本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體地，涉及負(fù)載囊泡，以及制備負(fù)載囊泡的方法。

背景技術(shù)：

近年來，兩親分子囊泡由于它的分子可設(shè)計性，組裝體結(jié)構(gòu)與表面性能的可操控性，在藥物載體領(lǐng)域得到了越來越廣泛的關(guān)注。為了滿足不同的需要，大量的囊泡被設(shè)計和制造出來以實現(xiàn)不同尺寸形狀，表面性質(zhì)以及透過率等等。然而，迄今為止，我們?nèi)匀蝗狈σ环N多功能的綜合性囊泡來實現(xiàn)多種功能。

由此，多功能的綜合性囊泡有待研究。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明旨在至少解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的技術(shù)問題之一。為此，本發(fā)明的一個目的在于提出一種負(fù)載囊泡，大小和尺寸的均可調(diào)控，并且能夠負(fù)載多種物質(zhì)，例如親水性物質(zhì)，疏水性物質(zhì)以及短鏈核苷酸等，是一種多功能的綜合性負(fù)載囊泡。

因而，根據(jù)本發(fā)明的一個方面，本發(fā)明提供了一種負(fù)載囊泡。根據(jù)本發(fā)明的實施例，該負(fù)載囊泡包括：

dna修飾的納米粒，所述dna修飾的納米粒包括：

納米粒；

修飾dna，所述修飾dna與所述納米粒相連；

囊泡層，所述囊泡層包覆在所述dna修飾的納米粒的外部，且所述囊泡層是由組裝dna構(gòu)成的，且所述組裝dna部分與所述修飾dna片段互補相連；以及

負(fù)載物，所述負(fù)載物的負(fù)載部位為以下至少一種：

(1)位于所述納米粒表面；

(2)位于所述囊泡層內(nèi)；

(3)位于所述囊泡層上。

根據(jù)本發(fā)明實施例的負(fù)載囊泡，大小和尺寸的均可調(diào)控，并且能夠負(fù)載多種物質(zhì)，例如親水性物質(zhì)，疏水性物質(zhì)以及短鏈核苷酸等，是一種多功能的綜合性負(fù)載囊泡，便于多種物質(zhì)的轉(zhuǎn)運。

另外，根據(jù)本發(fā)明上述實施例的負(fù)載囊泡還可以具有如下附加的技術(shù)特征：

根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述納米粒為金納米粒。

根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述修飾dna為巰基dna。

根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述組裝dna為ppo-b-dna。

根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述組裝dna為ppo-s-s-dna。

根據(jù)本發(fā)明的實施例，該負(fù)載囊泡進(jìn)一步包括：dna-b-peg，所述dna-b-peg與所述組裝dna的部分dna片段互補相連。

根據(jù)本發(fā)明的另一方面，本發(fā)明提供了一種制備負(fù)載囊泡的方法。根據(jù)本發(fā)明的實施例，該方法包括：

(1)將修飾dna加入到納米粒溶液中，以便得到dna修飾的納米粒；

(2)將所述dna修飾的納米粒加入含有負(fù)載物和組裝dna的溶液中進(jìn)行自組裝，以便獲得負(fù)載囊泡。

根據(jù)本發(fā)明實施例的制備負(fù)載囊泡的方法，通過框架誘導(dǎo)自組裝的策略，通過搭建的框架來實現(xiàn)負(fù)載囊泡的大小和尺寸的可調(diào)控的性能，并且在有順序的組裝過程中可以同時負(fù)載多種物質(zhì)，例如親水性物質(zhì)，疏水性物質(zhì)以及短鏈核苷酸等等，從而得到多功能的綜合性負(fù)載囊泡。

根據(jù)本發(fā)明的實施例，步驟(1)中，所述納米粒的濃度為所述修飾dna濃度的150-250倍。根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實施例，步驟(1)中，所述納米粒的濃度為所述修飾dna濃度的200倍。

