本申請要求2014年4月21日提交的美國臨時申請?zhí)?1/982,294的權(quán)益，其通過引用以其整體結(jié)合到本文中。序列表本申請包含以ASCII格式通過EFS-Web提交和藉此通過引用以其整體結(jié)合到本文中的序列表。所述ASCII副本創(chuàng)建于2015年4月21日，被命名為sc3701pct_S69697_1210WO_SEQL_042115.txt，大小為278,070(271KB)。發(fā)明領(lǐng)域本申請主要涉及新的抗-RNF43抗體或其免疫反應(yīng)片段和包含所述抗體或其免疫反應(yīng)片段的組合物(包括抗體藥物綴合物)，用于治療、診斷或預(yù)防癌癥和其任何復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移。本發(fā)明選擇的實施方案提供這樣的抗-RNF43抗體或抗體藥物綴合物用于治療癌癥(包括減少致瘤細(xì)胞頻率)的用途。發(fā)明背景干細(xì)胞和祖細(xì)胞的分化和增殖是在器官發(fā)生、細(xì)胞修復(fù)和細(xì)胞更換期間共同起作用以支持組織生長的正常進(jìn)行的過程。系統(tǒng)被嚴(yán)格調(diào)節(jié)以確保根據(jù)生物體的需要僅產(chǎn)生合適的信號。細(xì)胞增殖和分化通常僅為更換損傷或瀕死的細(xì)胞或為生長而按需要發(fā)生。然而，這些過程的中斷可由許多因素觸發(fā)，包括各種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)化學(xué)物質(zhì)的過少或過多、存在改變的微環(huán)境、遺傳突變或其組合。正常細(xì)胞增殖和/或分化的中斷可導(dǎo)致各種病癥，包括增殖性疾病，例如癌癥。對癌癥的常規(guī)治療性治療包括化學(xué)療法、放射療法和免疫療法。這些治療經(jīng)常是無效的，和手術(shù)切除可能不會提供可行的臨床備選方案。在患者經(jīng)歷一線治療并隨后復(fù)發(fā)的情況下，當(dāng)前護(hù)理標(biāo)準(zhǔn)的局限性特別明顯。在這樣的情況下頻繁發(fā)生難治性腫瘤，經(jīng)常是侵略性和不可治愈的。多年以來，許多實體腫瘤的總體存活率在很大程度上仍未改變，這至少部分地歸因于現(xiàn)有療法不能預(yù)防再發(fā)、腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移。因此，仍然極其需要開發(fā)增殖性病癥的更具靶向和有效的療法。本發(fā)明解決了這一需要。發(fā)明概述本發(fā)明總體上涉及可用于預(yù)防、診斷或治療癌癥的抗體、抗體藥物綴合物(ADC)和藥物組合物。在某些實施方案中，本發(fā)明包含式M-[L-D]n的抗體藥物綴合物或其藥學(xué)上可接受的鹽，其中M包含抗-RNF43抗體；L包含接頭；D包含細(xì)胞毒素；和n是1-20的整數(shù)。在另一個實施方案中，本發(fā)明的抗-RNF43ADC包含作為內(nèi)化抗體的抗-RNF43抗體。在另一方面，本發(fā)明涉及作為內(nèi)化抗體的抗-RNF43抗體。在進(jìn)一步的實施方案中，本發(fā)明的抗-RNF43ADC包含作為嵌合抗體、CDR移植抗體或人源化抗體或其片段的抗-RNF43抗體。在進(jìn)一步的方面，本發(fā)明涉及抗-RNF43抗體，其是嵌合的、CDR移植的或人源化的。在本發(fā)明的一個方面，本發(fā)明的抗-RNF43ADC包含結(jié)合腫瘤引發(fā)細(xì)胞的抗-RNF43抗體。在另一方面，本發(fā)明涉及結(jié)合腫瘤引發(fā)細(xì)胞的抗-RNF43抗體。本發(fā)明還包含抗-RNF43ADC，其包含與人RNF43(SEQIDNO:5)結(jié)合且不與人ZNRF3(SEQIDNO:6)結(jié)合的抗-RNF43抗體。在另一方面，本發(fā)明涉及與人RNF43(SEQIDNO:5)結(jié)合且不與人ZNRF3(SEQIDNO:6)結(jié)合的抗-RNF43抗體。已經(jīng)表明RNF43是WNT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的一種負(fù)反饋調(diào)節(jié)物，因此結(jié)合RNF43的抗體可具有干擾RNF43功能的能力。如本文所示，存在三個主要類型的抗-RNF43抗體：作為關(guān)于WNT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的“中立抗體”且不影響WNT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的抗體，增加WNT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的抗體，和減少WNT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的抗體。因此在一個方面，本發(fā)明涉及包含抗-RNF43抗體的抗-RNF43ADC，所述抗體在真核細(xì)胞的表面上與人RNF43(SEQIDNO:5)結(jié)合，其中抗體的結(jié)合減少WNT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。在進(jìn)一步的方面，本發(fā)明涉及包含抗-RNF43抗體的抗-RNF43ADC，所述抗體在真核細(xì)胞的表面上與人RNF43(SEQIDNO:5)結(jié)合，其中抗體的結(jié)合增加WNT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。在又一方面，本發(fā)明涉及包含抗-RNF43抗體的抗-RNF43ADC，所述抗體在真核細(xì)胞的表面上與人RNF43(SEQIDNO:5)結(jié)合，其中抗體的結(jié)合不影響WNT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。因此，在一些方面，本發(fā)明的抗-RNF43ADC將包含作為關(guān)于WNT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的“中立抗體”的抗-RNF43抗體。在進(jìn)一步的方面，本發(fā)明涉及與人RNF43(SEQIDNO:5)結(jié)合并且增加、減少或不影響WNT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的抗-RNF43抗體。R-spondin(RSPO)是參與WNT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的蛋白，并阻斷RNF43，因此導(dǎo)致WNT配體產(chǎn)生的增量調(diào)節(jié)和WNT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)增加。在一個實施方案中，本發(fā)明的抗-RNF43ADC包含與人RNF43(SEQIDNO:5)結(jié)合且阻斷R-spondin與RNF43的結(jié)合的抗-RNF43抗體。在另一方面，本發(fā)明涉及與人RNF43(SEQIDNO:5)結(jié)合且不阻斷R-spondin與RNF43的結(jié)合的抗-RNF43抗體。在本發(fā)明的另一方面，本發(fā)明的抗-RNF43ADC包含在真核細(xì)胞的表面上與人RNF43(SEQIDNO:5)結(jié)合的抗-RNF43抗體，其中抗體的結(jié)合不阻斷R-spondin刺激的WNT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。在另外的實施方案中，本發(fā)明的抗-RNF43ADC包含在真核細(xì)胞的表面上與人RNF43(SEQIDNO:5)結(jié)合的抗-RNF43抗體，其中抗體的結(jié)合阻斷R-spondin-刺激的WNT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。