本發(fā)明是涉及藥物的用途，特別是辛伐他汀在制備抑制乙肝病毒藥物中的應用，屬于西藥領域。

背景技術：

乙型肝炎病毒(hbv)感染大約4億人，是世界范圍內最常見的慢性感染性疾病，是導致原發(fā)性肝細胞癌(hcc)的主要原因，每年約有100萬人死于hbv感染所致的肝衰竭、肝硬化和肝癌。目前對hbv感染的治療主要是干擾素和核苷類似物，干擾素治療的長期有效率僅為30％左右,并且毒副作用較多；核苷類似物如拉米夫定雖然抗病毒能力較強，但停藥后病毒復制水平快速反跳及耐藥病毒株的出現，使得臨床抗病毒方案的實施面臨極大的挑戰(zhàn)。因此，對慢性hbv感染治療的積極探索已成為臨床研究的重要領域。

病毒本身的基因組非常小，只能編碼有限數量的基因，所以病毒必須利用宿主細胞的因子及元件進行復制，尤其是真核細胞基因復制、轉錄相關的因子。在流感病毒rna基因的復制過程中，微小染色體維持蛋白(mcms)起著重要的穩(wěn)定作用，mcms是宿主細胞dna復制起始和延長過程中的重要因子，同時也參與細胞周期調控。mcm7是mcm(minichromosomemaintenanceprotein)蛋白家族成員之一,負責細胞增殖過程中dna復制的啟動。研究發(fā)現，在體外應用阿托伐他汀處理的分離所得的兔主動脈平滑肌細胞，可以抑制該細胞的增殖能力。該研究還對e2f活性以及mcm6、mcm7進行檢測，發(fā)現阿托伐他汀可通過影響e2f活性下調mcm蛋白的表達，而這種抑制作用可以被外源性mva解除，證明他汀類藥物可能通過其抑制膽固醇合成的作用減少mav合成，進一步抑制dna復制因子mcm6、mcm7的表達，阻滯細胞周期進程。

目前臨床常用的辛伐他汀是羥甲戊二酰輔酶a還原酶(hmgcoa還原酶)抑制劑，一直被用來治療高膽固醇血癥及預防心血管疾病。目前尚無辛伐他汀以mcm7為靶點抑制細胞增值的相關研究報道，因此闡明辛伐他汀在hbv感染的相關機制研究具有積極的意義和研究價值。

技術實現要素：

本發(fā)明的目是：提供一種辛伐他汀在制備抑制乙肝病毒藥物中的應用，由于辛伐他汀具有很強的抗乙肝病毒的活性，為臨床制備抑制乙肝病毒藥物提供了新的有效方法。

本發(fā)明的技術方案是：辛伐他汀在制備抑制乙肝病毒藥物中的應用，其特征是：所述的辛伐他汀在制備以mcm7為靶標的藥物中的應用。

所述的辛伐他汀在制備以mcm7為靶標的抑制乙肝病毒的藥物中的應用。

所述的辛伐他汀在制備以mcm7為靶標的抑制肝癌的藥物中的應用。

所述的肝癌是由hbv感染引起的原發(fā)性肝癌。

本發(fā)明的有益效果是：辛伐他汀通過抑制hepg2.2.15細胞中mcm7表達水平，從而抑制了該細胞中hbv的復制，阻滯細胞周期進程。由于辛伐他汀具有很強的抗乙肝病毒的活性，為臨床制備抑制乙肝病毒藥物提供了新的有效方法。

