一種新型免標記模式識別細胞儀方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及細胞分類識別，特別是利用免標記細胞儀獲取細胞的光散射圖樣信 息，然后對光散射圖樣進行模式識別，實現(xiàn)免標記、自動化細胞計數(shù)或分類功能。
【背景技術】
[0002] 傳統(tǒng)流式細胞儀可用于細胞的分析和分選。一般說來，傳統(tǒng)流式細胞儀需對細胞 進行染色處理，而熒光染色或者其他生物標記可能會對細胞產生一定的影響，特別是在活 體細胞功能研究方面。其次，熒光測量所需光路復雜，這直接增加了儀器成本，而且熒光測 量需要對儀器進行校準，操作復雜，需要專業(yè)人員。最后，在后期信號處理方面，由于熒光發(fā) 射光譜之間可能存在相互重疊，需要進行補色等操作，而且現(xiàn)有常規(guī)流式細胞儀在后期細 胞分類識別方面，只能根據(jù)預定的物理、化學特征參量范圍識別相應的細胞亞群，缺乏自動 的機器學習并進行分類識別的功能，特別是在免標記、自動化細胞分類識別方面。
[0003] 臨床上宮頸癌的篩查主要借助于宮頸細胞學檢查以及HPV免疫檢測。對于宮頸細 胞學檢查而言，首先從宮頸組織上采集脫落的宮頸細胞，將其染色、制片，然后由臨床病理 學醫(yī)師在顯微鏡下進行人工閱片。有經驗的醫(yī)師可較為準確的判別宮頸正常與癌變細胞， 有時可能需要進行HPV檢測和陰道鏡活檢以便確診。宮頸細胞學檢查過程步驟復雜，耗時 長，并且人工閱片需要醫(yī)師具有豐富的臨床經驗，閱片結果具有較強的主觀性。HPV檢測和 陰道鏡活檢準確率高但較難普及。

【發(fā)明內容】

[0004] 本發(fā)明公開了一種新型免標記模式識別細胞儀方法，在獲得免標記細胞或細胞聚 集群的二維光散射圖樣的基礎上，對散射圖樣進行模式識別，達到免標記、自動化細胞計數(shù) 與分類識別的目的。該方法在樣本處理方面，克服了傳統(tǒng)流式細胞儀需要進行熒光染色的 缺點，實現(xiàn)了免標記的樣本處理；在光路系統(tǒng)上克服了傳統(tǒng)流式細胞儀光路復雜、成本高的 缺點；在信號處理方面，創(chuàng)新性的采用了模式識別來進行散射圖樣的自動分類識別。以上技 術的有機集成實現(xiàn)了細胞分類方法上的創(chuàng)新。在使用效果方面，該創(chuàng)新方法可用于細胞聚 集群數(shù)量的快速識別，也對正常宮頸細胞與癌變的宮頸HeLa細胞實現(xiàn)了免標記識別。
[0005] -種新型免標記模式識別細胞儀方法，具體方案包括以下步驟：
[0006] 配制出待測免標記細胞溶液并導入微流通道中或制成細胞懸液芯片；
[0007] 激光光源發(fā)出的光經過四倍物鏡耦合進入光纖，光纖傳導激光并激發(fā)微流通道或 細胞懸液中的單細胞或多細胞聚集群，形成分布于三維空間的散射光；
[0008] 散射光經過光學成像系統(tǒng)，被二維CMOS探測器探測并獲取待測細胞對應的二維 光散射圖樣；
[0009] 或者，散射光無需經過光學成像系統(tǒng)，被二維CMOS探測器探測并獲取待測細胞對 應的二維光散射圖樣；
[0010] 獲取的二維光散射圖樣傳輸至模式識別分類系統(tǒng)，該系統(tǒng)通過對已知不同細胞種 類的二維光散射圖樣進行機器學習，實現(xiàn)對未知細胞的無標記、自動化識別；
[0011] 識別結果用于觸發(fā)免標記模式識別細胞儀自動化細胞計數(shù)或細胞分類系統(tǒng)。