在一個實施方案中，本發(fā)明涉及這樣的分離的抗體，其與人RNF43(SEQIDNO:5)結(jié)合并與包含以下的抗體競爭人RNF43的結(jié)合：(1)SEQIDNO:78所示的輕鏈可變區(qū)和SEQIDNO:80所示的重鏈可變區(qū)；或(2)SEQIDNO:110所示的輕鏈可變區(qū)和SEQIDNO:112所示的重鏈可變區(qū)。在另一個實施方案中，本發(fā)明涉及與人RNF43(SEQIDNO:5)結(jié)合的分離的抗體，其包含輕鏈和重鏈，所述輕鏈包含以下輕鏈互補(bǔ)決定區(qū)(CDRL):CDRL1:SEQIDNO:288;CDRL2:SEQIDNO:289;CDRL3:SEQIDNO:290；和所述重鏈包含以下重鏈互補(bǔ)決定區(qū)(CDRH):CDRH1:SEQIDNO:291;CDRH2:SEQIDNO:292;CDRH3:SEQIDNO:293。在另外的實施方案中，本發(fā)明涉及與人RNF43(SEQIDNO:5)結(jié)合的分離的抗體，其包含輕鏈和重鏈，所述輕鏈包含以下輕鏈互補(bǔ)決定區(qū)(CDRL):CDRL1:SEQIDNO:294;CDRL2:SEQIDNO:295;CDRL3:SEQIDNO:296；和所述重鏈包含以下CDRH:CDRH1:SEQIDNO:297;CDRH2:SEQIDNO:298;CDRH3:SEQIDNO:299。本發(fā)明的一個方面是與人RNF43(SEQIDNO:5)結(jié)合的人源化抗體，其包含SEQIDNO:273所示的輕鏈和SEQIDNO:275所示的重鏈。本發(fā)明的另一方面是與人RNF43(SEQIDNO:5)結(jié)合的人源化抗體，其包含SEQIDNO:276所示的輕鏈和SEQIDNO:278所示的重鏈。本發(fā)明的進(jìn)一步的方面是編碼SEQIDNO:273或276所示的輕鏈或SEQIDNO:275或278所示的重鏈的核酸。在另一方面，本發(fā)明是包含載體的宿主細(xì)胞，所述載體包含上述核酸。在另一方面，本發(fā)明涉及包含本文所述的任何抗-RNF43抗體或ADC的藥物組合物。在一個實施方案中，本發(fā)明涉及治療癌癥的方法，包括給予有需要的受試者本發(fā)明的藥物組合物。在一些方面，癌癥選自結(jié)腸直腸癌或肺癌。附圖簡述圖1A描述使用源自正常組織和患者來源的異種移植物(PDX)腫瘤細(xì)胞的RNA的全轉(zhuǎn)錄組(SOLiD)測序測量的RNF43的表達(dá)水平。圖1B表明使用源自正常組織和患者來源的異種移植物(PDX)腫瘤細(xì)胞的RNA的全轉(zhuǎn)錄組(Illumina)測序測量的RNF43的表達(dá)水平。圖2A描述在自正常組織和自各種PDX腫瘤分離的RNA樣品中通過qRT-PCR測量的RNF43轉(zhuǎn)錄物的相對表達(dá)水平。圖2B描述在自各種正常組織和自分離自各種PDX腫瘤的癌癥干細(xì)胞(CSC)和非致瘤性(NTG)細(xì)胞分離的RNA樣品中通過qRT-PCR測量的RNF43轉(zhuǎn)錄物的相對表達(dá)水平。圖3表明在正常組織和各種PDX細(xì)胞系中通過微陣列雜交測量的RNF43轉(zhuǎn)錄物表達(dá)的標(biāo)準(zhǔn)化強(qiáng)度值。圖4表明在正常組織和來自癌癥基因組圖譜(TheCancerGenomeAtlas,TCGA)(一個公眾可得的數(shù)據(jù)集)的原發(fā)腫瘤中RNF43轉(zhuǎn)錄物的表達(dá)。圖5A表明示例性的抗-RNF43抗體的各種生理學(xué)和功能特征。圖5B表明RNF43(SEQIDNO:3)和ZNRF3(SEQIDNO:4)的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域的比對。圖6A表明在簡化形式的典型的WNT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中遺傳相互作用的圖示。圖6B表明在響應(yīng)用包含或缺乏WNT3A的條件培養(yǎng)基處理時，在存在或不存在RNF43的過表達(dá)的情況下，一對典型的WNT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)報告細(xì)胞系的行為。圖7A和7B提供示例性的鼠和人源化抗-RNF43抗體的輕鏈和重鏈可變區(qū)的連續(xù)的氨基酸序列(SEQIDNO:22-268，偶數(shù))。圖7C提供編碼圖7A和7B中的抗-RNF43抗體的氨基酸序列的核酸序列(SEQIDNO:21-269，奇數(shù))。圖7D提供全長人源化抗體hSC37.2、hSC37.17、hSC37.17ss1、hSC37.39、hSC37.39ss1、hSC37.67和hSC37.67變體1的氨基酸序列。圖7E-7H表明小鼠抗-RNF43抗體SC37.2(圖7E)、SC37.17(圖7F)、SC37.39(圖7G)和SC37.67(圖7H)的輕鏈和重鏈可變區(qū)的帶注釋的氨基酸序列(按照Kabat等編號)，其中CDR使用Kabat、Chothia、ABM和Contact方法衍生。圖8表明使用電化學(xué)發(fā)光夾心ELISA測定法測量的人RNF43的相對蛋白表達(dá)。圖9表明在各種PDX腫瘤細(xì)胞系中通過原位雜交測定的RNF43的RNA表達(dá)。圖10表明在癌癥干細(xì)胞(CSC)(實心黑線)或非致瘤細(xì)胞(NTG)(虛黑線)中，與同種型對照染色群(實心灰色)相比，在代表性的PDX細(xì)胞系中通過流式細(xì)胞術(shù)測定的RNF43的表面蛋白表達(dá)(黑線)。關(guān)于測試的各PDX系，對于IgG1同種型對照抗體和抗-RNF43抗體，顯示了平均熒光強(qiáng)度(MFI)值。圖11表明選擇的抗-RNF43人源化抗體(組合了與皂草素(saporin)直接綴合的山羊抗人抗體)內(nèi)化至過表達(dá)RNF43蛋白的HEK293T細(xì)胞和殺死所述細(xì)胞的能力。發(fā)明詳述本發(fā)明可以許多不同的形式體現(xiàn)。本文公開了本發(fā)明的非限制性的說明性實施方案，其舉例說明了本發(fā)明的原理。本文使用的任何章節(jié)標(biāo)題僅為組織目的，和不應(yīng)解釋為限制所述的主題。為本文公開的目的，所有識別序列登記號可見于NCBI參考序列(NCBIReferenceSequence,RefSeq)數(shù)據(jù)庫和/或NCBIGenBank?檔案序列數(shù)據(jù)庫，除非另外注明。已令人驚訝地發(fā)現(xiàn)，RNF43是許多腫瘤類型的生物標(biāo)記物，和可利用這種關(guān)聯(lián)來治療這樣的腫瘤。還出人意料地發(fā)現(xiàn)，RNF43與致瘤細(xì)胞有關(guān)，和可有效地利用RNF43來抑制或消除它們。致瘤細(xì)胞，其將在下文更詳細(xì)地描述，已知對許多常規(guī)治療顯示抗性。與現(xiàn)有技術(shù)的教導(dǎo)相比，本發(fā)明公開的化合物和方法有效地克服這種固有的抗性。本發(fā)明提供抗-RNF43抗體(包括抗體藥物綴合物)和它們在預(yù)后、診斷、治療診斷(theragnosis)、治療和/或預(yù)防各種RNF43-相關(guān)的癌癥中的用途，而無關(guān)乎任何特定的作用機(jī)制或特別靶向的細(xì)胞或分子組分。I.RNF43生理學(xué)RING指蛋白43(RNF43；亦稱為E3泛素-蛋白連接酶RNF43或RNF124)是一種單通道1型跨膜蛋白，其作為WNT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的重要的反饋調(diào)節(jié)物起作用。代表性的RNF43蛋白直向同源物包括但不限于人(NP_060233)、黑猩猩(XP_001172611)、恒河猴(XP_001106574)、大鼠(NP_001129393)和小鼠(NP_766036)。在人中，RNF43基因由跨越染色體17的細(xì)胞遺傳位點17q22上的大約63.9kBp的10個外顯子組成。人RNF43基因座的轉(zhuǎn)錄得到剪接的4.6kBp成熟mRNA轉(zhuǎn)錄物(NM_017763)，其編碼783個氨基酸的前蛋白(NP_060233)。RNF43前蛋白的加工預(yù)期包括除去包含分泌信號肽的前23個氨基酸。