本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥技術(shù)和納米醫(yī)學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種表面結(jié)合載藥納米粒的干細(xì)胞腫瘤靶向系統(tǒng)的構(gòu)建。

背景技術(shù)：

盡管經(jīng)歷了30年的發(fā)展，傳統(tǒng)的抗癌藥物仍然存在非特異性靶向腫瘤部位、劑量依賴性毒副作用的缺點(diǎn)。將緩控釋技術(shù)和靶向遞送技術(shù)相結(jié)合有助于攻克上述難題。納米技術(shù)的出現(xiàn)為抗腫瘤藥物的有效遞送提供了可能。包封藥物的聚合物納米粒能達(dá)到長期緩釋或環(huán)境響應(yīng)型釋放的效果，使藥物濃度長期維持在治療范圍內(nèi)，減少了毒副作用。載藥納米粒也能通過EPR效應(yīng)被動(dòng)靶向腫瘤部位，或者通過表面連接配體主動(dòng)靶向。但是這樣的靶向遞送方式仍然存在體內(nèi)循環(huán)不穩(wěn)定易被網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)(RES)快速消除、難以跨越生理屏障而無法在腫瘤部位有效蓄積達(dá)到治療濃度等問題。

受病原體吸附于紅細(xì)胞表面而有效逃避RES消除作用的啟發(fā)，細(xì)胞載體開始被應(yīng)用于抗腫瘤藥物靶向遞送。間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)因?yàn)榫哂斜举|(zhì)的腫瘤趨向性和遷移能力、低免疫原性和內(nèi)因性突變率、易于分離和體外培養(yǎng)等優(yōu)點(diǎn)而成為最具有應(yīng)用價(jià)值的細(xì)胞載體。目前對于以MSCs為載體的研究主要集中于遞送細(xì)胞因子(腫瘤壞死因子相關(guān)的誘導(dǎo)凋亡配體TRAIL、白細(xì)胞介素IL-12)、酶和前藥(胞嘧啶脫氨酶CD和5-氟胞嘧啶5-FC)、溶瘤病毒，用于治療腦膠質(zhì)瘤。

近年來也有研究嘗試以MSCs為細(xì)胞載體，與載藥納米粒通過細(xì)胞內(nèi)吞或膜表面結(jié)合的方式，構(gòu)建干細(xì)胞-納米?；旌陷d體以高效遞送抗腫瘤藥物的遞送系統(tǒng)。CN 104771764 A公布了一種內(nèi)載納米前藥的干細(xì)胞腫瘤靶向系統(tǒng)stem cells-(RGD-PPCD)_n，以細(xì)胞內(nèi)吞的方式將納米前藥加載于干細(xì)胞內(nèi)制備抗腫瘤靶向系統(tǒng)，結(jié)合了納米前藥的靶向、緩釋與酸敏釋放特性和干細(xì)胞載體的遠(yuǎn)程靶向腫瘤原發(fā)灶及轉(zhuǎn)移灶的特性。但是，在MSCs膜表面結(jié)合載藥納米粒構(gòu)建干細(xì)胞-納米?；旌陷d體的領(lǐng)域還少有涉及。通過膜表面結(jié)合的方式構(gòu)建的系統(tǒng)，抗腫瘤藥物不會(huì)直接作用于干細(xì)胞載體，能減少對其活性、腫瘤趨向性的影響；納米粒釋藥也不會(huì)受到干細(xì)胞載體P糖蛋白外排、膜被動(dòng)擴(kuò)散的影響，更容易調(diào)控釋放曲線，以實(shí)現(xiàn)藥物在腫瘤部位有效富集并持續(xù)釋放的目的。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種干細(xì)胞表面結(jié)合載藥納米粒的技術(shù)，應(yīng)用于腫瘤靶向治療。

具體而言，是以合成材料Bio-Chi作為抗腫瘤藥物Cur的納米粒載體，再以生物素化的MSCs作為細(xì)胞載體，通過親和素架橋連接納米粒表面生物素和MSCs表面生物素，制備干細(xì)胞-納米?；旌陷d體用于腫瘤靶向遞送，具有以下通式：Cur/Bio-Chi-S-B-MSCs。

所述的MSCs為鼠源脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞。

所述的Bio-Chi是由生物素的羧基與殼聚糖的氨基經(jīng)縮合反應(yīng)形成酰胺鍵制得，結(jié)構(gòu)為：

其中Bio-Chi的殼聚糖分子量為5-200k，生物素取代度為1.91-45.82％。優(yōu)選的分子量為200k，取代度為45.82％。

合成方法如下：將殼聚糖溶于1％鹽酸溶液中溶脹過夜，用pH＝5.5的2-嗎啉乙磺酸鈉緩沖液稀釋至所需濃度。將生物素、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽、N-羥基丁二酰亞胺溶于DMSO與DMF的混合溶劑中，室溫?cái)嚢?h。將活化的生物素逐滴加入攪拌中的殼聚糖溶液中，持續(xù)攪拌24h，過濾除去不溶物。置于透析袋中用去離子水透析2天，冷凍干燥。

