本發(fā)明涉及一種馬勃促凝血有效成分凍干提取物的制備方法及應(yīng)用。
背景技術(shù)：
馬勃?jiǎng)e名灰包、馬糞包，是一類擔(dān)子菌門的真菌通稱，分布廣泛，始載于《名醫(yī)別錄》，其干燥子實(shí)體可入中藥，具有止血、抗菌、抗癌等功效。從20世紀(jì)60年代以來，由于馬勃特殊的藥理作用，使其倍受醫(yī)藥界的關(guān)注。中國藥典2005版規(guī)定灰包科脫皮馬勃、大馬勃和紫色馬勃的干燥子實(shí)體做為藥用馬勃正品。
馬勃最早應(yīng)用于外傷出血，被稱為止血良藥。出血是導(dǎo)致創(chuàng)傷后早期死亡的重要原因，因此創(chuàng)傷后止血發(fā)揮越來越大的作用，有效的止血是救治的前提。近年來，隨著現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)的高速發(fā)展，止血敷料的研究取得了非?？斓倪M(jìn)展。以天然中草藥為主體研發(fā)的止血藥具有很大的前景，很可能成為止血領(lǐng)域的朝陽產(chǎn)業(yè)。中草藥是中國的瑰寶，源遠(yuǎn)流長。我國地域廣闊，擁有世界上最豐富的中草藥資源，品種眾多，比起其它國家具有得天獨(dú)厚的條件。
馬勃作為傳統(tǒng)中草藥，不但具有止血活性，而且具有抗菌活性，在創(chuàng)傷發(fā)生后，可以先抑制細(xì)菌感染，再止血。特別是在野外、戰(zhàn)場等惡劣環(huán)境下，由于傷口易化膿和感染，更是無法發(fā)揮其止血作用。而目前臨床所用的馬勃止血藥主要為馬勃孢子粉、馬勃菌絲海綿或直接將馬勃粉碎。針對(duì)當(dāng)前對(duì)出血的治療情況來看，如何進(jìn)行有效、快速地止血，預(yù)防感染，開發(fā)馬勃促凝血有效成分凍干提取物這種止血新產(chǎn)品，對(duì)提高平、戰(zhàn)時(shí)傷員的救治水平具有重要的意義。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明目的是提供一種能有效、快速止血，抑菌的馬勃促凝血有效成分凍干提取物的制備方法及應(yīng)用。
本發(fā)明的一種馬勃促凝血有效成分凍干提取物的制備方法如下：
一、將馬勃進(jìn)行自然陰干，然后使用粉碎機(jī)進(jìn)行粉碎，粉碎后置于干燥環(huán)境中備用，得到粉碎后馬勃；
步驟一中所述的自然陰干是指在陰涼條件下自然風(fēng)干；
二、向步驟一得到的粉碎后馬勃中加入溶劑，在溫度為85～95℃的條件下煎煮3～5次，每次1.5h～2.5h，將各次煎煮液過濾后合并，對(duì)過濾后合并得到的煎煮液進(jìn)行減壓濃縮，濃縮至密度為1.050g/cm3～1.200g/cm3，得到馬勃浸膏；
步驟二中所述粉碎后馬勃的質(zhì)量與溶劑的體積的比為1g：3ml～20ml；
三、將步驟二得到的馬勃浸膏在溫度為-80～-88℃、真空度為5pa～100pa的條件下冷凍干燥20h～40h，得到凍干粉，即馬勃促凝血有效成分凍干提取物。
本發(fā)明的一種馬勃促凝血有效成分凍干提取物的應(yīng)用如下：
將馬勃促凝血有效成分凍干提取物應(yīng)用于醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，用于制備止血抑菌紙巾或止血抑菌紗布；
具體方法如下：
向馬勃促凝血有效成分凍干提取物中加入濃度為45％的食品級(jí)乙醇，配制成馬勃促凝血有效成分凍干提取物質(zhì)量濃度為3％～5％的馬勃混懸浸漬液，然后將紙巾或紗布浸沒于馬勃混懸浸漬液中，2min～10min后取出，擠出液體后，在溫度為62～65℃的條件下干熱消毒30min～40min，得到止血抑菌紙巾或止血抑菌紗布。