成熟RNF43蛋白預(yù)期包含174個氨基酸的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域(氨基酸24–197)、21個氨基酸的螺旋跨膜結(jié)構(gòu)域(氨基酸198–218)和565個氨基酸的胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域(氨基酸219–783)，其一部分包含非典型的RING結(jié)構(gòu)域鋅指(氨基酸272–313)，該蛋白的名字來源于此。RING結(jié)構(gòu)域是與介導(dǎo)蛋白-蛋白相互作用的鋅指結(jié)構(gòu)的形成有關(guān)的序列確定的結(jié)構(gòu)域，通常存在于參與蛋白遍在化(ubiquitylation)過程的蛋白中。蛋白的遍在化是一個生物學(xué)綴合過程，其中熱穩(wěn)定的76個氨基酸的蛋白泛素(Ub)共價連接至靶蛋白的各個賴氨酸殘基。Ub通過其C-端甘氨酸殘基(UbG76)添加至靶蛋白的賴氨酸的ε-氨基(對于綜述，參見Shen等，2013;PMID23822887)。此外，因為Ub本身包含7個賴氨酸(UbK6、UbK11、UbK27、UbK29、UbK33、UbK49和UbK63)，因此在給定的賴氨酸上靶蛋白的初始單-遍在化之后，靶蛋白可通過Ub部分彼此的連鎖而被多遍在化。細(xì)胞利用Ub標(biāo)簽作為運(yùn)輸遍在化蛋白的信號，這取決于Ub共價連接的性質(zhì)和Ub標(biāo)簽的多聚化狀態(tài)。例如，當(dāng)?shù)鞍妆话琔bG76-UbK48連鍵的多聚Ub鏈標(biāo)記時，發(fā)生將錯誤折疊、氧化或短壽的蛋白靶向26S蛋白酶體，所謂的泛素-蛋白酶體系統(tǒng)(Dikic等，2009;PMID:19773779)。相比之下，多個單遍在化可指導(dǎo)細(xì)胞表面蛋白(例如受體酪氨酸激酶或蛇根堿(serpentine)受體)通過各種胞吞隔室，最終導(dǎo)致在溶酶體中降解(Railborg和Stenmark，2009，PMID:19325624;Mukai等，2010，PMID:20495530;Haglund和Dikic，2012;PMID:22357968)。Ub與靶蛋白的生物學(xué)綴合由酶促級聯(lián)介導(dǎo)，其包括三種不同的酶：Ub活化酶(E1)，其在化學(xué)上激活UbG76；Ub綴合酶(E2)，其作為活化的Ub的載體起作用；和Ub蛋白-連接酶(E3)，其與E2蛋白和靶蛋白兩者復(fù)合，并介導(dǎo)活化的Ub從E2轉(zhuǎn)移至蛋白靶標(biāo)。在人基因組內(nèi)，存在賦予該過程特異性的數(shù)百個E3Ub-蛋白連接酶，其中各E3蛋白識別特定或有限組的蛋白。RING指E3蛋白是最豐富類型的E3Ub-蛋白連接酶，和作為支架起作用以使蛋白底物接近活化的E2-Ub復(fù)合物。根據(jù)保守的RING序列的存在，RNF43被鑒定為有希望的E3泛素-蛋白連接酶(Yagyu等，2004，PMID:15492824)，該結(jié)果由后來的研究證實，其中表明RNF43的過表達(dá)促進(jìn)泛素-介導(dǎo)的各種細(xì)胞表面分子的減量調(diào)節(jié)(Koo等，2012，PMID:22895187)。E3Ub-蛋白連接酶的合適的表達(dá)和功能可能是參與各種生物學(xué)過程的蛋白的運(yùn)輸、功能和受調(diào)節(jié)的降解所必需的(Haglund和Dikic，同上)。然而，E3泛素-蛋白連接酶的失調(diào)的表達(dá)或錯誤功能可能導(dǎo)致癌癥發(fā)生(對于綜述，參見Mani和Gelmann，2005，PMID:16034054;Hoeller和Dikic，2009，PMID:19325623;Nakayama和Nakayama，2006，PMID:16633365)。RNF43通過表達(dá)分析被鑒定為在結(jié)腸直腸癌中增量調(diào)節(jié)，其中這些作者還報道了在胎兒腎和肺中有限表達(dá)，以及在正常成人組織中不可檢出的表達(dá)，如通過RNA印跡測量的(Yagyu等，2004，PMID:15492824)。一些初期的研究報道了在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和細(xì)胞核中(Sugiura等，2008，PMID:18313049)或作為分泌蛋白(Yagyu等，2004，PMID:15492824)檢出該蛋白。然而，最近的研究將RNF43定位在細(xì)胞表面上，將其功能關(guān)聯(lián)至WNT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的調(diào)節(jié)，和提示正確的細(xì)胞表面定位是其在WNT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的調(diào)節(jié)中的功能活性所必需的(Hao等，2012，PMID:22575959;Koo等，2012，PMID:22895187;Jiang等，2013，PMID:23847203;Tsukiyama等，2015，PMID:25825523)。1.RNF43在WNT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中的作用WNT途徑是調(diào)節(jié)細(xì)胞生長和分化的關(guān)鍵的發(fā)育和干細(xì)胞相關(guān)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑(Seifert和Mlodzik，2007，PMID:17230199;vanderFlier和Clevers，2009，PMID:18808327;Nihers，2012，PMID:23151663)，并且是其異常再活化或過度活化與癌癥有關(guān)的一個途徑(Barker和Clevers，2006，PMID:17139285;Krausova和Korinek，2013，PMID:24308963)。在人基因組中，存在19個不同的WNT基因，其編碼19種WNT蛋白配體，它們與各種細(xì)胞表面受體結(jié)合以形成配體/受體復(fù)合物，通過稱為WNT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的特定蛋白-蛋白相互作用的途徑將信號從細(xì)胞外部傳遞至細(xì)胞內(nèi)部。存在三個充分表征的WNT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑：(1)典型的WNT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，(2)非典型的平面細(xì)胞極性途徑，和(3)非典型的WNT/鈣途徑。盡管所有三個WNT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑通過WNT蛋白配體與在細(xì)胞表面上的Frizzed(FZD)蛋白受體的結(jié)合而活化，并且隨后信號轉(zhuǎn)導(dǎo)至在細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)上的Dishevelled(DVL)蛋白，但典型的途徑通過WNT與FZD和低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白5或6(LRP5/6)共-受體的結(jié)合而運(yùn)行，導(dǎo)致下游蛋白相互作用，其導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄的共激活物蛋白β-連環(huán)蛋白(CTNNB1)的穩(wěn)定。穩(wěn)定的β-連環(huán)蛋白能夠易位至細(xì)胞核，與TCF/LEF蛋白配合，和激活促進(jìn)細(xì)胞生長和分化的WNT靶基因的轉(zhuǎn)錄，以及該信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的負(fù)反饋調(diào)節(jié)物。典型的WNT途徑的簡化圖顯示在圖6A中。