本申請是申請?zhí)枮?01080063307.6的中國專利申請的分案申請，原申請是2010年12月8日提交的pct國際申請pct/us2010/059450于2012年8月7日進入中國國家階段的申請。

本發(fā)明涉及逆轉免疫抑制的方法。特別地，本發(fā)明涉及逆轉人乳頭瘤病毒(humanpapillomavirus，hpv)的免疫抑制以及治療hpv感染。

背景技術：

人乳頭瘤病毒(hpv)是性傳播的dna病毒家族，其具有超過100種不同的基因型?；谒鼈兯l(fā)的病變譜，所述基因型分為低風險型和高風險型。低風險型主要誘導良性生殖道濕疣和低級別鱗狀上皮內(nèi)病變(low-gradesquamousintraepitheliallesion)，而高風險型與肛門生殖器癌的發(fā)生有關并且可以在＞99％的子宮頸癌中檢測到(其中在約50％的病例中發(fā)現(xiàn)hpv16)。在美國，估計有75％的性活躍人群在其一生中染上至少一種生殖器hpv類型。

盡管通過有效的帕帕尼古拉烏(papanicolaou，pap))涂片篩查、早期檢測和治療可以使由子宮頸癌導致的發(fā)病率和死亡率降低，然而在美國很多移民所來源的發(fā)展中國家中，這些措施均不易獲得。在發(fā)展中國家中，子宮頸癌仍是婦女中癌癥相關死亡的第二大原因。重要的是，由于不斷變化的人口特征，預計該疾病所造成的負擔在接下來的幾十年間將顯著增加。即使在美國，其篩查計劃已使侵襲性癌癥的整體比率降低，但是在白種非西班牙裔婦女、黑人婦女、西班牙裔婦女和經(jīng)濟上處于劣勢的婦女之間，癌癥的發(fā)生率仍存在不同。在美國，目前fda批準之hpv預防性疫苗((merck))的外顯率令人失望。在2007年，該疫苗僅施用給年齡為13-17歲女孩中的25％、年齡為18-26歲的所有女性中的10％，并且僅給與西班牙裔婦女中的1.1％。此外，該疫苗對已感染所述病毒的婦女(無論其是否已發(fā)生(前)癌性子宮頸病變)無效?？紤]到感染hpv的終生風險以及疫苗覆蓋率嚴重不足的人群將很可能繼續(xù)以驚人速度發(fā)生子宮頸疾病和其它hpv相關疾病的事實，顯然非常需要減輕病毒感染發(fā)生后產(chǎn)生之致癌作用的治療方法。

hpv是非裂解性、非包膜病毒。其“早期”和“晚期”蛋白的基因組編碼區(qū)被命名為“e”和“l(fā)”。e蛋白執(zhí)行對于基因組復制來說關鍵的調(diào)節(jié)功能，其中的兩種蛋白(e6和e7)在腫瘤發(fā)生中發(fā)揮重要作用，而兩種l蛋白(l1和l2)是自組裝的衣殼蛋白，其負責dna包裝和病毒體組裝。乳頭瘤病毒感染的獨特之處在于：其生成周期與增殖中的宿主表皮或粘膜基底上皮細胞的細胞分化相關聯(lián)。hpv在其生命周期中保持在上基部(suprabasal)，因此其僅與表皮中的細胞(例如基底細胞和朗格漢斯細胞(langerhanscells，lc)相接觸。由于其生成周期與細胞分化相關聯(lián)，因此很難在體外產(chǎn)生hpv病毒體。作為hpv病毒體的替代物，已開發(fā)了能夠攜帶報告質(zhì)粒的hpv病毒樣顆粒(virus-likeparticle，vlp)和hpv假病毒體(二者均是在本申請人實驗室中建立的技術)。

高風險hpv的持久感染是發(fā)生子宮頸癌的主要風險因素。雖然大多數(shù)感染hpv的婦女清除了病毒，但是所花費的時間可能在數(shù)月至數(shù)年的范圍內(nèi)。約15％的已感染高風險hpv的婦女不能引發(fā)針對hpv的有效免疫應答，這使得病毒持續(xù)存在數(shù)十年。清除速率慢和缺乏有效免疫表明，hpv以某種方式逃脫了免疫應答。

hpv已發(fā)展出逃避立即清除的多種逃脫機制，使病毒得以在宿主中復制和持續(xù)存在。本申請人已顯示hpv利用lc作為免疫逃脫的一種機制，顯示于圖4中。lc位于皮膚和粘膜的上皮層中，其是與hpv接觸的第一個并且是關鍵性的apc。因此，lc負責起始針對hpv感染的有效免疫應答。一旦識別外來抗原，lc經(jīng)歷包括表型和功能變化的成熟過程，包括共刺激分子cd80和cd86、i類和ii類mhc、趨化因子受體(例如ccr7)的上調(diào)，細胞因子和趨化因子的分泌以及向局部淋巴結的遷移。本申請人已確定，暴露于hpv16l1l2vlp的lc不上調(diào)共刺激分子和趨化因子受體，不分泌細胞因子和趨化因子，并且不起始針對hpv16vlp來源之抗原的表位特異性免疫應答。相反，髓樣dc被hpv16l1l2vlp活化，并且一經(jīng)活化即刺激hpv特異性t細胞。攝入hpv16l1l2vlp后，dc和lc中起始不同的胞內(nèi)信號級聯(lián)反應。當用hpv16l1l2vlp刺激時，在dc中，有絲分裂原活化的蛋白激酶(mitogen-activatedproteinkinase，mapk)途徑被活化，而其在lc中不活化。然而，在lc中，磷脂酰肌醇3-激酶(phosphoinositide3-kinase，pi3k)途徑被活化，引發(fā)導致akt失活的信號級聯(lián)反應。hpv16e7特異性t細胞能夠識別并殺死暴露于hpv16l1l2-e7嵌合型vlp(chimericvlp，cvlp)的lc，表明cvlp內(nèi)化后，hpv肽由lc呈遞，但是hpv16l1l2vlp抑制lc引發(fā)免疫應答。綜上，這些數(shù)據(jù)揭示，在不存在共刺激時，lc呈遞hpv來源的肽，因而發(fā)生耐受和免疫抑制。這繼而可以導致hpv持久感染以及發(fā)生癌癥的可能性增加。

