本發(fā)明屬高分子抗腫瘤靶向藥物領(lǐng)域，具體涉及一種藤黃酸-半乳糖-HPMA高分子共聚物及其制備方法和應用。

背景技術(shù)：

藤黃酸(Gambogic Acid,GA,C38H4408)是中藥藤黃中有有效成分之一。近20年來，國內(nèi)外學者對藤黃進行了大量深入和系統(tǒng)的研究，藤黃及其活性成分藤黃酸等具有較廣泛的藥理活性，主要包括抗腫瘤、抗菌、抗炎、抗病毒、抗病毒及殺蟲等作用，其對多種腫瘤顯示較強的抗腫瘤活性在已經(jīng)成為近年來天然產(chǎn)物抗腫瘤研究的熱點，其毒副作用較大，選擇性很低，對正常動物造血系統(tǒng)和免疫功能也會產(chǎn)生影響，這就限制了目前藤黃酸抗腫瘤藥物的臨床研究。

哺乳動物的肝細胞是唯一在細胞表面表達有大量的親和能力強的受體-去唾液酸糖蛋白的受體(ASGPR)，去唾液酸糖蛋白的受體(ASGPR)在肝細胞的表面過度表達，估計每個細胞表面都50萬個受體，這些受體能夠與半乳糖結(jié)合，所以藥物可以通過聚合物上半乳糖殘基和去唾液酸糖蛋白受體的識別作用而進入到細胞里面，從而實現(xiàn)靶向給藥pH敏感的聚合物已經(jīng)被廣泛的用于疾病的治療。

水溶性HPMA聚合物作為抗腫瘤藥物載體的研究已有30多年歷史，具有良好的生物相容性、非免疫原性、無毒及可修飾結(jié)構(gòu)等特點。小分子藥物HPMA聚合物通過實體瘤組織的高通透性、滯留效應(EPR效應)和內(nèi)吞作用選擇性進入腫瘤細胞，并由細胞內(nèi)的溶酶體等分解使藥物釋放，從而減小藥物毒副反應，延長藥物在細胞內(nèi)的停留時間。

聚HPMA是一種對身體無害的生物相容高分子，且水溶性好。將阿霉素，喜樹堿等藥物和HPMA共聚藥物的臨床試驗已進行到三期。聚HPMA作為藥物載體的特點如下：(1)聚HPMA與藥物連接結(jié)構(gòu)是藥物靶向到預定部位釋放的重要的組成部分，根據(jù)對藥物機理的研究加上對特定組織或器官具體微環(huán)境特點的研究，用不同的連接結(jié)構(gòu)接上各種功能性因子；(2)合成出的多聚物具有良好的水溶性和生物相容性；(3)從機理上看，對HPMA聚合藥物輸送系統(tǒng)研究發(fā)現(xiàn)可以改變藥物的內(nèi)化，細胞內(nèi)的運輸路徑，增強藥物的作用和靶向性。

高分子藥物載體靶向受體是近年來發(fā)展的一個具有跨時代意義的腫瘤治療手段，該技術(shù)可以降低小分子藥物的毒副作用，降低抗藥性，提高藥物在體內(nèi)的穩(wěn)定性，發(fā)揮更大靶向效果，其選擇性到達惡性腫瘤特定部位，并在該部位發(fā)揮藥物的靶向作用。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明目的是提供一種具有智能釋放藥物的靶向抗腫瘤活性的藤黃酸-半乳糖-HPMA高分子共聚物，是將葉酸(半乳糖)、藤黃酸通過共價鍵連接到N-(2-羥丙基)甲基丙烯酰胺(HPMA)上而形成的高分子共聚物，屬于高分子化合物。

本發(fā)明采用的技術(shù)方案為：

一種藤黃酸-半乳糖-HPMA高分子共聚物，其結(jié)構(gòu)式如(I)所示：

式中，x＝5～10mol％，y＝5～10mol％，z＝80～90％mol％，Mn＝2.2×10⁴,Mw/Mn＝1.45。

一種所述藤黃酸-半乳糖-HPMA高分子共聚物的制備方法，步驟如下：

1)首先以D-半乳糖制備為原料，制備半乳糖衍生物C；

2)再將藤黃酸乙二酰胺與甲基丙烯酰反應制備藤黃酸衍生物D；

3)最后半乳糖衍生物C、藤黃酸衍生物D和HPMA縮合為藤黃酸-半乳糖-HPMA高分子共聚物。

所述的制備方法，步驟1)以D-半乳糖制備為原料，制備半乳糖衍生物C，具體步驟如下：

1.1)取D-半乳糖的溶解到丙酮中，加入濃硫酸，室溫攪拌過夜，溶液變?yōu)榱咙S色；再加入碳酸鉀溶液，析出大量白色固體，抽濾，蒸出濾液中的丙酮，剩余的濾液用氯仿萃取，再用蒸餾水洗滌氯仿，加入無水硫酸鈉干燥，蒸出氯仿，真空干燥得無色透明的油狀物化合物A；

