本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，涉及一種獨(dú)特的小分子多肽在治療慢性腎臟病(CKD)中的用途，具體是涉及KP-6多肽在制備治療CKD藥物中的用途。

背景技術(shù)：

慢性腎臟病(CKD)最終進(jìn)展至終末期腎功能衰竭(ESRD)，患者終身依賴“腎臟替代治療”來維持生命。在過去的幾十年中，伴隨著人類社會(huì)的人口老齡化，CKD患病率呈現(xiàn)逐年上升趨勢(shì)(Nat Rev Nephrol,2011,7:684-696)。有資料表明，CKD正成為一種“公眾健康問題”，嚴(yán)重危害人類健康并消耗大量衛(wèi)生資源。然而，目前臨床上尚缺乏有效延緩CKD進(jìn)展的藥物。針對(duì)CKD的發(fā)病機(jī)制，尋找有效地抑制或延緩CKD進(jìn)展的藥物無疑是當(dāng)前腎臟病學(xué)界的當(dāng)務(wù)之急，成為亟待攻克的戰(zhàn)略重點(diǎn)之一。

腎臟纖維化是CKD的共同途經(jīng)，其特征是細(xì)胞外基質(zhì)過量表達(dá)和沉積，導(dǎo)致組織結(jié)構(gòu)損傷，疤痕形成，毛細(xì)血管丟失和組織缺氧，最終腎臟功能衰竭。大量研究表明，Wnt/β-catenin信號(hào)的持續(xù)激活是腎臟纖維化和CKD發(fā)生發(fā)展的一個(gè)關(guān)鍵途經(jīng)(Kidney Int Supple2014,4:84-90)。因此，尋找阻斷Wnt/β-catenin信號(hào)途經(jīng)的對(duì)策，對(duì)于抑制腎臟纖維化的發(fā)生發(fā)展具有重要的理論意義和臨床應(yīng)用價(jià)值。

Wnt的配體在體內(nèi)可以與不同的蛋白質(zhì)結(jié)合，從而調(diào)節(jié)其生物學(xué)活性。蛋白質(zhì)相互作用通常是通過特定的氨基酸序列所組成的結(jié)構(gòu)域完成的。本發(fā)明涉及通過篩選多肽文庫，發(fā)現(xiàn)一個(gè)特異的小分子多肽(KP-6)，能抑制腎臟纖維化的關(guān)鍵信號(hào)通路。KP-6多肽無前人報(bào)道，它在氨基酸序列結(jié)構(gòu)上與抗衰老蛋白klotho分子的一段序列同源。有文獻(xiàn)報(bào)道，klotho能結(jié)合Wnt配體，阻斷Wnt/β-catenin信號(hào)傳導(dǎo)(JAm SocNephrol.2013,24:771-785)，從而抑制腎臟纖維化，延緩慢性腎病進(jìn)展。

KP-6作為一種新穎的、有效的小分子多肽，抑制腎組織損傷和腎臟纖維化、延緩或/和逆轉(zhuǎn)慢性腎臟病的病程。

單側(cè)輸尿管結(jié)扎(UUO)是經(jīng)典的CKD動(dòng)物模型，其特點(diǎn)是可以快速完整地展示梗阻腎臟間質(zhì)纖維化不同病理階段和特征，包括炎細(xì)胞浸潤(rùn)、小管細(xì)胞的增殖和凋亡、肌成纖維細(xì)胞的活化、纖連蛋白(Fibronectin)和I型膠原(Collagen I)的沉積。缺血-再灌注(IRI)模型是經(jīng)典的急性腎損傷(AKI)向慢性腎臟病(CKD)進(jìn)展的模型。單側(cè)腎臟進(jìn)行缺血-再灌注(IRI)手術(shù)后10天，然后合并進(jìn)行對(duì)側(cè)腎臟的切除(UIRI)，能夠明顯展示慢性腎臟纖維化的病理過程，其造模方法簡(jiǎn)便易行，成功率高，且具備手術(shù)切口小、手術(shù)時(shí)間短及并發(fā)癥少的優(yōu)點(diǎn)，建立的模型適合于急性腎損傷向慢性腎纖維化進(jìn)展的研究。