相比之下，非-典型的平面細(xì)胞極性途徑不通過β-連環(huán)蛋白中間體的穩(wěn)定而發(fā)生；而是，DVL蛋白調(diào)節(jié)可選的細(xì)胞表面共-受體例如蛋白酪氨酸激酶7(PTK7)或vanGogh-樣蛋白(VANGL1、VANGL2)的活性，導(dǎo)致調(diào)節(jié)肌動蛋白的行為和細(xì)胞骨架。類似地，非-典型的WNT/鈣信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑不通過穩(wěn)定的β-連環(huán)蛋白中間體而發(fā)生，而在來自DVL蛋白和相關(guān)的G-蛋白的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)鈣水平時產(chǎn)生，這最終導(dǎo)致細(xì)胞粘著、遷移和組織分離的改變。已經(jīng)表明E3Ub-蛋白連接酶RNF43和ZNRF3是WNT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的重要的調(diào)節(jié)物。這兩種在功能上同源但序列不同的蛋白(總體上同一性僅26%，外結(jié)構(gòu)域中40%，和非典型的RING結(jié)構(gòu)域鋅指中69%)是WNT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的負(fù)反饋調(diào)節(jié)物，這可通過它們與AXIN2(一個已知的WNT應(yīng)答基因，其也作為WNT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的負(fù)反饋調(diào)節(jié)物起作用)的表達(dá)正相關(guān)(Lustig等，2002，PMID:11809809)，通過它們在具有過度活化的β-連環(huán)蛋白信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的原發(fā)性結(jié)腸直腸腫瘤中的表達(dá)升高，和通過它們在用針對β-連環(huán)蛋白的siRNA處理的細(xì)胞中表達(dá)降低(Hao等，同上)推論出來。最近據(jù)報道，兩個WNT應(yīng)答元件定位于RNF43基因的內(nèi)含子，直接將β-連環(huán)蛋白信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與RNF43增量調(diào)節(jié)相關(guān)聯(lián)(Takahaski等，2014，PMID:24466159)。RNF43和ZNRF3通過控制這些受體的遍在化而各自調(diào)節(jié)細(xì)胞表面FZD和LRP受體水平(Koo等，同上；Hao等，同上)。在RNF43的情況下，外結(jié)構(gòu)域和功能性RING結(jié)構(gòu)域兩者均是對于將FZD遍在化和調(diào)節(jié)典型的WNT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的這種能力所需要的。RNF43在微調(diào)典型的WNT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中的生物學(xué)功能在一系列研究中進(jìn)一步得到證明，所述研究證實了R-spondin蛋白通過它們與E3泛素-蛋白連接酶的物理締合來抑制這些E3泛素-蛋白連接酶的水平，導(dǎo)致細(xì)胞表面上的WNT受體表達(dá)升高和結(jié)果完全使WNT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)成為可能(Chen等，2013，PMID:23756651;Hao等，同上)。在胰腺管腺癌中使RNF43功能上失活的突變賦予這些腫瘤WNT依賴性(Jiang等，同上)。最后，RNF43表達(dá)失調(diào)和其對在干細(xì)胞中和在癌癥中WNT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的影響的關(guān)聯(lián)被Koo等(同上)證實。發(fā)現(xiàn)RNF43和ZNRF3表達(dá)限制在小鼠的腸中的LGR5+干細(xì)胞隔室。腸雙敲除RNF43和ZNRF3基因的小鼠快速發(fā)生生長的腺瘤，其表型與β-連環(huán)蛋白信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的過度活化一致，和形態(tài)學(xué)與Paneth細(xì)胞和腸干細(xì)胞增生一致。最近還表明，RNF43還可通過其與DVL蛋白的相互作用而調(diào)節(jié)非-典型的WNT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)(Tsukiyama等，2015，PMID:2582552)。上述研究證實，RNF43是WNT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的精細(xì)的激動劑、拮抗劑和抗-拮抗劑反饋網(wǎng)絡(luò)的節(jié)點，可能暗示了癌癥的發(fā)生。β-連環(huán)蛋白過度活化是許多增生和癌癥的共同標(biāo)志，因此這些癌癥可能表明，RNF43表達(dá)升高作為不能對β-連環(huán)蛋白過度活化的同種靜止應(yīng)答的一部分。2.WNT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的測量典型的WNT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的蛋白調(diào)節(jié)物的功能可使用以下測定法闡明：(1)直接評價天然包含TCF/LEF轉(zhuǎn)錄因子的DNA結(jié)合位點(亦稱為WNT應(yīng)答元件或WRE)的“WNT應(yīng)答”基因(例如，AXIN2、MYC、CCND1、ASCL2)的升高的轉(zhuǎn)錄，或(2)通過使用合成的報告基因構(gòu)建體，其中TCF/LEF因子與WRE的結(jié)合導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄、隨后的翻譯和因此導(dǎo)致報告基因產(chǎn)物(例如，GFP、螢光素酶或其活性可容易測量的報告酶)的活性。在一個實施方案中，WNT活性可使用TOPFLASH測定法或其衍生方法測量(Korinek等，1997，PMID:9065401;Veeman等，2003，PMID:12699626)。在另一個實施方案中，可使用包含WNT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑需要的所有蛋白和經(jīng)工程改造以在包含WRE的DNA序列的控制下表達(dá)報告基因例如螢火蟲螢光素酶基因的WNT響應(yīng)報告細(xì)胞系。在本發(fā)明中，WNT響應(yīng)報告細(xì)胞系稱為293.TCF，被產(chǎn)生和用于測定本發(fā)明的抗-RNF43抗體或抗體藥物綴合物調(diào)節(jié)典型的WNT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的能力(見實施例8)。293.TCF細(xì)胞系表達(dá)四個WRE下游的螢火蟲螢光素酶基因。在WNT配體(例如，WNT3A)或可選的“WNT激活物”的存在下，TCF/LEF轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合WRE并激活螢火蟲螢光素酶基因的轉(zhuǎn)錄，最終導(dǎo)致螢光素酶的酶活性(例如，光的產(chǎn)生)的增加，如當(dāng)加入螢光素酶的合適的底物和輔助因子時所測量的。如本文所用的，術(shù)語“WNT激活物”意指激活WNT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)級聯(lián)的化合物(例如WNT配體)。