本發(fā)明涉及農(nóng)業(yè)微生物領(lǐng)域中馬齒莧益生菌劑及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

大腸桿菌病(colibacillosisi)是由致病性大腸埃希氏菌引起的一組傳染病，目前危害養(yǎng)殖業(yè)嚴(yán)重的主要是豬大腸桿菌病、禽大腸桿菌病、兔大腸桿菌病等。病原是腸道桿菌科埃希氏屬的大腸埃希氏菌(e.coli)，簡(jiǎn)稱大腸桿菌。豬大腸桿菌病是由病原性大腸桿菌引起的仔豬一組腸道傳染性疾病。常見(jiàn)的有仔豬黃痢、仔豬白痢和仔豬水腫病三種。

中草藥以其作用獨(dú)特、安全、環(huán)保、價(jià)廉，病菌不易產(chǎn)生耐藥性等優(yōu)勢(shì)，發(fā)揮著抗生素?zé)o法取代的作用而日益受到重視。中藥防治豬細(xì)菌性腸道病已經(jīng)取得較好的效果。趙坤等以石膏、滑石、白頭翁、蒼術(shù)等，王自然采用中藥茜草、苦參等治療仔豬大腸桿菌病，效果良好，治愈率達(dá)90％以上。

馬齒莧為馬齒莧科植物馬齒莧portulacaoleraceal.的干燥地上部分。性味酸，寒。歸肝、大腸經(jīng)。具有清熱解毒，涼血止血，止痢的功效。用于熱毒血痢，癰腫療瘡，濕疹，丹毒，蛇蟲(chóng)咬傷，便血，痔血，崩漏下血。

石榴皮為石榴科植物石榴punicagranatuml.的干燥果皮。性味酸、澀，溫。歸大腸經(jīng)。具有澀腸止瀉，止血，驅(qū)蟲(chóng)的功效，用于久瀉，久痢，便血，脫肛，崩漏，帶下，蟲(chóng)積腹痛。

魚(yú)腥草為三白草科植物蕺菜houttuyniacordatathunb.的新鮮全草或干燥地上部分。性味辛，微寒。歸肺經(jīng)。具有清熱解毒，消癰排膿，利尿通淋的功效。用于肺癰吐膿，痰熱喘咳，熱痢，熱淋，癰腫瘡毒。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是如何預(yù)防動(dòng)物腹瀉。

為了解決以上技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明提供了預(yù)防動(dòng)物腹瀉的中藥微生態(tài)制劑。

本發(fā)明所提供的預(yù)防動(dòng)物腹瀉的中藥微生態(tài)制劑(中藥和菌劑的組合物)，其活性成分為馬齒莧和抑制大腸桿菌的復(fù)合菌劑，所述抑制大腸桿菌的復(fù)合菌劑的活性成分由枯草芽孢桿菌、羅伊氏乳桿菌和酵母菌組成。

上述中藥微生態(tài)制劑中，所述枯草芽孢桿菌可為枯草芽孢桿菌accc02136，所述羅伊氏乳桿菌可為羅伊氏乳桿菌accc03949，所述酵母菌可為釀酒酵母accc21429。

上述中藥微生態(tài)制劑中，所述抑制大腸桿菌的復(fù)合菌劑中，所述枯草芽孢桿菌、羅伊氏乳桿菌和酵母菌的菌落形成單位數(shù)目比可為1:1-4:1-4，如1:1:1。

上述中藥微生態(tài)制劑中，所述馬齒莧和所述抑制大腸桿菌的復(fù)合菌劑的配比滿足每100克馬齒莧：總菌體含量為0.3×10⁸cfu的抑制大腸桿菌的復(fù)合菌劑。

上述中藥微生態(tài)制劑中，所述總菌體含量是指所述抑制大腸桿菌的復(fù)合菌劑中所述枯草芽孢桿菌、羅伊氏乳桿菌和酵母菌的菌落形成單位數(shù)目之和。

上述抑制大腸桿菌的復(fù)合菌劑也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。

含有上述中藥微生態(tài)制劑的動(dòng)物飼料和含有上述抑制大腸桿菌的復(fù)合菌劑的動(dòng)物飼料也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。

馬齒莧和上述抑制大腸桿菌的復(fù)合菌劑在制備預(yù)防動(dòng)物腹瀉或/和大腸桿菌病的產(chǎn)品(中藥微生態(tài)制劑或飼料)中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。

上述抑制大腸桿菌的復(fù)合菌劑在制備預(yù)防動(dòng)物腹瀉或/和大腸桿菌病的產(chǎn)品(中藥微生態(tài)制劑或飼料)中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。

本文中，所述大腸桿菌可為引起動(dòng)物腹瀉的大腸桿菌，如引起仔豬腹瀉的大腸桿菌，如大腸埃希菌cvcc231。

本文中，所述動(dòng)物可為哺乳動(dòng)物，如豬和鼠。

本文中，所述抑制大腸桿菌的復(fù)合菌劑除活性成分外，還可包括輔料，如水、碳源和/或氮源等。碳源是微生物生長(zhǎng)一類(lèi)營(yíng)養(yǎng)物，是含碳化合物，包括糖類(lèi)、油脂、有機(jī)酸及有機(jī)酸酯和小分子醇等速效、遲效碳源。氮源是指提供微生物營(yíng)養(yǎng)所需氮元素的物質(zhì)，包括花生餅粉、黃豆餅粉、酵母粉、蛋白胨、氨水、銨鹽和硝酸鹽等速效、遲效氮源。

