本發(fā)明屬于生物制藥領(lǐng)域，更具體地講，涉及胃泌素在制備診斷和治療乳腺癌藥物中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，嚴(yán)重影響女性的生活質(zhì)量[1]。乳腺癌根據(jù)不同標(biāo)準(zhǔn)有不同的分型，如根據(jù)不同受體表達(dá)情況可分為her2+,her2-,三陰性等。當(dāng)前對于乳腺癌的病因尚未完全明了，臨床上治療乳腺癌的方法有手術(shù)、化療、內(nèi)分泌等，但都有一定的局限性。因此闡明乳腺癌發(fā)病的分子機(jī)制，研發(fā)新的靶向治療藥物，探索新的治療方案將成為今后乳腺癌治療的主要方向。

胃泌素作為最早發(fā)現(xiàn)的胃腸激素之一，是一種多肽激素，由位于胃竇、十二指腸和上段空腸的g細(xì)胞分泌，此外，人胰島中的d細(xì)胞也能分泌胃泌素[2]，主要調(diào)節(jié)胃酸分泌及營養(yǎng)胃黏膜。胃泌素包括g-17、g-34兩種，其中g(shù)-17是胃泌素的主要形式，也是膳食后胃泌素存在于血液循環(huán)中的主要形式[3]。g-17活性最高，約為g-34的5倍[4,5]，而g-34則主要存在于血液，其分解成g-17才能發(fā)揮生理功能。本實驗以g-17作為試劑，以期更接近并反映胃泌素的生物學(xué)作用規(guī)律。胃泌素受體，又稱縮膽囊素b受體(cholecystokininbreceptor,cckbr)，它屬于g蛋白偶聯(lián)受體(g-proteincoupledreceptors，gpcrs)家族，是一個七次跨膜蛋白。cckbr主要分布在胃粘膜的壁細(xì)胞和ecl細(xì)胞中[6,7]。胃泌素主要通過與細(xì)胞膜上的cckbr特異性結(jié)合啟動下游信號通路發(fā)揮作用[8]。研究表明，胃泌素不僅具有刺激胃酸分泌及營養(yǎng)胃腸粘膜的作用，而且還影響胃腸腫瘤的增殖[9]，但是對于胃泌素與惡性腫瘤之間的關(guān)系目前還存在著許多爭議。部分研究認(rèn)為胃泌素是重要的促癌激素，可以通過上調(diào)reg1蛋白等促進(jìn)胃泌素受體陽性的癌細(xì)胞增長[10-12]。也有研究發(fā)現(xiàn)胃泌素可以通過抑制colo320細(xì)胞內(nèi)nf-κb的活性來有效抑制結(jié)腸腫瘤的增殖[13-15]。本課題組的早期研究發(fā)現(xiàn)胃癌組織中胃泌素的表達(dá)水平低于癌旁組織[16]，胃癌患者的血清胃泌素水平與其腫瘤直徑成負(fù)相關(guān)，并通過體外及體內(nèi)實驗證實胃泌素能有效抑制胃癌細(xì)胞的增殖。此外，近年來本課題組研究發(fā)現(xiàn)胃泌素，曲妥珠單抗在her2陽性及陰性的胃癌細(xì)胞中通過上調(diào)cckbr均有抗腫瘤作用[17]，這為我們的研究提供了思路。

歐陽可棟等人的“胃泌素釋放肽dna疫苗抑制emt6乳腺癌生長的實驗研究”[18]觀察胃泌素釋放肽(grp)dna疫苗對emt6小鼠乳腺癌生長的抑制作用，胃泌素釋放肽和胃泌素是不同的兩個物質(zhì)，具有完全不相同的蛋白序列。