[0012] 進一步的，二維光散射圖樣獲取對應的裝置包括：光源系統(tǒng)，用于產生激光光源激 發(fā)被測細胞的散射光；二維光散射圖樣探測記錄系統(tǒng)，記錄收集被測細胞的散射光；模式 識別分類系統(tǒng)，通過數(shù)據(jù)處理及機器學習進行自動分類識別；細胞計數(shù)或細胞分類系統(tǒng)，包 括數(shù)字計數(shù)器以及機械式分類裝置。
[0013] 進一步的，散射光經過光學成像系統(tǒng)，獲取待測細胞對應的二維光散射圖樣時，需 要移動調整三維位移臺尋找激光匯聚點，使激光光源經過四倍物鏡后能以最佳耦合狀態(tài)進 入光纖中，光纖的另一端作為探針用于激發(fā)微流通道或細胞懸液中的單細胞或細胞聚集 群。
[0014] 進一步的，微流通道中待測溶液中的細胞被激光激發(fā)產生的散射光，經過光學成 像系統(tǒng)或不經過光學成像系統(tǒng)；
[0015] 經過光學成像系統(tǒng)時，微流通道或細胞懸液中待測的細胞被激光激發(fā)產生散射 光，該散射光通過十倍物鏡觀測，調整十倍物鏡，觀察到細胞的原圖像，對該物鏡去焦，在 CMOS二維傳感器上獲得散射光圖樣。
[0016] 不經過光學成像系統(tǒng)，即不需要任何光學成像透鏡，散射光經過一物理孔徑，直接 在CMOS平面上形成二維光散射圖樣。
[0017] 進一步的，模式識別算法采用增強AdaBoost算法，對已檢測的N個二維光散射圖 樣，選取出N-I個已知分類的圖樣進行訓練，獲得一組模式識別的弱分類器，然后用此弱分 類器組合對原先第N個圖樣進行測試，通過循環(huán)測試選出最強的弱分類器組合，最終得到 對待測細胞分類識別的高準確率。
[0018] 進一步的，上述方法用于酵母細胞聚類群的分類。
[0019] 進一步的，上述方法用于正常宮頸細胞和癌變宮頸細胞的分類。
[0020] 本發(fā)明的有益效果：
[0021] (1)本發(fā)明提出的新型免標記模式識別細胞儀裝置簡便，克服了傳統(tǒng)流式細胞儀 光路復雜、設備昂貴、操作繁瑣等缺點，可簡便快速獲得二維光散射圖樣。
[0022] (2)本發(fā)明采用的無標記技術，克服了傳統(tǒng)流式細胞儀需要對細胞進行熒光染色， 從而可能造成細胞樣本損傷的問題，可避免熒光染色對細胞特別是活細胞功能造成的干 擾。
[0023] (3)本發(fā)明提出的新型免標記模式識別細胞儀可實現(xiàn)對細胞或細胞群的免標記、 自動化分類識別，即通過自動化的模式識別算法達到對待測細胞的分類識別。
[0024] (4)本發(fā)明提出的新型免標記模式識別細胞儀泛化能力強，可廣泛用于不同細胞 的分類識別。
[0025] (5)本發(fā)明分析過程可操作性強，可以選取恰當數(shù)目的弱分類器組成強分類器，盡 可能的提高識別準確率。獲得強分類后，操作人員只需輸入檢測圖像就可以自動的獲取分 類識別結果。
[0026] (6)本發(fā)明所提出的免標記、自動化模式識別細胞術，可用于激發(fā)相應的物理計數(shù) 器或者分選器，實現(xiàn)對細胞的計數(shù)、分選功能。
[0027] (7)本發(fā)明提供了一種新型的進行細胞群數(shù)量區(qū)分的判斷方法。
[0028] (8)本發(fā)明提供了一種新型的進行正常宮頸細胞和癌變的HeLa細胞分類的判斷 方法。
【附圖說明】
[0029] 圖1為本發(fā)明裝置的結構及原理圖，