本發(fā)明的有益效果：
本發(fā)明用溶劑提取法對(duì)馬勃促凝血有效部位進(jìn)行篩選，然后將粗提物采用真空冷凍干燥機(jī)干燥，得到馬勃促凝血有效成分凍干提取物，本發(fā)明制備的馬勃促凝血有效成分凍干提取物具有優(yōu)異的促進(jìn)血液凝固的作用，當(dāng)每毫升蒸餾水中馬勃促凝血有效成分凍干提取物含量為5mg時(shí)，血液凝聚時(shí)間最短可達(dá)201s，促進(jìn)血液凝固優(yōu)異。
具體實(shí)施方式
具體實(shí)施方式一：本實(shí)施方式的一種馬勃促凝血有效成分凍干提取物的制備方法如下：
一、將馬勃進(jìn)行自然陰干，然后使用粉碎機(jī)進(jìn)行粉碎，粉碎后置于干燥環(huán)境中備用，得到粉碎后馬勃；
二、向步驟一得到的粉碎后馬勃中加入溶劑，在溫度為85～95℃的條件下煎煮3～5次，每次1.5h～2.5h，將各次煎煮液過濾后合并，對(duì)過濾后合并得到的煎煮液進(jìn)行減壓濃縮，濃縮至密度為1.050g/cm3～1.200g/cm3，得到馬勃浸膏；
步驟二中所述粉碎后馬勃的質(zhì)量與溶劑的體積的比為1g：3ml～20ml；
三、將步驟二得到的馬勃浸膏在溫度為-80～-88℃、真空度為5pa～100pa的條件下冷凍干燥20h～40h，得到凍干粉，即馬勃促凝血有效成分凍干提取物。
具體實(shí)施方式二：本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式一不同的是：步驟一中自然陰干72h～120h。其他步驟及參數(shù)與具體實(shí)施方式一相同。
具體實(shí)施方式三：本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式一或二不同的是：步驟一中所述的溶劑為食品級(jí)乙醇。其他步驟及參數(shù)與具體實(shí)施方式一或二相同。
具體實(shí)施方式四：本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式一至三之一不同的是：步驟一中所述的食品級(jí)乙醇濃度為0～95％。其他步驟及參數(shù)與具體實(shí)施方式一至三之一相同。
具體實(shí)施方式五：本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式一至四之一不同的是：步驟二中所述的在溫度為90℃的條件下煎煮3次，每次2h。其他步驟及參數(shù)與具體實(shí)施方式一至四之一相同。
具體實(shí)施方式六：本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式一至五之一不同的是：步驟二中對(duì)過濾后合并得到的煎煮液進(jìn)行減壓濃縮，濃縮至密度為1.140g/cm3，得到馬勃浸膏。其他步驟及參數(shù)與具體實(shí)施方式一至五之一相同。
具體實(shí)施方式七：本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式一至六之一不同的是：步驟二中所述的粉碎后馬勃的質(zhì)量與溶劑的體積的比為1g：15ml。其他步驟及參數(shù)與具體實(shí)施方式一至六之一相同。
具體實(shí)施方式八：本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式一至七之一不同的是：步驟三中所述的將步驟二得到的馬勃浸膏在溫度為-80℃、真空度為100pa的條件下冷凍干燥30h，得到凍干粉。其他步驟及參數(shù)與具體實(shí)施方式一至七之一相同。