本文中，所述抑制大腸桿菌的復(fù)合菌劑中的各種菌可以被培養(yǎng)的活細(xì)胞、活細(xì)胞的發(fā)酵液的形式存在。所述菌劑的劑型可為多種劑型，如液劑、粉劑或顆粒劑等。

實(shí)驗(yàn)證明，在含馬齒莧的各組中，攻菌第1天的腹瀉率最低的是馬齒莧益生菌高劑量組，為12.5％；攻菌第1天的腹瀉率最高的是馬齒莧益生菌低劑量組，為37.5％；馬齒莧益生菌高劑量組攻菌第1天的腹瀉率降為馬齒莧高劑量組的50.0％，馬齒莧益生菌高劑量組攻菌第1天的腹瀉率降為益生菌組的33.3％；馬齒莧益生菌高劑量組和益生菌組攻菌第2天和第3天的腹瀉率均為0，馬齒莧高劑量組的攻菌第2天和第3天的腹瀉率分別為25.0％和12.5％(表3)；說(shuō)明馬齒莧和枯草羅伊氏酵母復(fù)合菌劑(本發(fā)明的抑制大腸桿菌的復(fù)合菌劑)在預(yù)防腹瀉方面起到了協(xié)同作用。在對(duì)腹瀉致病菌大腸埃希菌(cvcc231)的抑菌作用上，枯草羅伊氏酵母復(fù)合菌劑高于枯草芽孢桿菌accc02136菌劑、羅伊氏乳桿菌accc03949菌劑和釀酒酵母accc21429菌劑的三者之和，說(shuō)明在枯草羅伊氏酵母復(fù)合菌劑中，枯草芽孢桿菌accc02136、羅伊氏乳桿菌accc03949和釀酒酵母accc21429在抑制腹瀉致病菌大腸埃希菌方面產(chǎn)生了協(xié)同作用(表5)。本發(fā)明的抑制大腸桿菌的復(fù)合菌劑和預(yù)防動(dòng)物腹瀉的中藥微生態(tài)制劑可用于預(yù)防動(dòng)物腹瀉。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施方式對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步的詳細(xì)描述，給出的實(shí)施例僅為了闡明本發(fā)明，而不是為了限制本發(fā)明的范圍。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑得到。

下述實(shí)施例中的枯草芽孢桿菌(bacillussubtilis)accc02136于2007年7月20日收藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)農(nóng)業(yè)微生物中心(簡(jiǎn)稱accc，地址：北京市海淀區(qū)中關(guān)村南大街12號(hào)，中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)資源與農(nóng)業(yè)區(qū)劃研究所，郵編100081)，自該收藏日起公眾可從中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)農(nóng)業(yè)微生物中心獲得該菌株?？莶菅挎邨U菌(bacillussubtilis)accc02136在下文中簡(jiǎn)稱枯草芽孢桿菌accc02136。

下述實(shí)施例中的羅伊氏乳桿菌(lactobacillusreuteri)accc03949于2008年6月15日收藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)農(nóng)業(yè)微生物中心(簡(jiǎn)稱accc，地址：北京市海淀區(qū)中關(guān)村南大街12號(hào)，中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)資源與農(nóng)業(yè)區(qū)劃研究所，郵編100081)，自該收藏日起公眾可從中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)農(nóng)業(yè)微生物中心獲得該菌株。羅伊氏乳桿菌(lactobacillusreuteri)accc03949在下文中簡(jiǎn)稱羅伊氏乳桿菌accc03949。

下述實(shí)施例中的釀酒酵母(saccharomycescerevisiae)accc21429于2017年2月24日收藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)農(nóng)業(yè)微生物中心(簡(jiǎn)稱accc，地址：北京市海淀區(qū)中關(guān)村南大街12號(hào)，中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)資源與農(nóng)業(yè)區(qū)劃研究所，郵編100081)，自該收藏日起公眾可從中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)農(nóng)業(yè)微生物中心獲得該菌株。釀酒酵母(saccharomycescerevisiae)accc21429在下文中簡(jiǎn)稱酵母菌accc21429。

大腸埃希菌cvcc231于1984年12月30日收藏于中國(guó)獸醫(yī)微生物菌種保藏管理中心(簡(jiǎn)稱cvcc,地址：大興生物醫(yī)藥基地慶豐路33號(hào)國(guó)家獸醫(yī)微生物中心8號(hào)樓)自該收藏日起公眾可從中國(guó)獸醫(yī)微生物菌種保藏管理中心獲得該菌株。大腸埃希菌cvcc231引起新生仔豬腹瀉。

實(shí)施例1、抑制大腸桿菌的復(fù)合菌劑

本實(shí)施例的抑制大腸桿菌的復(fù)合菌劑是枯草羅伊氏酵母復(fù)合菌劑，它的活性成分由枯草芽孢桿菌accc02136，羅伊氏乳桿菌accc03949和釀酒酵母accc21429組成，該復(fù)合菌劑中，枯草芽孢桿菌accc02136，羅伊氏乳桿菌accc03949和釀酒酵母accc21429的菌落形成單位(cfu)數(shù)目比為1:1:1。