[0030] 圖2 (a)-圖2 (d)單個酵母細胞模擬圖和實驗散射圖對比；
[0031] 圖3(a)-圖3(d)不同數(shù)量酵母細胞聚集群原圖、散射圖對比；
[0032] 圖4(a) -圖4(d)正常宮頸細胞和HeLa細胞原圖、散射圖對比；
[0033] 圖1中：1、激光光源，2、四倍物鏡，3、光纖耦合器，4、微流通道或細胞懸液芯片，5、 十倍物鏡或物理孔徑，6、二維CMOS探測器，7、模式識別系統(tǒng)，8分類系統(tǒng)；
[0034] 表1不同數(shù)量酵母細胞聚集群分類結果；
[0035] 表2正常宮頸細胞和HeLa細胞分類結果。
【具體實施方式】：
[0036] 下面結合附圖對本發(fā)明進行詳細說明：
[0037] 如圖1所示，一種新型免標記模式識別細胞儀主要由光源系統(tǒng)、二維光散射圖樣 探測記錄系統(tǒng)、數(shù)據(jù)處理分類系統(tǒng)構成。其中光源系統(tǒng)包括激光光源1，四倍物鏡2,光纖耦 合器3,微流通道或細胞懸液芯片4 ;二維光散射圖樣探測記錄系統(tǒng)包括十倍物鏡或物理孔 徑5,二維CMOS探測器6 ;數(shù)據(jù)處理分類系統(tǒng)構成分析系統(tǒng)包括模式識別系統(tǒng)7,分類系統(tǒng) 8〇
[0038] 本發(fā)明的二維光散射圖樣檢測系統(tǒng)包括單細胞及細胞聚集群的光散射激發(fā)系統(tǒng)， 微流控或細胞懸液芯片系統(tǒng)，以及二維光散射圖樣獲取系統(tǒng)。本發(fā)明的數(shù)據(jù)處理分類系統(tǒng) 采用模式識別算法來進行二維光散射圖樣的后期數(shù)據(jù)處理，實現(xiàn)了對單細胞以及細胞群的 免標記、自動化分類識別。本發(fā)明以模式識別中的AdaBoost機器學習算法為例，但不局限 于使用該特定的模式識別方法進行細胞光散射圖樣的識別。本發(fā)明不依賴于傳統(tǒng)的熒光染 色以及人工分類，通過對散射圖樣的模式識別，實現(xiàn)了對不同數(shù)量酵母細胞群以及宮頸細 胞不同病理狀態(tài)的免標記、自動化分類識別。本發(fā)明應用范圍可推廣到一般生物細胞的生 理、病理分析。本發(fā)明所公開的新型免標記模式識別細胞儀方法，無需對細胞進行復雜的熒 光染色，可免標記、自動化實現(xiàn)對待測細胞的分類、識別，以及后期的計數(shù)、分選等，操作簡 便快捷，結果準確可靠，顯著降低分析成本，應用范圍廣泛。
[0039] 下面結合附圖1對本發(fā)明進行具體操作步驟的詳細說明：
[0040] 步驟一：配制待測細胞溶液，根據(jù)不同的待測細胞配制溶液的方法不盡相同。
[0041 ] 步驟二：將待測細胞溶液導入微流通道4或制成細胞懸液芯片4。
[0042] 步驟三：打開激光光源1，激光光源1采用532nm波長綠色激光二極管栗浦固體激 光器（DPSS)。二極管栗浦固體激光器具有工作時間長、效率高、耗能低、熱效應小、體積小等 顯著的優(yōu)勢。為了保證直徑為1.0 mm的激光光束能最大限度的耦合進入直徑105 μπκ數(shù)值 孔徑（NA)為0. 22的光纖中，本發(fā)明選擇數(shù)值孔徑為0. 1的四倍物鏡2以提高耦合效率。
[0043] 步驟四：不斷移動調整校準激光耦合器使激光光源經過四倍物鏡2后，能以最佳 耦合狀態(tài)進入光纖耦合器3中光纖一端。光纖耦合器3的光纖另一端作為探針