背景技術(shù)：

已經(jīng)表明，癌癥具有多種機制來阻止免疫應(yīng)答的激活并逃避免疫應(yīng)答。因此，單一處理，如用疫苗免疫，可能不足以滿足臨床效力。

發(fā)明概述

公開了用于治療一施用對象(受試者)中癌癥的方法。該方法包括向該對象施用一組合物，所述組合物包含治療有效量的檢查點抑制劑和治療有效量的腫瘤疫苗。在一些實施方案中，腫瘤疫苗包含經(jīng)輻射(照射)的自體腫瘤細胞和經(jīng)工程改造的表達GM-CSF和CD40配體的細胞系。

在一些情況下，所述疫苗包含一株、兩株或更多個人肺腺癌細胞系以及經(jīng)工程化以分泌GM-CSF和表達CD40配體(GM.CD40L)的和旁鄰細胞系的混合物。預(yù)計在疫苗位點的GM-CSF分泌會募集并分化樹突狀細胞(DC)，其將通過它們與旁鄰細胞表面上的CD40配體的相遇而被激活。這些激活的和負載抗原的DC將遷移到引流淋巴結(jié)并激活腫瘤抗原特異性T細胞(CD4和CD8)。這些活化的T細胞然后將再循環(huán)至(癌細胞)轉(zhuǎn)移性的位點并殺死腫瘤細胞。

細胞系可進一步工程化以表達選自下組的一個或多個因子：IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-15、促紅細胞生成素、GCSF、M-CSF、血小板衍生生長因子(PDGF)、MSF、FLT-3配體、EGF，成纖維細胞生長因子(FGF)、bFGF(FGF-2)、FGF-3、FGF-4、FGF-5、FGF-6、FGF-7、胰島素樣生長因子(IGF-1)、胰島素樣生長因子2(IGF-2)；血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、IFN-γ、IFN-α、IFN-β、白血病抑制因子(LIF)、睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子(CNTF)、抑瘤素M、干細胞因子(SCF)、TGF-a、和TGF-β1。所述細胞系優(yōu)選是MHC陰性的，并且可以是腫瘤細胞系。

所公開的疫苗與免疫檢查點的組合可以放大T細胞應(yīng)答并增強腫瘤浸潤性T細胞的功效，因此與單一試劑相比產(chǎn)生更有效的抗腫瘤效果。在一些實施方案中，所述檢查點抑制劑包括抗PD-1抗體(例如BMS936558)、抗PD-L1抗體(例如克隆M1H1)、抗CTLA-4抗體(例如伊匹單抗-Ipilimumab，BMS)、或其組合。

在附圖和下面的描述中闡述了本發(fā)明的一個或多個實施方式的細節(jié)。從說明書和附圖以及從權(quán)利要求書中，本發(fā)明的其它特征、目的和優(yōu)點將是顯而易見的。

詳細描述

腫瘤疫苗通常具有非常少的單一藥劑活性，因為即使它們有效地了擴增淋巴區(qū)(lymphoid compartment)中的腫瘤特異性T細胞，由于暴露于PD-L1，這些T細胞在腫瘤微環(huán)境中變得無活性。因此，有必要將腫瘤疫苗與針對腫瘤微環(huán)境的藥劑進行組合。

為了積極驅(qū)動抗腫瘤免疫應(yīng)答，開發(fā)了治療性的癌癥疫苗。與預(yù)防性地用于治療感染性疾病的預(yù)防性疫苗不同，治療性疫苗被設(shè)計為通過刺激針對特異性腫瘤相關(guān)抗原的免疫應(yīng)答來治療已發(fā)生的癌癥。許多腫瘤相關(guān)抗原是本領(lǐng)域已知的，并且用于檢測它們的方法是公知的。

在一些實施方案中，所述腫瘤疫苗包括作為表達GM-CSF和CD40配體來源的“基因修飾的通用生產(chǎn)細胞”。在一些實施方案中，所述細胞系是MHC分子陰性細胞系，例如K562細胞系(可從美國典型培養(yǎng)物保藏中心獲得，馬納薩斯，VA)－這種細胞的使用應(yīng)該降低引入機體后對細胞的同種異體反應(yīng)的發(fā)生率。在一些情況下，轉(zhuǎn)化的細胞表達外源GM-CSF和CD40配體轉(zhuǎn)基因。

在一些實施方案中，所述細胞系是MHC分子陰性細胞系，例如K562細胞系(可從美國典型培養(yǎng)物保藏中心獲得，Manassas，VA)－這種細胞的使用應(yīng)該降低引入機體后對細胞的同種異體反應(yīng)的發(fā)生率。在一些情況下，轉(zhuǎn)化的細胞表達外源的GM-CSF和CD40配體轉(zhuǎn)基因。