本實(shí)施例比較了該抑制大腸桿菌的復(fù)合菌劑和枯草芽孢桿菌accc02136菌劑、羅伊氏乳桿菌accc03949菌劑、釀酒酵母accc21429菌劑和枯草羅伊氏復(fù)合菌劑對(duì)腹瀉病原菌大腸埃希菌(cvcc231)的抑制作用，具體方法如下：

1、菌劑的制備

1.1釀酒酵母菌accc21429菌劑的制備

取保存的酵母菌accc21429于ypd培養(yǎng)基中28℃，140r/min，培養(yǎng)48h，得到酵母菌accc21429菌液。用無(wú)菌生理鹽水稀釋酵母菌accc21429菌液，得到酵母菌accc21429菌劑，該酵母菌accc21429菌劑中酵母菌accc21429的含量為1.2×10⁷cfu/ml。

1.2羅伊氏乳桿菌accc03949菌劑的制備

取保存的羅伊氏乳桿菌accc03949于mrs培養(yǎng)基中37℃，140r/min，培養(yǎng)24h，得到羅伊氏乳桿菌accc03949菌液。用無(wú)菌生理鹽水稀釋羅伊氏乳桿菌accc03949菌液，得到羅伊氏乳桿菌accc03949菌劑，該羅伊氏乳桿菌accc03949菌劑中羅伊氏乳桿菌accc03949的含量為1.2×10⁷cfu/ml。

1.3枯草芽孢桿菌accc02136菌劑的制備

取保存的枯草芽孢桿菌accc02136于lb培養(yǎng)基中28℃，140r/min，培養(yǎng)24h，得到枯草芽孢桿菌accc02136菌液。用無(wú)菌生理鹽水稀釋枯草芽孢桿菌accc02136菌液，得到枯草芽孢桿菌accc02136菌劑，該枯草芽孢桿菌accc02136菌劑中枯草芽孢桿菌accc02136的含量為1.2×10⁷cfu/ml。

1.4枯草羅伊氏酵母復(fù)合菌劑的制備

將1.1的酵母菌accc21429菌液、1.2的羅伊氏乳桿菌accc03949菌液和1.3的枯草芽孢桿菌accc02136菌液分別用無(wú)菌生理鹽水稀釋后混合，得到枯草羅伊氏酵母復(fù)合菌劑。該枯草羅伊氏酵母復(fù)合菌劑中，酵母菌accc21429的含量為0.4×10⁷cfu/ml，羅伊氏乳桿菌accc03949的含量為0.4×10⁷cfu/ml，枯草芽孢桿菌accc02136的含量為0.4×10⁷cfu/ml，即該枯草羅伊氏酵母復(fù)合菌劑中，總菌含量為1.2×10⁷cfu/ml。

1.5、枯草羅伊氏復(fù)合菌劑的制備

將1.2的羅伊氏乳桿菌accc03949菌液和1.3的枯草芽孢桿菌accc02136菌液分別用無(wú)菌生理鹽水稀釋后混合，得到枯草羅伊氏復(fù)合菌劑。該枯草羅伊氏復(fù)合菌劑中，羅伊氏乳桿菌accc03949的含量為0.6×10⁷cfu/ml，枯草芽孢桿菌accc02136的含量為0.6×10⁷cfu/ml，即該枯草羅伊氏復(fù)合菌劑中，總菌含量為1.2×10⁷cfu/ml。

2、拮抗大腸桿菌的實(shí)驗(yàn)

2.1仔豬腹瀉致病菌的活化

取保存的大腸埃希菌cvcc231到lb液體培養(yǎng)基中，37℃，140r/min培養(yǎng)24h。之后用無(wú)菌生理鹽水進(jìn)行10倍稀釋計(jì)數(shù)，每個(gè)濃度設(shè)3個(gè)平行，臨用前稀釋至1.0×10⁷cfu/ml，得到大腸桿菌菌液。

2.2羅伊氏乳桿菌accc03949菌劑對(duì)大腸桿菌的拮抗實(shí)驗(yàn)

取100μl1.0×10⁷cfu/ml的2.1的大腸桿菌菌液均勻地涂布在lb固體培養(yǎng)基上，每個(gè)培養(yǎng)基上放置4個(gè)牛津杯。每個(gè)牛津杯中分別加入200μl1.2×10⁷cfu/ml的1.2的羅伊氏乳桿菌accc03949菌劑。37℃培養(yǎng)24h，測(cè)定抑菌圈的大小。實(shí)驗(yàn)以2.1的大腸桿菌菌液、1.2羅伊氏乳桿菌accc03949菌劑純培養(yǎng)平板為對(duì)照組，以lb培養(yǎng)基為空白對(duì)照。

2.3枯草芽孢桿菌accc02136菌劑對(duì)大腸桿菌的拮抗實(shí)驗(yàn)

