(一)技術領域

本發(fā)明涉及一種雷公藤紅素的應用，特別涉及雷公藤紅素用于制備治療及延緩椎間盤退變藥物中的應用。

(二)

背景技術：

下腰痛是骨科常見疾病，好發(fā)于40歲到80歲人群。嚴重下腰痛可使患者失去工作能力，給社會和家庭造成嚴重負擔。40％以上的下腰痛是由椎間盤退變(intervertebraldiscdegeneration,ivdd)引起。但是目前為止，臨床上尚無針對椎間盤退變的治療藥物可用。

椎間盤退變可由多種因素引起，如異常受力、局部營養(yǎng)缺乏以及先天基因異常等，其中炎癥是椎間盤退變最重要的致病機制之一。由炎癥因子介導的髓核細胞過度凋亡被認為是椎間盤退變進程中重要的一環(huán)，因此針對髓核細胞凋亡的研究可能是治療椎間盤退變的重要途徑。

雷公藤紅素(celastrol)是一種廣泛存在于衛(wèi)矛科植物雷公藤、南蛇藤以及獨子藤等內的三萜類化合物。雷公藤紅素在多項藥理學研究中展示出了良好的生物活性，例如抗腫瘤、免疫抑制、抗神經(jīng)退行性疾病等。但是其對椎間盤退變疾病是否具有治療作用尚不清楚。

(三)

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明目的是提供一種雷公藤紅素在制備治療及延緩椎間盤退行性病變藥物中的應用。相比西藥較大的副作用，雷公藤紅素作為一種中藥，可以更加溫和地緩解椎間盤退變。此新功效的發(fā)現(xiàn)，也推動了我國中醫(yī)藥事業(yè)的發(fā)展。

本發(fā)明采用的技術方案是：

本發(fā)明提供一種雷公藤紅素在制備治療及延緩椎間盤退行性病變藥物中的應用，所述雷公藤紅素(cel)分子結構式為式(ⅰ)所示：

進一步，所述藥物還包括藥用載體，所述藥用載體為微乳、納米脂質體等。

進一步，所述藥物為片劑、乳劑、膠囊等。

進一步，所述藥物中雷公藤紅素的用量為4mg/kg～0.213g/g的用量為4mg/kg～0.213g/g，優(yōu)選含量為納米脂質體4mg/kg、微乳(油酸乙酯)0.213g/g。所述雷公藤紅素的用量為1～3mg/kg體重。

與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明有益效果主要體現(xiàn)在：雷公藤紅素作為一種具有良好的生物活性的植物提取物，具有用藥劑量低，抗炎效果明顯的特點。相比西藥，雷公藤紅素作為一種中藥，其抗炎作用比較緩和，可以為椎間盤退變疾病的綜合治療提供一種替代治療藥物。

(四)附圖說明

圖1雷公藤紅素對大鼠尾椎椎間盤退變針刺模型的治療效果的磁共振對照圖；2w是指培養(yǎng)2周，6w代表培養(yǎng)6周，control為對照，idd為椎間盤退變組，cel為椎間盤退變+雷公藤紅素組。

圖2雷公藤紅素的cck8藥物毒性試驗對照圖。

圖3雷公藤紅素在緩解il-1β對髓核細胞功能指標影響的qpcr試驗對照圖；a為mmp3在mrna水平的表達情況；b為mmp9在mrna水平的表達情況；c為mmp13在mrna水平的表達情況；d為adamts-4在mrna水平的表達情況；e為adamts-5在mrna水平的表達情況。

圖4髓核細胞在il-1β刺激下，雷公藤紅素改善其細胞外基質合成功能的對照圖；a為ii型膠原在mrna水平的表達情況；b為蛋白聚糖在mrna水平的表達情況；c為ii型膠原(collagenii)在蛋白水平的表達熒光圖；d為蛋白聚糖(aggrecan)在蛋白水平的表達熒光圖。