在病理上，通常采用Masson染色，來觀察組織細(xì)胞外膠原蛋白沉積情況。而更具體的組織纖維化則常常應(yīng)用肌成纖維細(xì)胞的標(biāo)志α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-SMA)、纖連蛋白和I型膠原的免疫染色和免疫印跡方法(Western blotting)來定性、定量觀察和評(píng)估。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供小分子多肽(命名為KP-6)在制備治療慢性腎臟病的藥物中的用途。所述多肽KP-6的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

SEQ ID NO.1：QPVVTLYHWDLPQRLQDAYGGWANRALADH。

根據(jù)本發(fā)明所述的用途的進(jìn)一步特征，所制備的藥物包括：治療上有效的小分子多肽(命名為KP-6)，以及藥學(xué)上可接受的輔料。

本發(fā)明的目的還在于提供小分子多肽KP-6的衍生物在制備治療慢性腎臟病的藥物中的用途。

根據(jù)本發(fā)明所述的用途的進(jìn)一步特征，KP-6的衍生物包括：含有KP-6氨基酸序列的更短肽段、氨基酸替代后的KP-6相關(guān)多肽，以及化學(xué)修飾后的KP-6及其更短肽段。

本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)證明，小分子多肽(KP-6)在小鼠動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中無明顯毒副作用。發(fā)明人對(duì)KP-6進(jìn)行單側(cè)輸尿管梗阻(UUO)和單側(cè)缺血再灌注損傷(UIRI)腎病模型實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明：與UUO或UIRI模型組比較，KP-6組腎臟間質(zhì)膠原沉積顯著減少，α平滑肌肌動(dòng)蛋白、纖連蛋白均顯著降低，β連環(huán)蛋白(β-catenin)及其下游靶基因表達(dá)明顯下調(diào)，表明KP-6能拮抗Wnt/β-catenin信號(hào)通路，有效抑制UUO和UIRI腎臟組織纖維化。

綜上所述，KP-6具有顯著抑制腎臟組織纖維化和CKD進(jìn)展的作用，且無明顯毒副作用，因此可用于制備有效治療慢性腎臟病的藥物。

附圖說明

圖1是KP-6的篩選和鑒定。人腎小管上皮細(xì)胞(HKC-8)轉(zhuǎn)染W(wǎng)nt1質(zhì)粒之后，給予不同的小分子多肽處理。圖1中，A圖顯示第1到第6號(hào)小分子多肽對(duì)Wnt1表達(dá)后纖維化相關(guān)蛋白的拮抗作用；B圖第6號(hào)小分子多肽(KP-6)對(duì)TGF-β表達(dá)后纖維化相關(guān)蛋白的拮抗作用；C圖顯示KP-6的氨基酸序列。

圖2是UUO模型各組小鼠腎臟Masson染色圖。圖2中，左：假手術(shù)組；中：UUO模型組；右：UUO+KP-6。

圖3是UUO模型各組小鼠腎臟纖維化指標(biāo)的免疫染色圖。該圖中，Sham：假手術(shù)組；UUO：模型對(duì)照組；UUO+KP-6：用藥組。

圖4是UUO模型各組小鼠腎組織β-catenin及其下游靶基因蛋白水平的免疫印跡圖。其中，圖4A為免疫印跡檢測(cè)的代表性結(jié)果；圖4B為所有結(jié)果的統(tǒng)計(jì)圖。Sham：假手術(shù)組；UUO：模型對(duì)照組；UUO+KP-6：用藥組。

圖5是UIRI模型各組小鼠腎臟Masson染色圖。該圖中，左：假手術(shù)組；中：UIRI模型組；右：UIRI+KP-6。

圖6是UIRI模型各組小鼠腎臟纖維化指標(biāo)的免疫染色圖。該圖中，Sham：假手術(shù)組；UIRI：模型對(duì)照組；UIRI+KP-6：用藥組。