在一些實施方案中，“基因修飾的通用生產(chǎn)細胞”還可以含有和表達編碼選自下組的一種或多種化合物的轉(zhuǎn)基因：IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-15、促紅細胞生成素、G-CSF、M-CSF、血小板衍生生長因子(PDGF)、MSF、FLT-3配體、EGF、成纖維細胞生長因子(FGF；例如aFGF(FGF-1)、bFGF(FGF-2)、FGF-3、FGF-4、FGF-5、FGF-6或FGF-7)、胰島素樣生長因子(例如IGF-1、IGF-2)；血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)；干擾素(例如IFN-γ、IFN-α、IFN-β)；白血病抑制因子(LIF)；睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子(CNTF)；抑瘤素M；干細胞因子(SCF)；轉(zhuǎn)化生長因子(例如TGF-α、TGF-～1、TGF-～1、TGF-～1)。DNA分子可以編碼上述化合物的哺乳動物(包括人或鼠)版本。

在一些實施方案中，將患有腫瘤、癌癥、或惡性疾病的個體的外周血淋巴細胞與抗原呈遞細胞(例如樹突細胞)、表達GM-CSF/CD40L的細胞(或源自GM-CSF/CD40L細胞系的細胞)、以及任選的凋亡自體腫瘤、癌癥或惡性細胞(或來源于它們的抗原)一起培養(yǎng)。然后將培養(yǎng)的細胞作為自體治療的形式再給予患者(參見，例如，美國專利號5,192,537[通過引用整體并入本文])。該方法也適用于經(jīng)歷腫瘤、癌癥或惡性疾病復(fù)發(fā)的患者。在另一個實施方案中，從個體的外周血淋巴細胞除去抑制性T細胞，并將剩余的細胞懸浮在含有表達GM-CSF/CD40L的細胞和經(jīng)輻照的自體腫瘤或癌細胞(或由其衍生的抗原)的組織培養(yǎng)基中。然后將細胞在約37℃至約40℃的溫度下孵育一段時間，以使它們被活化。克隆擴增對腫瘤抗原具有特異性的那些細胞，任選地，對其進行處理以再去除各種類型的抑制細胞和/或提高其活性。活化的細胞可以與表達GM-CSF/CD40L的細胞和/或與一種或多種細胞因子共同施用。

在一些情況下，所述腫瘤疫苗包括(1)提供共享腫瘤抗原來源的經(jīng)輻射的腫瘤細胞(例如自體腫瘤細胞)和(2)經(jīng)工程化以分泌GM-CSF并在其表面表達CD40配體的旁鄰細胞系(GM.CD40L)。在疫苗位點的GM-CSF分泌可以募集并分化DC細胞，其將通過它們與旁鄰細胞表面上的CD40配體的相遇而被激活。然后來自輻射的腫瘤細胞的凋亡小體將由DC細胞處理。

腫瘤疫苗可以與檢查點抑制劑組合使用。兩個已知的抑制性檢查點途徑涉及通過細胞毒性T淋巴細胞抗原-4(CTLA-4)和程序性死亡1(PD-1)受體的信號傳導(dǎo)。這些蛋白質(zhì)是協(xié)調(diào)分子(cosignaling)CD28-B7家族的成員，其在T細胞功能的所有階段中發(fā)揮重要作用。PD-1受體(也稱為CD279)在活化的T細胞的表面上表達。其配體PD-L1(B7-H1；CD274)和PD-L2(B7-DC；CD273)在APC細胞的表面上表達，例如樹突細胞或巨噬細胞。PD-L1是主要配體，而PD-L2具有更受限制的表達模式。當(dāng)配體結(jié)合PD-1時，抑制性信號傳遞到T細胞中，這減少了細胞因子的產(chǎn)生并抑制了T細胞增殖。臨床試驗中免疫檢查點靶向抗體的列表提供在表2中。

針對程序性死亡受體1(PD-1)的人單克隆抗體和單獨使用抗PD-1抗體或與其它免疫治療劑組合治療癌癥的方法描述于美國專利8,008,449中，對這些抗體通過引用并入本文?？筆D-L1抗體及其用途描述于美國專利8,552,154中，對于這些抗體通過引用并入本文。包含抗PD-1抗體或抗PD-L1抗體的抗癌劑描述于美國專利號8,617,546中，對于這些抗體通過引用并入本文。

在一些實施例中，所述PDl1抑制劑包括特異性結(jié)合于PDL1的抗體，例如BMS-936559(百時美施貴寶-Bristol-Myers Squibb)或MPDL3280A(羅氏-Roche)。在一些實施例中，所述PD1抑制劑包括特異性結(jié)合于PD1的抗體，例如lambrolizumab(默克-Merck)、納武單抗(百時美施貴寶)或MEDI4736(阿斯利康-AstraZeneca)。針對PD-1的人單克隆抗體和單獨使用抗PD-1抗體或與其它免疫治療劑組合治療癌癥的方法描述于美國專利8,008,449中，對這些抗體通過引用并入本文?？筆D-L1抗體及其用途描述于美國專利8,552,154中，對于這些抗體通過引用并入本文。包含抗PD-1抗體或抗PD-L1抗體的抗癌劑描述于美國專利號8,617,546中，對于這些抗體通過引用并入本文。