hpv的預防性疫苗誘導產(chǎn)生高效價的hpv中和抗體，并且已顯示在長達6.5年的隨訪中具有高效力以及穩(wěn)定水平的抗體。然而，在感染hpv的婦女中，一項3期試驗未發(fā)現(xiàn)經(jīng)接種組與對照組相比病毒清除加速的證據(jù)，確定性地表明基于vlp的預防性疫苗缺乏治療效力。此外，由于hpv培養(yǎng)時間長、存在幾種免疫逃避機制以及僅進行了幾年的觀察，因此預防性疫苗對癌癥預防的持續(xù)效力仍有待確定。事實上，約三分之一的子宮頸癌是由除目前疫苗中存在之hpv以外的hpv類型引起的，這增加了難題的范圍。因此，需要花費數(shù)十年才能夠測出針對子宮頸癌率的可計量效果。同時，對于全世界數(shù)以億計的、目前感染了高風險hpv或者在未來幾年內(nèi)會感染的婦女來說，仍然需要治療hpv感染和相關病變的療法。

手術是對患有子宮頸上皮內(nèi)腫瘤(cervicalintraepithelialneoplasia，cin)病變之患者的標準療法，其通常據(jù)稱在一年隨訪時去除cin病變的有效率高達90％。然而，當監(jiān)測婦女的整個生存期時，其有效率較低。多于80％的經(jīng)歷過手術過程的婦女在如下情形下將隨后再次需要進行第二次相關過程：手術未去除hpv感染，或者對一種hpv類型的清除激發(fā)了繼發(fā)性hpv感染的再活化。開發(fā)中的治療性疫苗旨在通過活化患者自身的細胞免疫應答來控制惡變，以及靶向(前)癌細胞中存在的抗原。在過去的十五年中，已開發(fā)了數(shù)種候選疫苗，然而迄今為止還沒有一種癌癥疫苗得到美國食品藥品監(jiān)督管理局的批準。

需要防止hpv感染到達誘導癌癥發(fā)生階段的干預手段。這樣的干預是可行的，因為利用市售的hpv檢測試劑盒(digenecorp.)可以在早期檢測到hpv感染。

幾條證據(jù)證實了細胞免疫系統(tǒng)在控制hpv和相關子宮頸病變的發(fā)病機制中的重要性。首先，25～40％的hpv陽性、輕微發(fā)育異常的病變自發(fā)地或者在局部活檢不久之后消退，這表明衰退可能涉及局部炎癥的誘導。其次，免疫缺陷與hpv感染的發(fā)生率增加有關。衰退中的hpv相關之皮膚疣和生殖器疣常常在病變處存在t淋巴細胞，這表明活躍的針對hpv的細胞介導之免疫應答可能是疾病衰退的要件之一。綜上所述，這些研究表明，對hpv感染及其相關疾病的治療方案應當旨在誘導感染部位的強的細胞免疫。

因此，需要在婦女的整個生存期間針對hpv的有效免疫治療，以及克服hpv誘導之lc免疫抑制(其阻止有效治療)的方法。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明提供了治療人乳頭瘤病毒(hpv)的方法，其包括向感染有hpv的患者施用治療有效量的來源于原代細胞之生物制品以及誘導針對hpv感染之免疫應答的步驟。

本發(fā)明還提供了克服hpv誘導之朗格漢斯細胞(lc)免疫抑制的方法，其包括向感染有hpv的患者施用治療有效量的來源于原代細胞之生物制品以及使lc活化的步驟。

本發(fā)明提供了提高lc向淋巴結遷移的方法，其包括向感染有hpv的患者施用治療有效量的來源于原代細胞之生物制品、使lc活化以及誘導lc向淋巴結遷移的步驟。

本發(fā)明還提供了產(chǎn)生針對hpv之免疫力的方法，其包括向感染有hpv的患者施用有效量的來源于原代細胞之生物制品、產(chǎn)生針對hpv的免疫力以及防止新病變發(fā)生的步驟。

附圖說明

通過參考以下詳細描述并結合附圖，本發(fā)明的其它優(yōu)點會很容易理解。

圖1是朗格漢斯細胞(lc)中表達的表型標志物的直方圖(現(xiàn)有技術)；

圖2是顯示lc之cd86表達的圖(現(xiàn)有技術)；

圖3是未活化lc與活化lc的示意圖；

圖4是hpv誘導lc耐受的示意圖；

圖5是lc活化實驗的實驗設計的示意圖；

圖6是暴露于hpv16和irx-2的人lc上的表面活化標志物上調(diào)的圖。

圖7是顯示在不存在和存在hpv16時irx-2誘導人lc遷移的圖。

圖8是顯示暴露于irx-2的人朗格漢斯細胞在hpv存在下較好地刺激同種異體t細胞的圖。

圖9是顯示暴露于hpv之后經(jīng)irx-2處理的人朗格漢斯細胞分泌高水平之il-8和ip-10的圖。

具體實施方式

本發(fā)明一般性地提供了通過施用來源于原代細胞的生物制品(irx-2)來治療hpv以及克服hpv誘導之lc免疫抑制的方法。本發(fā)明的療法有效地用于治療具有持久性hpv以及免疫系統(tǒng)不能產(chǎn)生針對hpv之有效應答的患者。