取100μl1.0×10⁷cfu/ml的2.1的大腸桿菌菌液均勻地涂布在lb固體培養(yǎng)基上，每個(gè)培養(yǎng)基上放置4個(gè)牛津杯。每個(gè)牛津杯中分別加入200μl1.2×10⁷cfu/ml的1.3的枯草芽孢桿菌accc02136菌劑。37℃培養(yǎng)24h，測(cè)定抑菌圈的大小。實(shí)驗(yàn)以2.1的大腸桿菌菌液、1.3的枯草芽孢桿菌accc02136菌劑純培養(yǎng)平板為對(duì)照組，以lb培養(yǎng)基為空白對(duì)照。

2.4酵母菌accc21429菌劑對(duì)大腸桿菌的拮抗實(shí)驗(yàn)

取100μl1.0×10⁷cfu/ml的2.1的大腸桿菌菌液均勻地涂布在lb固體培養(yǎng)基上，每個(gè)培養(yǎng)基上放置4個(gè)牛津杯。每個(gè)牛津杯中分別加入200μl1.2×10⁷cfu/ml的1.1的酵母菌accc21429菌劑。37℃培養(yǎng)48h，測(cè)定抑菌圈的大小。實(shí)驗(yàn)以2.1的大腸桿菌菌液、1.1的酵母菌accc21429菌劑純培養(yǎng)平板為對(duì)照組，以lb培養(yǎng)基為空白對(duì)照。

2.5枯草羅伊氏酵母復(fù)合菌劑對(duì)大腸桿菌的拮抗實(shí)驗(yàn)

取100μl1.0×10⁷cfu/ml的2.1的大腸桿菌菌液均勻地涂布在lb固體培養(yǎng)基上，每個(gè)培養(yǎng)基上放置4個(gè)牛津杯。每個(gè)牛津杯中分別加入200μl總菌含量為1.2×10⁷cfu/ml的1.4的枯草羅伊氏酵母復(fù)合菌劑。37℃培養(yǎng)24h，測(cè)定抑菌圈的大小。實(shí)驗(yàn)以2.1的大腸桿菌菌液、1.4的枯草羅伊氏酵母復(fù)合菌劑純培養(yǎng)平板為對(duì)照組，以lb培養(yǎng)基為空白對(duì)照。

2.6枯草羅伊氏復(fù)合菌劑對(duì)大腸桿菌的拮抗實(shí)驗(yàn)

取100μl1.0×10⁷cfu/ml的2.1的大腸桿菌菌液均勻地涂布在lb固體培養(yǎng)基上，每個(gè)培養(yǎng)基上放置4個(gè)牛津杯。每個(gè)牛津杯中分別加入200μl總菌含量為1.2×10⁷cfu/ml的1.5的枯草羅伊氏復(fù)合菌劑。37℃培養(yǎng)24h，測(cè)定抑菌圈的大小。實(shí)驗(yàn)以2.1的大腸桿菌菌液、1.5的枯草羅伊氏復(fù)合菌劑純培養(yǎng)平板為對(duì)照組，以lb培養(yǎng)基為空白對(duì)照。

結(jié)果表明在對(duì)腹瀉致病菌大腸埃希菌(cvcc231)的抑菌作用上，枯草羅伊氏復(fù)合菌劑略高于枯草芽孢桿菌accc02136菌劑、羅伊氏乳桿菌accc03949菌劑，但沒(méi)有顯著差異，枯草羅伊氏酵母復(fù)合菌劑卻高于枯草芽孢桿菌accc02136菌劑、羅伊氏乳桿菌accc03949菌劑和酵母菌accc21429菌劑的三者之和。說(shuō)明在枯草羅伊氏酵母復(fù)合菌劑中，枯草芽孢桿菌accc02136、羅伊氏乳桿菌accc03949和酵母菌accc21429在抑制腹瀉致病菌大腸埃希菌方面產(chǎn)生了協(xié)同作用(表1)。

表1、各菌劑對(duì)大腸桿菌的抑制作用

實(shí)施例2、枯草羅伊氏酵母復(fù)合菌劑及中藥微生態(tài)制劑預(yù)防腹瀉的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

1實(shí)驗(yàn)方法

1.1干姜水制備

取干姜，冷水浸泡2h后，大火煮沸，文火保持微沸40min，過(guò)濾，藥渣中加入60-70℃溫水煮沸，文火保持微沸30min，過(guò)濾，再次煎煮。合并三次濾液，濃縮至0.5g/ml，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2仔豬腹瀉致病菌大腸埃希菌的菌種活化

取-20℃保存的大腸埃希菌cvcc231接種到lb液體培養(yǎng)基中，37℃，140rpm/min培養(yǎng)12h，顯微計(jì)數(shù)法計(jì)數(shù)，臨用前用無(wú)菌生理鹽水稀釋至7.5×10⁷cfu/ml，得到大腸埃希菌菌液。