附圖說明

圖1是asirna干擾mcm7后adgfp的表達情況；

圖2是simcm7干擾后hepg2.2.15細胞mcm7表達情況；

圖3是下調mcm7后，hepg2.2.15細胞水平hbvdna拷貝數(*vscontrol，p<0.05)；

圖4是不同濃度辛伐他汀對hepg2.2.15細胞增殖率的影響；

圖5是不同濃度辛伐他汀對hepg2.2.15細胞細胞計數的影響；

圖6是hepg2.2.15細胞干預4d的細胞形態(tài)(a：溶劑對照，b:辛伐他汀40μmol/l)；

圖75×10⁶個hepg2.2.15細胞上清中hbv的dna拷貝數；

圖85×10⁶個hepg2.2.15細胞上清中hbv的dna拷貝數；

圖9辛伐他汀對肝癌hepg2.2.15細胞周期的影響；

圖10是辛伐他汀干預4d對肝癌hepg2.2.15細胞周期的影響；

圖11是辛伐他汀干預后hepg2.2.15細胞周期相關蛋白的表達；

圖12a是mcm7轉錄水平的變化；

圖12b是mcm7蛋白水平的變化；

圖13是辛伐他汀作用后對hepg2.2.15細胞蛋白水平的影響。

具體實施方式

下面通過給出的具體實施例可以進一步清楚的說明本發(fā)明，但不作為對本發(fā)明的限定。

本發(fā)明的是通過以下的實驗得到證實的。

如圖1-3所示，通過sirna技術，抑制mcm7的表達，發(fā)現腺病毒的gfp表達明顯下降，說明mcm7作為宿主細胞dna復制因子，參與病毒的復制。在流感病毒rna基因的復制過程中，微小染色體維持蛋白(mcms)起著重要的穩(wěn)定作用。我們在hepg2.2.15細胞中，通過sirna技術下調mcm7的蛋白表達，對細胞中的hbvdna拷貝數進行檢測，發(fā)現抑制hepg2.2.15細胞中mcm7的表達后，細胞中hbvdna拷貝數數降低，說明作為宿主細胞dna復制因子mcm7參與hbv的復制。

首先，采用mtt，細胞計數方法檢測不同濃度的辛伐他汀對hepg2.2.15細胞增殖的影響。結果如圖4和圖5所示：40μmol/l辛伐他汀在藥物作用3d后開始抑制hepg2.2.15細胞的增殖，可持續(xù)至藥物干預后7d；而其他濃度組(5μmol/l,20μmol/l)對細胞增殖無明顯作用；陽性對照藥物拉米夫定(5μmol/l)對細胞增殖無明顯作用。圖6是hepg2.2.15細胞干預4d的細胞形態(tài)(a：溶劑對照，b:辛伐他汀40μmol/l)。

根據mtt，細胞計數結果，使用40μmol/l和5μmol/l辛伐他汀分別作用于hepg2.2.15細胞，并在不同時間點(1d、4d、7d)收集不同組的細胞及上清，用np-40裂解細胞后，取部分樣品采用pcr-熒光探針法測定上清液中及細胞內hbvdna的拷貝數，如圖7所示。剩余樣品計算單位蛋白濃度的hbvdna拷貝數如圖8所示。結果發(fā)現：高濃度辛伐他汀在體外抑制hepg2.2.15細胞乙肝病毒復制，上清及細胞水平的hbvdna拷貝數數均降低，并且細胞內降低更明顯，且隨著作用時間、作用濃度的增高，抑制作用越明顯。證實辛伐他汀在體外確有抗hbv的作用。

用40μmol/l和5μmol/l辛伐他汀分別作用于hepg2.2.15細胞，在1d和4d收集不同組的細胞，采用pi單染法檢測細胞周期。結果如圖9和10顯示：辛伐他汀低濃度組及高濃度組對hepg2.2.15細胞作用1d時，對周期均無明顯影響；而藥物作用4d時，低濃度的辛伐他汀對細胞周期則無明顯影響，高濃度辛伐他汀則使g1期細胞明顯增多，s期及g2/m期細胞均減少。結果表明辛伐他汀可以使hepg2.2.15細胞發(fā)生g1期阻滯，且具有時間、濃度的雙重依賴性。

用western-blot檢測辛伐他汀作用后hepg2.2.15細胞的mcm7的表達，以及周期相關蛋白p21、p27、p53、cyclind1、prb和rb，結果如圖11顯示：5μmol/l和40μmol/l作用hepg2.2.15細胞1d時，均無明顯抑制mcm7蛋白表達；而在4d時可下調mcm7蛋白水平；在辛伐他汀高濃度作用4d時，cyclind1、prb表達下降，p21、p27的表達增高，而rb、p53表達無明顯變化。cyclind1，prb，mcm7作為細胞周期促進因子，其表達下降時，而周期抑制因子p27、p21表達增高，可以抑制細胞周期的進程，這也進一步解釋了流式細胞儀檢測的周期結果。辛伐他汀可能通過抑制hepg2.2.15細胞中mcm7表達水平，從而抑制了該細胞中hbv的復制。

如圖12a所示，通過實時熒光定量pcr的方法，檢測5μmol/l、40μmol/l的辛伐他汀分別作用于hepg2.2.15細胞后，mcm7的mrna水平的變化，隨作用濃度和作用時間的增加，mcm7的mrna水平表達均明顯增高。這與之前western-blot的結果相反，如圖12b所示。因此，辛伐他汀藥物干預后，細胞中mcm7的mrna水平表達增高，但蛋白水平表達下降。

如圖13所示，通過western-blot檢測辛伐他汀作用后的hepg2.2.15細胞中p-eif2α蛋白的表達，結果發(fā)現，隨著藥物作用濃度和作用時間的增加，p-eif2α的蛋白表達增強。這說明辛伐他汀對hepg2.2.15細胞進行干預后，會產生類似干擾素樣作用。有文獻報道ampk可以激活perk，從而使eif2α磷酸化水平增高，而lkb1是ampk的上游激酶，所以我們推測辛伐他汀可能通過激活lkb1-ampk，從而激活perk，使eif2α磷酸化水平增高，抑制下游靶基因翻譯，mcm7可能是其下游靶基因之一。而檢測顯示，藥物干預后，lkb1、p-ampk、perk、p-eif2α的蛋白表達水平隨作用濃度和作用時間的增加而增強，而mcm7隨作用濃度和作用時間的增加而降低，提示辛伐他汀可能通過激活lkb1-ampk通路發(fā)揮抗hbv的作用。