具體實(shí)施方式九：本實(shí)施方式一種馬勃促凝血有效成分凍干提取物的應(yīng)用，其特征在于將馬勃促凝血有效成分凍干提取物應(yīng)用于醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，用于制備止血抑菌紙巾或止血抑菌紗布。
具體實(shí)施方式十：本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式九不同的是將馬勃促凝血有效成分凍干提取物應(yīng)用于制備止血抑菌紙巾或止血抑菌紗布的具體方法如下：
向馬勃促凝血有效成分凍干提取物中加入濃度為45％的食品級(jí)乙醇，配制成馬勃促凝血有效成分凍干提取物質(zhì)量濃度為3％～5％的馬勃混懸浸漬液，然后將紙巾或紗布浸沒于馬勃混懸浸漬液中，2min～10min后取出，擠出液體后，在溫度為62～65℃的條件下干熱消毒30min～40min，得到止血抑菌紙巾或止血抑菌紗布。其他步驟及參數(shù)與具體實(shí)施方式九相同。
用以下試驗(yàn)驗(yàn)證本發(fā)明的有益效果
試驗(yàn)一、本試驗(yàn)的一種馬勃促凝血有效成分凍干提取物的制備方法，其特征在于該方法按以下步驟進(jìn)行：
一、將馬勃進(jìn)行自然陰干，然后使用粉碎機(jī)進(jìn)行粉碎，粉碎后置于干燥環(huán)境中備用，得到粉碎后馬勃；
步驟一中自然陰干120h；
二、向200g步驟一得到的粉碎后馬勃中加入3000ml蒸餾水，在溫度為90℃的條件下煎煮3次，每次2h，將各次煎煮液過濾后合并，對(duì)過濾后合并得到的煎煮液進(jìn)行減壓濃縮，濃縮至密度為1.140g/cm3，得到馬勃浸膏；
三、將步驟二得到的馬勃浸膏在溫度為-80℃、真空度為90pa的條件下冷凍干燥30h，得到凍干粉，即馬勃促凝血有效成分凍干提取物。
試驗(yàn)二、本試驗(yàn)的一種馬勃促凝血有效成分凍干提取物的制備方法，其特征在于該方法按以下步驟進(jìn)行：
一、將馬勃進(jìn)行自然陰干，然后使用粉碎機(jī)進(jìn)行粉碎，粉碎后置于干燥環(huán)境中備用，得到粉碎后馬勃；
步驟一中自然陰干120h；
二、向200g步驟一得到的粉碎后馬勃中加入3000ml濃度為45％的食品級(jí)乙醇，在溫度為90℃的條件下煎煮3次，每次2h，將各次煎煮液過濾后合并，對(duì)過濾后合并得到的煎煮液進(jìn)行減壓濃縮，濃縮至密度為1.140g/cm3，得到馬勃浸膏；
三、將步驟二得到的馬勃浸膏在溫度為-80℃、真空度為90pa的條件下冷凍干燥30h，得到凍干粉，即馬勃促凝血有效成分凍干提取物。
試驗(yàn)三、本試驗(yàn)的一種馬勃促凝血有效成分凍干提取物的制備方法，其特征在于該方法按以下步驟進(jìn)行：
一、將馬勃進(jìn)行自然陰干，然后使用粉碎機(jī)進(jìn)行粉碎，粉碎后置于干燥環(huán)境中備用，得到粉碎后馬勃；
步驟一中自然陰干120h；
二、向200g步驟一得到的粉碎后馬勃中加入3000ml濃度為95％的食品級(jí)乙醇，在溫度為90℃的條件下煎煮3次，每次2h，將各次煎煮液過濾后合并，對(duì)過濾后合并得到的煎煮液進(jìn)行減壓濃縮，濃縮至密度為1.140g/cm3，得到馬勃浸膏；
三、將步驟二得到的馬勃浸膏在溫度為-80℃、真空度為90pa的條件下冷凍干燥30h，得到凍干粉，即馬勃促凝血有效成分凍干提取物。
驗(yàn)證試驗(yàn)
促凝血實(shí)驗(yàn)
1、實(shí)驗(yàn)對(duì)象：6只體重為2000-2500g的雄性健康家兔(哈長耳白，購于哈爾濱醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心)