胃泌素釋放肽，英文全稱gastrin-releasingpeptide(grp)，在胰腺表達(dá)最豐富，其次在胃、腎上腺皮質(zhì)和腦都有表達(dá)。胃泌素釋放肽與grp受體(grpr)結(jié)合，調(diào)節(jié)中樞神經(jīng)系統(tǒng)和胃腸等臟器的許多功能，包括胃腸道激素的釋放(胃泌素gastrin屬于其中一種)，平滑肌細(xì)胞收縮，上皮細(xì)胞增殖和腫瘤組織。也就是說胃泌素釋放肽作用很廣，其中一個作用是刺激胃竇部及十二指腸近端黏膜中g(shù)細(xì)胞分泌釋放胃泌素。胃泌素釋放肽在乳腺癌中的應(yīng)用，主要是該肽的受體gastrin-releasingpeptidereceptor(grpr)在腫瘤組織的表達(dá)，通過胃泌素釋放肽疫苗激活機(jī)體免疫反應(yīng)，而我們的技術(shù)是研究直接運用胃泌素治療乳腺癌，是兩個不同概念。

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技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供胃泌素在制備診斷和治療乳腺癌藥物中的應(yīng)用。

為實現(xiàn)以上目的，本發(fā)明公開以下技術(shù)方案：胃泌素在制備診斷和治療乳腺癌藥物中的應(yīng)用。

作為一個優(yōu)選方案，所述胃泌素是指胃泌素全序列、活性形式17肽和活性形式34肽中的一種或幾種。

作為一個優(yōu)選方案，所述乳腺癌是指具有胃泌素受體cckbr的乳腺癌。

本發(fā)明的優(yōu)點在于：我們發(fā)現(xiàn)胃泌素在乳腺癌細(xì)胞系mcf-7、t47d中均有抗腫瘤作用，體內(nèi)實驗亦進(jìn)一步證實該作用，其分子機(jī)制考慮為胃泌素通過上調(diào)cckbr蛋白豐度，上調(diào)的cckbr受體與胃泌素相結(jié)合啟動并放大對下游信號分子的影響是胃泌素抗腫瘤增殖的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。本發(fā)明為闡明乳腺癌發(fā)病分子機(jī)制，研發(fā)新的靶向治療藥物，探索乳腺癌新的治療方案提供方向。

附圖說明

圖1不同乳腺癌細(xì)胞株中cckbr蛋白的表達(dá)情況。

圖2乳腺癌組織中cckbr蛋白的表達(dá)情況。

圖3胃泌素對乳腺癌細(xì)胞的增殖抑制作用。

圖4胃泌素在mcf-7、t47d中上調(diào)cckbr蛋白豐度。

圖5胃泌素在mcf-7、t47d中上調(diào)erk，p65蛋白豐度。

圖6胃泌素抑制裸鼠胃癌荷瘤增殖。

圖7胃泌素促進(jìn)荷瘤組織的cckbr表達(dá)。

圖8胃泌素影響裸鼠荷瘤組織蛋白p-erk，p-p65表達(dá)。

圖9乳腺癌患者血中胃泌素水平。

具體實施方式

下面結(jié)合具體實施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。應(yīng)理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。

實施例1.

1材料與方法

1.1實驗材料、試劑

(1)細(xì)胞株：mcf-7、t47d、mdamb231三種乳腺癌細(xì)胞株

(2)胎牛血清(gibcobrl,gaithersburg,md,usa)

(3)dmem培養(yǎng)基(hyclone,logan,ut,usa)

(4)penicillinstreptomycin(invitrogen,ca,usa)

(5)0.25％trypsin-edta(gibco,lifetechnologies,usa)

(6)樺木酸(betulinicacid,biovision,mountainview,ca,usa)

(7)parthenolide(santacruzbiotechnology,santacruz,ca,usa)

(8)兔抗p65、兔抗p-p65、兔抗erk及p-erk抗體(cellsignalingtechnology,

everly,ma,usa)

(9)鼠抗vinculin抗體(abcam,cambridge,uk)

(10)hrp-兔二抗、鼠二抗(sigmachemicalco.,st.louis,mo,usa)

(11)即用型免疫組織化學(xué)超敏ultrasensitivetmsp試劑盒、dab顯色試劑盒(福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司，中國)

(12)蛋白酶抑制劑(sigmachemicalco.,st.louis,mo,usa)