本文中使用的“有效量”是指實現(xiàn)本發(fā)明期望結果(即，在感染hpv的患者中產(chǎn)生lc免疫抑制的逆轉)所需的來源于原代細胞之生物制品的量。本領域技術人員能夠確定應給予特定患者的來源于原代細胞之生物制品的量。

“irx-2”也稱為“citoplurikin”，其是來源于白細胞、來源于天然原代細胞的生物制品，其在cgmp標準下由經(jīng)植物血凝素(pha)和環(huán)丙沙星(ciprofloxacin)刺激的純化人白細胞(單個核細胞(mononuclear))產(chǎn)生。主要的活性組分有白介素1β(il-1β，本文中也稱為il-1)、白介素2(il-2)、白介素6(il-6)、白介素8(il-8)、腫瘤壞死因子α(tnf-α)和γ-干擾素(ifn-γ)。優(yōu)選地，本發(fā)明中使用的irx-2包括這6種關鍵性細胞因子，并且可以僅含有這6種關鍵性細胞因子。irx-2先前還被稱為“ncm”——天然細胞因子混合物，其在美國專利no.6,977,072和7,153,499中定義和列出。術語“irx-2”、“來源于原代細胞的生物制品”和“ncm”在本文中可互換使用。

簡言之，在4-氨基喹諾酮(4-aminoquinolone)抗生素持續(xù)存在下以及有絲分裂原(在優(yōu)選的實施方案中為pha)持續(xù)或間斷存在下制備irx-2。然而，也可以使用其它有絲分裂原。所生產(chǎn)的用于向患者施用的irx-2含有濃度為60～6,000pcg/ml(更優(yōu)選150～1,800pcg/ml)的il-1β、濃度為600～60,000pcg/ml(更優(yōu)選3,000～12,000pcg/ml)的il-2以及濃度為200～20,000pcg/ml(更優(yōu)選1,000～4,000pcg/ml)的ifn-γ和tnf-α。

irx-2還可包含濃度為60～6,000pcg/ml(更優(yōu)選300～2,000pcg/ml)的il-6、濃度為6000～600,000pcg/ml(更優(yōu)選20,000～180,000pcg/ml)的il-8、濃度為200～20,000pcg/ml(更優(yōu)選1,000～4，000pcg/ml)的tnf-α?？梢允褂弥亟M、天然或聚乙二醇化的細胞因子，或者irx-2可包括重組、天然或聚乙二醇化細胞因子的混合物。irx-2可以僅包含上述細胞因子，然而也可以包含其它細胞因子。本發(fā)明的irx-2還可包含其它重組、天然或聚乙二醇化的細胞因子，例如il-7、il-12、il-15、gm-csf(濃度為100～10,000pcg/ml，更優(yōu)選500～2,000pcg/ml)以及g-csf。制備irx-2的方法公開于上文引用的專利文獻以及美國專利申請no.12/423,601中。

本發(fā)明還包括與本文公開之細胞因子相關的衍生物、片段和肽，其中所述衍生物、片段和肽保留其相應細胞因子的生物學活性。

irx-2的多種活性細胞因子組分作用于免疫系統(tǒng)的多種細胞類型，包括t細胞和樹突狀細胞。在h&nscc患者的臨床試驗中，irx-2顯示是安全、可耐受并具有生物學活性的，其導致明顯的無疾病存活和總體存活。irx-2中生理量的細胞因子可以局部施用(例如表面施用)，提供改變lc“遭遇”hpv處微環(huán)境的機會。傳統(tǒng)上，已使用來自單核細胞條件化培養(yǎng)基的天然細胞因子混合物或者含tnf-α、il-1β、il-6和pge2之重組炎性細胞因子的混合物使dc成熟，以離體制備基于dc的癌癥疫苗。irx-2中的生理細胞因子水平遠遠低于離體dc成熟中或高劑量全身性細胞因子療法中所使用的重組細胞因子的濃度。irx-2中低水平的細胞因子使其能夠直接注射入患者中而無顯著毒性。

irx-2還含有作為t細胞活化和增殖之關鍵介導物的幾種細胞因子。irx-2同時活化dc和t細胞的能力使其尤其具有吸引力，這是因為正是這種免疫細胞亞組的組合協(xié)調(diào)針對感染病毒之細胞的免疫應答。

還可以將另一些化合物與irx-2一起施用，例如化學抑制劑、非甾體類抗炎藥(nsaid)、鋅及其組合。

所述化學抑制劑可以是不具有免疫抑制性(優(yōu)選以低劑量使用)而具有免疫調(diào)節(jié)作用從而提高免疫力和/或免疫應答(例如通過抑制體內(nèi)的免疫抑制或抑制物機制來實現(xiàn))的任何化療劑。根據(jù)一個優(yōu)選的實施方案，所述化學抑制劑是抗腫瘤劑，包括但不限于烷化劑、抗代謝物和抗生素。所述化學抑制劑還可以是免疫調(diào)節(jié)劑，例如薩立多胺(thalidomide)。所述化學抑制劑還可以采用鹽或其它復合物形式。優(yōu)選地，所述化學抑制劑是烷化劑環(huán)磷酰胺(cyclophosphamide，cy)。

優(yōu)選地，所述nsaid是吲哚美辛(indomethacin，indo)，其是coxi和coxii二者的抑制劑。所述nsaid還可以是布洛芬或coxii抑制劑(例如塞來昔布(celecoxib)和羅非昔布(rofecoxib))或其組合。