2、實(shí)驗(yàn)儀器：秒表(型號(hào)：k61，上海星鉆秒表有限公司)、天平(型號(hào)：fa1004上海精科天平)、水浴鍋(型號(hào)：cs501-sp重慶四達(dá)實(shí)驗(yàn)儀器廠)、離心機(jī)(型號(hào)ldz4-0.8a北京醫(yī)用離心機(jī)廠)、10ml離心管、50ml離心管、10ml一次性注射器、50ml一次性注射器、8mm*10ml一次性試管、6孔白陶瓷板和大頭針(國營天津市文教用品一廠)
3、實(shí)驗(yàn)試劑：云南白藥(云南白藥股份有限公司，規(guī)格：4g，批號(hào)：zda1602購于哈爾濱聯(lián)想億百大藥房連鎖有限公司)、無菌蒸餾水(哈爾濱市蒸餾水廠)、枸櫞酸鈉(天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司，規(guī)格：500g)、生理鹽水(吉林省廣春藥業(yè)有限公司，規(guī)格：500ml)、氯化鈣溶液：精密量取無水氯化鈣1.38g，加蒸餾水至500ml的容量瓶中定容。
4、家兔飼養(yǎng)：購進(jìn)家兔配方飼料、無菌蒸餾水喂食適應(yīng)性飼養(yǎng)2天，
5、實(shí)驗(yàn)條件：22±5℃，相對(duì)濕度60～70％
6、家兔心臟血處置：①用10ml一次性注射器在家兔清醒狀態(tài)下快速穿刺取心臟血(兔心血液)，備用；②另取20ml步驟①得到的兔心血液置于預(yù)先加入0.5ml3.8％枸櫞酸鈉溶液的10ml離心管中搖勻，備用；③取10ml步驟②得到的抗凝兔心血，3500rpm離心10分鐘，分離血漿，4℃保存，備用。
7、樣品液配置：精確稱取試驗(yàn)一、二和三得到的馬勃促凝血有效成分凍干提取物(下稱馬勃提取物)0.5g，分別置于100ml容量瓶中，用蒸餾水定容至刻度，振搖溶解，然后用孔徑為0.45μm的水膜過濾，濾液備用。
8、實(shí)驗(yàn)操作：
瓷板針挑法：在白瓷板的凹坑內(nèi)，分別加入各樣品液0.1ml，再分別加入氯化鈣溶液0.1mll，用大頭針把樣品液與氯化鈣溶液混勻，最后分別同時(shí)加入步驟6-②中的抗凝兔心血0.5ml，立即計(jì)時(shí)，迅速用大頭針攪拌混勻且攪拌次數(shù)一致。以云南白藥為陽性對(duì)照，并設(shè)空白對(duì)照(不加樣品液加生理鹽水)。以后每30s用大頭針穿過血液輕挑1次，當(dāng)出現(xiàn)血絲時(shí)為開始凝血，當(dāng)推動(dòng)血塊時(shí)，露出瓷板白底即算血液完全凝固。從加入抗凝血液到血液完全凝固時(shí)間為凝血時(shí)間。每個(gè)樣品液重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次，取其平均值。結(jié)果采用平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差表示，采用graphpadprism軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。測定結(jié)果見表1。
表1馬勃提取物促凝血實(shí)驗(yàn)結(jié)果(抗凝兔心血液瓷板針挑法)
*p＜0.05**p＜0.01
馬勃提取物抗凝兔心血瓷板針挑法實(shí)驗(yàn)結(jié)果(表1)表明。馬勃提取物與空白對(duì)照組均有不同程度地差異，可以表明試驗(yàn)各批樣品能有效的縮短兔心血液凝聚時(shí)間。
試管法：