(13)胃泌素(gastrin)(強(qiáng)耀生物，上海，中國)

(14)脂多糖(lps)(sigmachemicalco.,st.louis,mo,usa)

(15)pd98059(sigmachemicalco.,st.louis,mo,usa)

(16)快捷型羊抗兔/鼠通用二抗(邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司，福建，中國)

(17)ripa裂解液(碧云天生物技術(shù)研究所，江蘇，中國)

(18)2×rnaloadingdye(fermentasins,burlington,canada)

1.2主要儀器設(shè)備

(1)co2細(xì)胞培養(yǎng)箱(thermofisherscientific,usa)

(2)細(xì)胞超凈工作臺(thermofisherscientific,usa)

(3)恒溫?fù)u床(forma,milford,ma)

(4)低溫高速離心機(jī)(eppendorf,germany)

(5)全自動包埋機(jī)(leica,wetzlar,germany)

(6)石蠟切片機(jī)(leica,wetzlar,germany)

(7)普通光學(xué)顯微鏡(olympus,tokyo,japan)

(8)電泳槽、轉(zhuǎn)膜槽(bio-rad,usa)

(9)隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱(上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠，中國)

(10)電熱恒溫水浴鍋(上海精宏實驗設(shè)備有限公司，中國)

(11)milli-q超純水純化系統(tǒng)(merckmillipore,usa)

(12)ph計(cyberscan,usa)

(13)fluorcheme掃膜儀(cellbiosciences,usa)

(14)低溫冰箱(sany,japan)

(15)酶標(biāo)儀(thermo,usa)

1.3主要試劑配制

1.3.1常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)液：

dmem培養(yǎng)液：dmem+10％胎牛血清

1.3.2細(xì)胞凍存液：

90％胎牛血清+10％dmso

1.3.3蛋白轉(zhuǎn)膜緩沖液：

稱取trisbase3.04g，甘氨酸14.4g，加雙蒸水600ml溶解，再加甲醇200ml，最后量筒定容至1l，4℃冷藏保存。

1.3.4sds-page電泳緩沖液：

稱取trisbase3.03g，甘氨酸18.77g，sds1g，加雙蒸水溶解，量筒定容至1l。

1.3.5tbst(tris-bufferedsalineandtween-20)：

秤取nacll8g，1mtris-hcl(ph7.6)20ml及tween-201ml，加雙蒸水量筒定容至1l。

1.3.6westernblot封閉液：

用tbst和光明脫脂奶粉配成10％(w/v)westernblot封閉液(例：50mltbst+5.0g脫脂奶粉)。

1.3.7westernblot清洗液

用tbst和光明脫脂奶粉配2％(w/v)westernblot清洗液(例：100mltbst+2.0g脫脂奶粉)。

1.3.8抗原修復(fù)緩沖液的配制：

(1)檸檬酸鹽儲存液的配制：

0.1m檸檬酸緩沖液a：每升含檸檬酸21g；

0.1m檸檬酸鈉緩沖液b：每升含檸檬酸鈉29.4g。

(2)檸檬酸鹽工作液的配制：

0.01m檸檬酸鹽緩沖液(ph6.0)：每升含a液19ml、b液81ml，加蒸餾水溶解，調(diào)ph值至6.0，量筒滴定至1l。

1.4細(xì)胞復(fù)蘇

(1)將-80℃冰箱中凍存的細(xì)胞凍存管于42℃水浴中迅速圓周式搖晃，盡量于1分鐘內(nèi)融化凍存管中細(xì)胞液；

(2)凍存管口酒精燈火焰滅菌后，將細(xì)胞液移入無菌的15ml離心管中，800rpm，室溫(roomtemperature，rt)，離心5min，可見細(xì)胞團(tuán)塊沉積在管底；