根據(jù)本發(fā)明的實施例，步驟(2)中，所述組裝dna的濃度是所述dna修飾的納米粒濃度的100-200倍。根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實施例，步驟(2)中，所述組裝dna的濃度是所述dna修飾的納米粒濃度的150倍。

根據(jù)本發(fā)明的實施例，該方法進(jìn)一步包括：將所述負(fù)載囊泡加入含有dna-b-peg的溶液中，以便得到調(diào)節(jié)表面電勢后的負(fù)載囊泡。

根據(jù)本發(fā)明的實施例，該方法進(jìn)一步包括：將所述負(fù)載囊泡加入含有鏈霉親和素的溶液中，以便得到具有生物素靶向性的負(fù)載囊泡。

本發(fā)明的附加方面和優(yōu)點將在下面的描述中部分給出，部分將從下面的描述中變得明顯，或通過本發(fā)明的實踐了解到。

附圖說明

本發(fā)明的上述和/或附加的方面和優(yōu)點從結(jié)合下面附圖對實施例的描述中將變得明顯和容易理解，其中：

圖1顯示了根據(jù)本發(fā)明一個實施例的負(fù)載囊泡的結(jié)構(gòu)示意圖；

圖2顯示了根據(jù)本發(fā)明一個實施例的peg-b-dna修飾負(fù)載囊泡的方法及負(fù)載囊泡的電勢變化示意圖；

圖3顯示了根據(jù)本發(fā)明一個實施例的制備負(fù)載囊泡的方法的流程示意圖；

圖4顯示了根據(jù)本發(fā)明一個實施例的制備負(fù)載囊泡的方法的流程示意圖；

圖5顯示了根據(jù)本發(fā)明一個實施例的制備負(fù)載囊泡的過程中各物質(zhì)的粒徑示意圖；

圖6顯示了根據(jù)本發(fā)明一個實施例的制備負(fù)載囊泡的過程中各物質(zhì)的電鏡示意圖；

圖7顯示了根據(jù)本發(fā)明一個實施例的負(fù)載囊泡負(fù)載負(fù)載物的流程和電勢變化示意圖；

圖8顯示了根據(jù)本發(fā)明一個實施例的負(fù)載囊泡靶向轉(zhuǎn)移的示意圖；

圖9顯示了根據(jù)本發(fā)明一個實施例的負(fù)載囊泡靶向轉(zhuǎn)移過程中各物質(zhì)的電鏡示意圖；

圖10顯示了根據(jù)本發(fā)明一個實施例的負(fù)載囊泡相應(yīng)性解散和可控釋放的示意圖。

具體實施方式

下面詳細(xì)描述本發(fā)明的實施例，所述實施例的示例在附圖中示出，其中自始至終相同或類似的標(biāo)號表示相同或類似的元件或具有相同或類似功能的元件。下面通過參考附圖描述的實施例是示例性的，僅用于解釋本發(fā)明，而不能理解為對本發(fā)明的限制。

根據(jù)本發(fā)明的一個方面，本發(fā)明提供了一種負(fù)載囊泡。參考圖1，根據(jù)本發(fā)明的實施例，對該負(fù)載囊泡進(jìn)行解釋說明，該負(fù)載囊泡包括：dna修飾的納米粒100、囊泡層200和負(fù)載物300。根據(jù)本發(fā)明的實施例，dna修飾的納米粒100包括：納米粒110和修飾dna120，該修飾dna120與納米粒110相連。根據(jù)本發(fā)明的實施例，囊泡層200包覆在dna修飾的納米粒100的外部，且該囊泡層200是由組裝dna構(gòu)成的，且該組裝dna部分與修飾dna片段互補相連。根據(jù)本發(fā)明的實施例，負(fù)載物300的負(fù)載部位為以下至少一種：(1)與納米粒相連；(2)位于囊泡層內(nèi)；(3)位于囊泡層上，其中不同的物質(zhì)負(fù)載的部位不同，例如dna分子可以與納米粒相連，親水性物質(zhì)可以位于囊泡層內(nèi)，而疏水性物質(zhì)可以位于囊泡層上。