所公開的組合物和方法可以與其他癌癥免疫治療組合使用。有兩種不同類型的免疫治療：被動免疫療法使用免疫系統(tǒng)的組分來指導(dǎo)針對癌細胞的靶向細胞毒活性，而不必在患者中啟動免疫應(yīng)答，而主動免疫療法主動觸發(fā)內(nèi)源性免疫應(yīng)答。被動策略包括使用由B細胞響應(yīng)特異性抗原產(chǎn)生的單克隆抗體(mAb)。1970年代的雜交瘤技術(shù)的發(fā)展和腫瘤特異性抗原的鑒定允許mAb的藥物開發(fā)，其可以特異性靶向腫瘤細胞以被免疫系統(tǒng)破壞。迄今為止，mAb是免疫治療的最大成功案例；2012年最暢銷抗癌藥的前三名是單克隆抗體(mAb)。它們是利妥昔單抗(瑞圖宣-Rituxan，基因泰克-Genentech)，其結(jié)合于在B細胞惡性腫瘤例如非霍奇金淋巴瘤(NHL)的表面上高度表達的CD20蛋白。利妥昔單抗被FDA批準用于與化療聯(lián)合治療NHL和慢性淋巴細胞性白血病(CLL)。另一個重要的單克隆抗體是曲妥珠單抗(赫賽汀Herceptin；基因泰克)，其通過靶向HER2的表達徹底改變了HER2(人表皮生長因子受體2)陽性乳腺癌的治療。

產(chǎn)生最佳“殺傷”CD8T細胞應(yīng)答還需要T細胞受體活化加上共刺激，其可通過連接腫瘤壞死因子受體家族成員(包括OX40(CD134)和4-1BB(CD137))提供。OX40是特別令人感興趣的，因為用活化(激動劑)抗OX40mAb的治療增強了T細胞分化和細胞溶解功能，導(dǎo)致針對多種腫瘤的抗腫瘤免疫增強。