(3)棄去上清，加入4ml1×pbs緩沖液(ph7.4)，輕輕吹打混勻后，800rpm，rt，離心5min；

(4)棄去上清，用2mldmem培養(yǎng)基(含10％胎牛血清)吹打成單懸的懸浮細(xì)胞，將細(xì)胞液轉(zhuǎn)移到細(xì)胞培養(yǎng)皿中，加入10ml培養(yǎng)基，于含5％co2和95％o2混合氣體的37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.5細(xì)胞培養(yǎng)

(1)細(xì)胞于dmem培養(yǎng)基(含10％胎牛血清)中常規(guī)培養(yǎng)，孵育在含5％co2和95％o2混合氣體的37℃培養(yǎng)箱里；

(2)根據(jù)細(xì)胞倍增時間的不同給予不同的處理，平均每2-3天傳代一次，以保持細(xì)胞一直處于對數(shù)生長期；

(3)培養(yǎng)的細(xì)胞在實驗期間進(jìn)行支原體檢測，結(jié)果均為陰性；經(jīng)臺盼藍(lán)染色分析細(xì)胞活力保持在90％以上。

1.6細(xì)胞傳代

(1)取擬傳代的細(xì)胞，棄去培養(yǎng)液，加入1×pbs緩沖液(ph7.4)輕輕搖晃漂洗細(xì)胞表面，共2次，以去除培養(yǎng)基中的血清成分對胰酶消化細(xì)胞能力的影響；

(2)棄去1×pbs緩沖液(ph7.4)，加入適量的胰酶(0.25％trypsin-edta)，在含5％co2和95％o2混合氣體的37℃培養(yǎng)箱中孵育數(shù)分鐘；

(3)倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，待細(xì)胞失去原有形態(tài)，變小變圓，呈透亮狀，處于半貼壁狀態(tài)未脫落時，考慮消化良好，棄去胰酶，加入適量培養(yǎng)基終止消化反應(yīng)；

(4)用1ml槍頭輕柔吹打細(xì)胞至單懸，將細(xì)胞分入其他培養(yǎng)皿中(通常為1:2或1：3傳代)，并加入足量培養(yǎng)基后置于培養(yǎng)箱內(nèi)，完成細(xì)胞傳代。

1.7細(xì)胞凍存

(1)需要凍存的細(xì)胞，應(yīng)保持其處于細(xì)胞對數(shù)生長期，活力在90％以上；

(2)當(dāng)細(xì)胞培養(yǎng)至匯合率90％-95％時，棄掉培養(yǎng)液，用預(yù)熱的1×pbs緩沖液(ph7.4)清洗細(xì)胞2遍，加入適量胰酶消化細(xì)胞；

(3)將消化后的細(xì)胞移入無菌的15ml離心管中，800rpm，rt，離心5min，細(xì)胞沉積在管底；

(4)棄去上清，用預(yù)熱的1×pbs緩沖液(ph7.4)清洗細(xì)胞，800rpm，rt，離心5min；

(5)棄去上清，加入1ml細(xì)胞凍存液，輕柔吹打細(xì)胞至單細(xì)胞懸液后移入凍存管中，詳細(xì)標(biāo)記凍存細(xì)胞的名稱、來源、凍存日期等，于-20℃冰箱放置30分鐘后轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱放置過夜，最后移入液氮罐中長期保存。

1.8細(xì)胞計數(shù)實驗

將處于對數(shù)增長期的乳腺癌細(xì)胞mcf-7，t47d，231設(shè)置成對照組、胃泌素組分別種板3000個/孔于96孔板中，每組設(shè)置3個復(fù)孔，24小時細(xì)胞貼壁后根據(jù)需要予以不同濃度藥物處理，日給藥一次，連續(xù)7日每日進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)

1.9蛋白質(zhì)印跡法

蛋白印跡實驗(westernblot)沿用已有的實驗方法，具體步驟如下：

(1)收蛋白：取對數(shù)生長期的細(xì)胞，經(jīng)預(yù)冷的1×pbs緩沖液(ph7.4)清洗兩次，根據(jù)細(xì)胞密度加入適量的含dtt的2×sds蛋白裂解液，用槍頭充分混勻，徹底裂解蛋白，吸取細(xì)胞蛋白收集到1.5mlep管中，置于冰上30min，使蛋白充分裂解；