1.2)取化合物A溶解在二氯甲烷中，加入三乙胺得混合液I，于冰浴中降溫到0℃左右；將甲基丙烯酰氯溶于二氯甲烷，用分液漏斗緩慢滴加到混合液I中，滴完后再反應3h，抽濾掉生產(chǎn)的沉淀，濾液蒸干，加入正己烷，有少量的不溶物，除去后，蒸除正己烷，制得化合物B；

1.3)取化合物B于圓底燒瓶中，加入三氟乙酸-水的混合物，在室溫下攪拌15分鐘，加入乙醇，抽濾出去溶劑，得淡黃色固體，用乙醇重結(jié)晶，得白色固體即半乳糖衍生物C。

所述的制備方法，步驟1.3)中三氟乙酸-水的混合物中三氟乙酸和水按體積比為9:1進行配置。

所述的制備方法，步驟2)將藤黃酸乙二酰胺與甲基丙烯酰反應制備藤黃酸衍生物D，具體步驟如下：取藤黃酸乙二酰胺溶解到二氯甲烷中，加入三乙胺的混合液Ⅱ，于冰浴中降溫到0℃左右；將甲基丙烯酰氯溶于二氯甲烷，用分液漏斗緩慢滴加到上述混合液Ⅱ中，滴完后反應4h；再將反應液倒入碳酸鉀溶液中，分出二氯甲烷層，水相用二氯甲烷萃取兩次，每次50mL，合并二氯甲烷相，二氯甲烷相分別用10％碳酸鉀溶液、水洗滌兩次，加入無水硫酸鈉干燥，蒸出二氯甲烷，真空干燥,硅膠柱層析得黃色固體化合物即藤黃酸衍生物D。

所述的制備方法，步驟3)半乳糖衍生物C、藤黃酸衍生物D和HPMA縮合為藤黃酸-半乳糖-HPMA高分子共聚物，具體步驟如下：稱取HPMA加入到Shleck瓶中，用DMSO加熱溶解，再加入丙酮、半乳糖衍生物C和藤黃酸衍生物D攪拌直至溶解，待冷卻至室溫，加入偶氮二異丁腈，抽真空充氮氣循環(huán)3次，密封后保持溫度55℃反應24小時；用丙酮和乙醚的混合液沉淀，過濾后用無水甲醇溶解沉淀，用分子量為3000的超濾濃縮離心管進行離心，除去小分子，得到聚合物。

所述的制備方法，丙酮和乙醚的混合液按體積比＝4:6的比例進行配置。

所述的藤黃酸-半乳糖-HPMA高分子共聚物在治療腫瘤疾病的藥物中的應用。

所述的應用，所述藥物為含有藤黃酸-半乳糖-HPMA高分子共聚物的藥學上可接受的載體或賦形劑的制劑。

所述的應用，所述腫瘤疾病包括肝癌、肺癌、結(jié)腸癌。

本發(fā)明具有以下有益效果：

本發(fā)明將半乳糖、藤黃酸與N-(2-羥丙基)甲基丙烯酰胺的抗腫瘤活性鏈接，由于半乳糖在腫瘤細胞中的受體相結(jié)合，增強了共聚藥物的靶向性，同時大大延長了抗癌藥物在腫瘤的停留時間。該共聚物具有靶向性智能釋放藥物的功能，對肝癌、肺癌和結(jié)腸癌具有很好的抑制作用，而且靶向性的增強，在其它組織中分布明顯減少，降低了抗癌藥物的毒性，HPMA同時也體現(xiàn)出良好的生物相溶性，從而減少了對正常組織的傷害。因此，以該聚合物作為腫瘤細胞抑制劑應用于抗腫瘤藥物的制備具有很好的前景。

本發(fā)明首先以D-半乳糖制備為原料，制備半乳糖甲基丙烯酰衍生物C；再將藤黃酸乙二酰胺與甲基丙烯酰反應制備藤黃酸丙烯酰二乙酰胺衍生物D。半乳糖衍生物C、藤黃酸衍生物D和HPMA縮合為藤黃酸-半乳糖-HPMA高分子共聚物。本發(fā)明為增強藤黃酸的片劑、膠囊劑、口服液、顆粒劑及注射劑等多種劑型開發(fā)的可行性，本技術(shù)通過采用HPMA聚合物靶向藥物輸送技術(shù)，半乳糖-受體去唾液酸糖蛋白的受體為靶點，設(shè)計研制藤黃酸HPMA聚合物靶向藥物輸送系統(tǒng)，增加藤黃酸靶向治療作用、降低毒副作用、從而提高生物利用度。