WNT激活物例如可如下鑒定：使用WNT響應(yīng)報告細(xì)胞系(例如293.TCF細(xì)胞)，通過僅加入WNT激活物化合物(例如WNT3A)和觀察與未暴露于這樣的WNT激活物化合物的293.TCF細(xì)胞相比是否存在螢光素酶活性增加；或者例如通過使用各種生理化學(xué)技術(shù)(例如，脂轉(zhuǎn)染、電穿孔等)將所述試劑引入WNT響應(yīng)報告細(xì)胞，或通過轉(zhuǎn)染編碼所述化合物(例如，膜結(jié)合或跨膜蛋白)的DNA構(gòu)建體至WNT-響應(yīng)報告細(xì)胞系并允許天然細(xì)胞機(jī)器產(chǎn)生所述化合物。在一個實施方案中，293.TCF細(xì)胞系可用來自過表達(dá)WNT3A的細(xì)胞的上清液(例如來自L/WNT3A細(xì)胞的條件培養(yǎng)基)處理，螢光素酶活性(即WNT信號轉(zhuǎn)導(dǎo))可與未用WNT3A處理的細(xì)胞(例如，暴露于來自不表達(dá)WNT3A的親本L-細(xì)胞的條件培養(yǎng)基的細(xì)胞)相比，在WNT3A-處理的細(xì)胞中測量。與WNT激活物相比，本文描述為“WNT調(diào)節(jié)劑”的各種化合物(例如，R-spondin；FZD)能夠在WNT激活物(例如，WNT3A或來自L/WNT3A細(xì)胞的條件培養(yǎng)基)的存在下通過增加或降低WNT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)來影響WNT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的活性，但不能獨(dú)立于WNT激活物而激活WNT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。WNT調(diào)節(jié)劑可例如這樣鑒定：使用WNT響應(yīng)報告細(xì)胞系(例如293.TCF)，通過將這些細(xì)胞暴露于潛在的WNT調(diào)節(jié)劑以及WNT激活物化合物(例如WNT3A)和觀察與僅暴露于WNT激活物的293.TCF細(xì)胞相比是否存在可測量和顯著的螢光素酶活性變化。用于鑒定WNT調(diào)節(jié)劑的其它方法包括：使用各種生理化學(xué)技術(shù)(例如，脂轉(zhuǎn)染、電穿孔等)將潛在的WNT調(diào)節(jié)劑引入WNT響應(yīng)報告細(xì)胞，或通過將編碼所述化合物(例如，膜結(jié)合或跨膜蛋白)的DNA構(gòu)建體轉(zhuǎn)染至WNT-響應(yīng)報告細(xì)胞系和允許天然細(xì)胞機(jī)器產(chǎn)生WNT調(diào)節(jié)劑，然后將處理的細(xì)胞暴露于WNT激活物化合物(例如WNT3A)和觀察與不表達(dá)WNT調(diào)節(jié)劑的對照WNT-響應(yīng)報告細(xì)胞相比是否存在可測量和顯著的螢光素酶活性變化。在一個實施方案中，293.TCF細(xì)胞可經(jīng)工程改造以過表達(dá)RNF43或ZNRF3蛋白(例如在RNF43的情況下為293.TCF.37)，和在將這些細(xì)胞系與不表達(dá)RNF43的對照293.TCF細(xì)胞系暴露于合適的WNT激活物(例如條件培養(yǎng)基)后，比較兩種細(xì)胞系的螢光素酶活性。以這樣的方式，RNF43的生物學(xué)活性首次得到證實(Koo等，同上)，其觀察結(jié)果被發(fā)明人確認(rèn)，其中證實了RNF43是減少(或拮抗)WNT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的WNT調(diào)節(jié)劑，如與不表達(dá)RNF43的293.TCF細(xì)胞系的螢光素酶活性相比，通過觀察表達(dá)RNF43的293.TCF.37WNT響應(yīng)報告細(xì)胞系的螢光素酶活性的降低所測量的(見實施例8；圖6B)。RNF43-介導(dǎo)的WNT的降低或拮抗與RNF43(一種結(jié)合并特異性標(biāo)記FZD蛋白以降解的E3-泛素連接酶)降低細(xì)胞表面上的WNT受體密度和降低對激活的WNT信號(例如WNT3A配體)的應(yīng)答的能力相關(guān)聯(lián)。WNT調(diào)節(jié)劑也可在更復(fù)雜的條件下測試，其中可加入多種調(diào)節(jié)劑以測定它們對WNT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的加和作用。在一個實施方案中，經(jīng)工程改造以過表達(dá)已知的WNT調(diào)節(jié)劑的293.TCF細(xì)胞(例如，過表達(dá)RNF43的293.TCF.37細(xì)胞)可暴露于另外的WNT調(diào)節(jié)劑，以測定與未暴露于所述另外的WNT調(diào)節(jié)劑的對照細(xì)胞相比，這樣的暴露是否導(dǎo)致可測量的和顯著的螢光素酶活性變化。已知R-spondin(RSPO)家族的蛋白參與WNT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑(Kim等2008;PMID:18400942;參見圖6B)，并經(jīng)本發(fā)明人證實是一種增加WNT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的WNT調(diào)節(jié)劑。這通過與在WNT3A的存在下但在R-spondin的缺失下相同細(xì)胞系293.TCF.37的螢光素酶活性相比，在WNT3A和R-spondin(例如RSPO3)的存在下觀察293.TCF.37(例如，RNF43-過表達(dá))WNT響應(yīng)報告細(xì)胞系的螢光素酶活性增加得到證實(數(shù)據(jù)未顯示)。公開的分子細(xì)胞生物學(xué)研究表明：(1)R-spondin是WNT調(diào)節(jié)劑；它們單獨(dú)不激活WNT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)(例如，在WNT配體不存在時)，但在WNT配體存在時，正調(diào)節(jié)(即增加)WNT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)；和(2)R-spondin增加WNT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的能力與它們促進(jìn)LGR受體與RNF43或ZNRF3的相互作用的能力相關(guān)，導(dǎo)致RNF43或ZNRF3的膜清除，隨后促進(jìn)在細(xì)胞表面上FZD駐留增加，從而正調(diào)節(jié)或增加WNT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。如本文所用的，相關(guān)術(shù)語例如“增加WNT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)”、“減少WNT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)”或“不影響WNT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)”表示相對于對照條件或參比化合物，各種WNT調(diào)節(jié)劑或WNT激活物(例如本發(fā)明的抗-RNF43抗體或抗體藥物綴合物)單獨(dú)或組合調(diào)節(jié)WNT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的能力。在一個實施方案中，某些化合物(例如本發(fā)明的抗-RNF43抗體或抗體藥物綴合物)調(diào)節(jié)WNT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的能力可通過在WNT配體(例如WNT3A；參見實施例8)的存在下將293.TCFWNT響應(yīng)報告細(xì)胞系暴露于這樣的化合物來測定。