本發(fā)明涉及葉綠素和/或其衍生物的用途，具體來說涉及葉綠素和/或其衍生物用于預(yù)防和/或治療鐵過載的用途，屬于醫(yī)藥領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
：鐵過載，又稱鐵負(fù)荷過多，是指機體鐵供給超過鐵需求。鐵過載形成的原因有很多，例如，機體因為口服鐵劑、注射鐵劑、輸血等導(dǎo)致鐵攝入過多；又如，基因突變、飲酒、病毒感染等導(dǎo)致肝臟調(diào)節(jié)鐵平衡紊亂；再如，遺傳性或獲得性鐵代謝異常等；另外，某些疾病亦能影響鐵在微環(huán)境中的代謝從而導(dǎo)致鐵選擇性地沉積在特定細(xì)胞，如病毒性肝炎導(dǎo)致鐵沉積在肝細(xì)胞中從而導(dǎo)致鐵過載等等。鐵過載會導(dǎo)致鐵在某些組織器官貯存增加，例如心臟、肝臟、胰腺、腦等，從而影響心、肝、胰腺、腦等臟器的功能和結(jié)構(gòu)，而且鐵過載與血液系統(tǒng)造血紊亂密切相關(guān)，對機體造成十分嚴(yán)重的危害。目前一般通過祛鐵治療，延緩鐵過載的發(fā)生，減輕鐵過載的危害，并改善預(yù)后。一種有效的祛鐵治療方法是放血治療，但其明顯不適合于貧血患者，尤其是輸血依賴性鐵過載患者。另一種祛鐵治療方法是鐵螯合劑，鐵螯合劑是目前治療鐵過載的唯一有效藥物，通過與體內(nèi)鐵離子定向結(jié)合有效地提高鐵的排泄，降低體內(nèi)鐵的含量及其在各器官的病理性沉積。目前臨床上應(yīng)用的鐵螯合劑主要有三種：去鐵胺(dfo)、去鐵酮(dfp)和地拉羅司(dfx)。其中，去鐵胺是一種三價鐵離子螯合劑，能與三價鐵離子結(jié)合成鐵胺復(fù)合物，其藥物代謝半衰期為20-30min，代謝后主要通過尿液排出。去鐵酮是一種二齒狀突起的口服鐵螯合劑，口服給藥后于上消化道快速吸收，藥物代謝半衰期為2-3h，空腹服藥24h可達(dá)血藥峰濃度，經(jīng)葡萄糖醛酸化代謝失活，最終主要經(jīng)尿液排出。地拉羅司為一種新型的三價鐵螯合劑，口服吸收率高，藥物代謝半衰期為8-16h，代謝后主要經(jīng)糞便排出，僅用于治療年齡大于6歲的β-地中海貧血患者因頻繁輸血所致慢性鐵過載，對于6歲以下兒童及其他輸血依賴性疾病所致的鐵過載以及中國患者的安全有效性數(shù)據(jù)有限。鐵螯合劑治療雖然取得了一定的療效，但其不足之處在于：⑴不良反應(yīng)明顯且較多，包括眼耳毒性、生長遲緩、骨骼改變、粒細(xì)胞和白細(xì)胞減少、胃腸功能紊亂、消化道出血、肝臟和腎臟功能衰竭等；⑵水溶性，從而不能進(jìn)入細(xì)胞大量轉(zhuǎn)移與轉(zhuǎn)鐵蛋白結(jié)合的鐵；⑶去鐵胺半衰期短(20-30min)，需要長時間皮下或靜脈注射使用，依從性差；⑷治療費用昂貴，例如奧貝安可牌去鐵酮片的價格為680元/瓶(30片)，成人每天需服用3次，每次3片，日服用藥物價格為204元；⑸使用人群受限，老人、孕婦、哺乳期婦女和6歲以下兒童忌用或慎用。技術(shù)實現(xiàn)要素：為了克服上述現(xiàn)有技術(shù)中存在的不足，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)葉綠素和/或其衍生物對人體內(nèi)的鐵有雙向調(diào)節(jié)作用，既可改善缺鐵性貧血，也能降低體內(nèi)鐵含量，能夠預(yù)防和/或治療鐵過載，并且沒有明顯的副作用。