圖5雷公藤紅素在緩解il-1β對髓核細胞炎性指標影響的qpcr、elisa和westernblot試驗對照圖；a為il-6在mrna水平的表達情況；b為tnf-α在mrna水平的表達情況；c為il-6在細胞外的分泌情況；d為tnf-α和il-6在蛋白水平的表達情況；e為tnf-α和β-actin灰度值比值統(tǒng)計圖；f為il-6和β-actin灰度值比值統(tǒng)計圖；g為cox-2在mrna水平的表達情況；h為inos在mrna水平的表達情況。

圖6髓核細胞在il-1β刺激下，雷公藤紅素對其nf-κb通路的westernblot試驗對照圖；a為nf-κb信號通路在蛋白水平的表達情況；b為p-p65與p65灰度值比值的統(tǒng)計圖；c為p-iκbα與β-actin灰度值比值的統(tǒng)計圖；d為iκbα與β-actin灰度值比值的統(tǒng)計圖。

圖7髓核細胞在il-1β刺激下，雷公藤紅素對p65入核情況的細胞免疫熒光試驗對照圖；p65為p65的分布情況，dapi為細胞核，merge為每個細胞內p65的分布情況。

(五)具體實施方式

下面結合具體實施例對本發(fā)明進行進一步描述，但本發(fā)明的保護范圍并不僅限于此：

實施例1

1、實驗步驟：

(1)造模方法：取8周齡sd大鼠(約200-220g)，10％水合氯醛麻醉后(3.5ml/kg)，碘伏消毒，取大鼠7、8節(jié)尾椎(co7/8)，30g穿刺針刺入，刺入長度為5mm，刺入后旋轉360°并留置30s后拔出，即獲得大鼠尾椎椎間盤退變模型。將15只sd大鼠分成3組：組1(正常椎間盤對照組，圖1中control)，組2(單純椎間盤退變組，圖1中idd)，組3(椎間盤退變后雷公藤紅素治療組，圖1中cel，造模成功后每天行雷公藤紅素(雙蒸水配制)灌胃治療，3mg/kg/d)。分別在損傷后第2及第6周，以大鼠7、8節(jié)尾椎為中心，包括與其相鄰的椎間盤，進行大鼠尾椎磁共振檢測，比較正常椎間盤與退變椎間盤磁共振信號的差異。

(2)選取臨床上由于癥狀強烈而影像學情況較輕的，希望通過手術緩解癥狀的患者的髓核進行培養(yǎng)。一次髓核取出量約為一個成年人小拇指第一指節(jié)大小，取出后放于生理鹽水中保存，30分鐘運送到實驗室。先用無菌pbs將髓核洗2次，除去雜質與血跡。再用無菌器械將其剪碎成1mm×1mm×1mm大小，轉移到15ml離心管。再次用無菌的pbs洗一次，離心。棄去上清液，往髓核碎片內加入0.2％ii型膠原酶(vetec)20ml，放置在37℃細胞培養(yǎng)箱內消化5個小時，每隔1小時搖晃試管一次，以便充分消化。隨后離心，用10ml的pbs清洗髓核細胞一遍。再離心，加入含體積濃度15％fbs(hyclone)+質量濃度1％的青霉素鏈霉素(索萊寶)的dmem/f12基礎培養(yǎng)基(gibco)混懸細胞，接種到2個底面積為25cm²的培養(yǎng)瓶內。7天后可見髓核細胞基本貼壁，即可更換培養(yǎng)基。隨后2-3天換一次培養(yǎng)基。