圖7是免疫印跡法檢測(cè)各組小鼠腎臟β-catenin及其下游靶基因蛋白水平。其中，圖7A為免疫印跡檢測(cè)的代表性結(jié)果；圖7B為所有結(jié)果的統(tǒng)計(jì)圖。

具體實(shí)施方式

下面僅以實(shí)施例的方式結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的說明。

實(shí)施例一：KP-6小分子多肽的篩選

1.實(shí)驗(yàn)材料：

細(xì)胞：人腎小管上皮細(xì)胞。

培養(yǎng)液：含10％FBS的DMEM/F129(1:1)培養(yǎng)液。

培養(yǎng)條件：37℃含5％CO₂培養(yǎng)箱。

小分子多肽文庫：由計(jì)算機(jī)設(shè)計(jì)產(chǎn)生18條多肽序列，平均每條長(zhǎng)度為30氨基酸，交由南京金斯瑞生物科技公司人工合成，建成小分子多肽文庫，進(jìn)行以下實(shí)驗(yàn)。

2.實(shí)驗(yàn)處理：

(I)將培養(yǎng)好的人腎小管上皮細(xì)胞以1.5×10⁶種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板，培養(yǎng)1天，饑餓24小時(shí)，提前1小時(shí)給予18種不同的小分子多肽(10μg/ml)。然后轉(zhuǎn)染W(wǎng)nt1質(zhì)粒，24小時(shí)后收取蛋白，進(jìn)行Western blot實(shí)驗(yàn)，篩選其中對(duì)Wnt1誘導(dǎo)纖連蛋白抑制最強(qiáng)的肽段。

(II)將培養(yǎng)好的人腎小管上皮細(xì)胞以1.5×10⁶種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板，培養(yǎng)1天，提前1小時(shí)給予肽段6號(hào)(KP-6)(10μg/ml)。然后，加入TGF-β(2ng/ml)刺激，24小時(shí)后收取蛋白，進(jìn)行Western blot實(shí)驗(yàn)。

3.實(shí)驗(yàn)結(jié)果

(I)實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖1A所示，部分小分子肽段能抑制Wnt1所介導(dǎo)的纖連蛋白(Fibronectin)和α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-SMA)的表達(dá)。其中第6肽段(命名為KP-6)抑制作用最強(qiáng)。

(II)如圖1B所示，KP-6能抑制TGF-β所引起的纖維化相關(guān)基因的表達(dá)。因此，KP-6作為一種新穎的小分子多肽，能拮抗Wnt和TGF-β活性，阻斷體內(nèi)關(guān)鍵的促纖維化信號(hào)通路，從而抑制纖維化相關(guān)蛋白的表達(dá)。

(III)KP-6的氨基酸序列

多肽KP-6的氨基酸序列為QPVVTLYHWDLPQRLQDAYGGWANRALADH(SEQ ID NO.1)。

實(shí)施例二：小分子多肽KP-6對(duì)小鼠UUO模型腎臟纖維化的抑制作用

1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：C57小鼠，雌雄匹配，體重20-22g，SPF級(jí)。

先將動(dòng)物稱重、編號(hào)，選擇健康、體重在20-22g的小鼠12只，隨機(jī)分為3組，每組4只。包括假手術(shù)組、模型對(duì)照組及用藥組。

2.實(shí)驗(yàn)分組

1)假手術(shù)組：室溫，3％戊巴比妥鈉以1ml/公斤體重麻醉小鼠后，選擇左側(cè)腹2-3cm為切口；局部消毒后，逐層切開皮膚、皮下、肌層及腹膜，發(fā)現(xiàn)左側(cè)輸尿管后，隨即逐層縫合。局部消毒后，核實(shí)標(biāo)記，置于相應(yīng)鼠籠。