根據(jù)本發(fā)明的一個方面，本發(fā)明提供了葉綠素和/或其衍生物在制備用于預(yù)防和/或治療鐵過載的藥物中的用途。在本發(fā)明中，葉綠素和/或其衍生物可以與鐵螯合劑聯(lián)合預(yù)防和/或治療鐵過載。根據(jù)本發(fā)明的另一個方面，本發(fā)明提供了一種用于預(yù)防和/或治療鐵過載的藥物組合物，其含有葉綠素和/或其衍生物、鐵螯合劑和可藥用載體。根據(jù)本發(fā)明的另一個方面，本發(fā)明提供了一種用于預(yù)防和/或治療鐵過載的藥物組合，其含有彼此分開的第一藥物組合物和第二藥物組合物，其中，第一藥物組合物含有葉綠素和/或其衍生物和可藥用載體；第二藥物組合物中含有鐵螯合劑和可藥用載體。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解，本發(fā)明的藥物組合物、第一藥物組合物和第二藥物組合物，可以根據(jù)需要制成本領(lǐng)域各種常規(guī)劑型。在優(yōu)選的技術(shù)方案中，本發(fā)明的藥物組合物、第一藥物組合物和第二藥物組合物為口服劑型或注射劑型。在本發(fā)明中，口服劑型包括但不限于片劑、膠囊劑、顆粒劑、散劑、錠劑、滴丸劑、口服液、糖漿劑、混懸劑等等；注射劑型包括但不限于注射液、注射用粉針劑等等。第一藥物組合物和第二藥物組合物的劑型可以相同或不同。根據(jù)本發(fā)明的另一個方面，本發(fā)明還涉及上述藥物組合物或藥物組合在制備用于預(yù)防和/或治療鐵過載的藥物中的用途。根據(jù)本發(fā)明的另一個方面，本發(fā)明還涉及葉綠素和/或其衍生物在制備用于和鐵螯合劑聯(lián)合預(yù)防和/或治療鐵過載的藥物中的用途。根據(jù)本發(fā)明的另一個方面，本發(fā)明還涉及鐵螯合劑在制備用于和葉綠素和/或其衍生物聯(lián)合預(yù)防和/或治療鐵過載的藥物中的用途。在本發(fā)明中，葉綠素衍生物不包含鐵葉綠酸鈉，其包括但不限于葉綠酸鈉、脫鎂葉綠素酸a、脫鎂葉綠素酸b、焦脫鎂葉綠酸a、二氫卟吩e6、二氫卟吩e4、二氫卟吩p6、二氫卟吩f、紫紅素-18、葉綠卟啉等。本發(fā)明的葉綠素和/或其衍生物可以商購獲得，或者提取自含有葉綠素和/或其衍生物的各種生物材料，包括但不限于蠶砂、竹葉、杜仲、雛菊、大麥苗、菠菜、空心菜、芹菜、萵筍、甘藍(lán)、油菜、豆芽菜苗、西蘭花葉、三葉草、雪松、綠藻、青草、仙人掌、蘆薈、甘蔗葉、獼猴桃葉、桃葉、大葉黃楊、絞股藍(lán)葉、牡丹葉、紫丁香葉、喬木葉片(女貞)、海桐葉片、石楠、冬青葉片、寧箭荷花葉片、桑葉等，優(yōu)選蠶砂。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解，可以通過本領(lǐng)域已知的各種方法提取得到本發(fā)明的葉綠素和/或其衍生物。在本發(fā)明中，葉綠素和其衍生物優(yōu)選使用葉綠素提取物。在本發(fā)明中，葉綠素提取物可以商購獲得，或者提取自含有葉綠素和/或其衍生物的各種生物材料。在本發(fā)明中，葉綠素提取物中基本上不含有鐵葉綠酸鈉，即在提取葉綠素和其衍生物的過程中，不包括以生成鐵葉綠酸鈉為目的的鐵化步驟。根據(jù)本發(fā)明，葉綠素提取物中葉綠素衍生物以葉綠酸(b)計不少于15％，優(yōu)選不少于30％，進(jìn)一步優(yōu)選不少于50％，進(jìn)一步優(yōu)選不少于70％，進(jìn)一步優(yōu)選不少于85％。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解，可以通過本領(lǐng)域已知的各種方法提取得到本發(fā)明的葉綠素提取物。