(3)cck8法測定藥物細胞毒性以及藥物抗炎效果：取選取步驟(3)中前3代髓核細胞以5～6×10³個/孔的量播種在96孔板內，待其貼壁后，分成組1至組7共7個組，其中組1為對照組(以100μl基礎培養(yǎng)基為對照)，組2添加用dmem/f12基礎培養(yǎng)基配制的10^-5mg/ml雷公藤紅素100μl(雷公藤紅素添加量為10nm)，組3添加用dmem/f12基礎培養(yǎng)基配制的5×10^-5mg/ml雷公藤紅素100μl(雷公藤紅素添加量為50nm)，組4添加用dmem/f12基礎培養(yǎng)基配制的10^-4mg/ml雷公藤紅素μl(雷公藤紅素添加量為100nm)，組5添加用dmem/f12基礎培養(yǎng)基配制的2×10^-4mg/ml雷公藤紅素100μl(雷公藤紅素添加量為200nm)，組6添加用dmem/f12基礎培養(yǎng)基配制的4×10^-4mg/ml雷公藤紅素100μl(雷公藤紅素添加量為400nm)，組7添加用dmem/f12基礎培養(yǎng)基配制的8×10^-4mg/ml雷公藤紅素100μl(雷公藤紅素添加量為800nm)。隨后在每孔加入用dmem/f12基礎培養(yǎng)基配置含質量濃度10％(基礎培養(yǎng)基：cck8工作液＝9:1)的cck8(dojindo)工作稀釋液100μl。在37℃培養(yǎng)箱內孵育2h，其各孔吸光度由酶標儀測得。

(4)步驟(2)的髓核細胞倍分成4組，組1為對照組(以100％的dmem/f12基礎培養(yǎng)基為對照)，組3添加10^-4mg/ml雷公藤紅素(雷公藤紅素添加量為100nm)+dmem/f12基礎培養(yǎng)基，組4添加2×10^-4mg/ml雷公藤紅素(雷公藤紅素添加量為200nm)+dmem/f12基礎培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)2h后，組2、組3、組4棄培養(yǎng)基后再分別加入終濃度10ng/ml的il-1β+dmem/f12基礎培養(yǎng)基，37℃作用24小時后，收集上清液用以炎癥因子的elisa檢測，細胞沉淀分離細胞蛋白和細胞rna分別進行westernblot和qpcr，以檢測髓核細胞在炎癥刺激下其細胞內nf-κb的表達變化情況，并用elisa檢測細胞分泌炎癥因子的情況。

(5)westernblots：取步驟(4)作用24h后的細胞沉淀用ripa法提蛋白，并用bca法測蛋白濃度。取蛋白提取液加入loadingbuffer與水，使蛋白量定量為30μg，100℃加熱5min使蛋白變性。在sds-page凝膠的每個孔內加入20μl變性后的蛋白液，sds-page凝膠電泳后轉膜至pvdf膜，5％脫脂奶粉室溫封閉2h，一抗(一抗：一抗稀釋液體積比＝1:1000)4℃過夜，tbst洗滌pvdf膜5min×4次，二抗(二抗：tbst體積比＝1：1000)室溫孵育2h，tbst洗滌5min×4次，ecl系統(tǒng)顯影。β-actin作為內參，imagelab3.0采集條帶灰度值，取目的條帶吸光度與內參條帶比值作為相對表達量?？筽-p65,p65,p-iκbα,iκbα一抗購置于cellsignalingtechnology,inc.(beverly,ma,usa)，抗tnf-α和il-6一抗購置于santacruzbiotechnology(santacruz,ca,usa)，抗collagen-ii和aggrecan一抗購置于abcam(cambridge,ma,usa)。二抗購置于santacruzbiotechnology(santacruz,ca,usa)。

(6)實時熒光定量pcr：取步驟(4)作用24h后的細胞沉淀用trizol法提rna，并測定濃度。用primescript^tm逆轉錄試劑盒進行反轉錄，用sybr(上海生工)試劑盒進行試驗，并且統(tǒng)計數(shù)據(jù)，進行表達差異分析。

表1目的基因引物序列

(7)elisa檢測細胞炎癥因子：取步驟(4)作用24h后獲得的上清液，按照il-6試劑盒(r&dsystems,inc.,minneapolis,mn,usa)操作步驟加入試劑，并用酶標儀檢測吸光度。