所述的載藥納米粒Cur/Bio-Chi的制備方法如下：將含1mg Cur的乙醇溶液，以體積比1/4-3/4，滴加入濃度為2-10mg/mL的含10mg Bio-Chi的1％醋酸溶液中。置于50℃水浴中持續(xù)攪拌30min。用50W探頭超聲處理30min，透析6h，過0.8μm親水性微孔濾膜，用PBS稀釋到所需濃度。

在上述制備過程中，乙醇溶液與1％醋酸溶液的體積比為1/4，Bio-Chi的濃度為10mg/mL。

將制得的Cur/Bio-Chi置于透析袋(MWCO＝14,000)中，兩端扎緊，浸入pH＝7.4、6.5、5.5的釋放介質(zhì)中。在預(yù)定時(shí)間點(diǎn)收集釋放介質(zhì)，加入等量乙醇劇烈渦旋，根據(jù)λ＝431nm處的吸光度值計(jì)算釋放量，繪制釋放曲線。

所述的干細(xì)胞-納米?；旌陷d體，通過親和素架橋連接Cur/Bio-Chi表面生物素和B-MSCs表面生物素。首先檢測藥物、聚合物材料、載藥納米粒對MSCs的細(xì)胞毒性。將含2-200μg/mL Cur的Cur溶液、Cur/Bio-Chi溶液，含0.05-5mg/mL的Bio-Chi溶液與MSCs共同孵育24h，用MTT法檢測細(xì)胞生存率。

制備方法如下：將MSCs與0.5mL濃度為0.1-1mg/mL的sulfo-NHS-LC-Biotin的PBS溶液孵育20min。同時(shí)，將0.25mL濃度為100-200μg/mL的RBITC-親和素的PBS溶液與0.25mL含25-100μg/mL Cur的Cur/Bio-Chi的PBS溶液避光孵育20min。將0.5mL RBITC-親和素和Cur/Bio-Chi的混合溶液與B-MSCs孵育20min。

在上述制備過程中，sulfo-NHS-LC-Biotin的濃度為0.5mg/mL，RBITC-親和素的濃度為150μg/mL，Cur/Bio-Chi的濃度為100μg/mL Cur。

將與MSCs孵育前、孵育后的Cur/Bio-Chi溶液適當(dāng)稀釋后，加入等量乙醇劇烈渦旋，根據(jù)λ＝431nm處的吸光度差值定量計(jì)算細(xì)胞載藥量。將孵育完成后的Cur/Bio-Chi-S-B-MSCs用倒置熒光顯微鏡觀察，并用胰酶消化，PBS重懸，用流式細(xì)胞儀對RBITC、Cur的熒光進(jìn)行檢測，定性檢測MSCs對Cur/Bio-Chi的加載。

本發(fā)明構(gòu)建的表面結(jié)合載藥納米粒的干細(xì)胞腫瘤靶向系統(tǒng)，將具有如下優(yōu)勢：

1、將抗腫瘤藥物特異性遞送至腫瘤部位，并在腫瘤部位富集。

2、抗腫瘤藥物能在腫瘤部位持續(xù)緩慢釋放。

3、抗腫瘤藥物不會(huì)直接作用于干細(xì)胞載體，減少對其活性、腫瘤趨向性的影響。

4、抗腫瘤藥物的釋放只與聚合物載體的相互作用有關(guān)，釋放曲線易于控制。

附圖說明

圖1 Chi與Bio-Chi的紅外圖譜

圖2 Bio-Chi在不同pH的介質(zhì)中的釋放曲線

圖3 Bio-Chi對MSCs的細(xì)胞毒性

圖4 Cur、Cur/Bio-Chi對MSCs的細(xì)胞毒性

圖5 MSCs的生物素化檢驗(yàn)

圖6 親和素濃度對MSCs表面結(jié)合載藥納米粒的影響

圖7 Cur/Bio-Chi濃度對MSCs表面結(jié)合載藥納米粒的影響

具體實(shí)施方式

下面具體實(shí)施例是對本發(fā)明的進(jìn)一步說明，但下述僅用于說明本發(fā)明而非用于限定本發(fā)明的范圍。

實(shí)施例1：Bio-Chi的合成與表征

將90mg殼聚糖溶于1％鹽酸溶液中溶脹過夜，用pH＝5.5的2-嗎啉乙磺酸鈉緩沖液稀釋至20mL。將120mg生物素、84mg EDC、56mg NHS溶于6mL DMSO與DMF的混合溶劑中，室溫?cái)嚢?h。將活化的生物素逐滴加入攪拌中的殼聚糖溶液中，持續(xù)攪拌24h，過濾除去不溶物。置于透析袋中去離子水透析2天，冷凍干燥。