1.3藥物的制備

1.3.1用于配置含藥飼料的魚(yú)腥草、馬齒莧、石榴皮的制備

利用超微粉碎機(jī)將魚(yú)腥草、馬齒莧、石榴皮三種中藥分別粉碎，得到用于配置含藥飼料的魚(yú)腥草、馬齒莧、石榴皮。

1.3.2、中藥微生態(tài)制劑的制備

1.3.2.1枯草羅伊氏酵母復(fù)合菌劑的制備

將實(shí)施例1中1.1的酵母菌accc21429菌液、1.2的羅伊氏乳桿菌accc03949菌液和1.3的枯草芽孢桿菌accc02136菌液分別用無(wú)菌生理鹽水稀釋后混合，得到枯草羅伊氏酵母復(fù)合菌劑。該枯草羅伊氏酵母復(fù)合菌劑中，酵母菌accc21429的含量為0.5×10⁸cfu/ml，羅伊氏乳桿菌accc03949的含量為0.5×10⁸cfu/ml，枯草芽孢桿菌accc02136的含量為0.5×10⁸cfu/ml，即該枯草羅伊氏酵母復(fù)合菌劑中，總菌含量為1.5×10⁸cfu/ml。

1.3.2.2馬齒莧微生態(tài)制劑1的制備

每100g的1.3.1的用于配置含藥飼料的馬齒莧與10g的蒙脫石吸附劑混合均勻后加入1.0ml的1.3.2.1的枯草羅伊氏酵母復(fù)合菌劑，通風(fēng)干燥后得到馬齒莧微生態(tài)制劑1，該馬齒莧微生態(tài)制劑1中，馬齒莧的質(zhì)量含量為90.9％，枯草羅伊氏酵母復(fù)合菌劑的含量以總菌體含量計(jì)為1.5×10⁸cfu/110g。

1.3.2.3馬齒莧微生態(tài)制劑2的制備

每100g的1.3.1的用于配置含藥飼料的馬齒莧與10g的蒙脫石吸附劑混合均勻后加入0.4ml的1.3.2.1的枯草羅伊氏酵母復(fù)合菌劑，通風(fēng)干燥后得到馬齒莧微生態(tài)制劑2，該馬齒莧微生態(tài)制劑2中，馬齒莧的質(zhì)量含量為90.9％，枯草羅伊氏酵母復(fù)合菌劑的含量以總菌體含量計(jì)為0.6×10⁸cfu/110g。

1.3.2.4馬齒莧微生態(tài)制劑3的制備

每100g的1.3.1的用于配置含藥飼料的馬齒莧與10g的蒙脫石吸附劑混合均勻后加入0.2ml的1.3.2.1的枯草羅伊氏酵母復(fù)合菌劑，通風(fēng)干燥后得到馬齒莧微生態(tài)制劑3，該馬齒莧微生態(tài)制劑3中，馬齒莧的質(zhì)量含量為90.9％，枯草羅伊氏酵母復(fù)合菌劑的含量以總菌體含量計(jì)為0.3×10⁸cfu/110g。

1.3.2.5石榴皮微生態(tài)制劑1的制備

每100g的1.3.1的用于配置含藥飼料的石榴皮與10g的蒙脫石吸附劑混合均勻后加入1.0ml的1.3.2.1的枯草羅伊氏酵母復(fù)合菌劑，通風(fēng)干燥后得到石榴皮微生態(tài)制劑1，該石榴皮微生態(tài)制劑1中，石榴皮的質(zhì)量含量為90.9％，枯草羅伊氏酵母復(fù)合菌劑的含量以總菌體含量計(jì)為1.5×10⁸cfu/110g。

1.3.2.6石榴皮微生態(tài)制劑2的制備

每100g的1.3.1的用于配置含藥飼料的石榴皮與10g的蒙脫石吸附劑混合均勻后加入0.4ml的1.3.2.1的枯草羅伊氏酵母復(fù)合菌劑，通風(fēng)干燥后得到石榴皮微生態(tài)制劑2，該石榴皮微生態(tài)制劑2中，石榴皮的質(zhì)量含量為90.9％，枯草羅伊氏酵母復(fù)合菌劑的含量以總菌體含量計(jì)為0.6×10⁸cfu/110g。

1.3.2.7石榴皮微生態(tài)制劑3的制備

每100g的1.3.1的用于配置含藥飼料的石榴皮與10g的蒙脫石吸附劑混合均勻后加入0.2ml的1.3.2.1的枯草羅伊氏酵母復(fù)合菌劑，通風(fēng)干燥后得到石榴皮微生態(tài)制劑3，該石榴皮微生態(tài)制劑3中，石榴皮的質(zhì)量含量為90.9％，枯草羅伊氏酵母復(fù)合菌劑的含量以總菌體含量計(jì)為0.3×10⁸cfu/110g。

1.3.2.8魚(yú)腥草微生態(tài)制劑1的制備

每100g的1.3.1的用于配置含藥飼料的魚(yú)腥草與10g的蒙脫石吸附劑混合均勻后加入1.0ml的1.3.2.1的枯草羅伊氏酵母復(fù)合菌劑，通風(fēng)干燥后得到魚(yú)腥草微生態(tài)制劑1，該魚(yú)腥草微生態(tài)制劑1中，魚(yú)腥草的質(zhì)量含量為90.9％，枯草羅伊氏酵母復(fù)合菌劑的含量以總菌體含量計(jì)為1.5×10⁸cfu/110g。

1.3.2.9魚(yú)腥草微生態(tài)制劑2的制備

每100g的1.3.1的用于配置含藥飼料的魚(yú)腥草與10g的蒙脫石吸附劑混合均勻后加入0.4ml的1.3.2.1的枯草羅伊氏酵母復(fù)合菌劑，通風(fēng)干燥后得到魚(yú)腥草微生態(tài)制劑2，該魚(yú)腥草微生態(tài)制劑2中，魚(yú)腥草的質(zhì)量含量為90.9％，枯草羅伊氏酵母復(fù)合菌劑的含量以總菌體含量計(jì)為0.6×10⁸cfu/110g。