具體實施方式

實施例1一種藤黃酸-半乳糖-HPMA高分子共聚物

其結(jié)構(gòu)如下：

該化合物的制備方法如下：首先以D-半乳糖制備為原料，制備半乳糖衍生物C；再將藤黃酸乙二酰胺與甲基丙烯酰反應制備藤黃酸衍生物D。半乳糖衍生物C、藤黃酸衍生物D和HPMA縮合為藤黃酸-半乳糖-HPMA高分子共聚物。

其中，

1、半乳糖衍生物C的合成，具體包括如下步驟：

1.1)取D-半乳糖2.0g(11.2mmol)的溶解到100mL丙酮中，加入1.0～2.5m L濃硫酸，室溫攪拌過夜，溶液變?yōu)榱咙S色，加入20％的碳酸鉀溶液20mL，析出大量的白色固體，抽濾，蒸出濾液中的丙酮，剩余的濾液用5×40ml的氯仿萃取，再用2×15mL的蒸餾水洗滌氯仿，加入無水硫酸鈉干燥，蒸出氯仿，真空干燥得無色透明的油狀物化合物A2.40g，產(chǎn)率83％。

1.2)取上述化合物A2.4g(9.4mmol)溶解在100m L的二氯甲烷中，加入三乙胺0.948g(9.4mmol)，于冰浴中降溫到0℃左右，將0.979g(9.4mmol)的甲基丙烯酰氯溶于50mL二氯甲烷，用分液漏斗緩慢滴加到上述溶液中，滴完后再反應3h。抽濾掉生產(chǎn)的沉淀，濾液蒸干，加入110mL正己烷，有少量的不溶物，除去后，蒸除正己烷，制的化合物B，為無色的粘稠狀物2.06g，產(chǎn)率68％。

1.3)取2.06g化合物B于100mL的圓底燒瓶中，加入10mL體積比為9:1的三氟乙酸—水的混合物，在室溫下攪拌15分鐘，加入大量的乙醇，抽濾出去溶劑，得淡黃色固體，用乙醇重結(jié)晶，得白色固體1.36g，產(chǎn)率90％.IR(KBr,cm^-1)：3489,3970,2972,2926,2860,1684,1430,1388,1362,1350,1212,1165,1124,1051；¹H NMR(400MHz,D₂O,ppm):δ1.95(s,3H,–OC(CH₃)C＝CH₂),4.08,4.19-4.42,4.63,and 5.04(7H,sugar moiety),6.13(s,1H,–OC(CH₃)C＝CHH),5.57(s,1H,–OC(CH₃)C＝CHH)；MS(ESI)m/z(％):249.3[M+H]⁺.

2、藤黃酸衍生物D的合成，具體包括如下步驟：

取藤黃酸乙二酰胺2.0g(2.98mmol)溶解到80mL二氯甲烷中，加入三乙胺0.905g(8.94mmol)，于冰浴中降溫到0℃左右，將0.343g(3.28mmol)的甲基丙烯酰氯溶于30mL二氯甲烷，用分液漏斗緩慢滴加到上述溶液中，滴完后反應4h。將反應液倒入200mL碳酸鉀溶液(10％)中，分出二氯甲烷層，水相用二氯甲烷萃取兩次，每次50mL，合并二氯甲烷相，二氯甲烷相分別用10％碳酸鉀溶液，水洗滌兩次，加入無水硫酸鈉干燥，蒸出二氯甲烷，真空干燥,硅膠柱層析得黃色固體化合物D 1.93g，產(chǎn)率87％。IR(KBr,cm^-1)：3454,2969,2931,2854,1732,1694,1640,1593,1430,1399,1382,1175,1114,1061；¹H NMR(CDCl₃)δ12.77(s,1H,-OH),7.55(d,1H),6.64(d,1H),6.55(br,1H),6.43(br,1H),5.89-5.79(m,3H),5.42(m,1H),5.23(m,1H),5.07(br,2H),3.48(m,1H),3.24(m,2H),3.21(m,2H),2.61(m,2H),2.40-2.28(m,2H),1.99(m,2H)，1.80-1.70(s,8H),1.66(br,6H),1.58(s,3H),1.51-1.40(m,6H),1.36(br,2H),1.96(s,3H),1.29(s,3H)；MS(ESI)m/z(％):740.1[M+H]⁺.