許多抗癌藥物可以與本發(fā)明的方法和組合物組合使用。以下是可以與輻照聯(lián)合使用的抗癌(抗腫瘤)藥物的非窮舉性列表：阿西維辛(Acivicin)、阿柔比星(Aclarubicin)、鹽酸阿扎唑(Acodazole Hydrochloride)；AcrQnine；阿多來新(Adozelesin)；阿地白介素(Aldesleukin)；六甲蜜胺(Altretamine)；安博霉素；乙酸阿美蒽醌(Ametantrone Acetate)；氨魯米特(Aminoglutethimide)；安吖啶(Amsacrine)；阿那曲唑；安曲霉素；天冬酰胺酶；曲林菌素(Asperlin)；阿扎胞苷；阿扎替派(Azetepa)；阿佐霉素(Azotomycin)；巴馬司他(Batimastat)；苯佐替派(Benzodepa)；比卡魯胺(Bicalutamide)；鹽酸必?？?Bisantrene Hydrochloride)；雙奈法德(Bisnafide Dimesylate)；比折來新(Bizelesin)；硫酸博來霉素；布喹那鈉(Brequinar Sodium)；溴匹立明(Bropirimine)；白消安；放線菌素；卡普睪酮(Calusterone)；卡拉酰胺；卡貝替姆(Carbetimer)；卡鉑；卡莫司?。畸}酸卡米諾霉素(Carubicin Hydrochloride)；卡折來新(Carzelesin)；西地芬戈(Cedefingol)；苯丁酸氮芥；西羅霉素(Cirolemycin)；順鉑；克拉屈濱；甲磺酸克雷斯托(Crisnatol Mesylate)；環(huán)磷酰胺(Cyclophosphamide)；阿糖胞苷；達卡巴嗪；更生霉素；鹽酸柔紅霉素；地西他濱；右奧馬鉑(Dexormaplatin)；地扎胍寧(Dezaguanine)；甲磺酸地扎胍寧；亞絲醌(Diaziquone)；多西他賽；多柔比星；鹽酸多柔比星；屈洛昔芬；檸檬酸屈洛昔芬；屈他雄酮丙酸酯(Dromostanolone Propionate)；達佐霉素(Duazomycin)；依達曲沙(Edatrexate)；鹽酸氨法林(Eflomithine Hydrochloride)；依沙蘆星(Elsamitrucin)；埃洛鉑(Enloplatin)；恩普氨酯(Enpromate)；依匹哌啶(Epipropidine)；鹽酸表柔比星；厄布洛唑；鹽酸依索比星；雌莫司?。淮颇就×姿徕c；依他硝唑(Etanidazole)；乙碘油I 131；依托泊苷；磷酸依托泊苷；艾托卜寧(Etoprine)；鹽酸法倔唑(Fadrozole Hydrochloride)；法扎拉濱(Fazarabine)；芬維A胺；氟尿苷；磷酸氟達拉濱；氟尿嘧啶；氟西他濱(Flurocitabine)；磷喹酮(Fosquidone)；福司曲星(Fostriecin)鈉；吉西他濱；鹽酸吉西他濱；金Au198；羥基脲；鹽酸伊達比星；異環(huán)磷酰胺；伊莫福星(I lmofosine)；異丙鉑(Iproplatin)；鹽酸伊立替康；醋酸蘭瑞肽；來曲唑；醋酸亮丙瑞林；鹽酸利洛唑(Liarozole Hydrochloride)；洛美曲塞鈉(Lometrexol Sodium)；洛莫司??；鹽酸洛索蒽醌；馬索羅酚(Masoprocol)；美登素；鹽酸氮芥；醋酸甲地孕酮；醋酸美侖孕酮；美法侖；美諾立爾(Menogaril)；巰嘌呤；甲氨蝶呤；甲氨蝶呤鈉；氯苯氨啶(Metoprine)；美妥替哌(Meturedepa)；米丁度胺(Mitindomide)；邁拓卡素(Mitocarcin)；絲裂紅素(Mitocromin)；米托潔林(Mitogillin)；米托馬星(Mitomalcin)；絲裂霉素(Mitomycin)；米托司培(Mitosper)；米托坦(Mitotane)；鹽酸米托蒽醌；霉酚酸；諾考達唑；諾加霉素；奧馬鉑；奧昔舒侖(Oxisuran)；紫杉醇；培門冬酶(Pegaspargase)；培利霉素(Peliomycin)；戊氮芥(Pentamustine)；硫酸培洛霉素(Peplomycin Sulfate)；培磷酰胺(Perfosfamide)；哌泊溴烷(Pipobroman)；哌泊舒凡(Piposulfan)；鹽酸羅蒽醌(Piroxantrone Hydrochloride)；普卡霉素；普洛美司坦(Plomestane)；卟吩姆鈉(PorfimerSodium)；甲基絲裂霉素(Porfiromycin)；潑尼氮芥(Prednimustine)；鹽酸丙卡巴肼(Procarbazine Hydrochloride)；嘌呤霉素；鹽酸嘌呤霉素；吡唑呋喃(Pyrazofurin)；利波腺苷(Riboprine)；羅谷亞胺(Rogletimide)；沙芬戈(Safmgol)；鹽酸沙芬戈(Safingol Hydrochloride)；甲基環(huán)己亞硝脲(Semustine)；辛曲秦(Simtrazene)；司帕福賽特鈉鹽(Sparfosate Sodium)；司帕霉素；鹽酸螺旋鍺(Spirogermanium Hydrochloride)；螺莫司汀(Spiromustine)；螺磺鉑胺(Spiroplatin)；鏈黑霉素(Streptonigrin)；鏈脲霉素(Streptozocin)；氯化鍶Sr 89；磺氯苯脲(Sulofenur)；他利霉素(Talisomycin)；紫杉烷(Taxane)；紫杉烷(Taxoid)；替可加蘭鈉(Tecogalan Sodium)；替加氟(Tegafur)；鹽酸拓蘭酮(Teloxantrone Hydrochloride)；替莫泊芬(Temoporfin)；替尼泊苷(Teniposide)；替羅昔隆(Teroxirone)；睪內(nèi)酯(Testolactone)；硫咪嘌呤(Thiamiprine)；硫鳥嘌呤(Thioguanine)；噻替哌(Thiotepa)；噻唑羧胺核苷(Tiazofurin)；替拉扎明；鹽酸拓撲替康；檸檬酸托瑞米芬；醋酸曲托龍(Trestolone Acetate)；磷酸曲西瑞賓(Triciribine Phosphate)；三甲曲沙；三甲曲沙葡糖醛酸酯；曲普瑞林；鹽酸妥布氯唑(Tubulozole Hydrochloride)；尿嘧啶氮芥(UracilMustard)；烏瑞替哌(Uredepa)；伐普肽(Vapreotide)；維替泊芬；硫酸長春花堿；硫酸長春新堿；長春地辛；硫酸長春地辛；硫酸長春匹定(Vinepidine Sulfate)；硫酸長春甘酯；硫酸長春羅辛；酒石酸長春瑞濱；硫酸長春羅定；硫酸長春利定；伏羅唑；折尼鉑(Zeniplatin)；凈司他丁(Zinostatin)；鹽酸佐柔比星。

所公開的方法的癌癥可以是受試者經(jīng)歷的不受調(diào)節(jié)的生長、侵襲或轉(zhuǎn)移的任何細胞。在一些方面，癌癥可以是目前使用放射治療的任何贅生物或腫瘤?；蛘?，癌癥可以是使用標準方法對放射療法不夠敏感的贅生物或腫瘤。因此，所述癌癥可以是肉瘤、淋巴瘤、白血病、癌，胚細胞瘤或生殖細胞腫瘤。所公開的組合物可用于治療的癌癥的代表性但非限制性的列表包括：淋巴瘤、B細胞淋巴瘤、T細胞淋巴瘤，蕈樣肉芽腫病，霍奇金病，骨髓性白血病，膀胱癌，腦癌，神經(jīng)系統(tǒng)癌，頭頸癌，頭頸鱗狀細胞癌，腎癌，肺癌如小細胞肺癌和非小細胞肺癌(NSCLC)，神經(jīng)母細胞瘤/成膠質(zhì)細胞瘤，卵巢癌，胰腺癌，前列腺癌，皮膚癌，肝癌，黑色素瘤，口腔、喉、喉頭和肺的鱗狀細胞癌，結(jié)腸癌，宮頸癌，宮頸上皮癌，乳腺癌，上皮癌，腎癌，泌尿生殖器癌，肺癌，食管癌，頭頸癌，大腸癌，造血癌；睪丸癌；結(jié)腸和直腸癌，前列腺癌和胰腺癌。例如，提供了腫瘤的類別和類型的列表。