(8)細胞免疫熒光：將步驟(4)作用24h后的細胞沉淀播種于6孔板玻片，通過細胞免疫熒光檢測各組(分組同步驟(4))膠原蛋白ii和蛋白聚糖的表達情況以及p65的細胞內定位情況。用pbs洗滌5分鐘×3次，再用4％多聚甲醛固定。用pbs洗滌5min×3次后加入0.5％的tritonx-100處理10min。用pbs洗滌5min×3次，再用5％的bsa封閉30min。吸干pbs，滴加p65(1:200，cst)和ii型膠原抗體(1:200，abcam)，4℃過夜。次日，pbs洗滌5min×3次后，用細胞用綠色熒光二抗(1:400，bioworld)室溫避光孵育1h。用pbs洗滌后，再用dapi染核。再用pbs洗滌5min×3次后，滴加抗熒光淬滅劑，封片。取玻片于熒光顯微鏡下觀察并拍攝。

2、實驗結果：

(1)單純椎間盤退變組(圖1中idd)的磁共振t2加權像顯示，退變的椎間盤呈現(xiàn)明顯的低信號。而雷公藤紅素治療后(圖1中cel)，椎間盤的信號相對于椎間盤退變組(圖1中idd)有明顯的提升，證明了雷公藤紅素能顯著延緩椎間盤退變的程度(圖1)。

(2)通過cck8試驗得出吸光度后，我們統(tǒng)計各組吸光度/對照組吸光度的比值，結果顯示10、50、100、200nm雷公藤紅素作用下，髓核細胞吸光值與0nm組(無雷公藤紅素組)無顯著統(tǒng)計學差異，表明10、50、100、200nm雷公藤紅素對細胞無顯著毒性；而400、800nm雷公藤紅素組髓核細胞吸光值顯著低于0nm組，表明400、800nm雷公藤紅素具有顯著的髓核細胞毒性。通過本實驗，確定了雷公藤紅素對髓核細胞的安全濃度，即0～200nm(圖2)。

(3)通過qpcr試驗，我們發(fā)現(xiàn)在il-1β刺激下，髓核細胞內的細胞外基質分解酶表達上升，并且發(fā)現(xiàn)在雷公藤紅素處理后，mmp與adamts的表達呈現(xiàn)劑量依賴性下降，即mmp3(圖3中a)、mmp9(圖3中b)、mmp13(圖3中c)與adamts-4(圖3中d)、adamts-4-5(圖3中e)的表達量在il-1β的刺激下上調，在加入100nmcel后出現(xiàn)下降，在加入200nmcel后進一步下降，表明了雷公藤紅素可以減少細胞外基質的炎性降解。另外，細胞免疫熒光試驗還證明了雷公藤紅素可以緩解il-1β對髓核細胞外基質的影響(圖4)。

(4)通過westernblot、qpcr以及elisa試驗，雷公藤紅素可以降低在il-1β刺激下髓核細胞細胞炎癥因子的含量，證實了雷公藤紅素確實具有抗炎作用(圖5)。

(5)通過進一步蛋白印記試驗分析，我們發(fā)現(xiàn)雷公藤紅素可以通過抑制nf-κb信號通路的激活來起到抗炎作用(圖6)，這一結果也在p65的細胞免疫熒光試驗中得以驗證(圖7)。

另外，本實施例作為已知結構的雷公藤紅素，可直接從市場采購或者化學合成，含雷公藤紅素的藥物組合物可以是一些長效或者局部緩釋制劑，例如，可以利用現(xiàn)代醫(yī)學的一些生物材料，包括聚已酸內酯，聚乳酸-聚乙二醇，聚乙烯醇等等，包載雷公藤紅素，形成復合制劑。也有研究表明，雷公藤具有具有一定的細胞毒性。在中醫(yī)理論指導下通過中藥配伍降低雷公藤的毒性，是雷公藤減毒的一個重要方法，例如與白芍配伍用藥可以減輕肝毒性，與淫羊藿配伍用藥可降低其對男性的生殖毒性等。中藥配伍減毒的研究需將傳統(tǒng)的中醫(yī)理論與現(xiàn)代疾病發(fā)病機制結合，建立適當?shù)睦碚撛u價指標，應用現(xiàn)代的檢測手段及方法，開展雷公藤配伍減毒機制研究，篩選出減毒增效的最佳配伍，深入認識雷公藤的毒性作用與規(guī)避措施，從而更好地提高雷公藤應用的安全性和臨床應用價值。