實施例1

mtt實驗檢測細胞增殖能力

取對數生長期肝癌hepg2.2.15細胞，用含0.25％胰酶(trypsin)+0.02％edta的消化液消化細胞離心棄去上清，用完全培養(yǎng)基吹打均勻后使用細胞計數板計數，按細胞數3×104/孔接種于96孔培養(yǎng)板中。孵育24h后用不同濃度的辛伐他汀(如表1)處理細胞，每個濃度設5個副孔。分別在藥物作用1、2、3、4、5、6、7d后，加入500μg·ml-1mtt20μl，37℃孵育4h后先吸棄培養(yǎng)液，隨后每孔加入dmso150μl，震蕩15min混勻，用酶標儀檢測570nm下各孔吸光度(a)值。將各測試孔的a值減去本底a值(無細胞培養(yǎng)基加mtt試劑)；根據各平行孔的a值計算平均值。

細胞增殖率％＝(干預組細胞a值-本底a值)/(對照組細胞a值-本底a值)×100％。實驗重復3次，繪制抑制率曲線如圖4。

表1辛伐他汀作用濃度

實施例2

細胞計數實驗檢測細胞增殖能力

取對數生長期肝癌hepg2.2.15細胞，用含0.25％胰酶(trypsin)+0.02％edta的消化液消化細胞離心棄去上清，用完全培養(yǎng)基吹打均勻后使用細胞計數板計數，按細胞數3×104/孔接種于96孔培養(yǎng)板中。孵育24h后用不同濃度的辛伐他汀(如表1)處理細胞，每個濃度設5個副孔。分別在藥物作用1、2、3、4、5、6、7d后將細胞用0.25％胰酶消化，充分吹打制備成單細胞懸液。計數板和蓋玻片用95％的乙醇擦洗干凈，涼干。把蓋玻片覆蓋在計數板上，充分混勻細胞懸液，吸管吸取細胞，從計數板邊緣輕輕滴約10μl細胞懸液，使之充滿計數板和蓋玻片之間的空隙中，要避免溢出蓋玻片，也不要過少或帶氣泡。在倒置顯微鏡下用10x物鏡觀察，計數四角的4個大方格，2個以上細胞組成的細胞團按一個細胞計算，壓線的細胞只計上線和左線者。按下列公式計算細胞濃度：(4大格細胞總數/4)x104個/ml。每一樣品重復3次，取平均值得細胞懸液濃度。

實施例3

蛋白免疫印記分析法(western-blot)

1)蛋白樣品的準備：將事先培養(yǎng)并做相應處理的細胞去除培養(yǎng)基，用預冷(4℃)的pbs沖洗3遍，盡量將殘余pbs充分吸干，之后加入預冷的蛋白裂解液，置于冰上裂解30min。此后，用細胞刮培養(yǎng)皿收集細胞，并于4℃下12000rpm離心2min，取上清。取其中少量上清進行蛋白定量，其余部分加入loadingbuffer液，104℃煮30min，之后置于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2)制備電泳凝膠：按表2配制5％濃縮膠及10％分離膠?？偟鞍咨蠘恿繛?0μg，60v電泳，待樣品前沿進入分離膠后，調電壓至100v，繼續(xù)電泳約1.5h。見表2

表-2凝膠配制

3)蛋白電泳：將蛋白樣品調至等濃度后上樣，開始先45v電壓進行穩(wěn)流電泳，當電壓達65v時改為穩(wěn)壓電泳。當目的蛋白移動至距分離膠下緣1cm左右停止電泳。

4)半干式轉膜：預先裁好與膠條同樣大小的濾紙和pvdf膜，電泳結束后剝離凝膠，以去離子水漂洗，按pvdf膜>濾紙>凝膠的大小順序切20層濾紙及一張pvdf膜，pvdf膜在甲醇中浸泡30～60s，后與濾紙一起浸泡在轉膜緩沖液中15～30min待用。用半干電轉法轉膜，在陽極與陰極間依次放置20層濾紙、pvdf膜、凝膠、20層濾紙，設置轉膜條件為25v，30min。