組合物、制劑和施用方法

所公開的化合物和包含它們的組合物的體內(nèi)應(yīng)用可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員目前或預(yù)期已知的任何合適的方法和技術(shù)來實現(xiàn)。例如，所公開的化合物可以以生理學(xué)上或藥學(xué)上可接受的形式配制并通過本領(lǐng)域已知的任何合適的途徑施用，包括例如口服、鼻、直腸、局部和腸胃外施用途徑。如本文所用，術(shù)語腸胃外包括皮下、皮內(nèi)、靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、腹膜內(nèi)和胸骨內(nèi)施用，例如通過注射。所公開的化合物或組合物的施用可以是單次施用，或者以本領(lǐng)域技術(shù)人員容易確定的連續(xù)或不同間隔施用。

本文公開的化合物和包含它們的組合物也可以使用脂質(zhì)體技術(shù)、緩釋膠囊、可植入泵和可生物降解的容器給藥。這些遞送方法可以有利地在延長的時間段內(nèi)提供均勻的劑量。化合物也可以以其鹽衍生物形式或結(jié)晶形式施用。

本文公開的化合物可以根據(jù)已知方法配制來制備藥學(xué)上可接受的組合物。制劑在本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知和容易獲得的許多來源中有詳細描述。例如，E.W.Martin(1995)的雷明頓藥物科學(xué)(Remington'sPharmaceuticalScience)描述了可以與所公開的方法結(jié)合使用的制劑。通常，可以配制本文公開的化合物，使得有效量的化合物與合適的載體組合以便于化合物的有效給藥。所使用的組合物也可以是多種形式。這些包括例如固體、半固體和液體劑型，例如片劑、丸劑、粉劑、液體溶液或懸浮液、栓劑、可注射和可輸注的溶液劑和噴霧劑。優(yōu)選的形式取決于預(yù)期的施用模式和治療應(yīng)用。所述組合物還優(yōu)選包括本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)藥學(xué)上可接受的載體和稀釋劑。與化合物一起使用的載體或稀釋劑的實例包括乙醇、二甲基亞砜、甘油、氧化鋁、淀粉、鹽水和等效載體和稀釋劑。為了給所需治療性治療提供的該劑量下的施用，本文公開的組合物可有利地包含基于總重量約0.1％至99％，特別是1至15％的一種或多種主題化合物，基于包括載體或稀釋劑的總組合物的重量。

適于施用的制劑包括例如水性無菌注射溶液、其可含有抗氧化劑、緩沖劑、抑菌劑和使制劑與預(yù)期接受者的血液等滲的溶質(zhì)；和水性和非水性無菌混懸劑，其可以包括懸浮劑和增稠劑。制劑可以存在于單位劑量或多劑量容器中，例如密封的安瓿和小瓶中，并且，在使用前可以儲存在僅需要無菌液體載體的條件的冷凍干燥(凍干)條件下，例如注射用水。即用型注射溶液和懸浮液可以由無菌粉末、顆粒、片劑等制備。應(yīng)當(dāng)理解，除了上述特別提及的成分之外，本文公開的組合物可以包括本領(lǐng)域中常規(guī)的其它試劑，考慮到所討論的制劑的類型。

本文公開的化合物和包含它們的組合物可以通過與細胞直接接觸或通過載體手段遞送至細胞。用于將化合物和組合物遞送到細胞的載體裝置是本領(lǐng)域已知的，包括，例如將組合物包封在脂質(zhì)體部分中。用于將本文公開的化合物和組合物遞送至細胞的另一種手段包括將化合物連接至靶向遞送至靶細胞的蛋白質(zhì)或核酸。美國專利6,960,648和美國專利申請公開號20030032594和20020120100公開了可以偶聯(lián)到另一種組合物并且允許組合物通過生物膜移位的氨基酸序列。美國申請公開號20020035243還描述了用于將生物部分轉(zhuǎn)移穿過細胞膜進行細胞內(nèi)遞送的組合物?；衔镆部梢哉先刖酆衔镏?，其實例包括用于顱內(nèi)腫瘤的聚(D-L丙交酯-共-乙交酯)聚合物；聚[雙(對羧基苯氧基)丙烷：癸二酸](摩爾比為20:80)(如GLIADEL中所用)；軟骨素；幾丁質(zhì)和殼聚糖。

為了治療腫瘤疾病，本文公開的化合物可以聯(lián)合其它抗腫瘤或抗癌物質(zhì)和/或放射和/或光動力治療和/或手術(shù)治療施用給需要治療的患者以除去腫瘤。這些其它物質(zhì)或治療可以與本文公開的化合物相同或不同時給予。例如，使用時本文公開的化合物可以聯(lián)合有絲分裂抑制劑如紫杉醇或長春堿，烷化劑如環(huán)磷酰胺或異環(huán)磷酰胺，抗代謝物如5-氟尿嘧啶或羥基脲，DNA嵌入劑如阿霉素或博來霉素，拓撲異構(gòu)酶抑制劑如依托泊苷或喜樹堿，抗血管生成劑例如血管抑制素，抗雌激素例如他莫昔芬和/或其他抗癌藥物或抗體，例如分別為GLEEVEC(諾華藥物公司)和赫塞汀(Genentech公司)，或免疫治療劑如依匹單抗(ipilimumab)和硼替佐米。