2)模型對(duì)照組：同上麻醉、消毒。逐層切開皮膚、皮下、肌層及腹膜，找到左側(cè)輸尿管后，于輸尿管上1/3段結(jié)扎，逐層縫合。局部消毒后，核實(shí)標(biāo)記，置于相應(yīng)鼠籠。

3)用藥組：同上麻醉、消毒。逐層切開皮膚、皮下、肌層及腹膜，找到左側(cè)輸尿管后，于輸尿管上1/3段結(jié)扎，逐層縫合。局部消毒后，核實(shí)標(biāo)記，置于相應(yīng)鼠籠。

3.實(shí)驗(yàn)過程

KP-6水溶性的粉末用無菌的生理鹽水稀釋為25mg/ml的儲(chǔ)存濃度。實(shí)驗(yàn)各組分籠飼養(yǎng)。假手術(shù)組僅觀察。模型對(duì)照組僅給予生理鹽水尾靜脈注射。用藥組予以UUO開始后的連續(xù)6天以含有0.5mg/kg體重的KP-6的1ml生理鹽水尾靜脈注射。飼養(yǎng)7天后殺死各組小鼠，均取左側(cè)腎臟，分別予以10％中性緩沖甲醛固定及液氮冷凍組織。甲醛固定組織在經(jīng)脫水、包埋、切片、制片后，分別予以Masson染色及平滑肌肌動(dòng)蛋白α、纖連蛋白免疫染色。冰凍組織勻漿后提取蛋白，用免疫印跡法(Western Blot)檢測(cè)β-catenin及其靶基因表達(dá)水平。

4.實(shí)驗(yàn)結(jié)果

1)Masson染色檢測(cè)腎臟組織纖維化程度

(I)、KP-6減少UUO小鼠腎間質(zhì)膠原沉積

實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2所示，用藥組小鼠腎間質(zhì)膠原沉積明顯低于模型對(duì)照組。

(II)、KP-6減少UUO小鼠腎間質(zhì)纖維化

實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3所示，與模型對(duì)照組比較，用藥組小鼠腎間成纖維細(xì)胞特異性蛋白1(Fsp1)、平滑肌肌動(dòng)蛋白α(α-SMA)水平明顯降低。

(III)、KP-6抑制UUO小鼠的異?；罨摩?catenin信號(hào)通路

實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖4所示，與模型對(duì)照組比較，用藥組小鼠腎臟的β-catenin蛋白及其下游靶基因蛋白PAI-1和MMP-7明顯降低。

實(shí)施例三：小分子多肽KP-6對(duì)小鼠UIRI模型腎臟纖維化的抑制作用

1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：BABL/c小鼠，雄性，體重20-22g，SPF級(jí)。

先將動(dòng)物稱重、編號(hào)，選擇健康、體重在20-22g的小鼠18只，隨機(jī)分為3組，每組6只。包括生理鹽水組、模型對(duì)照組及用藥組。

2.實(shí)驗(yàn)各組

1)假手術(shù)組：室溫，3％戊巴比妥鈉以1ml/公斤體重麻醉小鼠后，選擇左側(cè)腹2-3cm為切口；局部消毒后，逐層切開皮膚、皮下、肌層及腹膜，發(fā)現(xiàn)左側(cè)腎蒂后隨即逐層縫合。局部消毒后，核實(shí)標(biāo)記，置于相應(yīng)鼠籠。

2)模型對(duì)照組：同上麻醉、消毒。逐層切開皮膚、皮下、肌層及腹膜，找到左側(cè)腎蒂后用無損傷微型動(dòng)脈夾迅速阻斷左側(cè)腎蒂，可見腎臟有鮮紅變成紫黑色，表示夾閉成功，將小鼠置于37度的金屬加熱板上，計(jì)時(shí)35分鐘，手術(shù)結(jié)束后逐層縫合。局部消毒后，核實(shí)標(biāo)記，置于相應(yīng)鼠籠。于術(shù)后第10天行右側(cè)腎切除，同上麻醉、消毒。行右側(cè)背部1-2cm切口，先結(jié)扎右側(cè)腎蒂，再切除右側(cè)腎，手術(shù)結(jié)束后逐層縫合。局部消毒后，核實(shí)標(biāo)記，置于相應(yīng)鼠籠。