例如，葉綠素提取物的提取方法包括如下步驟：(1)提取葉綠素；優(yōu)選，進(jìn)一步對提取得到的提取物進(jìn)行精制；(2)皂化；優(yōu)選，進(jìn)一步用有機溶劑洗滌皂化液；(3)堿化。在上述步驟(1)中，優(yōu)選取含有葉綠素和/或其衍生物的各種生物材料(優(yōu)選蠶砂)，用有機溶劑或有機溶劑與水的混合物提取，回收有機溶劑后得葉綠素；其中，有機溶劑優(yōu)選為丙酮、乙醇、石油醚、正己烷、汽油、甲苯或其中兩種或多種的混合物，汽油優(yōu)選為120號汽油，進(jìn)一步優(yōu)選，有機溶劑為丙酮、乙醇或其混合物。進(jìn)一步優(yōu)選，提取方法為回流、萃取、滲濾、微波或使用超微震動磨等。在優(yōu)選的實施方案中，通過用去離子水洗滌或者通過用大孔吸附樹脂吸附進(jìn)行精制。精制用于去除非葉綠素類物質(zhì)。在上述步驟(2)中，優(yōu)選將葉綠素用有機溶劑溶解，加入堿溶液使其皂化；其中，有機溶劑優(yōu)選為汽油、丙酮或其混合物，汽油優(yōu)選為120號汽油；堿溶液優(yōu)選為naoh水溶液或koh水溶液，進(jìn)一步優(yōu)選，堿溶液的濃度為25-35％。皂化是為了去除類胡蘿卜素。在上述步驟(3)中，優(yōu)選調(diào)節(jié)皂化液的ph值至2-4，析出沉淀，加入有機溶劑或有機溶劑與水的混合物使其溶解，再加入naoh水溶液或naoh乙醇溶液至不再有沉淀產(chǎn)生為止，得葉綠素提取物；其中，有機溶劑優(yōu)選為丙酮、乙醇或其混合物；naoh水溶液或naoh乙醇溶液的濃度為25-35％。在本發(fā)明中，鐵螯合劑選自去鐵胺或其可藥用鹽、去鐵酮、地拉羅司或其可藥用鹽中的一種或多種。根據(jù)本發(fā)明，在藥物組合物和藥物組合中，葉綠素和/或其衍生物和鐵螯合劑的重量比為3:1-20，更優(yōu)選為3:5-15，最優(yōu)選為3:7-10。當(dāng)鐵螯合劑為去鐵胺或其可藥用鹽時，葉綠素和/或其衍生物和去鐵胺或其可藥用鹽的重量比為3:1-20，更優(yōu)選為3:5-15，最優(yōu)選為3:10。當(dāng)鐵螯合劑為去鐵酮時，葉綠素和/或其衍生物和去鐵酮的重量比為3:1-20，更優(yōu)選為3:5-15，最優(yōu)選為1:3。當(dāng)鐵螯合劑為地拉羅司或其可藥用鹽時，葉綠素和/或其衍生物和地拉羅司或其可藥用鹽的重量比為3:1-20，更優(yōu)選為3:5-15，最優(yōu)選為3:7。根據(jù)本發(fā)明，鐵過載可以是各種原因引起的鐵過載。在一個方面，所述鐵過載由鐵攝入過多、鐵平衡紊亂、和/或鐵代謝異常導(dǎo)致。所述鐵攝入過多由口服鐵劑、注射鐵劑、和/或輸血導(dǎo)致。所述鐵平衡紊亂由基因突變、飲酒、和/或病毒感染導(dǎo)致；優(yōu)選，所述病毒感染選自乙型肝炎病毒感染、丙型肝炎病毒感染和/或幽門螺桿菌感染。所述鐵代謝異常為遺傳性鐵代謝異常和/或獲得性鐵代謝異常；優(yōu)選，所述遺傳性鐵代謝異常選自遺傳性血色病、遺傳性血色素沉著病、遺傳性高鐵血紅蛋白血癥、和/或地中海貧血；優(yōu)選，所述獲得性鐵代謝異常由環(huán)境因素、膳食因素和/或疾病導(dǎo)致，進(jìn)一步優(yōu)選，所述疾病為動脈粥樣硬化。在另一個方面，所述鐵過載為疾病導(dǎo)致鐵在細(xì)胞內(nèi)沉積。