在某些實施例中，本文公開的化合物和組合物可以在一個或多個解剖部位局部給藥，例如不想要細胞生長的部位(例如腫瘤部位或良性皮膚生長，例如注射或局部應(yīng)用于腫瘤或皮膚生長)，任選與藥學(xué)上可接受的載體例如惰性稀釋劑組合。本文公開的化合物和組合物可以全身施用，例如靜脈內(nèi)或口服，任選與藥學(xué)上可接受的載體例如惰性稀釋劑，或可吸收的可食用載體組合用于口服遞送。它們可以包在硬或軟殼明膠膠囊中，可以壓制成片劑，或者可以直接與患者的飲食的食物結(jié)合。對于口服治療性給藥，活性化合物可與一種或多種賦形劑組合并以其形式使用，如可攝入片劑、口含片劑、錠劑、膠囊、酏劑、混懸劑、糖漿劑、囊劑(wafers)、氣溶膠噴霧劑等。

片劑、錠劑、丸劑、膠囊等還可以含有以下物質(zhì)：粘合劑如黃蓍膠、阿拉伯膠、玉米淀粉或明膠；賦形劑如磷酸二鈣、崩解劑如玉米淀粉、馬鈴薯淀粉、海藻酸等；潤滑劑如硬脂酸鎂；并且可以加入甜味劑如蔗糖、果糖、乳糖或阿斯巴甜或調(diào)味劑如薄荷油、冬青油或櫻桃調(diào)味劑。當(dāng)單位劑型是膠囊時，除了上述類型的材料之外，其可以包含液體載體，例如植物油或聚乙二醇。各種其它材料可以作為包衣存在或以其它方式改變固體單位劑型的物理形式。例如，片劑、丸劑、或膠囊可以用明膠、蠟、蟲膠或糖等包衣。糖漿或酏劑可以含有活性化合物，蔗糖或果糖作為甜味劑，對羥基苯甲酸甲酯和對羥基苯甲酸丙酯作為防腐劑，染料和調(diào)味劑如櫻桃或橙味。當(dāng)然，用于制備任何單位劑型的任何材料應(yīng)當(dāng)是藥學(xué)上可接受的，并且在所使用的量下基本上無毒。此外，活性化合物可以摻入緩釋制劑和裝置中。

本文公開的化合物和組合物，包括其藥學(xué)上可接受的鹽或其水合物，可以靜脈內(nèi)、肌內(nèi)或腹膜內(nèi)輸注或注射?；钚詣┗蚱潲}的溶液可以在水中制備，任選與無毒表面活性劑混合。分散體也可以在甘油、液體聚乙二醇、三醋精及其混合物中和在油中制備。在普通儲存和使用條件下，這些制劑可以含有防腐劑以防止微生物的生長。

適于注射或輸注的藥物劑型可包括含有活性成分的無菌水溶液或分散體或無菌粉末，其適于制備即用型無菌可注射或可輸注的溶液或分散體，任選地包囊于脂質(zhì)體中。最終劑型應(yīng)在制造和儲存條件下是無菌的、流動的和穩(wěn)定的。液體載體或載體可以是溶劑或液體分散介質(zhì)，其包含例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇、液體聚乙二醇等)、植物油、無毒甘油酯和其合適的混合物。可以例如通過形成脂質(zhì)體，通過在分散體的情況下維持所需的粒度或通過使用表面活性劑來保持適當(dāng)?shù)牧鲃有浴?/p>

任選地，可以通過各種其它抗細菌和抗真菌劑防止微生物的活性，例如對羥基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞等。在許多情況下，優(yōu)選包括等滲劑，例如糖、緩沖劑或氯化鈉。可注射組合物的延長吸收可以通過包含延遲吸收的試劑(例如單硬脂酸鋁和明膠)來實現(xiàn)。

通過將所需量的本文公開的化合物和/或試劑與上述列舉的各種其它成分在合適的溶劑中根據(jù)需要混合，隨后過濾滅菌來制備無菌可注射溶液。在用于制備無菌注射溶液的無菌粉末的情況下，優(yōu)選的制備方法是真空干燥和冷凍干燥技術(shù)，從而獲得活性成分加上先前無菌過濾溶液中存在的任何額外所需成分的粉末。

對于局部給藥，本文公開的化合物和試劑可以作為液體或固體施用。然而，通常期望將其作為組合物與皮膚病學(xué)可接受的載體(其可以是固體或液體)組合地局部施用于皮膚。本文公開的化合物和試劑和組合物可以局部施用于受試者的皮膚以減小惡性或良性生長的尺寸(并且可以包括完全去除)或治療感染部位。本文公開的化合物和試劑可以直接施用于生長或感染部位。優(yōu)選地，將化合物和試劑以制劑如軟膏、乳膏、洗劑、溶液、酊劑等施用于生長或感染部位。