3)用藥組：同上麻醉、消毒。逐層切開皮膚、皮下、肌層及腹膜，找到左側(cè)腎蒂后用無損傷微型動(dòng)脈夾迅速阻斷左側(cè)腎蒂，可見腎臟有鮮紅變成紫黑色，表示夾閉成功，將小鼠置于37度的金屬加熱板上，計(jì)時(shí)35分鐘，手術(shù)結(jié)束后逐層縫合。局部消毒后，核實(shí)標(biāo)記，置于相應(yīng)鼠籠。于術(shù)后第10天行右側(cè)腎切除，同上麻醉、消毒。行右側(cè)背部1-2cm切口，先結(jié)扎右側(cè)腎蒂，再切除右側(cè)腎，手術(shù)結(jié)束后逐層縫合。局部消毒后，核實(shí)標(biāo)記，置于相應(yīng)鼠籠。

3.實(shí)驗(yàn)過程

KP-6水溶性的粉末用無菌的生理鹽水稀釋為25mg/ml的儲(chǔ)存濃度。各組分籠飼養(yǎng)。假手術(shù)組僅觀察。模型對(duì)照組僅給予生理鹽水尾靜脈注射。用藥組予以缺血再灌注損傷開始后的連續(xù)10天以含有0.5mg/kg體重的KP-6的1ml生理鹽水尾靜脈注射。飼養(yǎng)第11天殺死各組小鼠，收集血標(biāo)本，均取左側(cè)腎臟，分別予以10％中性緩沖甲醛固定及液氮冷凍組織。甲醛固定組織在經(jīng)脫水、包埋、切片、制片后，分別予以Masson染色及平滑肌肌動(dòng)蛋白α、纖連蛋白免疫染色。冰凍組織勻漿后提取蛋白，用免疫印跡法(Western Blot)檢測(cè)β-catenin及其靶基因表達(dá)水平。

4.實(shí)驗(yàn)結(jié)果

1)Masson染色檢測(cè)腎臟組織纖維化程度

(I)、KP-6減少UIRI小鼠腎間質(zhì)膠原沉積

實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖5所示，用藥組小鼠腎間質(zhì)膠原沉積明顯低于模型對(duì)照組。

(II)、KP-6減少UIRI小鼠腎間質(zhì)纖維化

實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖6所示，與模型對(duì)照組比較，用藥組小鼠腎組織成纖維細(xì)胞特異性蛋白1、平滑肌肌動(dòng)蛋白α、纖連蛋白水平明顯降低。

(III)、KP-6抑制UIRI小鼠的異?；罨摩?catenin信號(hào)通路

實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖7所示，與模型對(duì)照組比較，用藥組小鼠腎臟的β-catenin蛋白及其下游靶基因蛋白PAI-1和Snail明顯降低。

綜上所述，KP-6可以明顯減少UUO、UIRI小鼠腎間質(zhì)膠原蛋白沉積，顯著降低UUO、UIRI小鼠腎組織纖連蛋白、I型膠原α-SMA表達(dá)水平，并可以明顯抑制CKD模型中的異?；罨摩?catenin信號(hào)通路。因此，KP-6可以成為有效抑制CKD進(jìn)展的新藥。

SEQUENCE LISTING

<110> 南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院

<120> 小分子多肽KP-6在制備治療慢性腎臟病的藥物中的用途

<130>

<160> 1

<170> PatentIn version 3.4

<210> 1

<211> 30

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 1

Gln Pro Val Val Thr Leu Tyr His Trp Asp Leu Pro Gln Arg Leu Gln

1 5 10 15

Asp Ala Tyr Gly Gly Trp Ala Asn Arg Ala Leu Ala Asp His

20 25 30