增加螢光素酶活性高于自暴露于單獨(dú)的WNT配體所觀察到的活性的化合物被稱為“增加WNT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)”(例如，抗-RNF43抗體SC37.231；參見圖5A)；而與自暴露于單獨(dú)的WNT配體所觀察到的活性相比，不改變螢光素酶活性的化合物被稱為“不影響WNT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)”(例如，抗-RNF43抗體SC37.170；參見圖5A)；和降低螢光素酶活性低于自暴露于單獨(dú)的WNT配體所觀察到的活性的化合物被稱為“降低WNT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)”(例如，抗-RNF43抗體SC37.231；參見圖5A)。WNT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的變化可表示為“TCF活性倍數(shù)”，其中在試驗條件下在WNT報告系中測量的TCF活性除以在對照條件下對于WNT報告系觀察到的TCF活性。根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的標(biāo)準(zhǔn)統(tǒng)計學(xué)技術(shù)(例如，StudentT-檢驗；p值)，與對照相比，WNT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的增加或降低被確定為“顯著的”；因此，可測量的變化被認(rèn)為是統(tǒng)計學(xué)顯著的，只要它們在對于實驗測定法的正常生物學(xué)變異性的范圍之外。例如，如果測定法可以可靠地區(qū)分在測定群和對照群中的統(tǒng)計學(xué)顯著差異，其中各群體的均值與其它群體差異達(dá)2倍或以上，即2倍差異，則“顯著增加WNT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)”的WNT調(diào)節(jié)劑可被認(rèn)為增加WNT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)(例如TCF活性)至2.0倍以上(例如測定群和對照群的比率為2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0或更大)。同樣，“顯著減少WNT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)”的WNT調(diào)節(jié)劑可被認(rèn)為降低WNT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)(例如TCF活性)至1/2以下(例如測定群和對照群的比率為0.5、0.4、0.3、0.2、0.1或更小)?！皩NT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)沒有顯著影響”的WNT調(diào)節(jié)劑(例如中性抗體)可例如被認(rèn)為對WNT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的改變(增加WNT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)或降低WNT信號轉(zhuǎn)導(dǎo))小于2.0倍。3.通過抗-RNF43抗體和抗體藥物綴合物調(diào)節(jié)WNT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)典型的WNT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的簡化圖顯示于圖6A?？?RNF43抗體調(diào)節(jié)WNT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的能力可使用各種方法測定，其中的一些描述于本說明書上文的章節(jié)I.2.。如上文所述，抗體作為WNT調(diào)節(jié)劑的活性可使用WNT報告測定法測定，其提供WRE激活的轉(zhuǎn)錄的直接讀出，并因此直接測量WNT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。在本發(fā)明中，與在WNT3A配體的存在下但無抗-RNF43抗體的TCF活性(圖5A)相比，在WNT3A配體和抗-RNF43抗體的存在下TCF活性的測量是WNT調(diào)節(jié)劑對WNT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的作用的直接測量的實例。另外，根據(jù)在WNT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中蛋白生物學(xué)的已知理解，本領(lǐng)域公認(rèn)的其它測定法可用于推知WNT調(diào)節(jié)。例如，可在細(xì)胞表面上測量WNT受體FZD5的表達(dá)水平，因為已知細(xì)胞表面上存在的FZD5受體的量的變化與WNT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的變化正相關(guān)(參見Koo等，同上)。已知RNF43是一種通過涉及RNF43和FZD受體之間的物理相互作用的機(jī)制來減少WNT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的WNT調(diào)節(jié)劑，導(dǎo)致細(xì)胞表面上的FZD水平降低和導(dǎo)致WNT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)降低(Koo等，同上;Hao等，同上)。功能上阻斷RNF43與FZD相互作用的抗體(在圖6A中標(biāo)記為組I抗體)預(yù)期導(dǎo)致細(xì)胞表面上FZD受體密度增加，導(dǎo)致WNT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)增加。在一個實施方案中，本發(fā)明的抗-RNF43抗體或ADC增加WNT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的能力可通過這樣的抗-RNF43抗體和ADC與RNF43競爭結(jié)合FZD，從而防止FZD降解，導(dǎo)致WNT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)增加的能力間接測定。這樣的競爭實驗可使用ELISA測定法或本說明書的章節(jié)IV.5中更詳細(xì)描述的其它競爭測定法進(jìn)行，其中測定抗-RNF43抗體阻斷RNF43與分離的FZD蛋白、FZD外結(jié)構(gòu)域或過表達(dá)FZD的細(xì)胞結(jié)合的能力。同樣地，本領(lǐng)域技術(shù)人員已知R-spondin(RSPO)在功能上阻斷RNF43的活性。RNF43的表面表達(dá)對RNF43調(diào)節(jié)FZD受體的能力是重要的；通過募集LGR4受體至由RSPO、RNF43和LGR4組成的三元復(fù)合物，RSPO阻斷RNF43的活性，從而隔離RNF43與FZD，導(dǎo)致細(xì)胞表面上的FZD(WNT受體)水平增加，這導(dǎo)致WNT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)增加(Hao等，同上;Zebisch等，2013，PMID24225776;Xie等2013，PMID:24165923)。因此，相對于具有RSPO但缺少抗體的對照條件，功能上阻斷RSPO與RNF43相互作用的抗體(在圖6A中標(biāo)記為組II抗體)將預(yù)期導(dǎo)致細(xì)胞表面上的FZD受體密度降低，和導(dǎo)致WNT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)降低。在一個實施方案中，抗-RNF43抗體和ADC的WNT調(diào)節(jié)劑活性可通過這樣的抗-RNF43抗體和ADC與R-spondin競爭結(jié)合RNF43并從而阻斷R-spondin與RNF43的結(jié)合的能力間接測定。