優(yōu)選，所述疾病選自病毒性肝炎、動脈粥樣硬化、遺傳性血色病、遺傳性血色素沉著病、遺傳性高鐵血紅蛋白血癥和/或地中海貧血；進(jìn)一步優(yōu)選，所述病毒性肝炎為乙型肝炎和/或丙型肝炎。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解，本發(fā)明的藥物組合物、第一藥物組合物、第二藥物組合物、以及口服劑型、注射劑型均可以使用本領(lǐng)域已知的方法制備得到。本發(fā)明的藥物組合物、第一藥物組合物、第二藥物組合物、口服劑型或注射劑型中含有的可藥用載體，包括但不限于常規(guī)的各種有機或無機藥物載體，例如潤滑劑、粘合劑、崩解劑、水溶性聚合物、無機鹽、溶劑、溶解助劑、懸浮劑、等滲劑、緩沖液、防腐劑、抗氧劑、著色劑、甜味劑、酸味劑、起泡劑、芳香劑、穩(wěn)定劑、包衣材料和調(diào)味劑等等。本發(fā)明具有以下優(yōu)點：①對祛鐵治療有顯著的療效；②可避免祛鐵治療過度，葉綠素和/或其衍生物對人體內(nèi)的鐵有雙向調(diào)節(jié)作用，既可改善缺鐵性貧血，也能降低體內(nèi)鐵含量，是一種鐵穩(wěn)態(tài)劑；③能同時改善和修復(fù)鐵過載所致肝、腎組織損傷，改善預(yù)后；④可制作成口服制劑，患者的順應(yīng)性強；⑤為天然中藥提取物，無明顯毒副作用，可較長時間服用；⑥能夠提高鐵螯合劑的療效，從而可以縮短單獨使用鐵螯合劑的治療周期，減少其因長期用藥產(chǎn)生不良反應(yīng)的風(fēng)險；⑦大幅減輕了患者的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。具體實施方式下面結(jié)合具體實施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。此外，應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明所記載的內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本發(fā)明所限定的范圍。在下述實施例中，如無特別說明，葉綠素提取物為實施例1所制備的葉綠素提取物。葉綠素片劑的規(guī)格為0.25g/片，其中含50mg實施例1制備的葉綠素提取物，其他為醫(yī)用常規(guī)輔料。地拉羅司分散片為恩瑞格牌地拉羅司分散片，每片含有地拉羅司125mg。實施例1.葉綠素提取物(含有葉綠素及其衍生物)的制備將蠶砂置于超微振動磨中，加入70％～80％乙醇，提取2-5分鐘，再加入70％～80％乙醇提取5-15分鐘，出料，以離心的方式分得上清液和藥渣，將上清液回收乙醇，得葉綠素及其衍生物粗提物。用去離子水沖洗葉綠素粗提物1-3次，濾過，所得濾渣即為葉綠素及其衍生物精提物。將葉綠素精提取用120號汽油溶解，加入足量的naoh溶液，攪拌，使其全皂化，取下層皂化液。將皂化液以酸溶液調(diào)節(jié)ph值至2～4，將析出的沉淀溶解于丙酮或95％乙醇中，再加入足量naoh乙醇溶液，濾過，所得沉淀為葉綠素提取物，含有葉綠素及其衍生物，其中，葉綠素衍生物含量以葉綠酸(b)計不少于85％。實施例2.葉綠素提取物(含有葉綠素及其衍生物)的祛鐵作用取昆明種小鼠80只，雌雄各半，隨機分為正常對照組、陽性對照組、葉綠素高劑量組和葉綠素低劑量組，每組20只，雌雄各半。除正常組外，其他各組小鼠均按100mg/kg每周腹腔注射1次右旋糖酐鐵造模，連續(xù)注射10周，建立鐵過載小鼠模型。