1.3.2.10魚(yú)腥草微生態(tài)制劑3的制備

每100g的1.3.1的用于配置含藥飼料的魚(yú)腥草與10g的蒙脫石吸附劑混合均勻后加入0.2ml的1.3.2.1的枯草羅伊氏酵母復(fù)合菌劑，通風(fēng)干燥后得到魚(yú)腥草微生態(tài)制劑3，該魚(yú)腥草微生態(tài)制劑3中，魚(yú)腥草的質(zhì)量含量為90.9％，枯草羅伊氏酵母復(fù)合菌劑的含量以總菌體含量計(jì)為0.3×10⁸cfu/110g。

1.4含藥飼料制備

分別向基礎(chǔ)飼料(江蘇省協(xié)同醫(yī)藥生物工程有限責(zé)任公司產(chǎn)品)中添加1.3的藥物得到含藥飼料，具體如下。

1.4.1魚(yú)腥草低劑量飼料、魚(yú)腥草中劑量飼料和魚(yú)腥草高劑量飼料

將1.3.1的用于配置含藥飼料的魚(yú)腥草加入到粉碎后的基礎(chǔ)飼料中，混勻后加水?dāng)嚢?，分別制成魚(yú)腥草含量為1g/kg的魚(yú)腥草低劑量飼料、魚(yú)腥草含量為2.5g/kg的魚(yú)腥草中劑量飼料和魚(yú)腥草含量為5g/kg的魚(yú)腥草高劑量飼料。

1.4.2馬齒莧低劑量飼料、馬齒莧中劑量飼料和馬齒莧高劑量飼料

將1.3.1的用于配置含藥飼料的馬齒莧粉碎后加入到粉碎后的基礎(chǔ)飼料中，混勻后加水?dāng)嚢?，分別制成馬齒莧含量為1g/kg的馬齒莧低劑量飼料、馬齒莧含量為2.5g/kg的馬齒莧中劑量飼料和馬齒莧含量為5g/kg的馬齒莧高劑量飼料。

1.4.3石榴皮低劑量飼料、石榴皮中劑量飼料和石榴皮高劑量飼料

將1.3.1的用于配置含藥飼料的石榴皮粉碎后加入到粉碎后的基礎(chǔ)飼料中，混勻后加水?dāng)嚢?，分別制成石榴皮含量為1g/kg的石榴皮低劑量飼料、石榴皮含量為2.5g/kg的石榴皮中劑量飼料和石榴皮含量為5g/kg的石榴皮高劑量飼料。

1.4.4馬齒莧微生態(tài)制劑低劑量飼料、馬齒莧微生態(tài)制劑中劑量飼料和馬齒莧微生態(tài)制劑高劑量飼料

將1.3.2.2的馬齒莧微生態(tài)制劑1加入到粉碎后的基礎(chǔ)飼料中，混勻后加水?dāng)嚢?，制成馬齒莧含量為1g/kg、枯草羅伊氏酵母復(fù)合菌劑含量以總菌體含量計(jì)為1.5×10⁶cfu/kg的馬齒莧微生態(tài)制劑低劑量飼料。

將1.3.2.3的馬齒莧微生態(tài)制劑2加入到粉碎后的基礎(chǔ)飼料中，混勻后加水?dāng)嚢瑁瞥神R齒莧含量為2.5g/kg、枯草羅伊氏酵母復(fù)合菌劑含量以總菌體含量計(jì)為1.5×10⁶cfu/kg的馬齒莧微生態(tài)制劑中劑量飼料。

將1.3.2.4的馬齒莧微生態(tài)制劑3加入到粉碎后的基礎(chǔ)飼料中，混勻后加水?dāng)嚢瑁瞥神R齒莧含量為5g/kg、枯草羅伊氏酵母復(fù)合菌劑含量以總菌體含量計(jì)為1.5×10⁶cfu/kg的馬齒莧微生態(tài)制劑高劑量飼料。

1.4.5石榴皮微生態(tài)制劑低劑量飼料、石榴皮微生態(tài)制劑中劑量飼料和石榴皮微生態(tài)制劑高劑量飼料

將1.3.2.5的石榴皮微生態(tài)制劑1加入到粉碎后的基礎(chǔ)飼料中，混勻后加水?dāng)嚢?，制成石榴皮含量?g/kg、枯草羅伊氏酵母復(fù)合菌劑含量以總菌體含量計(jì)為1.5×10⁶cfu/kg的石榴皮微生態(tài)制劑低劑量飼料。

將1.3.2.6的石榴皮微生態(tài)制劑2加入到粉碎后的基礎(chǔ)飼料中，混勻后加水?dāng)嚢瑁瞥墒衿ず繛?.5g/kg、枯草羅伊氏酵母復(fù)合菌劑含量以總菌體含量計(jì)為1.5×10⁶cfu/kg的石榴皮微生態(tài)制劑中劑量飼料。