對合成的Bio-Chi進(jìn)行紅外光譜分析，結(jié)果顯示在1635.6cm^-1處出現(xiàn)酰胺鍵的伸縮振動(dòng)峰，在1531.9cm-1處出現(xiàn)生物素咪唑酮環(huán)的酰胺鍵的伸縮振動(dòng)峰，表明生物素與殼聚糖已經(jīng)化學(xué)鍵合(附圖1)。

實(shí)施例2：Cur/Bio-Chi的制備與表征

稱取10mg Bio-Chi，溶于1mL 1％醋酸溶液中，溶脹過夜。室溫?cái)嚢柘?，?.25mL 4mg/mL的Cur乙醇溶液滴加入Bio-Chi溶液中。50℃水浴中持續(xù)攪拌30min，50W探頭超聲處理30min，透析6h除去有機(jī)溶劑，過0.8μm親水性微孔濾膜，用PBS稀釋到所需濃度。

用激光粒度分析儀測定Cur/Bio-Chi的粒徑為360.2±2.6nm，電位為9.6±1.9mV。取適量納米粒溶液，加入等量乙醇劇烈渦旋，測定λ＝431nm處的吸光度值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算納米粒溶液中的Cur含量，并按照下式計(jì)算包封率：包封率％＝W_Cur納米粒/W_Cur投料×100％。計(jì)算得到Cur/Bio-Chi的包封率為54.7±2.4％。

實(shí)施例3：Cur/Bio-Chi的釋放曲線

取0.4mL Cur/Bio-Chi，用10mM PBS 7.4稀釋至2mL，置于透析袋(MWCO＝14,000)中，兩端扎緊，浸入5mL含0.1％吐溫80的10mM PBS(pH＝7.4、6.5、5.5)中。在恒溫37℃，轉(zhuǎn)速為100rpm條件下進(jìn)行釋放。在預(yù)定時(shí)間點(diǎn)2、4、8、12、24、36、48、60、72、96、120、144、168h，收集釋放介質(zhì)并更換5mL新鮮介質(zhì)。取1mL收集的釋放介質(zhì)，加入1mL乙醇，劇烈渦旋5min，紫外-可見分光光度計(jì)測定λ＝431nm處的吸光度值，計(jì)算釋放量，繪制釋放曲線。

結(jié)果表明，在pH＝7.4環(huán)境中，Cur/Bio-Chi能保持持續(xù)緩慢釋放Cur長達(dá)7天以上；在酸性環(huán)境中，Cur/Bio-Chi出現(xiàn)了一個(gè)突釋，而后再持續(xù)釋放，釋放更完全、釋放速度更快(附圖2)。

實(shí)施例4：藥物與載體材料的細(xì)胞毒性

將對數(shù)生長期的MSCs按每孔1×104個(gè)細(xì)胞接種于96孔板，100μL DMEM高糖完全培養(yǎng)基/孔，培養(yǎng)24h，使細(xì)胞匯合度為70-80％。吸去培養(yǎng)基，每孔加入200μL含2-200μg/mL Cur的Cur溶液、Cur/Bio-Chi溶液、含0.05-5mg/mL的Bio-Chi溶液。24h后，吸去培養(yǎng)基，PBS清洗，每孔加入100μL含10％MTT溶液(5mg/mL，pH＝7.4PBS)的DMEM高糖完全培養(yǎng)基，37℃繼續(xù)孵育4h。輕輕吸除培養(yǎng)基，每孔加入150μL DMSO，室溫振蕩10min，用酶聯(lián)免疫測定儀于570nm測定吸光度。以未經(jīng)陽離子聚合物處理的細(xì)胞作為對照，計(jì)算細(xì)胞生存率，細(xì)胞生存率(％)＝OD570(實(shí)驗(yàn)組)/OD570(對照組)×100。

結(jié)果表明，Bio-Chi的細(xì)胞毒性小，細(xì)胞相容性好(附圖3)。Cur對MSCs有一定的細(xì)胞毒性，但是經(jīng)Bio-Chi包封后，細(xì)胞毒性顯著減小，在100μg/mL Cur的高濃度下孵育24h，細(xì)胞生存率仍能達(dá)到80％以上，所以孵育20min以及負(fù)載低濃度的Cur/Bio-Chi產(chǎn)生的細(xì)胞毒性可忽略不計(jì)(附圖4)。

實(shí)施例5：MSCs的細(xì)胞表面生物素化與檢驗(yàn)