其中，需要說明書的是，負(fù)載物的種類不受特別的限制，可以是親水性物質(zhì)，疏水性物質(zhì)以及短鏈核苷酸等，并且，該負(fù)載囊泡可以同時負(fù)載多種物質(zhì)。

根據(jù)本發(fā)明的實施例，納米粒110為選自金納米粒。

根據(jù)本發(fā)明的實施例，修飾dna為巰基dna。由此，巰基與金納米粒能形成s-au鍵，便于將修飾dna連接在納米粒上。

根據(jù)本發(fā)明的一些具體實施例，修飾dna可以具有以下核苷酸序列：

5’-ctatcctctcatcac-3’(seqidno：1)

5’-gctcactcagtatcaaca-3’(seqidno：2)

5’-tggtgaagtagatgtgta-3’(seqidno：3)

5’-tttttt-3’(seqidno：4)

根據(jù)本發(fā)明的實施例，組裝dna為ppo-b-dna。由此，該組裝dna具有溫度響應(yīng)性，在溫度超過25℃即具有疏水性質(zhì)，從而可通過加熱升溫快速制備囊泡。

根據(jù)本發(fā)明的一些具體實施例，組裝dna具有以下核苷酸序列：

5’-gtgatgagaggatag-3’(seqidno：5)

根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述組裝dna為ppo-s-s-dna。由此，利用ppo-s-s-dna中的二硫鍵在框架上引入氧化還原響應(yīng)性的二硫鍵，從而利用框架誘導(dǎo)自組裝的策略得到具有響應(yīng)性的囊泡。利用還原劑谷胱甘肽處理響應(yīng)性的囊泡，切斷了框架上的二硫鍵，進(jìn)而實現(xiàn)了負(fù)載囊泡對小分子的可控性釋放。此外，在該實驗中，所用谷胱甘肽為細(xì)胞內(nèi)10mm的濃度，這也為該囊泡在細(xì)胞內(nèi)作用提供了依據(jù)。

根據(jù)本發(fā)明的實施例，該負(fù)載囊泡進(jìn)一步包括：dna-b-peg，該dna-b-peg與組裝dna的部分dna片段互補相連。利用dna-b-peg調(diào)節(jié)囊泡層的負(fù)電性，可以使囊泡在生物體內(nèi)具有更長的循環(huán)時間，并能調(diào)節(jié)負(fù)載囊泡與目標(biāo)細(xì)胞結(jié)合，實現(xiàn)負(fù)載物的靶向轉(zhuǎn)運。

其中，dna-b-peg調(diào)節(jié)囊泡層的負(fù)電性的原理如下：由于peg不帶電，通過調(diào)節(jié)dna-b-peg的加入比例，可以改變囊泡層200的表面電勢。如圖2所述，逐漸增加dna-b-peg的加入量，使囊泡層200的表面電勢逐漸由dna的負(fù)電性向不顯電性偏移，而加入不互補的dna-b-peg則沒有類似的變化。

根據(jù)本發(fā)明的另一方面，本發(fā)明提供了一種制備負(fù)載囊泡的方法。參考圖3，根據(jù)本發(fā)明的實施例，對該制備負(fù)載囊泡的方法進(jìn)行解釋說明，該方法包括：

s100dna修飾

根據(jù)本發(fā)明的實施例，將修飾dna加入到納米粒溶液中，得到dna修飾的納米粒。

根據(jù)本發(fā)明的實施例，在步驟s100中，溶液中，納米粒的濃度為修飾dna濃度的150-250倍。根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實施例，在該步驟中，溶液中，納米粒的濃度為修飾dna濃度的200倍。由此，該種密度dna修飾的納米粒子表面，使組裝dna更易于自組裝形成囊泡層。