聯(lián)合使用所述四種組分(即化學抑制劑、nsaid、來源于原代細胞的生物制品和鋅)能夠應對由免疫靶標所產(chǎn)生的抑制性環(huán)境并恢復患者的細胞免疫應答。更具體地，化學抑制劑抑制調(diào)節(jié)性t細胞；nsaid逆轉前列腺素的局部免疫抑制，來源于原代細胞的生物制品使樹突狀細胞活化、刺激t細胞并保護t細胞免于凋亡；鋅提供對于t細胞功能來說關鍵的營養(yǎng)物。這一組合作用激發(fā)了針對內(nèi)源和外源抗原的免疫應答。

更具體地，本發(fā)明提供了通過向感染有hpv的患者施用治療有效量的irx-2以及誘導針對hpv的免疫應答來治療hpv的方法。優(yōu)選地，irx-2包含如上所述的6種關鍵性細胞因子——il-1、il-2、il-6、il-8、tnf-α和ifn-γ。如上所述，還可包含額外的細胞因子。如上所述，還可以施用額外的化合物，例如化學抑制劑、nsaid和鋅。優(yōu)選地，通過注射將irx-2施用至上皮中存在hpv感染處以及誘導免疫應答所需的lc位置處。還優(yōu)選表面應用至子宮頸。表面應用的方法包括但不限于將irx-2分散于脂質(zhì)體制劑biphasix^tm(helixbiopharmacorp.，aurora，ontario，ca)中，隨后應用至子宮頸上皮；使用子宮頸藥物遞送系統(tǒng)^tm(cervicaldrugdeliverysystem^tm)(inc.chicago，il)，其中irx-2吸收進生物粘附聚合物貼劑中，然后將其粘貼至子宮頸上皮；以及通過子宮頸分離和遞送設備(例如公開于tracy等人的美國專利no.7,165,550中的設備)將irx-2溶液注入子宮頸中。

一般來講，irx-2通過使未成熟的樹突狀細胞成熟從而有效地“啟動”免疫系統(tǒng)，刺激幼稚(naive)t細胞的產(chǎn)生，并有效地將抗原呈遞至幼稚t細胞。irx-2通過誘導針對hpv的免疫應答從而能夠有效地治療hpv(由于hpv對lc的免疫抑制作用，hpv患者中缺乏所述免疫應答)。

針對hpv的免疫應答通過活化lc來誘導。活化與未活化的lc顯示于圖3中?；旧?，irx-2能夠克服hpv對lc的免疫抑制。然后，活化的lc分泌活化t細胞和調(diào)節(jié)免疫的細胞因子，以誘導針對hpv的免疫應答，從而由于免疫系統(tǒng)能夠有效地攻擊hpv而消除所有存在的病變以及抗御未來病變發(fā)作。例如，irx-2增加lc的il-8分泌和ilip-10產(chǎn)生。lc能夠活化hpv特異性cd8+t細胞。如以下實施例中所述，lc的活化由cd1a、mhci類分子、mhcii類分子、cd40、cd80、cd83、cd86和ccr7的上調(diào)證實。

本發(fā)明還提供了通過向感染有hpv的患者施用治療有效量的irx-2以及使lc活化從而克服hpv誘導的lc免疫抑制的方法。irx-2如上所述。通過活化lc，irx-2能夠克服由hpv所致的lc免疫抑制。因此，這樣的lc可以有效地誘導t細胞活化，以攻擊患者中存在的hpv。

本發(fā)明提供了通過施用治療有效量的irx-2、使lc活化以及誘導lc向淋巴結遷移從而提高lc向淋巴結遷移的方法。irx-2如上所述。在irx-2處理后，活性lc可有效地向患者的淋巴結遷移，并在感染hpv的患者中產(chǎn)生免疫應答。由于hpv的免疫抑制，正常情況下lc不能遷移至淋巴結。然而，使用irx-2進行處理逆轉了該免疫抑制，使得lc能夠有效地在免疫系統(tǒng)中起作用。

本發(fā)明提供了通過向感染有hpv的患者施用有效量的irx-2、產(chǎn)生針對hpv的免疫力以及防止新病變發(fā)生從而產(chǎn)生針對hpv之免疫力的方法。irx-2能夠使已被hpv抑制的lc活化。活化的lc能夠產(chǎn)生針對hpv的免疫應答。具有活躍地識別并能夠攻擊hpv的免疫系統(tǒng)使得能夠預防任何新病變的發(fā)生。活化的免疫系統(tǒng)能夠有效地治療hpv以及預防未來的疾病發(fā)生。

本發(fā)明具有幾個益處。由于病變主要由hpv的持久存在引起，因此誘導感染之免疫清除以及防止hpv傳播的干預行為對于公共衛(wèi)生來說具有重大影響。消除hpv持久存在有助于降低針對每種hpv相關癌癥所發(fā)生的衛(wèi)生保健費用。該方法是反復篩查或昂貴手術干預的低成本替代方法，并且其成功性具有高的合理預期，這是因為其靶向了hpv誘導之病變發(fā)生的原因(即，hpv持久存在及其相關的免疫逃脫)。

對于任何上述實施方案，使用如下治療施用細節(jié)和/或步驟：

優(yōu)選地，通過注射將所述細胞因子組合物局部應用至被hpv感染的上皮?；蛘?，可以將本發(fā)明的細胞因子組合物注射至如下淋巴管周圍，所述淋巴管流入所治療之病變或其它病毒感染區(qū)區(qū)域的淋巴結中。更具體地，施用本領域技術人員已知的局部淋巴管外周注射或其它注射，以提供免疫治療制備物的充分定位。

在使用外源性抗原的實施方案中，外源提供的合成或提取的抗原(例如腫瘤抗原和肽(參見bellone，1998))可以以單獨的制備物或者作為本發(fā)明細胞因子組合物的一部分施用至預先激發(fā)(pre-primed)或共激發(fā)(co-primed)的區(qū)域或遠端淋巴結中。

