皮量數(shù)據(jù)(n＝3)

表10ua納米乳凝膠單位面積累積透皮量數(shù)據(jù)(n＝3)

精密稱取松蘿酸磷脂復(fù)合物0.15g加入到10ml純化水中，用勻漿機(jī)將其高速分散后得到含量為5.3817g/ml的水分散液，精密移取2ml加入到各供給池中進(jìn)行透皮試驗(yàn)。

表11松蘿酸磷脂復(fù)合物單位面積累積透皮量數(shù)據(jù)(n＝3)

表12ua磷脂復(fù)合物凝膠單位面積累積透皮量數(shù)據(jù)(n＝3)

采用小鼠皮膚對(duì)松蘿酸不同脂質(zhì)載體的制劑進(jìn)行透皮實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)分析；

將得到的各個(gè)數(shù)據(jù)進(jìn)行比較分析，得到如下所示的圖3。從圖中，明顯看出，松蘿酸磷脂復(fù)合物及其凝膠制劑的平均單位面積累積透皮量均高于其他幾種制劑。中性磷脂作為松蘿酸的載體，能夠大大地提高藥物中松蘿酸的含量，同時(shí)由于脂類載體的作用，使藥物僅作用于病變部位或靶細(xì)胞，延長(zhǎng)在血液中駐留時(shí)間，提高藥物的療效，減少劑量，為松蘿酸在腫瘤治療、克服生物屏障等領(lǐng)域提供了良好的發(fā)展前景。

2.2采用家兔皮膚對(duì)松蘿酸不同脂質(zhì)載體的制劑進(jìn)行透皮實(shí)驗(yàn)，得到的結(jié)果如表13-17所示。

表13松蘿酸凝膠單位面積累積透皮量數(shù)據(jù)(n＝3)

表14松蘿酸納米乳單位面積累積透皮量數(shù)據(jù)(n＝3)

表15松蘿酸納米乳凝膠單位面積累積透皮量數(shù)據(jù)(n＝3)

精密稱取松蘿酸磷脂復(fù)合物0.15g加入到10ml純化水中，用勻漿機(jī)將其高速分散后得到含量為5.3817g/ml的水分散液，精密移取2ml加入到各供給池中進(jìn)行透皮試驗(yàn)。

表16松蘿酸磷脂復(fù)合物單位面積累積透皮量數(shù)據(jù)(n＝3)

表17松蘿酸磷脂復(fù)合物凝膠單位面積累積透皮量數(shù)據(jù)(n＝3)

采用家兔皮膚對(duì)松蘿酸不同脂質(zhì)載體的制劑進(jìn)行透皮實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)分析

將得到的各個(gè)數(shù)據(jù)進(jìn)行比較分析，得到如下所示的圖4。從圖中，明顯看出，松蘿酸磷脂復(fù)合物及其凝膠制劑的平均單位累積透皮量均高于其他幾種制劑。這個(gè)結(jié)果與采用鼠皮進(jìn)行透皮吸收實(shí)驗(yàn)的結(jié)果一致，進(jìn)一步證實(shí)了磷脂作為松蘿酸的載體，具有良好的發(fā)展前景。

2.3體外透皮吸收方程的擬合

將松蘿酸凝膠、松蘿酸納米乳、松蘿酸納米乳凝膠、松蘿酸磷脂復(fù)合物、松蘿酸磷脂復(fù)合物凝膠在各時(shí)間點(diǎn)的單位面積累積滲透量qn對(duì)時(shí)間t進(jìn)行方程擬合，以相關(guān)系數(shù)最r²大者為佳，得到的方程如表18所示：

表18體外透皮方程擬合

結(jié)果表明，松蘿酸納米乳、松蘿酸納米乳凝膠、松蘿酸磷脂復(fù)合物、松蘿酸磷脂復(fù)合物凝膠均符合零級(jí)動(dòng)力學(xué)方程，相關(guān)性良好，在鼠皮中的穩(wěn)態(tài)滲透速率j為：0.93835，0.6325，4.7683，4.4444μg·cm^-2·h^-1；在兔皮中的穩(wěn)態(tài)滲透速率j為：2.7538，1.079，3.5685，1.5715μg·cm^-2·h^-1。

2.4皮膚滯留量的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)

表19不同皮膚的平均藥物滯留量

結(jié)果表明，松蘿酸不同脂類載體的制劑在鼠皮中的藥物滯留量均大于在兔皮中的藥物滯留量，且松蘿酸磷脂復(fù)合物及其凝膠制劑在兩種不同的動(dòng)物皮膚中，均有較大的皮膚滯留量。

實(shí)施例3松蘿酸各制劑對(duì)皮膚愈合的活性考察

皮膚損傷模型的建立：sd大鼠70只,體重180～220g,雌雄兼用，大鼠用1％戊巴比妥鈉腹腔麻醉(30mg/kg),背部用電動(dòng)推剪毛,10％硫化鈉脫毛后,皮膚經(jīng)強(qiáng)力碘消毒后,在大鼠背部同一部位用特制打孔器將背部切成直徑約1.2cm,面積為1.44cm²的創(chuàng)面2個(gè),皮膚圓型全層切除,止血,形成機(jī)械損傷動(dòng)物模型,所有大鼠均單籠喂養(yǎng),充足給水。每組10只動(dòng)物,20個(gè)創(chuàng)傷面。第1組生理鹽水空白對(duì)照組,創(chuàng)傷面涂100μl/d生理鹽水；第2組給藥ua對(duì)照組(ua溶解，2g/10ml溶于dmso中)，第3-6組作為實(shí)驗(yàn)組，均給藥實(shí)施例1優(yōu)選方法制備得到ua制劑；第2組為ua磷脂復(fù)合物組,創(chuàng)傷面涂ua磷脂復(fù)合物的溶解物組(1g/10ml溶于dmso中)100μl/d。第3組為ua納米乳組,創(chuàng)傷面涂300μl/dua納米乳；第4組為ua米乳凝膠組,創(chuàng)傷面涂300μl/dua米乳凝膠；第5組為ua納米乳組,,創(chuàng)傷面涂300μl/d復(fù)合物凝膠組；第6組，bfgf(組牛堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子外用溶液)對(duì)照組，創(chuàng)傷面涂100μl/dbfgf2(120au)(購自珠海億勝生物制藥有限公司)；每天觀察術(shù)后表皮、肉芽組織生長(zhǎng)情況,動(dòng)態(tài)觀察創(chuàng)面愈合過程,測(cè)量創(chuàng)面面積大小,計(jì)算愈合率。