s200自組裝

根據(jù)本發(fā)明的實施例，將dna修飾的納米粒加入含有負(fù)載物和組裝dna的溶液中進(jìn)行自組裝，獲得負(fù)載囊泡。由此，通過框架誘導(dǎo)自組裝的策略，通過搭建的框架來實現(xiàn)負(fù)載囊泡的大小和尺寸的可調(diào)控的性能，并且在有順序的組裝過程中可以同時負(fù)載多種物質(zhì)，例如親水性物質(zhì)，疏水性物質(zhì)以及短鏈核苷酸等等，從而得到多功能的綜合性負(fù)載囊泡。

根據(jù)本發(fā)明的實施例，自組裝的過程包括：將組裝dna加入到含有dna修飾的納米粒的溶液中，加熱升溫至37℃，之后緩慢退火至室溫。由此，制備得到的負(fù)載囊泡數(shù)目多，并且尺寸均一。

根據(jù)本發(fā)明的實施例，在步驟200中，所述組裝dna的濃度是所述dna修飾的納米粒濃度的100-200倍。根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實施例，步驟(2)中，所述組裝dna的濃度是所述dna修飾的納米粒濃度的150倍。

根據(jù)本發(fā)明的實施例，該方法進(jìn)一步包括：將負(fù)載囊泡加入含有dna-b-peg的溶液中，得到調(diào)節(jié)表面電勢后的負(fù)載囊泡。由此，利用dna-b-peg調(diào)節(jié)囊泡層的負(fù)電性，使負(fù)載囊泡根據(jù)不同的細(xì)胞的不同帶電性，延長其循環(huán)時間，并能與目標(biāo)細(xì)胞結(jié)合。

根據(jù)本發(fā)明的實施例，該方法進(jìn)一步包括：將負(fù)載囊泡加入含有鏈霉親和素的溶液中，得到具有生物素靶向性的負(fù)載囊泡。由此，利用鏈霉親和素與生物素結(jié)合的性能，使負(fù)載囊泡可以靶向生物素基體，并且該種模式可以推廣到其他特異性相互作用，實現(xiàn)靶向目標(biāo)細(xì)胞的功能。

其中，需要說明的是，制備負(fù)載囊泡的過程可以通過動態(tài)光散射進(jìn)行跟蹤，參考圖4-6，對該制備負(fù)載囊泡的過程進(jìn)一步說明，其中，圖4提供了制備負(fù)載囊泡的過程；圖5提供了一個具體實施例中，納米粒、dna修飾的納米粒和負(fù)載囊泡的粒徑范圍，如圖所示，分別為11.02,19.77以及33.26納米；而圖6a-6c依次分別提供了負(fù)載囊泡、經(jīng)修飾后負(fù)載囊泡和其放大的電鏡照片，從電鏡照片中可以觀察到各照片中的顆粒的粒徑范圍，與圖5的粒徑范圍相符，并且，圖6c中，負(fù)載囊泡的數(shù)目眾多，尺寸相對均一。由此，上述過程表明，本發(fā)明實施例的方法能夠在納米粒表面修飾dna，同時組裝dna-雙親分子已組裝到金顆粒外圍形成穩(wěn)定的囊泡，從而，該方法能夠制備得到負(fù)載囊泡。

下面參考具體實施例，對本發(fā)明進(jìn)行說明，需要說明的是，這些實施例僅僅是說明性的，而不能理解為對本發(fā)明的限制。

下面將結(jié)合實施例對本發(fā)明的方案進(jìn)行解釋。本領(lǐng)域技術(shù)人員將會理解，下面的實施例僅用于說明本發(fā)明，而不應(yīng)視為限定本發(fā)明的范圍。實施例中未注明具體技術(shù)或條件的，按照本領(lǐng)域內(nèi)的文獻(xiàn)所描述的技術(shù)或條件或者按照產(chǎn)品說明書進(jìn)行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為可以通過市購獲得的常規(guī)產(chǎn)品，例如可以采購自sigma公司。