這樣的競爭實驗可使用ELISA測定法進(jìn)行，例如基本上如下：抗-RNF43抗體可加入重組的RNF43細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域蛋白，將混合物加入用R-spondin包被的ELISA板(見實施例8；圖5A)以測定抗體是否阻斷R-spondin與RNF43的相互作用。阻斷R-spondin與RNF43相互作用的抗-RNF43抗體或ADC意指與在缺少抗體時R-spondin與RNF43的結(jié)合相比，顯示R-spondin與RNF43的結(jié)合減少例如50%、60%、70%、80%、90%或更多的抗體。在其它實施方案中，另外的競爭測定法可按本說明書的章節(jié)IV.5中更詳細(xì)描述的進(jìn)行。WNT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的間接測量，如通過WNT調(diào)節(jié)劑(例如R-spondins和FZD)的活性測量的，可使用本說明書的章節(jié)I.2.中描述的直接WNT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)測定法證實。最后，可預(yù)期將存在不顯示上文描述的組I或組II抗體的性質(zhì)的抗-RNF43抗體和ADC，即這樣的抗體或ADC將不阻斷R-spondin與RNF43相互作用，它們也不阻斷RNF43與FZD的相互作用。該組抗體或ADC，盡管仍能夠特異性結(jié)合RNF43，但由于它們對WNT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)不具有作用的事實，可被稱為“中立抗體”。II.癌癥干細(xì)胞根據(jù)目前的模型，腫瘤包含非致瘤細(xì)胞和致瘤細(xì)胞。非致瘤細(xì)胞不具有自我更新的能力，甚至當(dāng)以過量的細(xì)胞數(shù)移植到免疫缺失的小鼠中時，也不能夠繁殖形成腫瘤。致瘤細(xì)胞，本文亦稱為“腫瘤引發(fā)細(xì)胞”(TIC)，其構(gòu)成腫瘤的細(xì)胞群的0.1-40%，具有形成腫瘤的能力。致瘤細(xì)胞包含腫瘤永生細(xì)胞(TPC)(可替換地稱為癌癥干細(xì)胞(CSC))和腫瘤祖細(xì)胞(TProg)兩者。CSC，像在正常組織中支持細(xì)胞分層的正常的干細(xì)胞一樣，能夠無限自我復(fù)制，同時保留多譜系分化的能力。CSC能夠產(chǎn)生致瘤性子代和非致瘤性子代兩者，和能夠完全重演親代腫瘤的異質(zhì)細(xì)胞組分，如通過連續(xù)分離和移植低數(shù)量的分離的CSC至免疫缺失的小鼠證實的。TProg，像CSC一樣，具有在原代移植物中刺激腫瘤生長的能力。然而，與CSC不同的是，它們不能夠重演親代腫瘤的細(xì)胞異質(zhì)性和在隨后的移植物中再起始腫瘤發(fā)生的效率更低，這是因為TProg通常僅能夠有限次細(xì)胞分裂，如通過連續(xù)移植低數(shù)量的高度純化的TProg至免疫缺失的小鼠所證實的。TProg可進(jìn)一步分成早期TProg和晚期TProg，它們可通過表型(例如，細(xì)胞表面標(biāo)記物)和它們重演腫瘤細(xì)胞結(jié)構(gòu)的不同能力進(jìn)行區(qū)分。盡管二者均不能重演腫瘤至與CSC相同的程度，但與晚期TProg相比，早期TProg具有重演親代腫瘤的特征的更大能力。雖然有上述差異，但已經(jīng)表明在個別情況下，一些TProg群可獲得正常屬于CSC的自我更新能力，本身可成為CSC。與以下細(xì)胞相比，CSC顯示更高的致腫瘤性和相對更加靜止：(i)TProg(早期和晚期TProg兩者)；和(ii)非致瘤細(xì)胞，例如腫瘤-侵潤細(xì)胞，例如可源自CSC和通常包含大多數(shù)腫瘤的成纖維細(xì)胞/間質(zhì)、內(nèi)皮和造血細(xì)胞。鑒于常規(guī)療法和方案在很大程度上設(shè)計為將腫瘤分散和快速攻擊增殖性細(xì)胞，與更快速增殖的TProg和其它大多數(shù)腫瘤細(xì)胞群例如非致瘤細(xì)胞相比，CSC對常規(guī)療法和方案更有抗性?？墒笴SC對常規(guī)療法有相對化學(xué)抗性的其它特征是增加的多重耐藥性轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的表達(dá)、增強(qiáng)的DNA修復(fù)機(jī)制和抗細(xì)胞凋亡基因表達(dá)。CSC中的這些性質(zhì)構(gòu)成確保晚期腫瘤的大多數(shù)患者長期獲益的標(biāo)準(zhǔn)腫瘤學(xué)治療方案失效的重要原因，這是因為標(biāo)準(zhǔn)化學(xué)療法不靶向?qū)嶋H上刺激連續(xù)腫瘤生長和復(fù)發(fā)的CSC。令人驚訝地發(fā)現(xiàn)，RNF43表達(dá)與各種致瘤細(xì)胞亞群相關(guān)。本發(fā)明提供抗-RNF43抗體，其可特別用于靶向致瘤細(xì)胞和可用于沉默、敏化、中和、降低頻率、阻斷、廢除、干擾、降低、妨礙、抑制、控制、減少、減輕、調(diào)節(jié)、減小、改變、消除或以其它方式抑制(統(tǒng)稱為“抑制”)致瘤細(xì)胞，從而促進(jìn)增殖性病癥(例如癌癥)的治療、管理和/或預(yù)防。有利的是，本發(fā)明的新的抗-RNF43抗體可經(jīng)選擇使得它們在給予受試者時優(yōu)選地降低致瘤細(xì)胞的頻率或致腫瘤性，而不管RNF43決定子的形式(例如，表型或基因型)如何。致瘤細(xì)胞頻率的減少可因為以下而發(fā)生：(i)致瘤細(xì)胞的抑制或根除；(ii)控制致瘤細(xì)胞的生長、擴(kuò)增或復(fù)發(fā)；(iii)阻斷致瘤細(xì)胞的起始、繁殖、維持或增殖；或(iv)通過其它方式阻礙致瘤細(xì)胞的存活、再生和/或轉(zhuǎn)移。在一些實施方案中，致瘤細(xì)胞的抑制可因為一個或多個生理學(xué)途徑的變化而發(fā)生。所述途徑的變化，無論是通過致瘤細(xì)胞的抑制、它們的潛力的改變(例如，通過誘導(dǎo)分化或生境破壞)或以其它方式干擾致瘤細(xì)胞影響腫瘤環(huán)境或其它細(xì)胞的能力，允許通過抑制腫瘤發(fā)生、腫瘤維持和/或轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)而更有效地治療RNF43相關(guān)病癥?？捎糜谠u價致瘤細(xì)胞的頻率減少的方法包括但不限于細(xì)胞計數(shù)分析或免疫組織化學(xué)分析，優(yōu)選地通過體外或體內(nèi)有限稀釋分析(Dylla等2008，PMID:PMC2413402和Hoey等2009，PMID:19664991)。體外有限稀釋分析可通過在促進(jìn)集落形成的固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)分級或未分級的腫瘤細(xì)胞(例如分別來自治療和未治療的腫瘤)并計數(shù)和表征生長的集落進(jìn)行?；蛘撸[瘤細(xì)胞可連續(xù)稀釋至包含液體培養(yǎng)基的帶孔的板中，和各孔可對在接種后的任何時間，但優(yōu)選地在接種后超過10天的集落形成評分為正值或負(fù)值。體內(nèi)有限稀釋通過以連續(xù)的稀釋度移植來自未治療的對照或來自暴露于選擇的治療劑的腫瘤的腫瘤細(xì)胞至免疫缺失的小鼠，和隨后對腫瘤形成評分各小鼠為正值或負(fù)值來進(jìn)行。可在可檢出植入的腫瘤后的任何時間進(jìn)行評分，但優(yōu)選地在移植后60天或更久進(jìn)行。分析有限稀釋實驗的結(jié)果以確定致瘤細(xì)胞的頻率優(yōu)選地使用泊松分布統(tǒng)計學(xué)或評價預(yù)定義的決定性事件例如體內(nèi)產(chǎn)生或不產(chǎn)生腫瘤的能力的頻率進(jìn)行(Fazekas等，1982，PMID:7040548)。流式細(xì)胞術(shù)和免疫組織化學(xué)也可用于測定致瘤細(xì)胞頻率。這兩種技術(shù)采用結(jié)合已知致瘤細(xì)胞富含的本領(lǐng)域公認(rèn)的細(xì)胞表面蛋白或標(biāo)記物的一種或多種抗體或試劑(參見WO2012/031280)。如本領(lǐng)域已知的，流式細(xì)胞術(shù)(例如熒光活化細(xì)胞分選(FACS))也可用于表征、分離、純化、富集或分選各種細(xì)胞群，包括致瘤細(xì)胞。