自造模之日起，各組均每天給予1次灌胃，其中：正常對照組給予1ml生理鹽水，陽性對照組給予1ml生理鹽水，葉綠素提取物高劑量組按80mg/kg給予葉綠素提取物水溶液1ml，葉綠素提取物低劑量組按40mg/kg給予葉綠素提取物水溶液1ml，治療結(jié)束后尾靜脈取血用動物血常規(guī)檢測儀檢測小鼠血清鐵(si)和血清鐵蛋白(sf)水平，結(jié)果見下表1。表1.葉綠素對鐵過載小鼠si和sf水平的影響si(μmol/l)sf(μg/l)正常對照組65.21±3.18112.68±9.52陽性對照組106.87±9.15168.55±14.83葉綠素提取物低劑量組94.15±8.28*142.61±12.95*葉綠素提取物高劑量組85.12±6.86**137.24±11.39**注：與陽性對照組相比，*p<0.05，**p<0.01表1顯示，與正常對照組小鼠比較，鐵過載陽性對照組小鼠si和sf水平明顯升高。葉綠素提取物低劑量組和高劑量組與陽性對照組相比，si和sf水平均降低，具有顯著性差異(p＜0.05或p＜0.01)，說明葉綠素提取物能降低鐵過載小鼠si和sf水平，并具有劑量相關(guān)性。實施例2.葉綠素提取物(含有葉綠素及其衍生物)的臨床祛鐵作用為證明葉綠素及其衍生物的治療效果，給鐵過載患者服用含有葉綠素及其衍生物的葉綠素片劑進(jìn)行觀察。⑴一般資料選取因各類貧血需要長期輸血而導(dǎo)致鐵過載的患者31例，其中男15例，女16例，年齡16～68歲，其中重型再生障礙性貧血(saa)20例，重型地中海貧血7例，骨質(zhì)增生異常綜合征(mds)4例，治療前肝及腎功能均正常。當(dāng)患者sf水平超過1000μg/l時開始給予葉綠素片劑進(jìn)行祛鐵治療。⑵治療方法每次口服葉綠素片劑4片，餐后1h服藥，忌茶，3次/天，4周為一個療程，治療4個療程。⑶觀察指標(biāo)整個研究期間，患者需要進(jìn)行常規(guī)輸血治療以維持血紅蛋白(hb)水平≥70g/l。每4周檢測1次sf、si、血常規(guī)、血生化、尿蛋白等；定期觀察心電圖、超聲心電圖、橈骨x線等；密切觀察患者用藥情況，了解有無不良反應(yīng)。⑷統(tǒng)計學(xué)方法數(shù)據(jù)分析使用spss17.0統(tǒng)計軟件。計量資料結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用t檢驗，p<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。⑸治療結(jié)果所有患者在治療過程中均未發(fā)現(xiàn)過敏反應(yīng)，均無惡心、嘔吐等胃腸道反應(yīng)，無關(guān)節(jié)疼痛、腫脹，未出現(xiàn)視力及聽力異常，用藥期間肝腎功能、電解質(zhì)未見明顯改變，未發(fā)現(xiàn)與治療相關(guān)性血象異常，表明葉綠素具有良好的安全性、耐用性和依從性。患者治療前后sf和si平均水平見下表2。表2.患者治療前后sf和si平均水平注：與治療前相比，*p<0.05。表2顯示，與治療前相比，患者在接受葉綠素及其衍生物治療后4周和8周sf和si平均值均有下降趨勢，12周和16周的sf和si平均值均明顯下降，與治療前相比具有顯著性差異(p＜0.05)，表明葉綠素及其衍生物對鐵過載具有顯著的臨床治療效果，并具有劑量相關(guān)性。實施例3.葉綠素提取物(含有葉綠素及其衍生物)和地拉羅司聯(lián)用的臨床祛鐵作用為證明葉綠素及其衍生物和地拉羅司聯(lián)用的治療效果，給鐵過載的患者服用含有葉綠素及其衍生物的葉綠素片劑和地拉羅司片進(jìn)行觀察。