(2)蛋白變性：type17600dri-bath溫度調(diào)節(jié)至95℃，將收有細(xì)胞蛋白的ep管置于金屬浴鍋內(nèi)煮10min，冰上放置10min，重復(fù)兩次，使蛋白徹底變性；

(3)提取蛋白上清：蛋白再經(jīng)95℃煮10min后，12,000rpm，rt，離心5min，棄沉淀，將蛋白上清移入另一干凈的ep管中；

(4)蛋白定量：蛋白經(jīng)bca法測濃度進(jìn)行定量，用sds配制成一樣的體積、一樣的總量后后分裝保存在-80℃；

(5)配膠：根據(jù)目的蛋白分子量大小，配制相應(yīng)的6％～12％的十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠(sds-page)，通過電泳進(jìn)行蛋白分離；

(6)蛋白上樣：將分裝的蛋白從-80℃取出，于95℃金屬浴鍋內(nèi)煮10min，將樣品加入凝膠孔內(nèi)，同時每孔加入1ul溴酚藍(lán)示蹤；

(7)電泳：完成上樣后，首先用80v電壓進(jìn)行電泳至溴酚藍(lán)示蹤條帶至分離膠時變換電壓為120v，直至溴酚藍(lán)示蹤條帶到達(dá)電泳槽底部時，終止電泳；

(8)轉(zhuǎn)膜：取出電泳膠，去除積層膠后在預(yù)冷的轉(zhuǎn)膜液中進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，將含有蛋白質(zhì)的分離膠平放在westernblot專用三明治式轉(zhuǎn)膜夾中夾緊，安放順序由負(fù)極至正極依次為黑板、海綿、濾紙、分離膠、硝酸纖維素膜(nitrocellulosemembrane,nc膜)、濾紙、海綿及白板；轉(zhuǎn)膜采用濕轉(zhuǎn)法，根據(jù)實驗要求選擇恒流300ma或恒壓100v，轉(zhuǎn)膜時間根據(jù)蛋白質(zhì)分子量設(shè)定為60至100min，將蛋白轉(zhuǎn)移至nc膜上；

(9)麗春紅染色：轉(zhuǎn)膜結(jié)束后取出nc膜，將與分離膠接觸的一面朝上，剪右上角作為標(biāo)記，用tbst將nc膜漂洗一次置于抗體孵育盒中，麗春紅染色大致評估蛋白電泳、轉(zhuǎn)膜及蛋白定量情況；

(10)漂洗：用tbst快速漂洗nc膜3次，將麗春紅洗凈，然后將抗體孵育盒置于360度搖床上，用tbst漂洗nc膜約10min，充分洗滌至麗春紅染色褪盡；

(11)封閉：漂洗后的nc膜孵育在westernblot封閉液(tbst配制10％脫脂奶粉)中，水平搖床上室溫孵育1小時，以封閉nc膜上的非特異性結(jié)合位點；

(12)孵育一抗：結(jié)束封閉后，將nc膜孵育在用westernblot洗滌液配制的與目的蛋白相應(yīng)的一抗中，水平搖床，rt，孵育2h，或者4℃孵育過夜；

(13)洗滌：一抗孵育結(jié)束后，tbst快速漂洗nc膜3次，然后置于360度搖床上再用westernblot洗滌液(tbst配制的2％脫脂奶粉)洗滌3次，室溫，每次10min；

(14)孵育二抗：充分洗滌殘余的一抗后，將nc膜置相應(yīng)的hrp標(biāo)記的二抗中，rt，孵育1h；

(15)洗滌：二抗孵育結(jié)束后，westernblot洗滌液(tbst配制的2％脫脂奶粉)快速漂洗nc膜3次，然后置于360度搖床上再次洗滌3次，rt，每次10min；

(16)顯像：將洗滌后的nc膜用immobilonwesternchemilminescenthrpsubstrate試劑進(jìn)行顯影，抗原抗體復(fù)合物與顯影劑結(jié)合，可在凝膠成像儀上顯像。