將MSCs接種于24孔板，37℃培養(yǎng)過夜。將MSCs與0.5mL濃度為0.1-1mg/mL的sulfo-NHS-LC-Biotin的PBS溶液室溫孵育20min，以0.5mL PBS溶液為空白對照。吸除介質(zhì)，避光加入0.5mL濃度為50μg/mL的RBITC-親和素的PBS溶液，室溫孵育20min。吸除介質(zhì)，胰酶消化后用PBS重懸，用流式細(xì)胞儀對RBITC的熒光強(qiáng)度進(jìn)行檢測。

結(jié)果表明，未經(jīng)生物素化的MSCs(PBS組)幾乎不結(jié)合RBITC-親和素。經(jīng)濃度為0.1、0.5、1mg/mL的sulfo-NHS-LC-Biotin生物素化后，B-MSCs結(jié)合的RBITC熒光逐漸增強(qiáng)。當(dāng)達(dá)到一定濃度后(≥0.5mg/mL)，熒光標(biāo)記細(xì)胞數(shù)與熒光強(qiáng)度都趨于穩(wěn)定(附圖5)。

實(shí)施例6：Cur/Bio-Chi-S-B-MSCs的最佳親和素濃度考察

將MSCs接種于24孔板，37℃培養(yǎng)過夜。將MSCs與0.5mL濃度為0.5mg/mL的sulfo-NHS-LC-Biotin的PBS溶液室溫孵育20min。同時(shí)，將0.25mL濃度為100-200μg/mL的親和素的PBS溶液與0.25mL含50μg/mL Cur的Cur/Bio-Chi的PBS溶液避光孵育20min。將0.5mL親和素和Cur/Bio-Chi的混合溶液與B-MSCs孵育20min。吸除介質(zhì)，胰酶消化后用PBS重懸，用流式細(xì)胞儀對Cur的熒光強(qiáng)度進(jìn)行檢測。

結(jié)果表明，隨親和素濃度增加，能結(jié)合更多的Cur/Bio-Chi使細(xì)胞表面載藥量增加。但到達(dá)一定濃度后(＞150μg/mL)細(xì)胞表面載藥量會(huì)達(dá)到飽和(附圖6)。

實(shí)施例7：Cur/Bio-Chi-S-B-MSCs的最佳Cur/Bio-Chi濃度考察

將MSCs接種于24孔板，37℃培養(yǎng)過夜。將MSCs與0.5mL濃度為0.5mg/mL的sulfo-NHS-LC-Biotin的PBS溶液室溫孵育20min。同時(shí)，將0.25mL濃度為150μg/mL的親和素的PBS溶液與0.25mL含25-100μg/mL Cur的Cur/Bio-Chi的PBS溶液避光孵育20min。將0.5mL親和素和Cur/Bio-Chi的混合溶液與B-MSCs孵育20min。吸除介質(zhì)，胰酶消化后用PBS重懸，用流式細(xì)胞儀對Cur的熒光強(qiáng)度進(jìn)行檢測。

結(jié)果表明，隨Cur/Bio-Chi的濃度增加，細(xì)胞表面載藥量明顯增加。但考慮到細(xì)胞毒性的影響，Cur/Bio-Chi的濃度不宜過大，所以確定濃度為100μg/mL(附圖7)。

實(shí)施例8：Cur/Bio-Chi-S-B-MSCs的載藥量檢測

將MSCs接種于24孔板，37℃培養(yǎng)過夜。將MSCs與0.5mL濃度為0.5mg/mL的sulfo-NHS-LC-Biotin的PBS溶液室溫孵育20min。同時(shí)，將0.25mL濃度為150μg/mL的親和素的PBS溶液與0.25mL含25-100μg/mL Cur的Cur/Bio-Chi的PBS溶液避光孵育20min。將0.5mL親和素和Cur/Bio-Chi的混合溶液與B-MSCs孵育20min。將與B-MSCs孵育前、后的Cur/Bio-Chi溶液，分別與等量乙醇混合，渦旋混合，測定λ＝431nm處的吸光度值差值。計(jì)算細(xì)胞表面載藥量。

結(jié)果表明，MSCs表面載藥量為54.26±4.18pg Cur/細(xì)胞。

實(shí)施例1-8結(jié)果表明，干細(xì)胞-納米?；旌陷d體可以通過親和素架橋連接Cur/Bio-Chi表面生物素和B-MSCs表面生物素的方式構(gòu)建。本發(fā)明構(gòu)建的一種表面結(jié)合載藥納米粒的干細(xì)胞腫瘤靶向系統(tǒng)，能減小對干細(xì)胞載體活性的影響，在腫瘤部位富集并持續(xù)緩慢釋放藥物以達(dá)到療效，為干細(xì)胞作為腫瘤靶向藥物遞送載體提供一種新的途徑。

以上所述僅是本發(fā)明的具體實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)，這些改進(jìn)也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。