將1.3.2.7的石榴皮微生態(tài)制劑3加入到粉碎后的基礎(chǔ)飼料中，混勻后加水?dāng)嚢?，制成石榴皮含量?g/kg、枯草羅伊氏酵母復(fù)合菌劑含量以總菌體含量計(jì)為1.5×10⁶cfu/kg的石榴皮微生態(tài)制劑高劑量飼料。

1.4.6魚(yú)腥草微生態(tài)制劑低劑量飼料、魚(yú)腥草微生態(tài)制劑中劑量飼料和魚(yú)腥草微生態(tài)制劑高劑量飼料

將1.3.2.8的魚(yú)腥草微生態(tài)制劑1加入到粉碎后的基礎(chǔ)飼料中，混勻后加水?dāng)嚢瑁瞥婶~(yú)腥草含量為1g/kg、枯草羅伊氏酵母復(fù)合菌劑含量以總菌體含量計(jì)為1.5×10⁶cfu/kg的魚(yú)腥草微生態(tài)制劑低劑量飼料。

將1.3.2.9的魚(yú)腥草微生態(tài)制劑2加入到粉碎后的基礎(chǔ)飼料中，混勻后加水?dāng)嚢瑁瞥婶~(yú)腥草含量為2.5g/kg、枯草羅伊氏酵母復(fù)合菌劑含量以總菌體含量計(jì)為1.5×10⁶cfu/kg的魚(yú)腥草微生態(tài)制劑中劑量飼料。

將1.3.2.10的魚(yú)腥草微生態(tài)制劑3加入到粉碎后的基礎(chǔ)飼料中，混勻后加水?dāng)嚢瑁瞥婶~(yú)腥草含量為5g/kg、枯草羅伊氏酵母復(fù)合菌劑含量以總菌體含量計(jì)為1.5×10⁶cfu/kg的魚(yú)腥草微生態(tài)制劑高劑量飼料。

1.4.7復(fù)合菌劑飼料

每10g的蒙脫石吸附劑與1ml的1.3.2.1的復(fù)合菌劑混勻，通風(fēng)干燥后與加入到粉碎后的基礎(chǔ)飼料中，混勻后加水?dāng)嚢?，得到枯草羅伊氏酵母復(fù)合菌劑含量以總菌體含量計(jì)為1.5×10⁶cfu/kg的復(fù)合菌劑飼料。

1.5動(dòng)物分組及處理

昆明小鼠，雄性，18-22g，適應(yīng)性生長(zhǎng)3d，隨機(jī)分為21組，每組8只，具體分組見(jiàn)表2。除空白組外，其它各組每只小鼠在飼喂表2中的相應(yīng)飼料10d后，灌胃1.1的干姜水(0.028ml/g體重)，1次/d，連續(xù)灌胃干姜水10d后連續(xù)3天每天腹腔注射7.5×10⁷cfu/ml的1.2的大腸埃希菌菌液，制造腹瀉模型。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，采集小鼠血清樣品，以備后續(xù)檢測(cè)。空白組不灌胃1.1的干姜水也不腹腔注射7.5×10⁷cfu/ml的1.2的大腸埃希菌菌液，每天飼喂基礎(chǔ)飼料。按照各檢測(cè)指標(biāo)的說(shuō)明書(shū)采用全自動(dòng)生化儀檢測(cè)小鼠血清樣品中的肝功能以及電解質(zhì)水平。

表2、動(dòng)物分組及飼喂的飼料

2實(shí)驗(yàn)結(jié)果

實(shí)驗(yàn)各組小鼠在實(shí)驗(yàn)期間均無(wú)死亡。從正式實(shí)驗(yàn)第1天開(kāi)始計(jì)的體重的測(cè)定結(jié)果如表3和表4所示，模型組小鼠發(fā)生腹瀉后體重明顯降低。分析馬齒莧各用藥組發(fā)現(xiàn)，馬菌3和馬3的體重與空白組差異不顯著，而顯著高于模型組，表明馬菌3和馬3能夠抵抗大腸桿菌感染對(duì)小鼠生長(zhǎng)性能的影響。分析石榴皮各用藥組發(fā)現(xiàn)，石菌3和石3的體重與空白組差異不顯著，而顯著高于模型組，表明石菌3和石3能夠抵抗大腸桿菌感染對(duì)小鼠生長(zhǎng)性能的影響。

表3、馬齒莧各用藥組小鼠的體重變化情況(均值±標(biāo)準(zhǔn)誤)

注：馬1為馬齒莧低劑量組，馬2為馬齒莧中劑量組，馬3為馬齒莧高劑量組，馬菌1為馬齒莧益生菌低劑量組，馬菌2為馬齒莧益生菌中劑量組，馬菌3為馬齒莧益生菌高劑量組；不具有相同字母的處理間具有顯著差異，具有相同字母的處理間不具有顯著差異。

表4、石榴皮各用藥組小鼠體重變化情況(均值±標(biāo)準(zhǔn)誤)

注：石1為石榴皮低劑量組，石2為石榴皮中劑量組，石3為石榴皮高劑量組，石菌1為石榴皮益生菌低劑量組，石菌2為石榴皮益生菌中劑量組，石菌3為石榴皮益生菌高劑量組；不具有相同字母的處理間具有顯著差異，具有相同字母的處理間不具有顯著差異。