實施例1

利用本發(fā)明實施例的負(fù)載囊泡負(fù)載親水物質(zhì)，疏水物質(zhì)以及短鏈核苷酸，其中，熒光素鈉，尼羅紅和fam修飾的dna分別代表親水物質(zhì)，疏水物質(zhì)以及短鏈核苷酸。針對熒光素鈉，將10nm囊泡在1mm的熒光素鈉溶液中形成，之后經(jīng)過透析與未形成囊泡的樣品做熒光光譜對比；對于尼羅紅，將囊泡形成之后加入尼羅紅溶液，與未加入囊泡的尼羅紅溶液進(jìn)行對比，對于fam-dna，我們控制熔點，在熔點上下分別進(jìn)行熒光光譜的測定，實驗步驟具體如下：

(1)將金納米粒加入到含有修飾dna的溶液中，得到dna修飾的金納米粒，其中，修飾dna的核苷酸序列如下：

5’-ctatcctctcatcac-3’(seqidno：1)

(2)將dna修飾的金納米粒分別加入到含有熒光素鈉、尼羅紅和fam修飾的dna的dna-b-ppo溶液中，其中，dna-b-ppo的終濃度為10μm，加熱升溫至37℃過夜，分別得到負(fù)載三種負(fù)載物的負(fù)載囊泡，其中，fam修飾的dna的核苷酸序列為如下其中一種：

5’-tgttgatactgagtgagc-3’(seqidno：6)

5’-ttttacacatctacttca-3’(seqidno：7)

dna-b-ppo的核苷酸序列如下：

5’-gtgatgagaggatag-3’(seqidno：5)

(3)分別取3種含有不同負(fù)載物的負(fù)載囊泡溶液，離心沉降后再溶于純水中，稀釋10倍，通過熒光光譜儀對其進(jìn)行檢測，與上述參照樣品進(jìn)行對比，參照樣品分別為未形成囊泡的熒光素鈉溶液、尼羅紅溶液和fam-dna溶液。實驗過程和結(jié)果如圖7所示，相對于參照樣品，載有負(fù)載物的負(fù)載囊泡的熒光信號有了明顯的增強，說明本實施例中所設(shè)定的幾種物質(zhì)均能夠成功的在該種囊泡中進(jìn)行負(fù)載。

實驗結(jié)果表明，本發(fā)明實施例的負(fù)載囊泡能夠負(fù)載多種物質(zhì)，例如親水性物質(zhì)，疏水性物質(zhì)以及短鏈核苷酸等，是一種多功能的綜合性負(fù)載囊泡，便于多種物質(zhì)的轉(zhuǎn)運。

實施例2

本實施例中，利用dna-b-peg和鏈霉親和素改變負(fù)載囊泡的外圍表面電勢和實現(xiàn)負(fù)載囊泡的靶向轉(zhuǎn)運功能，具體實驗過程如下：

(1)將金納米粒加入到含有修飾dna的溶液中，得到dna修飾的金納米粒，其中，修飾dna的核苷酸序列如下：

5’-ctatcctctcatcac-3’(seqidno：1)

(2)將dna修飾的金納米粒加入到含有dna-b-ppo的溶液中，其中，dna-b-ppo的終濃度為10μm，加熱升溫至37℃過夜，得到負(fù)載囊泡，其中，dna-b-ppo的核苷酸序列如下：

5’-gtgatgagaggatag-3’(seqidno：5)

(3)將負(fù)載囊泡加入到含有dna-b-peg的溶液中，得到dna-b-peg修飾的負(fù)載囊泡。

(4)將負(fù)載囊泡加入到dna-生物素和10倍過量的鏈霉親和素，之后通過超濾清洗出去雜質(zhì)，由于鏈霉親和素與生物素具有靶向識別的作用，該修飾過的囊泡可以識別生物素修飾的dna折紙，結(jié)果如圖8和9所示，其中，圖8為dna-b-peg修飾的負(fù)載囊泡靶向識別生物素修飾的dna折紙的過程，圖9為各物質(zhì)的電鏡照片，其中，圖9a為dna折紙的電鏡照片，圖9b為dna-b-peg修飾的負(fù)載囊泡富集在生物素修飾的dna折紙上的電鏡照片，圖9c為富集dna-b-peg修飾的負(fù)載囊泡的dna折紙上的放大電鏡照片。