3、藤黃酸-半乳糖-HPMA高分子共聚物的制備：

稱取HPMA(0.961g,6.71mmol)加入到Shleck瓶中，用4.0m L的DMSO加熱溶解，再加入2.0m L丙酮，D-半乳糖單體(0.10g,0.040mmol)和藤黃酸單體(0.298g,0.040mmol)攪拌直至溶解，待冷卻至室溫,加入0.068g(5％,wt)偶氮而異丁腈(AIBN)，抽真空充氮氣循環(huán)3次，密封后保持溫度大約在55℃反應24小時。用丙酮和乙醚的混合液沉淀(體積比＝4:6)，過濾后用5mL無水甲醇溶解沉淀，用分子量為3000的超濾濃縮離心管進行離心，除去小分子，得到聚合物0.89g，產(chǎn)率67％。Mn＝2.2×10⁴，Mw/Mn＝1.45.IR(KBr,cm^-1):3436,3380,2967,2923,2855,1736,1773,1642,1593,1504,1483,1457,1431,1382,1329,1304,1228,1173,1136,1114,1039,999；¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆):12.83(OH of Gambogic acid),7.62-7.45(Gambogic acid),6.10-5.4(alkene of gambogic acid),3.94-5.05(Galactose),3.59(CH₃CH(OH)CH₂NH of HPMA),3.40-3.05(CH₃CH(OH)CH₂NH of HPMA and-CH₂-CH＝CH₂of gambogic acid),1.34-1.80(-CH₂-of polymer backbone),1.29(-CH₃of gambogic acid),0.96-0.55(-CH₃of polymer backbone).

實施例2藤黃酸-半乳糖-HPMA高分子共聚物的藥效學試驗

以實施例3提供的共聚物為受試樣品，表示了如以下藥效學試驗所示的優(yōu)良抗腫瘤作用。

對于各種癌細胞的抑制生長活性(GI₅₀)測定方法：腫瘤細胞經(jīng)胰蛋白酶消化后，分散成單個細胞，并使其懸浮在含青霉素(25U/m1)和鏈霉素(25μg/ml)的RPMI1640培養(yǎng)基中。將細胞接種于96孔培養(yǎng)板(Corning Incorporated)，在37℃，含5％CO₂的空氣，相對濕度100％條件下培養(yǎng)24小時后，棄去培養(yǎng)液，加入含一系列濃度受試樣品(相當于等量的藤黃酸)的培養(yǎng)液，每一濃度設(shè)平行孔，培養(yǎng)24小時后，棄去含受試樣品的培養(yǎng)液，加入常規(guī)培養(yǎng)液培養(yǎng)48小時后，棄去培養(yǎng)液，再代之以含噻唑藍(MTT，美國Sigma公司產(chǎn)品)培養(yǎng)液，MTT終濃度為0.5g/L，繼續(xù)溫育4小時后加二甲基亞砜溶解液，1小時后紫色結(jié)晶完全溶解，在SK601型酶標儀(日本國Seikagaku公司產(chǎn)品)檢測570nm/630nm的光密度(OD)。按下式計算受試樣品對腫瘤細的半數(shù)生長抑制率：

(T-T₀)/(C-T₀)×100％

注：C表示對照組細胞的OD值

T表示加受試樣品組細胞的OD值

T₀表示加受試樣品時對照平板細胞的OD值

受試樣品對于各種癌細胞的抑制作用，結(jié)果見表1。

表1藤黃酸共聚物和藤黃酸對腫瘤細胞的抑制作用

實施例3藤黃酸-半乳糖-HPMA高分子共聚物的安全性試驗(急性毒性)

藤黃酸-半乳糖-HPMA高分子共聚物通過小鼠灌胃給藥結(jié)果顯示，共聚物均對循環(huán)系統(tǒng)有一定毒性，大劑量組動物在給藥后10～24小時出現(xiàn)可見少動部分小鼠排稀糞，肛門周圍有淺黃色稀糞污染。死亡發(fā)生在給藥后24～48小時內(nèi)，對死亡小鼠進行解剖，肝臟變白，其余臟器未見異常。對各組存活小鼠連續(xù)觀察14天，攝食、飲水、一般狀態(tài)及活動情況均未見異常，觀察期結(jié)束后處死小鼠，肉眼觀察肝臟及主要器官均未見異常。

共聚物對循環(huán)系統(tǒng)有一定的毒性，給藥后造成小鼠肝損傷，其LD₅₀為大于1.0g/kg，毒性靶器官主要為肝臟。

如上述藥理試驗結(jié)果表明，本發(fā)明化合物(藤黃酸-半乳糖-HPMA高分子共聚物)顯示了優(yōu)良的靶向抗腫瘤作用，作為抗腫瘤劑，對于預防、治療疾病，特別是處置癌是有效的。將本發(fā)明的化合物用于這樣的用途時，可制成含有本發(fā)明化合物的有效量和藥學容許的載體或賦形劑的制劑。

作為抗腫瘤劑使用本發(fā)明化合物的給藥形態(tài)，可選擇各種形態(tài)，例如可舉出片劑、膠囊劑、粉劑、顆粒劑或液劑等的經(jīng)口制劑等。