5)免疫印跡：轉膜成功后，pvdf膜以含有5％脫脂奶粉的tbst，37℃搖床上輕搖60min，封閉非特異結合位點。封閉后用tbst液洗膜，搖床輕搖5min×3次。將膜與稀釋的一抗4℃孵育過夜。孵育一抗后tbst液洗膜，搖床輕搖5min×3次。將膜移入二抗工作液(用封閉液按1:2000稀釋二抗)37℃2h。孵育二抗后tbst液洗膜，搖床輕搖5min×3次。棄去tbst，加顯色液，曝光采集圖像。

實施例4

實時熒光定量pcr(real-timepcr)

1)總rna提取凍存已裂解的細胞，室溫放置5分鐘使其完全溶解。每1ml的trizol試劑裂解的樣品中加入0.2ml的氯仿，蓋緊管蓋。手動劇烈振蕩管體15秒后，15到30℃孵育2到3分鐘。4℃下12000rpm離心15分鐘。離心后混合液體將分為下層的紅色酚氯仿相，中間層以及無色水相上層。rna全部被分配于水相中。水相上層的體積大約是勻漿時加入的trizol試劑的60％。將水相上層轉移到一干凈無rna酶的離心管中。加等體積異丙醇混合以沉淀其中的rna，混勻后15到30℃孵育10分鐘后，于4℃下12000rpm離心10分鐘。此時離心前不可見的rna沉淀將在管底部和側壁上形成膠狀沉淀塊。移去上清液，每1mltrizol試劑裂解的樣品中加入至少1ml的75％乙醇(75％乙醇用depch2o配制)，清洗rna沉淀?；靹蚝螅?℃下7000rpm離心5分鐘。rna干燥：小心吸去大部分乙醇溶液，使rna沉淀在室溫空氣中干燥5-10分鐘。溶解rna沉淀溶解rna時，先加入無rna酶的水40μl用槍反復吹打幾次，使其完全溶解，獲得的rna溶液保存于-80℃待用。

2)cdna合成在0.5ml的離心管中加入1ul模板總rna；2ul隨機引物；2ul10mmdntpmix；加水至15ul體系。混勻后70℃變性rna5分鐘，冰上速冷1分鐘，離心將溶液收集至管底加入6ul5×pcrbuffer；1ulrnaseout；1ulm-mlvrt；加水至30ul體系。pcr儀中反應條件設置37℃延伸60min，70℃保溫15min終止反應。合成好的cdna置于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

3)實時定量pcr按以下反應體系進行:2xrealqpcrmastermix(modifieddnapolymerase、sybrgreeni、optimizedpcrbuffer、5mmmgci2、dntpmixincludingdutp)25ul；上游引物f1ul，下游引物r1ul；cdnatemplate2ul。定量pcr儀擴增反應條件設置：50℃2min；95℃10min；95℃15s-60℃60s(40個循環(huán))。

實施例5sirna轉染

1)轉染前一天的準備工作：取對數生長期細胞經胰酶消化后計數。滅菌一次性六孔板一個，每個孔中滴加lxl05個細胞，并補加2ml含10％fbs的dmem，輕輕晃動培養(yǎng)皿使細胞密度均勻。在37℃，5％c02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。

2)轉染：100pmol(5u1)sirna分子和5ullipofectamine2000分別用245uldmem稀釋后，空白組只含5ullipofectamine2000，將稀釋好的lipofectamine2000分別加入到對應的稀釋好的sirna分子中，輕輕混合均勻后，于室溫下靜置20min，使形成sirna.lipofectamine2000復合物。取出培養(yǎng)皿，倒去舊的培養(yǎng)基，用pbs洗一次，各轉染組分別加入1500ul血清的dmem。然后分別加入對應的sirna分子復合物，十字方向晃動培養(yǎng)皿以使混合均勻，37℃，5％c02培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)6h。6h后結束轉染，棄去培養(yǎng)基，換成新鮮含10％fbs的高糖dmem，37℃，5％c02培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)48-72h。

本發(fā)明通過上述實驗及實施例進一步說明：由于辛伐他汀通過激活lkb1-ampk，從而激活perk，使eif2α磷酸化水平增高，抑制下游靶基因mcm7的翻譯，而下調mcm7的表達可以抑制hepg2.2.15細胞中hbv的復制。mcm7表達受到抑制很可能是辛伐他汀類抗病毒的機制。因此，mcm7是辛伐他汀藥物抑制乙肝病毒復制的作用靶點，進一步說明辛伐他汀能夠應用于制備以mcm7為靶標的藥物中；特別是辛伐他汀在制備以mcm7為靶標的抑制乙肝病毒的藥物中的應用；以及所述的辛伐他汀在制備以mcm7為靶標的抑制由hbv感染引起的原發(fā)性肝癌的藥物中的應用，并為臨床治療乙肝提供了新的有效方法。

本實施例沒有詳細敘述的部分和英文縮寫屬本行業(yè)的公知常識，在網上可以搜索到，這里不一一敘述。