可由例如癌癥或其它免疫抑制疾病引起的t細胞內(nèi)源性抑制可以通過低劑量環(huán)磷酰胺(cy)和非甾體類抗炎藥(nsaid)的共施用(即與本發(fā)明的細胞因子組合物聯(lián)用)而阻斷。nsaid優(yōu)選是吲哚美辛(indo)，但也可以使用布洛芬或coxii抑制劑(例如塞來昔布()或羅非昔布())或其組合。nsaid的副作用可以用質(zhì)子抑制劑和前列腺素e類似物主動地進行治療。還可以加入鋅和復合維生素(可包括加入硒)作為幫助恢復t細胞免疫的試劑。優(yōu)選地，鋅的劑量是15～75mg?？梢允┯脴藴实膹秃暇S生素。鋅可以是可獲得的葡糖酸鹽。

本發(fā)明的細胞因子組合物可以在手術、放療、化療或其組合之前或之后施用。本發(fā)明的組合物可以在腫瘤復發(fā)期間施用，即在認為腫瘤已經(jīng)消失或者減輕的時期后再次發(fā)生腫瘤生長的期間。

irx-2的作用機制

如上文所定義，本發(fā)明的來源于原代細胞之生物制品作為佐劑起作用，即刺激或增強患者針對特定抗原的免疫應答。此外，本發(fā)明的irx-2組合物和方法特別適用于刺激t細胞介導的免疫應答。由本發(fā)明的組合物和方法引發(fā)的免疫應答包括誘導或產(chǎn)生幼稚t細胞、使樹突狀細胞分化和成熟、使抗原正確地呈遞至t細胞(例如在淋巴結中)以及使單核細胞和巨噬細胞活化。具體地，在癌癥患者中，由本發(fā)明的組合物和方法引發(fā)的免疫應答包括淋巴細胞對腫瘤的浸潤、腫瘤破碎和消退以及竇組織細胞增生(存在時)降低?；旧?，來源于原代細胞的生物制品誘導免疫產(chǎn)生，并阻斷免疫破壞。來源于原代細胞之生物制品的作用機制進一步描述于本申請人的美國專利申請no.12/323,595中。

更具體地，本發(fā)明的組合物和方法通過誘導產(chǎn)生幼稚t細胞從而有助于克服患者的免疫阻遏/抑制。如本文所定義地，術語“幼稚”t細胞是指新產(chǎn)生的t細胞，該t細胞尚未暴露于抗原。因此，本發(fā)明的組合物和方法補充或產(chǎn)生新的t細胞。

由于已知樹突狀細胞在體內(nèi)產(chǎn)生適當免疫應答的抗原呈遞中發(fā)揮重要作用，因此對樹突狀細胞成熟具有刺激性作用的試劑將作為激發(fā)針對抗原之良好免疫應答的佐劑起作用。本發(fā)明的細胞因子組合物促進樹突狀細胞的成熟。本發(fā)明的細胞因子組合物還通過作為單核細胞/巨噬細胞的強效活化劑而提供進一步的佐劑作用。單核細胞是體內(nèi)dc和巨噬細胞的前體，因而促進單核細胞/巨噬細胞活化的試劑對體內(nèi)免疫應答具有佐劑作用。

來源于原代細胞的生物制品還通過保護活化的t細胞免于凋亡從而阻斷免疫破壞。臨床和實驗數(shù)據(jù)顯示，某些細胞因子(特別是利用共同的受體γ鏈的存活性細胞因子(survivalcytokine))能夠保護活化的t細胞免于腫瘤誘導的死亡并增強其抗腫瘤活性。

更具體地，有幾種方式使來源于原代細胞的生物制品保護t細胞免于凋亡。使抗凋亡信號分子(即jak-3和磷酸化的akt)的表達上調(diào)以及使促凋亡分子(即socs-2)的表達下調(diào)。使cd8+和cd4+t淋巴細胞中胱天蛋白酶(caspase)的活化降低以及使cflip的表達增加。irx-2對抗了pi3k/akt存活途徑的抑制。t細胞受到保護免于外在凋亡(mv誘導的和fasl誘導的凋亡)和內(nèi)在線粒體凋亡。

通過阻止jak3、cd3-ζ和stat5下調(diào)，抑制akt-1/2去磷酸化以及維持bax/bcl-2、bax-bcl-xl和bim/mcl-1的平衡比率，從而進一步保護免于mv誘導的外在調(diào)亡。還通過阻止胱天蛋白酶-3和胱天蛋白酶-7活性的誘導來保護免于mv誘導的調(diào)亡。更具體地，阻斷胱天蛋白酶-3之經(jīng)切割活性形式的誘導，以及線粒體膜電勢的損失。抑制核dna片段化。來源于原代細胞的生物制品保護免于內(nèi)在凋亡表現(xiàn)為其保護活化的t細胞免于星孢菌素(staurosporine)誘導的凋亡。

重要的是，來源于原代細胞之生物制品的細胞因子以協(xié)同方式保護活化的t細胞免于凋亡。換言之，來源于原代細胞之生物制品中的細胞因子組合物產(chǎn)生的作用比單獨施用各細胞因子時的更強。

鑒于以上方面，本發(fā)明的組合物和方法通過多種作用方式刺激免疫系統(tǒng)，包括使樹突狀細胞體內(nèi)成熟(導致肽抗原有效呈遞)以及使單核細胞和巨噬細胞活化和產(chǎn)生幼稚未定向t細胞?？乖恼_呈遞導致t和b細胞克隆擴增，使患者體內(nèi)產(chǎn)生免疫力。在癌癥患者的情形中，上述作用導致例如淋巴細胞浸潤入腫瘤中(例如通過血行播散來實現(xiàn))以及腫瘤減小和/或破壞。結果是由于免疫記憶而使得存活率提高。