有用的固體載體包括細碎的固體，例如滑石、粘土、微晶纖維素、二氧化硅、氧化鋁等。可用的液體載體包括水、醇或二醇或水-醇/二醇混合物，其中化合物可以任選地在無毒表面活性劑的幫助下以有效水平溶解或分散?？梢约尤胱魟┤缦懔虾皖~外的抗微生物劑以優(yōu)化給定用途的性質(zhì)。所得液體組合物可以從吸收墊施用，用于浸漬繃帶和其它敷料，或者使用例如泵型或氣溶膠噴霧器噴涂到受影響的區(qū)域上。

增稠劑如合成聚合物、脂肪酸、脂肪酸鹽和酯、脂肪醇、改性纖維素或改性礦物材料也可以與液體載體一起使用以形成可涂抹的糊劑、凝膠、軟膏、肥皂等，以直接施用于使用者的皮膚。

本文公開的化合物和試劑和藥物組合物的起效劑量可以通過比較它們的體外活性和動物模型中的體內(nèi)活性來確定。將小鼠和其它動物中的有效劑量外推至人的方法是本領(lǐng)域已知的。

在一個實施方案中，所公開的組合物以與腸胃外施用相當(dāng)?shù)膭┝渴┯?，每kg體重約0.1ng至約100g，每kg體重約10ng至約50g，約100ng至約1g每kg體重，約1μg至約100mg每kg體重，約1μg至約50mg每kg體重，約1mg至約500mg每kg體重；和約1mg至約50mg每kg體重?；蛘?，施用組合物的量以實現(xiàn)約0.1ng、1ng、10ng、100ng、1μg、10μg、100μg、1mg、2mg、3mg、4mg、5mg、6mg、7mg、8mg、9mg、10mg、11mg、12mg、13mg、14mg、15mg、16mg、17mg、18mg、19mg、20mg、30mg、40mg、50mg、60mg、70mg、80mg、90mg、100mg、500mg每kg體重或更大的治療有效量。

盡管組合物可以一天施用一次或幾次，并且治療的持續(xù)時間可以是每天一次持續(xù)約1、2、3、4、5、6、7天或更長的時間，但是更優(yōu)選地以單個劑量單位或幾個較小劑量單位的形式施用單一劑量或以一定間隔多次施用細分劑量。例如，可以從約0小時至約1小時，約1小時至約24小時，約1至約72小時，約1至約120小時，或約24小時至至少約120小時施用一劑量單位?；蛘?，劑量單位可以在約0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、30、40、48、72、96、120小時施用。隨后的劑量單位可以在初始施用后的任何時間施用，使得實現(xiàn)治療效果。使用所公開的組合物的治療可以替代地包括多水平給藥方案，其中組合物在兩個或更多個時間段內(nèi)施用，優(yōu)選具有約12小時至約7天的組合持續(xù)時間，包括1、2、3、4、或5天或約15、15、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、115、120、125、130、135、140、或144小時，或者約1至24小時，約12至36小時，約24至48小時，約36至60小時，約48至72小時，約60至96小時，約72至108小時，約96至120小時，或約108至136小時。在一個實施方案中，兩水平給藥方案具有約1天至約5天的組合持續(xù)時間；在其它實施方案中，兩水平給藥方案具有約1天至約3天的組合持續(xù)時間。

還公開了藥物組合物，其包含本文公開的化合物聯(lián)合藥學(xué)上可接受的載體。適于口服、局部或腸胃外給藥的藥物組合物包含一定量的化合物構(gòu)成優(yōu)選方面。給予患者，特別是人的劑量應(yīng)足以在合理的時間范圍內(nèi)在患者中實現(xiàn)治療反應(yīng)，而沒有致死毒性，并且優(yōu)選引起不超過可接受水平的副作用或發(fā)病率。本領(lǐng)域技術(shù)人員將認識到，劑量將取決于多種因素，包括施用對象的狀況(健康)、施用對象的體重、同時治療的種類(如果有的話)、治療頻率、治療比、以及作為病理狀態(tài)的嚴重性和階段。

定義

術(shù)語“施用對象”是指作為給藥或治療的目標的任何個體。施用對象可以是脊椎動物，例如哺乳動物。因此，施用對象可以是人類或獸用患者。術(shù)語“患者”是指在臨床醫(yī)生(例如內(nèi)科醫(yī)生)治療下的施用對象。

術(shù)語“治療有效”是指所使用的組合物的量具有足以改善疾病或病癥的一種或多種原因或癥狀的量。這種改善僅需要減少或改變，而不一定是消除。

術(shù)語“治療”是指旨在治愈、改善、穩(wěn)定或預(yù)防疾病、病理狀況或病癥的患者的醫(yī)療管理。該術(shù)語包括主動治療，即特異性針對疾病、病理狀況或病癥的改善的治療，并且還包括病因治療，即針對去除相關(guān)疾病、病理狀況或病癥的原因的治療。此外，該術(shù)語包括姑息治療，即設(shè)計用于緩解癥狀而不是治愈疾病、病理狀況或病癥的治療；預(yù)防性治療，即最小化或部分或完全抑制相關(guān)疾病、病理狀況或病癥的發(fā)展的治療；和支持性治療，即用于補充針對改善相關(guān)疾病、病理狀況或病癥的另一種特定治療的治療。