1.10免疫組織化學(xué)染色分析

全部標(biāo)本經(jīng)10％福爾馬林常規(guī)固定，石蠟包埋處理，切成4μm組織切片，具體免疫組織化學(xué)染色實驗參照已有的實驗方法，具體步驟如下：

(1)烤片：組織切片置入60℃恒溫烤箱中烘烤30過夜；

(2)脫蠟：切片在45℃二甲苯i中放置20min，二甲苯ii中放置30min；

(3)水化：將切片依次放入100％乙醇i、100％乙醇ii、95％乙醇i和95％乙醇ii中，各2min；

(4)取出切片，用自來水沖洗殘留乙醇后于自來水中靜置1min，換單蒸水靜置1min；

(5)抗原修復(fù)：將切片置修復(fù)盒中，加入抗原修復(fù)液(檸檬酸鹽緩沖液)，蓋好盒蓋，微波爐加熱90℃3min至緩沖液沸騰，再以60℃維持12min；

(6)取出抗原修復(fù)盒，打開盒蓋，于室溫下靜置抗原修復(fù)液，一直到溫度下降至室溫為止；

(7)棄去抗原修復(fù)液，將切片移入染色缸內(nèi)，加入1×pbs緩沖液(ph7.4)，溫和沖洗切片3次，每次5min；

(8)棄去pbs，加入新鮮配制的3％雙氧水，室溫下孵育10min，以去除內(nèi)源性過氧化物酶的影響；

(9)棄去3％雙氧水，用1×pbs緩沖液(ph7.4)溫和沖洗切片3次，每次5min；

(10)將切片移入濕盒中，切片上滴加5％bsa(雙蒸水配制)，室溫孵育30min，封閉非特異性結(jié)合位點；

(11)棄去5％bsa，直接在切片組織上滴加由5％bsa稀釋的一抗，37℃孵育1h，或4℃孵育過夜；

(12)一抗孵育完成后，用1×pbs緩沖液(ph7.4)溫和沖洗切片3次，每次10min；

(13)棄去1×pbs緩沖液(ph7.4)，在切片組織上滴加hrp標(biāo)記的二抗，室溫孵育15min；

(14)二抗孵育完成后，用1×pbs緩沖液(ph7.4)溫和沖洗切片3次，每次10min；

(15)用新鮮配置的二氨基聯(lián)苯胺溶液(dab)室溫孵育顯色，顯微鏡下觀察顯色情況；

(16)雙蒸水沖洗切片，去除殘留的dab；

(17)將切片移入染色缸內(nèi)，用蘇木素染液進(jìn)行細(xì)胞核的復(fù)染，室溫下放置1min；

(18)回收蘇木素染液，以自來水沖洗切片數(shù)次，去除殘留的蘇木素，在50℃到60℃的自來水中靜置5-10min，進(jìn)行反藍(lán)；

(19)反藍(lán)完成后，用自來水洗切片，再依次經(jīng)過95％乙醇i、95％乙醇ii、100％乙醇i、100％乙醇ii進(jìn)行切片脫水，各1min，室溫下徹底晾干；

(20)晾干的切片在二甲苯i、二甲苯ii中各放置5min，進(jìn)行切片透明，晾干；

(21)最后在切片樣本上滴加中性樹膠封片，后置光學(xué)顯微鏡下觀察；

(22)結(jié)果判斷：棕黑色染色顆粒為陽性表達(dá)。

1.11藥物干預(yù)裸鼠荷瘤增殖實驗

本研究實驗用鼠均為雌性balb/c裸鼠(約4～6周)，體重16～18g，均購自中國科學(xué)院上海實驗動物中心，動物飼養(yǎng)在本校實驗動物中心spf級實驗室內(nèi)，實驗設(shè)計及操作遵守上海交通大學(xué)實驗動物中心和動物倫理委員會的相關(guān)規(guī)定與要求。