實(shí)驗(yàn)各組小鼠腹瀉率情況見(jiàn)表5。腹瀉率為該組腹瀉只數(shù)/總只數(shù)。由表5可知：

1、模型組小鼠在攻菌第1天、攻菌第2天和攻菌第3天的腹瀉率分別為87.5％、50.0％和50.0％，顯著高于其它用藥組。

2、益生菌組，攻菌第1天的腹瀉率降為模型組的42.9％，攻菌第2天和攻菌第3天的腹瀉率均為0，說(shuō)明該枯草羅伊氏酵母復(fù)合菌劑起到了預(yù)防腹瀉的作用。

3、在含馬齒莧的各組中，攻菌第1天的腹瀉率最低的是馬齒莧益生菌高劑量組，為12.5％；攻菌第1天的腹瀉率最高的是馬齒莧益生菌低劑量組，為37.5％；馬齒莧益生菌高劑量組攻菌第1天的腹瀉率降為馬齒莧高劑量組的50.0％，馬齒莧益生菌高劑量組攻菌第1天的腹瀉率降為益生菌組的33.3％；馬齒莧益生菌高劑量組和益生菌組攻菌第2天和第3天的腹瀉率均為0，馬齒莧高劑量組的攻菌第2天和第3天的腹瀉率分別為25.0％和12.5％；說(shuō)明馬齒莧和枯草羅伊氏酵母復(fù)合菌劑在預(yù)防腹瀉方面起到了協(xié)同作用。

4、在含石榴皮的各組中，攻菌第1天的腹瀉率最低的是石榴皮益生菌高劑量組為12.5％，攻菌第1天的腹瀉率最高的是石榴皮益生菌低劑量組、石榴皮低劑量組、石榴皮中劑量組和益生菌組，均為37.5％，石榴皮益生菌高劑量組攻菌第1天的腹瀉率降為石榴皮高劑量組的50.0％，石榴皮益生菌高劑量組攻菌第1天的腹瀉率降為益生菌組的33.3％；含石榴皮的各組和益生菌組攻菌第2天和第3天的腹瀉率均為0；說(shuō)明石榴皮和枯草羅伊氏酵母復(fù)合菌劑在預(yù)防腹瀉方面起到了協(xié)同作用。

5、在含魚(yú)腥草的各組中，攻菌第1天的腹瀉率最低的是魚(yú)腥草益生菌中劑量組和魚(yú)腥草益生菌高劑量組，均為37.5％，與益生菌組攻菌第1天的腹瀉率相同；攻菌第2天和第3天的腹瀉率最低的是魚(yú)腥草益生菌高劑量組、魚(yú)腥草中劑量組和魚(yú)腥草高劑量組，均為0％，與益生菌組攻菌第2天和第3天的腹瀉率相同；說(shuō)明魚(yú)腥草和該枯草羅伊氏酵母復(fù)合菌劑在預(yù)防腹瀉方面沒(méi)有產(chǎn)生協(xié)同作用。

表5、各組的腹瀉率

注：攻菌第1天為第一次腹腔注射大腸埃希菌菌液后24小時(shí)，攻菌第2天為第二次腹腔注射大腸埃希菌菌液后24小時(shí)，攻菌第3天為第三次腹腔注射大腸埃希菌菌液后24小時(shí)。

血清中的丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(alt)、堿性磷酸酶(alp)、天門(mén)冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ast)、乳酸脫氫酶(ldh)、葡萄糖(glu)、鈉(na)氯(cl)和鉀(k)檢測(cè)結(jié)果如表6和表7所示，模型組小鼠發(fā)生腹瀉，導(dǎo)致肝功能以及部分電解質(zhì)紊亂，小鼠腹瀉模型建造成功。分析比較馬齒莧各用藥組的作用效果發(fā)現(xiàn)，馬菌3(馬齒莧益生菌高劑量組)的效果優(yōu)于其他用藥組，能夠很好的恢復(fù)腹瀉造成的機(jī)體功能損傷。分析比較各石榴皮各用藥組的作用效果發(fā)現(xiàn)，石菌3(石榴皮益生菌高劑量組)的效果優(yōu)于其他用藥組，能夠很好的恢復(fù)腹瀉造成的機(jī)體功能損傷。

表6、馬齒莧各組生化指標(biāo)變化(均值±標(biāo)準(zhǔn)誤)

注：馬1為馬齒莧低劑量組，馬2為馬齒莧中劑量組，馬3為馬齒莧高劑量組，馬菌1為馬齒莧益生菌低劑量組，馬菌2為馬齒莧益生菌中劑量組，馬菌3為馬齒莧益生菌高劑量組；不具有相同字母的處理間具有顯著差異，具有相同字母的處理間不具有顯著差異。

表7、石榴皮各組生化指標(biāo)的變化(均值±標(biāo)準(zhǔn)誤)

注：石1為石榴皮低劑量組，石2為石榴皮中劑量組，石3為石榴皮高劑量組，石菌1為石榴皮益生菌低劑量組，石菌2為石榴皮益生菌中劑量組，石菌3為石榴皮益生菌高劑量組；不具有相同字母的處理間具有顯著差異，具有相同字母的處理間不具有顯著差異。