術(shù)語“抑制”是指活性、反應(yīng)、病癥、疾病或其它生物學(xué)參數(shù)的降低。這可以包括但不限于活性、反應(yīng)、病癥或疾病的完全消除。這還可以包括例如與天然或?qū)φ账较啾然钚?、反?yīng)、病癥或疾病減少10％。因此，與天然或?qū)φ账较啾?，減少可以是10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％或任何量之間的減少。

術(shù)語“增生細胞”或“增生”是指經(jīng)歷生理(正常)細胞增殖(“增生”)的細胞。

術(shù)語“新生細胞”或“新生物”是指經(jīng)歷異常細胞增殖(“新生物形成性”)的細胞。新生細胞的生長超過并且不與其周圍的正常組織的生長協(xié)調(diào)。生長通常以相同的過度方式持續(xù)，即使在刺激停止后，并且通常導(dǎo)致腫瘤的形成。新生物可以是良性的、惡變前的或惡性的。

術(shù)語“癌癥”或“惡性新生物”是指顯示不受控制的生長、侵入相鄰組織并且經(jīng)常轉(zhuǎn)移到身體的其它位置的細胞。

術(shù)語“腫瘤”是指含有新生細胞的異常大量的組織。

術(shù)語“轉(zhuǎn)移”是指惡性腫瘤細胞從一個器官或部分擴散到另一個不相鄰的器官或部分。癌細胞可以從原發(fā)性腫瘤“脫離”、“泄漏”或“溢出”，進入淋巴和血管，通過血流循環(huán)，并沉降下來在體內(nèi)其他地方的正常組織內(nèi)生長。當(dāng)腫瘤細胞轉(zhuǎn)移時，新腫瘤稱為繼發(fā)性或轉(zhuǎn)移性癌癥或腫瘤。

術(shù)語“抗體”是指選擇性結(jié)合于靶抗原的天然或合成抗體。該術(shù)語包括多克隆和單克隆抗體。除完整的免疫球蛋白分子外，術(shù)語“抗體”中還包括那些免疫球蛋白分子的片段或聚合物，以及選擇性結(jié)合靶抗原的人或人源化形式的免疫球蛋白分子。

術(shù)語“肽”、“蛋白質(zhì)”和“多肽”可互換使用，是指包含通過一個氨基酸的羧基與另一個氨基酸的α氨基連接的兩個或更多個氨基酸的天然或合成分子。

如本文所用，“模擬肽”是指肽的模擬物，其包括正常肽化學(xué)的一些改變。模擬肽通常增強原始肽的一些性質(zhì)，例如增加穩(wěn)定性、增加功效、增強遞送、增加半衰期等。模擬肽的使用可涉及在給定位置并入非氨基酸殘基與非酰胺鍵。本發(fā)明的一個實施方案是模擬肽，其中所述化合物具有鍵、肽主鏈或用合適的模擬物替代的氨基酸組分?？梢允呛线m的氨基酸模擬物的非天然氨基酸的一些非限制性實例包括β-丙氨酸、L-a-氨基丁酸、L-γ-氨基丁酸、L-a-氨基異丁酸、L-ε-氨基己酸、7-氨基庚酸、L-天冬氨酸、L-谷氨酸、N-ε-Boc-Na-CBZ-L-賴氨酸、N-ε-Boc-N-a-Fmoc-L-賴氨酸、L-甲硫氨酸砜、L-正亮氨酸、L-正纈氨酸，N-α-Boc-N-δCBZ-L-鳥氨酸、N-δ-Boc-N-α-CBZ-L-鳥氨酸、Boc-對硝基-L-苯丙氨酸、Boc-羥脯氨酸和Boc-L-硫代脯氨酸。

術(shù)語“腫瘤浸潤淋巴細胞”或“TIL”是指已經(jīng)離開血流并遷移到腫瘤中的白細胞。

術(shù)語“回歸”不一定意味著100％或完全回歸。相反，存在本領(lǐng)域普通技術(shù)人員認為具有潛在益處或治療效果的不同程度的回歸。該術(shù)語還包括延遲疾病或其癥狀或病癥的發(fā)作。

已經(jīng)描述了本發(fā)明的多個實施方式。

然而，應(yīng)當(dāng)理解，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍的情況下可以進行各種修改。因此，其他實施例在所附權(quán)利要求的范圍內(nèi)。

除非另有定義，本文使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語具有與所公開的發(fā)明所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員通常理解的相同的含義。本文引用的出版物和其引用的材料通過引用特別地并入。

本領(lǐng)域技術(shù)人員將認識到或僅使用常規(guī)實驗就能夠確定本文所述的本發(fā)明的具體實施方案的許多等同物。這些等同物旨在被所附權(quán)利要求所涵蓋。

實施例

實施例1：納武單抗(Nivolumab)與GM.CD40L疫苗聯(lián)合用于肺腺癌的隨機I/II期臨床研究。

以下是II期臨床試驗的描述，以建立結(jié)合抗PD-1治療與GM.CD40L腫瘤疫苗的功效。