用一次性無菌注射器在裸鼠的左、右脂肪墊接種mcf-7細(xì)胞約5×10⁶個，并將裸鼠隨機(jī)分成2組，分別為對照組、胃泌素組。每組各5只；在細(xì)胞種植15日后，腫瘤體積達(dá)到約100-200mm³，從即日起給藥，對照組0.9％nacl100ul/次，日1次尾靜脈注射；胃泌素組予以胃泌素2mg/kg，日1次尾靜脈注射，以上均給藥2周。給藥當(dāng)天設(shè)為d0；每周2次測量移植瘤的長徑和短徑，按照下面的公式計算腫瘤體積：腫瘤體積(mm³)＝長(mm)×寬2(mm)/2；在d28給予裸鼠過量麻醉處死，取出荷瘤分別稱重記錄，并將腫瘤切成厚度為4mm的薄片，部分以福爾馬林固定，部分以液氮凍存，用于后續(xù)實驗。

2結(jié)果

2.1cckbr受體在乳腺癌細(xì)胞中的表達(dá)

本研究對3種乳腺癌細(xì)胞株提取蛋白進(jìn)行了cckbr蛋白的westernblot檢測.結(jié)果在mcf-7和t47d中均有cckbr的表達(dá)，而在231中cckbr表達(dá)極低，圖1為不同乳腺癌細(xì)胞株中cckbr蛋白的表達(dá)情況。

2.2cckbr受體在乳腺癌組織中的表達(dá)

本研究對20例乳腺癌患者的組織進(jìn)行免疫組化檢測cckbr蛋白的表達(dá)情況。結(jié)果顯示在這些患者的組織中cckbr蛋白普遍表達(dá)。圖2為乳腺癌組織中cckbr蛋白的表達(dá)情況。

2.3胃泌素對乳腺癌細(xì)胞增殖的影響

將胃泌素分別應(yīng)用于mcf-7，t47d及mdamb231細(xì)胞，日給藥一次，連續(xù)7天，每天進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)。結(jié)果顯示在mcf-7和t47d中胃泌素處理后腫瘤細(xì)胞數(shù)目較對照組明顯減少(*p<0.05，與對照組相比較，n＝3)，但對231沒有抑制作用。圖3為胃泌素對乳腺癌細(xì)胞的增殖抑制作用。

2.4胃泌素對cckbr蛋白水平的影響

將胃泌素10^-7m分別作用于mcf-7、t47d細(xì)胞，日一次給藥，共3日，然后分別于給藥后1d、3d、5d收取細(xì)胞提取蛋白做western-blot檢測cckbr蛋白，結(jié)果顯示mcf-7在胃泌素給藥后1d即可明顯上調(diào)cckbr蛋白豐度，并隨著給藥次數(shù)的增多及時間的延長仍保持高豐度并呈明顯持續(xù)上調(diào)趨勢；而t47d細(xì)胞在胃泌素給藥后1dcckbr蛋白豐度開始增加，并隨著給藥次數(shù)及時間的延長呈逐漸升高趨勢。而且mcf-7細(xì)胞中cckbr上升的速度明顯快于t47d細(xì)胞。圖4為胃泌素在mcf-7、t47d中上調(diào)cckbr蛋白豐度。

2.5胃泌素上調(diào)erk，p65蛋白表達(dá)

將胃泌素10^-7m分別作用于mcf-7、t47d細(xì)胞，日一次給藥，共3日，然后分別于給藥后0d、1d、2d、3d收取細(xì)胞提取蛋白做western-blot檢測erk，p65蛋白，結(jié)果顯示mcf-7在胃泌素給藥后1d即可明顯上調(diào)cckbr蛋白豐度，并隨著給藥次數(shù)的增多及時間的延長仍保持高豐度并呈明顯持續(xù)上調(diào)趨勢；而t47d細(xì)胞在胃泌素給藥后1dcckbr蛋白豐度開始增加，并隨著給藥次數(shù)及時間的延長呈逐漸升高趨勢。而且mcf-7細(xì)胞中cckbr上升的速度明顯快于t47d細(xì)胞。圖5為胃泌素在mcf-7、t47d中上調(diào)erk，p65蛋白豐度。