使本發(fā)明細胞因子組合物的給藥和劑量促進對外源或內(nèi)源抗原的最佳免疫，其中需考慮個體患者的臨床病癥、施用位點和方法、施用方案、患者年齡、性別和體重。因此，出于本文目的的藥學“有效量”如本領域已知地通過考慮這些因素來確定。所述量必須有效地促進免疫，導致例如腫瘤減小、腫瘤破碎和白細胞浸潤、復發(fā)延遲或存活率提高或者癥狀改善或消除(包括t細胞數(shù)增加)。

在本發(fā)明的方法中，本發(fā)明的組合物可采用多種方式施用。應當注意，本發(fā)明組合物中使用的細胞因子或外源抗原可以其標準形式或者作為可藥用衍生物來施用，并且可以單獨施用或者作為活性成分與可藥用載體、稀釋劑、佐劑和載劑聯(lián)周。此外，本發(fā)明的組合物可以皮內(nèi)或皮下、或者淋巴管外周或淋巴管內(nèi)、淋巴節(jié)內(nèi)或脾內(nèi)或肌內(nèi)、腹膜內(nèi)和胸內(nèi)施用。本發(fā)明的組合物還可以表面應用至hpv感染的上皮，例如通過注入患者的子宮頸中來實現(xiàn)。接受治療的患者是溫血動物，特別是哺乳動物(包括人)?？伤幱玫妮d體、稀釋劑、佐劑和載劑以及植入載體一般是指惰性、非毒性的固體或液體填充劑、稀釋劑或包封材料，其不與本發(fā)明的活性成分發(fā)生反應。

劑量可以是單次劑量或數(shù)天期間內(nèi)的多次劑量。當施周本發(fā)明的組合物時，一般將其制備為單位劑量的注射用形式(例如溶液、混懸液或乳液)。適于注射的藥物制劑包括無菌水溶液或分散體系，以及用于重溶形成無菌注射用溶液或分散體系的無菌粉末。載體可以是含有例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇、液態(tài)聚乙二醇等)、其合適混合物或植物油的溶劑或分散介質(zhì)。

可例如通過使用包衣(例如卵磷脂)、通過在分散體系的情形中維持所需顆粒大小以及通過使用表面活性劑來維持適當?shù)牧鲃有?。還可以使用非水性載劑(例如棉花籽油、芝麻油、橄欖油、大豆油、玉米油、葵花籽油或者花生油以及酯(例如肉豆蔻酸異丙酯))作為本發(fā)明組合物的溶劑系統(tǒng)。此外，可以添加增強組合物穩(wěn)定性、無菌性和等滲性的多種添加劑，包括抗微生物防腐劑、抗氧化劑、螯合劑和緩沖劑。可以通過不同的抗細菌劑和抗真菌劑(例如對羥基苯甲酸酯(paraben)、氯丁醇、苯酚、山梨酸等)來確保抑制微生物的作用。在很多情況下，包含等滲劑(例如糖、氯化鈉等)是理想的?？梢酝ㄟ^使用延遲吸收的試劑(例如單硬脂酸鋁和明膠)來延長注射用藥物形式的吸收。然而，根據(jù)本發(fā)明，所使用的任何載劑、稀釋劑或添加劑需要與本發(fā)明的細胞因子或外源抗原相容。

可以通過將實施本發(fā)明時使用的細胞因子或外源抗原摻入所需量的合適溶劑中來制備無菌注射用溶液，其中所述溶劑含有所期望的幾種其它成分。

本發(fā)明的藥物制劑可以以含有任何相容載體(例如多種載劑、添加劑和稀釋劑)的注射用制劑向患者施用，或者，本發(fā)明中使用的細胞因子和/或外源抗原可以以緩慢釋放皮下植入物或靶向遞送系統(tǒng)(例如單克隆抗體、運載體遞送、離子電滲入療法、聚合物基質(zhì)、脂質(zhì)體和微球)的形式向患者進行腸胃外施用?？捎糜诒景l(fā)明的遞送系統(tǒng)的實例包括公開于美國專利no.5,225,182、5,169,383、5,167,616、4,959,217、4,925,678、4,487,603、4,486,194、4,447,233、4,447,224、4,439,196和4,475,196中的那些。很多其它的這種植入物、遞送系統(tǒng)和組件是本領域技術人員公知的。

應當理解，如上所討論地，本發(fā)明的組合物和方法可用于治療抗原引發(fā)的疾病，例如癌癥、感染性疾病或持久性病變。所述組合物和方法通過刺激患者體內(nèi)的免疫應答從而促進針對產(chǎn)生這些疾病之抗原的免疫，該免疫應答有助于減輕或消除患者之疾病的癥狀和效應。

本發(fā)明通過參考以下實驗例而進一步詳細描述。除非另有指明，否則這些實施例僅出于舉例說明的目的而提供，而非旨在用于限定。因此，本發(fā)明不應以任何方式解釋為限制于以下實施例，而應視為包括根據(jù)本文教導顯見的任何及所有變化形式。

實施例1

產(chǎn)生人lc

由于hpv僅感染人類，因此使用人免疫細胞來研究hpv與lc的相互作用。從人皮膚中分離的原代lc通過遷移過程而活化，并表達高水平的mhc和共刺激分子。因此，從人供體分離原代未活化的皮膚來源之lc以進行有意義的體外長期和可重復性功能研究是不可行的。對于本實驗而言，利用分化細胞因子從分離自健康供體的外周血單核細胞離體產(chǎn)生原代lc。循環(huán)單核細胞是體內(nèi)表皮lc的直接前體。本申請人等已顯示離體產(chǎn)生的lc表達與表皮lc同樣的表面標志物(langerin、e-鈣粘素、cd11c、cd1a、高的mhcii類分子和胞內(nèi)birbeck顆粒)(圖1)，并且可以在體外lc研究中一致地使用。