愈合率＝(1.44-現(xiàn)傷口面積)÷d0傷口面積×100％。

創(chuàng)面一般觀察：實(shí)驗(yàn)組各組、ua對(duì)照組、bfgf組、對(duì)照組之間創(chuàng)面修復(fù)情況有明顯差別。術(shù)后24h,實(shí)驗(yàn)組中ua磷脂復(fù)合物組和ua復(fù)合物凝膠組傷口開始出現(xiàn)少許紅暈,表明肉芽組織已在生長(zhǎng),而對(duì)照組傷口濕潤(rùn)；傷后3d,ua磷脂復(fù)合物組、ua納米乳凝膠組、ua復(fù)合物凝膠組和bfgf組肉芽組織生長(zhǎng)明顯,局部已長(zhǎng)出薄層或點(diǎn)狀上皮,創(chuàng)緣皮膚收縮明顯；傷后7d,ua磷脂復(fù)合物組、ua納米乳凝膠組、ua復(fù)合物凝膠組與bfgf組傷口干燥、無感染,創(chuàng)面已基本為肉芽組織所填充,而對(duì)照組傷口濕潤(rùn),有滲出物,收縮不明顯,僅見薄層肉芽,未見明顯的新生上皮。傷后12d,實(shí)驗(yàn)組中各組與bfgf組創(chuàng)面基本愈合,其中，ua復(fù)合物凝膠組效果最為顯著；而對(duì)照組創(chuàng)面修復(fù)欠佳。

動(dòng)態(tài)觀察創(chuàng)面愈合情況：實(shí)驗(yàn)組和bfgf組能明顯加速皮膚創(chuàng)傷愈合,結(jié)果見表18所示。

表18各組大鼠皮膚損傷傷口愈合率(n＝20)

注：與生理鹽水組比較,*p<0.05,**p<0.01；

除ua的dmso溶劑物和ua納米乳以外，松蘿酸其他幾種制劑(ua磷脂復(fù)合物、ua納米乳凝膠、ua復(fù)合物凝膠)用于外涂治療大鼠皮膚機(jī)械損傷,獲得理想治療效果,作用與bfgf作用相當(dāng)。

據(jù)屈紀(jì)富等報(bào)道，bfgf能夠刺激傷口修復(fù)過程的物質(zhì)是有限的,盡管近來研究報(bào)道多種生長(zhǎng)因子可促進(jìn)傷口愈合,其中最重要的是劑量和安全問題。由于多肽生長(zhǎng)因子受體具有下調(diào)效應(yīng),因而使用時(shí)必須注意劑量不可過高。而長(zhǎng)松蘿資源豐富,松蘿酸易于提取純化,松蘿酸的制劑因?yàn)榱己玫耐钙の仗匦詫?duì)創(chuàng)面的愈合展現(xiàn)良好的活性，尤其是ua復(fù)合凝膠的活性最優(yōu)，這也與其透皮吸收能力向?qū)?yīng)的。因此松蘿酸的復(fù)合物凝膠可望成為生長(zhǎng)因子的替代品,用于創(chuàng)傷愈合。

通過透皮實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，松蘿酸磷脂復(fù)合物及其凝膠制劑24h后單位面積累積透皮量明顯高于其他組別，有利于長(zhǎng)時(shí)間發(fā)揮藥效；松蘿酸凝膠劑的體外透皮行為更符合higuchi方程，而松蘿酸納米乳及其凝膠劑、松蘿酸磷脂復(fù)合物及其凝膠劑的透皮吸收行為符合零級(jí)動(dòng)力學(xué)方程，具有良好的線性關(guān)系，能夠穩(wěn)定的釋放藥物；體外透皮后，單位面積皮膚滯藥量的比較結(jié)果為：松蘿酸磷脂復(fù)合物>松蘿酸磷脂復(fù)合物凝膠>松蘿酸納米乳>松蘿酸納米乳凝膠>松蘿酸凝膠。直接將藥物添加到凝膠基質(zhì)中，制備成松蘿酸普通凝膠劑外用，在一定程度上可以改善藥物的溶解性，但不能很好的控制藥物的釋放，達(dá)到緩釋的效果；納米乳作為新型藥物載體較凝膠劑相比，符合零級(jí)動(dòng)力學(xué)方程，可以穩(wěn)定的釋放藥物，能夠增加松蘿酸的皮膚滯留量，延長(zhǎng)作用時(shí)間，但由于其載藥量較磷脂復(fù)合物相對(duì)偏低，導(dǎo)致松蘿酸的單位面積累積滲透量相對(duì)偏低；松蘿酸磷脂復(fù)合物含有較高的載藥量，能起到藥物儲(chǔ)庫的作用，還能夠完整地穿過角質(zhì)層，有較大的皮膚滯留量從而達(dá)到緩釋的目的，同時(shí)符合零級(jí)動(dòng)力學(xué)方。