2.6胃泌素在體內(nèi)實驗中的抗腫瘤作用

2.6.1胃泌素在裸鼠荷瘤模型中抑制腫瘤增殖

取平均6周齡的balb/c裸鼠于兩側(cè)脂肪墊分別注射5×10⁶個mcf-7細(xì)胞，建造裸鼠荷瘤模型。在裸鼠注射腫瘤細(xì)胞后隨機(jī)將裸鼠分為2組，即對照組、胃泌素組，接種腫瘤細(xì)胞約15日后，裸鼠腋下腫瘤生長至100-200mm³后開始予以藥物處理，對照組0.9％nacl100ul/次，日1次尾靜脈注射，胃泌素2mg/kg，日1次尾靜脈注射，共給藥2周。通過測量荷瘤大小來計算腫瘤生長率，腫瘤體積＝長×寬²/2。結(jié)果顯示在給藥2周后開始各組荷瘤生長曲線出現(xiàn)分離，到給藥2周時胃泌素組荷瘤平均大小明顯低于對照組(p<0.05)，證實二者在體內(nèi)確實亦有抗腫瘤作用。并取腫瘤拍照稱重。圖6為胃泌素抑制裸鼠胃癌荷瘤增殖。

2.6.2胃泌素促進(jìn)裸鼠荷瘤組織的cckbr蛋白的表達(dá)

圖7為胃泌素促進(jìn)荷瘤組織的cckbr表達(dá)。

2.6.3胃泌素通過影響cckbr的下游信號通路抑制腫瘤增殖

取荷瘤組織提取蛋白進(jìn)行了相關(guān)蛋白如erk，p65等的westernblot檢測，結(jié)果顯示在荷瘤組織中胃泌素可上調(diào)蛋白豐度，此與細(xì)胞實驗結(jié)果相一致，進(jìn)一步支持了我們的假說。圖8為胃泌素影響裸鼠荷瘤組織蛋白p-erk,p-p65表達(dá)。

綜合以上實驗，我們發(fā)現(xiàn)胃泌素在mcf-7、t47d中均有抗腫瘤作用，體內(nèi)實驗亦進(jìn)一步證實該作用。其分子機(jī)制考慮為胃泌素通過上調(diào)cckbr蛋白豐度，上調(diào)的cckbr受體與胃泌素相結(jié)合啟動并放大對下游信號分子的影響是胃泌素抗腫瘤增殖的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。

2.9臨床患者胃泌素水平檢測

體內(nèi)體外實驗證實胃泌素能夠抑制mcf-7、t47d兩種乳腺癌細(xì)胞系。分析其分子特征均為her2陰性，er和或pr陽性。我們收集了38例此類型乳腺癌患者的血清以及15例正常人的血清，通過elisa檢測兩組胃泌素水平。結(jié)果顯示這類乳腺癌患者的血中胃泌素水平普遍低于正常人。圖9為乳腺癌患者血中胃泌素水平。

我們用胃泌素處理乳腺癌細(xì)胞mcf-7和t47d，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞株mcf-7和t47d的增殖得到了抑制，通過westernblot檢測發(fā)現(xiàn)上調(diào)了cckbr，磷酸化的erk和磷酸化的p65。此結(jié)果在動物預(yù)實驗上也得到了初步驗證。其確切機(jī)制還需要接下來的進(jìn)一步驗證及探究。mcf-7和t47d均為her2陰性，er和或pr陽性，根據(jù)此分子特征，我們收集了38例臨床乳腺癌患者的血清及15例正常人的血清，通過elisa檢測其血清胃泌素水平，發(fā)現(xiàn)此類型患者血清胃泌素水平低于正常人水平。此外，我們還發(fā)現(xiàn)這些胃泌素水平低的患者中25例主訴有胃病史或者胃鏡檢查有胃病。據(jù)此，我們推測胃泌素水平低是乳腺癌發(fā)病的一個風(fēng)險因素。

以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和潤飾，這些改進(jìn)和潤飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。