⑴一般資料選取因各類貧血需要長期輸血而導(dǎo)致鐵過載的患者32例，其中男18例，女14例，年齡18～68歲，其中重型再生障礙性貧血(saa)16例，重型地中海貧血10例，骨質(zhì)增生異常綜合征(mds)6例，治療前肝及腎功能均正常。隨機分為對照組(16例)和治療組(16例)，當(dāng)患者sf水平超過1000μg/l時開始給予祛鐵治療，其中對照組口服地拉羅司分散片，治療組口服葉綠素片劑和地拉羅司分散片。⑵治療方法每次口服葉綠素片劑4片，餐后1h服藥，忌茶，3次/天；每次口服地拉羅司分散片，空腹口服，30mg/kg·d，3次/d，兩組口服地拉羅司分散片用法相同。4周為一個療程，治療4個療程。⑶觀察指標(biāo)整個研究期間，患者需要進(jìn)行常規(guī)輸血治療以維持血紅蛋白(hb)水平≥70g/l。每4周檢測1次sf、si、血常規(guī)、血生化、尿蛋白等；定期觀察心電圖、超聲心電圖、橈骨x線等；密切觀察患者用藥情況，了解有無不良反應(yīng)。⑷統(tǒng)計學(xué)方法數(shù)據(jù)分析使用spss17.0統(tǒng)計軟件。計量資料結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用t檢驗，p<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。⑸治療結(jié)果所有患者在治療過程中均未發(fā)現(xiàn)過敏反應(yīng)，均無惡心、嘔吐等胃腸道反應(yīng)，無關(guān)節(jié)疼痛、腫脹，未出現(xiàn)視力及聽力異常，用藥期間肝腎功能、電解質(zhì)未見明顯改變，未發(fā)現(xiàn)與治療相關(guān)性血象異常，表明葉綠素及其衍生物和地拉羅司聯(lián)合用藥是安全的。患者治療前后sf和si平均水平見下表3。表3.兩組患者治療前后sf和si平均水平注：與治療前相比，*p<0.05，**p<0.01；與對照組相比，#p<0.05。表3顯示，對照組和治療組患者治療前sf和si大致相同，治療4周后兩組sf和si平均值有下降趨勢，治療8周、12周和16周后的sf和si平均值均下降明顯，與治療前相比具有顯著性差異(與治療前相比p＜0.01)，表明葉綠素及其衍生物和地拉羅司聯(lián)合對鐵過載具有顯著的臨床治療效果，并具有劑量相關(guān)性。并且，治療組與對照組相比，sf和si下降幅度更大，治療16周后與對照組相比具有顯著性差異(與對照組相比p＜0.05)，表明葉綠素及其衍生物和地拉羅司聯(lián)合的治療效果優(yōu)于單用地拉羅司的治療效果。實施例4.制劑的制備稱取葉綠素提取物原料藥60g、地拉羅司原料藥140g、淀粉23g、糊精80g、羥丙纖維素25g，微晶纖維素25g、硬脂酸鎂2g，混勻，過100目篩。稱取羧甲基纖維素鈉1g和適量純化水，配制濃度為3％的溶液，稱取蔗糖90g和適量純化水配制成糖漿。將上述原料混勻，制成顆粒，干燥，壓制成片，包薄膜衣，即得。以上，對本發(fā)明的實施方式進(jìn)行了說明。但是，本發(fā)明不限定于上述實施方式。凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所做的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。當(dāng)前第1頁12