實施例3

在負(fù)載囊泡的囊泡層框架上引入氧化還原響應(yīng)性的二硫鍵，利用框架誘導(dǎo)自組裝的策略制備響應(yīng)性的囊泡。模擬細(xì)胞內(nèi)的還原環(huán)境，使用細(xì)胞內(nèi)濃度水平的還原劑谷胱甘肽處理響應(yīng)性的囊泡，切斷了框架上的二硫鍵，進(jìn)而實現(xiàn)了可控的囊泡解組裝，具體實驗過程如下：

(1)將金納米粒加入到含有修飾dna的溶液中，得到dna修飾的金納米粒，其中，修飾dna的核苷酸序列如下：

5’-ctatcctctcatcac-3’(seqidno：1)

(2)將dna修飾的金納米粒加入到含有dna-s-s-ppo的溶液中，其中，dna-s-s-ppo的終濃度為10μm，加熱升溫至37℃過夜，得到負(fù)載囊泡，其中，dna-s-s-ppo的核苷酸序列如下：

5’-s-s-gtgatgagaggatag-3’(seqidno：8)

(3)將負(fù)載囊泡溶液平均分為兩部分，其中一部分加入還原型谷胱甘肽，至終濃度為10mm，處理8小時后加入修飾的5nm金顆粒，外圍無法互補一圈小的金顆粒。另一部分沒有用谷胱甘肽處理的囊泡，其外圍可以很好地互補。

(4)按照步驟(1)和(2)的方法制備負(fù)載囊泡，其中，不同的是含有dna-s-s-ppo的溶液還含有1mm的熒光素鈉，得到負(fù)載熒光素鈉的囊泡。

(5)將負(fù)載熒光素鈉的囊泡進(jìn)行透析以除去游離的熒光素鈉。

(6)加入還原型谷胱甘肽至終濃度為10mm，利用熒光光譜儀檢測釋放出來的熒光素鈉。如圖10所示，在還原型谷胱甘肽的處理下，囊泡中小分子熒光素鈉有著明顯加強的釋放速率。

由此，囊泡層框架上引入氧化還原響應(yīng)性的二硫鍵的負(fù)載囊泡利用還原型谷胱甘肽可控制的囊泡解組裝，從而實現(xiàn)負(fù)載囊泡對小分子的可控性釋放。

在本說明書的描述中，參考術(shù)語“一個實施例”、“一些實施例”、“示例”、“具體示例”、或“一些示例”等的描述意指結(jié)合該實施例或示例描述的具體特征、結(jié)構(gòu)、材料或者特點包含于本發(fā)明的至少一個實施例或示例中。在本說明書中，對上述術(shù)語的示意性表述不一定指的是相同的實施例或示例。而且，描述的具體特征、結(jié)構(gòu)、材料或者特點可以在任何的一個或多個實施例或示例中以合適的方式結(jié)合。

盡管已經(jīng)示出和描述了本發(fā)明的實施例，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員可以理解：在不脫離本發(fā)明的原理和宗旨的情況下可以對這些實施例進(jìn)行多種變化、修改、替換和變型，本發(fā)明的范圍由權(quán)利要求及其等同物限定。

sequencelisting

<110>清華大學(xué)

<120>負(fù)載囊泡及其制備方法

<130>pidc3168933

<160>8

<170>patentinversion3.3

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<212>dna

<213>artificial

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<400>4

tttttt6

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<213>artificial

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<223>組裝dna

<400>5

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<212>dna

<213>artificial

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