圖1顯示人單核細胞來源的朗格漢斯細胞表達與表皮來源之朗格漢斯細胞類似的表型標志物。未成熟的朗格漢斯細胞由粘附單核細胞在1000iu/mlgm-csf、1000iu/mlil-4和10ng/mltgfβ中7天分化得到。通過流式細胞術分析細胞中mhcii類分子(hla-dp、dq、dr)、cd1a、cd11c、langerin或e-鈣粘蛋白的表達(灰色陰影直方圖)。同工型對照顯示為黑色無陰影的直方圖。該數(shù)據(jù)代表獲自數(shù)個健康供體的lc。

逆轉hpv免疫逃脫

本申請人先前已著手研究通過靶向lc來逆轉hpv免疫逃脫的策略。lc表達多種tlr，包括tlr3、7、8和9，其識別病原體相關分子模式(pathogen-associatedmolecularpattern，pamp)并且一經(jīng)與其配體結合即使細胞活化。出人意料的是，通過測量cd86的表達，發(fā)現(xiàn)fda批準用于外部生殖器疣的tlr7激動劑(咪喹莫特(imiquimod)，gracewaypharmaceuticals，llc)對lc活化完全沒有作用(圖2)。這可以解釋尚未發(fā)表的觀察結果，即使用咪喹莫特治療子宮頸病變沒有效果。令人感興趣的是，tlr8活化劑(3m-002)和tlr7/8激動劑(雷西莫特(resiquimod))使感染hpv的lc完全活化，從而它們開始體外誘導hpv特異性t細胞應答。這些數(shù)據(jù)表明，可以通過使某些“危險信號”途徑活化來逆轉hpv對lc功能的抑制。

用irx-2使人朗格漢斯細胞活化

暴露于病原體或其它“危險信號”后，lc從表皮遷移至引流淋巴結(draininglymphnode)后能夠有效地刺激t細胞，這種能力需要其細胞表面上共刺激分子和趨化因子受體的表達。研究了irx-2在體外對人單核細胞來源之lc的表型成熟的作用。發(fā)現(xiàn)irx-2處理誘導mhci類分子和mhcii類分子以及共刺激分子cd40、cd80和cd86、成熟標志物cd83的上調(diào)。如先前所述進行l(wèi)c的活化。簡單地講，收獲lc，清洗，對其不處理或者用hpv16l1l2vlp以10μg/10⁶個細胞的濃度于37℃處理1小時。孵育后，將細胞于37℃置于完全培養(yǎng)基中6小時。接著，不對細胞進行處理，或者用irx-2(1∶2稀釋)處理，或者用1μg/mllps處理作為陽性對照。irx-2處理后，細胞再孵育48小時。收獲細胞，清洗，染色以進行流式細胞分析，其中對cd1a、mhci類分子、mhcii類分子、cd40、cd80、cd83、cd86或同工型對照進行染色。由mfi值計算處理組之間表面標志物的變化倍數(shù)。mfi提高表明標志物上調(diào)和lc活化。數(shù)據(jù)代表3個個體供體。

irx-2的來源是從經(jīng)植物血凝素(pha)刺激24小時的人外周血單個核細胞中收集的上清液。利用qc試驗測定混合物中細胞因子的水平，并根據(jù)4種關鍵細胞因子的水平將其標準化。cgmp生產(chǎn)過程得到高度一致的產(chǎn)物，各批次之間具有非常近似的細胞因子濃度。為了確保irx-2對lc活化的一致性，使用兩個不同批次的irx-2對lc進行活化。

如圖6所示，irx-2處理使全部6種lc標志物的表達均顯著增加，而與lc是否已暴露于hpv16l1l2vlp無關。令人感興趣的是，與對照相比，暴露于hpv16l1l2vlp的lc中共刺激分子cd86的增加甚至更有效。多于95％的細胞表達cd86，多于80％的lc表達成熟標志物cd83(未顯示)。

結果表明，irx-2是lc活化和成熟的強效誘導物，并且其有效性不受lc先前暴露于hpv的影響。

實施例2

確定目前臨床上可用的irx-2是否能夠使先前暴露于hpv16的lc活化是必要的。irx-2對lc活化標志物表達的作用報道于實施例1中。在接下來的實驗中，通過測定細胞因子分泌、遷移和同種異體抗原(alloantigen)特異性t細胞的活化來測試irx-2的效力。

與lc類似地，apc的活化對于原代t淋巴細胞的成功相互作用和活化是必需的。炎性細胞因子能夠使apc活化，導致其成熟以及抗原呈遞功能的提高。irx-2是有前景的免疫調(diào)節(jié)劑，當局部應用至感染hpv的上皮時，其能夠影響lc的免疫刺激能力。為了確定irx-2是否在表型上和功能上使暴露于hpv的lc活化，對細胞因子/趨化因子分泌、遷移以及刺激同種異體抗原特異性t細胞應答的能力進行測定。這些研究確定，與tlr8激動劑類似，irx-2亦能夠逆轉hpv導致的免疫抑制。

實驗設計：

當使lc暴露于hpv16并接著暴露于irx-2時，測定lc的t細胞共刺激標志物的表達水平。lc由分離自健康供體的外周血單核細胞分化得到。如圖5所示，將lc暴露于hpv16病毒樣顆粒(vlp)6小時，然后加入irx-2額外48小時。利用熒光抗體通過流式細胞術對細胞表面分子進行測定。測定細胞培養(yǎng)上清液中免疫刺激性細胞因子和趨化因子的存在情況，以確定lc是否已活化以及是否分泌活化t細胞的細胞因子或其它免疫調(diào)節(jié)細胞因子。通過體外遷移穿過transwell膜，測定暴露于hpvvlp和irx-2后的lc遷移。通過在混合淋巴細胞反應(mixedlymphocytereaction，mlr)中將lc與同種異體t細胞一起培養(yǎng)，評估刺激t細胞的能力。每個實驗中利用未經(jīng)處理的lc、僅暴露于hpvvlp的lc以及僅用irx-2處理的lc作為對照。每個實驗利用來源于個體健康供體的lc重復至少3次。選擇hla-a＊0201陽性的受試者，以使能夠針對已知的hpv來源之肽抗原對已明確的t細胞免疫應答進行測定。這些數(shù)據(jù)顯示，irx-2能夠使暴露于hpv的lc重新獲得刺激t細胞和遷移的能力，這兩種功能對于產(chǎn)生抗病毒免疫應答來說是必需的。