取內(nèi)徑為8mm，長10cm的玻璃潔凈試管，每管分別加入上述各樣品液0.1ml，再分別加入氯化鈣溶液0.1ml，搖勻，在37℃水浴溫浴1min，然后于各管內(nèi)同時(shí)加入步驟6-①的兔心血液0.5ml，以云南白藥為陽性對(duì)照，并設(shè)生理鹽水空白對(duì)照，蓋緊，倒轉(zhuǎn)3次，立即計(jì)時(shí)，在37℃的水浴箱中觀察，每隔30s輕輕傾斜試管1次，角度為30°，觀察血液是否流動(dòng)，直至傾斜到90°血液不再流動(dòng)而完全凝固于試管底為止，即為凝血時(shí)間，每組重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次，取其平均值。結(jié)果采用平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差表示，采用graphpadprism軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。測定結(jié)果見表2。
表2馬勃提取物促凝血實(shí)驗(yàn)結(jié)果(兔心血試管法)
*p＜0.05**p＜0.01
馬勃提取物兔心血試管法實(shí)驗(yàn)結(jié)果(表2)表明。3組馬勃提取物和云南白藥陽性對(duì)照組，均與空白試驗(yàn)組有明顯差異(p＜0.01、p＜0.05)。
復(fù)鈣時(shí)間的測定：
取內(nèi)徑為8mm，長10cm的玻璃潔凈試管，每管分別加入上述各藥液0.1ml，加入的氯化鈣溶液0.1ml，搖勻，在37℃水浴溫浴1min，再于各管內(nèi)同時(shí)加入0.1ml步驟6-③中的血漿，同時(shí)開動(dòng)秒表計(jì)時(shí)，每隔15s傾斜試管1次，在混合液中開始出現(xiàn)彌漫的白色顆粒纖維蛋白絲時(shí)，即為復(fù)鈣時(shí)間。以云南白藥為陽性對(duì)照，并設(shè)空白對(duì)照，每種藥物重復(fù)3次，取其平均值。結(jié)果采用平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差表示，采用graphpadprism軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。測定結(jié)果見表3。
表3馬勃提取物促凝血實(shí)驗(yàn)結(jié)果(兔心血漿復(fù)鈣時(shí)間測定法)
*p＜0.05**p＜0.01
馬勃提取物兔心血漿復(fù)鈣時(shí)間測定法結(jié)果表明(表3)，3組馬勃提取物與空白對(duì)照組均有不同程度地差異，可以表明試驗(yàn)各批樣品能有效的縮短兔心血液凝聚時(shí)間。
結(jié)論：通過對(duì)3組馬勃提取物凝血實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)：馬勃提取物和云南白藥均能有效的縮短兔心血液凝聚時(shí)間，起到促進(jìn)血液凝固的作用，其中45％乙醇提取物效果最佳。
試驗(yàn)四、將試驗(yàn)二得到的馬勃促凝血有效成分凍干提取物應(yīng)用于醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，用于制備止血抑菌紙巾或止血抑菌紗布。
具體方法如下：
向馬勃促凝血有效成分凍干提取物中加入濃度為45％的食品級(jí)乙醇，配制成馬勃促凝血有效成分凍干提取物質(zhì)量濃度為4％的馬勃混懸浸漬液，然后將紙巾浸沒于馬勃混懸浸漬液中，10min后取出，擠出液體后，在溫度為64℃的條件下干熱消毒35min，得到止血抑菌紙巾。
向馬勃促凝血有效成分凍干提取物中加入濃度為45％的食品級(jí)乙醇，配制成馬勃促凝血有效成分凍干提取物質(zhì)量濃度為4％的馬勃混懸浸漬液，然后將紗布浸沒于馬勃混懸浸漬液中，10min后取出，擠出液體后，在溫度為64℃的條件下干熱消毒35min，得到止血抑菌紗布。