產(chǎn)生人朗格漢斯細胞：

利用分化細胞因子由通過匿名健康供體的白細胞采集而分離的市售外周血單核細胞離體產(chǎn)生原代lc。首先使凍存的pbmc粘附至塑料培養(yǎng)瓶來產(chǎn)生單核細胞來源的lc。貼壁細胞在含有1000u/ml重組人(recombinanthuman，rhu)-gm-csf、1000u/mlrhu-il-4和10ng/mlrhu-tgf-β1的培養(yǎng)基中培養(yǎng)7天，培養(yǎng)期間添料兩次。

lc遷移：

利用具有5μm孔徑聚碳酸酯濾膜的24孔transwell板(corningcostar)進行趨化因子引導的lc遷移。將培養(yǎng)基(含有250ng/mlrhuccl21(r&dsystems)，或者僅為培養(yǎng)基以作為自發(fā)遷移的對照)加入下部腔室中。將未經(jīng)處理或經(jīng)上述處理的lc加入上部腔室中，并于37℃孵育4小時。利用血細胞計數(shù)器或自動細胞計數(shù)器對遷移至下部腔室中的細胞進行計數(shù)，ccl21依賴性遷移計算為：ccl21存在時遷移細胞與無ccl21時遷移細胞的比率，稱為“遷移指數(shù)”。遷移指數(shù)提高表明lc功能性活化，從組織向引流淋巴結移動(圖7)。

irx-2處理使得對照和hvpl1l2vlp中遷移提高了3至4倍。結果說明，irx-2可以促進lc向區(qū)域淋巴結遷移，甚至當lc已暴露于hvp時。

混合淋巴細胞反應測定：

如上所述用hpv16l1l2vlp和irx-2對lc進行處理。將lc與未經(jīng)接觸的(untouched)同種異體t細胞共培養(yǎng)，所述t細胞利用macs陰性選擇人泛t細胞分離試劑盒(macsnegativeselectionhumanpantcellisolationkit)分離。應答性t細胞(respondertcell)和刺激性lc(stimulatorlc)以10∶1和5∶1的r∶s比率培養(yǎng)5天。單獨培養(yǎng)的t細胞、單獨培養(yǎng)的lc、與自體pbmc一起培養(yǎng)的t細胞以及與t細胞有絲分裂原pha一起培養(yǎng)的t細胞用作測定對照。收獲經(jīng)放射性³h-胸腺嘧啶脈沖處理的細胞，并利用閃爍板計數(shù)器對放射性進行計數(shù)。確定放射性cpm，并在處理組間進行比較。增加的胸腺嘧啶摻入指示更多的t細胞增殖。暴露于hpv16l1l2vlp并用irx-2刺激后t細胞增殖增加，這證實了暴露于hpv16l1l2vlp的lc在hpv存在下重新獲得其免疫刺激能力(圖8)。

細胞因子和趨化因子分析：

從用irx-2刺激的lc中收集上清液，并對所分泌的細胞因子和趨化因子進行測試。如上所述對lc進行處理。irx-2處理后36小時，清洗lc，并在收集上清液前培養(yǎng)額外的36小時。這免除了對irx-2混合物中存在之細胞因子的測定。利用使得能夠?qū)?shù)種炎癥和t細胞刺激和趨化分析物同時進行測定的bio-plexsuspensionassaysystem完成該測定。所測定的細胞因子和趨化因子包括il-8、ifn-γ可誘導蛋白10(ifn-γinducibleprotein10，ip-10)、單核細胞趨化蛋白(mcp)-1、巨噬細胞炎性蛋白(mip)-1α、mip-1β和rantes。通過比較處理組上清液中細胞因子和趨化因子的濃度，對數(shù)據(jù)進行分析。th1相關細胞因子和趨化因子的分泌增加，表示lc功能性活化，這支持了cd8+t細胞應答的誘導，而抑制性細胞因子的增加表明lc的耐受或功能抑制。

用irx-2處理lc使得兩種th1相關趨化因子ip-10和ip10的分泌顯著增加(圖9)。這兩種趨化因子均是促炎的，已知ip-10吸引t細胞、nk細胞和單核細胞至炎癥部位。結果顯示，在irx-2刺激下，暴露于l1l2vlp的lc在hpv存在下重新獲得其免疫刺激能力。

結論：

irx-2在表型上和功能上使來自健康供體的人lc活化，即使在其暴露于hpvl1l2vlp之后也是如此。hpv和irx-2處理后mhc和表面活化分子的水平增加，炎性和活化t細胞之細胞因子和趨化因子的分泌增加，進行趨化因子引導之遷移的能力增強(圖6-9)。所有這些結果均支持本發(fā)明在克服hpv誘導之lc耐受以及提供hpv感染治療中的有效性。已經(jīng)以舉例說明的方式對本發(fā)明進行了描述，應理解，所使用的術語旨在描述詞語的本義而非限制性的。

顯然，根據(jù)上述教導，本發(fā)明可具有多種修改和變化形式。因此，應理解，在所附權利要求的范圍內(nèi)，可以以除具體描述之外的方式實踐本發(fā)明。