流式細(xì)胞術(shù)通過使混合細(xì)胞群懸浮其中的液體流穿過電子檢測裝置測量致瘤細(xì)胞水平，所述裝置能夠測量多達(dá)數(shù)千個顆粒/秒的物理和/或化學(xué)特征。由于通過用結(jié)合致瘤細(xì)胞標(biāo)記物的標(biāo)記抗體或試劑染色組織樣品，使致瘤細(xì)胞原位可視化成為可能(例如，在組織切片中)，免疫組織化學(xué)提供另外的信息。通過方法例如流式細(xì)胞術(shù)、磁性活化細(xì)胞分選(MACS)、激光介導(dǎo)的分組或FACS，本發(fā)明的抗體可用于鑒定、表征、監(jiān)測、分離、分組或富集致瘤細(xì)胞群體或亞群。FACS是一種基于特異性細(xì)胞表面標(biāo)記物以超過99.5%純度分離細(xì)胞亞群的可靠方法。用于表征和操作致瘤細(xì)胞包括CSC的其它合適的技術(shù)可見于例如U.S.P.N.12/686,359、12/669,136和12/757,649。下文列舉了與CSC群有關(guān)并已用于分離或表征CSC的標(biāo)記物：ABCA1、ABCA3、ABCG2、ADAM9、ADCY9、ADORA2A、AFP、AXIN1、B7H3、BCL9、Bmi-1、BMP-4、C20orf52、C4.4A、羧肽酶M、CAV1、CAV2、CD105、CD133、CD14、CD16、CD166、CD16a、CD16b、CD2、CD20、CD24、CD29、CD3、CD31、CD324、CD325、CD34、CD38、CD44、CD45、CD46、CD49b、CD49f、CD56、CD64、CD74、CD9、CD90、CEACAM6、CELSR1、CPD、CRIM1、CX3CL1、CXCR4、DAF、核心蛋白多糖(decorin)、easyh1、easyh2、EDG3、eed、EGFR、ENPP1、EPCAM、EPHA1、EPHA2、FLJ10052、FLVCR、FZD1、FZD10、FZD2、FZD3、FZD4、FZD6、FZD7、FZD8、FZD9、GD2、GJA1、GLI1、GLI2、GPNMB、GPR54、GPRC5B、IL1R1、IL1RAP、JAM3、Lgr5、Lgr6、LRP3、LY6E、MCP、mf2、mllt3、MPZL1、MUC1、MUC16、MYC、N33、Nanog、NB84、巢蛋白、NID2、NMA、NPC1、制癌蛋白M、OCT4、OPN3、PCDH7、PCDHA10、PCDHB2、PPAP2C、PTPN3、PTS、RARRES1、SEMA4B、SLC19A2、SLC1A1、SLC39A1、SLC4A11、SLC6A14、SLC7A8、smarcA3、smarcD3、smarcE1、smarcA5、Sox1、STAT3、STEAP、TCF4、TEM8、TGFBR3、TMEPAI、TMPRSS4、轉(zhuǎn)鐵蛋白受體、TrkA、WNT10B、WNT16、WNT2、WNT2B、WNT3、WNT5A、YY1和β-連環(huán)蛋白。參見例如Schulenburg等，2010，PMID:20185329、U.S.P.N.7,632,678和U.S.P.N.2007/0292414、2008/0175870、2010/0275280、2010/0162416和2011/0020221。同樣地，與某些腫瘤類型的CSC有關(guān)的細(xì)胞表面表型的非限制性實例包括CD44hiCD24low、ALDH+、CD133+、CD123+、CD34+CD38?、CD44+CD24?、CD46hiCD324+CD66c?、CD133+CD34+CD10?CD19?、CD138?CD34?CD19+、CD133+RC2+、CD44+α2β1hiCD133+、CD44+CD24+ESA+、CD271+、ABCB5+以及本領(lǐng)域已知的其它CSC表面表型。參見例如：Schulenburg等，2010，同上；Visvader等，2008，PMID:18784658；和U.S.P.N.2008/0138313。本發(fā)明特別關(guān)心包含CD46hiCD324+表型的CSC群體。“正”、“低”和“負(fù)”表達(dá)水平當(dāng)應(yīng)用于標(biāo)記物或標(biāo)記物表型時如下定義。具有負(fù)表達(dá)(即“-”)的細(xì)胞在本文定義為在熒光發(fā)射的另外通道中標(biāo)記其它目的蛋白的完全抗體染色混合物的存在下，表達(dá)低于或等于在熒光通道中用同種型對照抗體觀察到的表達(dá)的95%的那些細(xì)胞。本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，用于定義負(fù)事件的該程序稱為“熒光-1”或“FMO”染色。具有大于使用上述FMO染色程序用同種型對照抗體觀察到的表達(dá)的95%的表達(dá)的細(xì)胞在本文定義為“正”(即”+”)。如本文定義的，存在廣泛定義為“正”的各種細(xì)胞群。如果抗原的平均觀察表達(dá)用上述的同種型對照抗體使用FMO染色測定高于95%，則細(xì)胞被定義為正。如果平均觀察表達(dá)通過FMO染色測定高于95%并且在95%的一個標(biāo)準(zhǔn)偏差內(nèi)，則正細(xì)胞可稱為具有低表達(dá)(即“l(fā)o”)的細(xì)胞?；蛘?，如果平均觀察表達(dá)通過FMO染色測定高于95%并比95%高一個標(biāo)準(zhǔn)偏差，則正細(xì)胞可稱為具有高表達(dá)(即“hi”)的細(xì)胞。在其它實施方案中，99%可優(yōu)選地用作負(fù)和正FMO染色之間的劃界點，和在特別優(yōu)選的實施方案中，百分?jǐn)?shù)可大于99%。CD46hiCD324+標(biāo)記物表型和上文剛剛示例的那些可與標(biāo)準(zhǔn)流式細(xì)胞計數(shù)分析和細(xì)胞分選計數(shù)結(jié)合用于表征、分離、純化或富集TIC和/或TPC細(xì)胞或細(xì)胞群，用于進(jìn)一步分析。本發(fā)明的抗體降低致瘤細(xì)胞頻率的能力因此可使用上述技術(shù)和標(biāo)記物測定。在一些實例中，抗-RNF43抗體可降低致瘤細(xì)胞頻率達(dá)10%、15%、20%、25%、30%或甚至35%。在其它實施方案中，致瘤細(xì)胞頻率的減少可為大約40%、45%、50%、55%、60%或65%。在某些實施方案中，公開的化合物可降低致瘤細(xì)胞頻率達(dá)70%、75%、80%、85%、90%或甚至95%。應(yīng)理解，致瘤細(xì)胞頻率的任何減少可能導(dǎo)致瘤形成的致腫瘤性、持續(xù)性、復(fù)發(fā)和侵襲性的相應(yīng)減少。III.抗體1.抗體結(jié)構(gòu)抗體和其變體及衍生物，包括公認(rèn)的命名法和編號系統(tǒng)，已詳細(xì)描述于例如Abbas等(2010)，CellularandMolecularImmunology(第6版)，W.B.SaundersCompany;或Murphey等(2011)，Janeway’sImmunobiology(第8版)，GarlandScience。如本文所用的，“完整抗體”通常是指Y-形四聚體蛋白，其包含通過共價二硫鍵和非共價相互作用保持在一起的兩條重多肽鏈(H)和兩條輕多肽鏈(L)。人輕鏈分為κ或λ輕鏈。各輕鏈由一個可變結(jié)構(gòu)域(VL)和一個恒定結(jié)構(gòu)域(CL)構(gòu)成。各重鏈包含一個可變結(jié)構(gòu)域(VH)和恒定區(qū)，在IgG、IgA和IgD的情況下恒定區(qū)包含稱為CH1、CH2和CH3的三個結(jié)構(gòu)域(IgM和IgE具有第四個結(jié)構(gòu)域CH4)。在IgG、IgA和IgD類型中，CH1和CH2結(jié)構(gòu)域通過柔性的鉸鏈區(qū)分開，所述鉸鏈區(qū)是不定長度的富含脯氨酸和半胱氨酸的區(qū)段(在IgG中通常約10-約60個氨基酸)。在輕鏈和重鏈兩者中的可變結(jié)構(gòu)域通過約12個或更多個氨基酸的“J”區(qū)與恒定結(jié)構(gòu)域連接，和重鏈還具有約10個另外的氨基酸的“D”區(qū)。各類型的抗體還包含由成對的半胱氨酸殘基形成的鏈間和鏈內(nèi)二硫鍵。如本文所用的術(shù)語"抗體"包括多克隆抗體(polyclonalantibody)、多克隆抗體(multiclonalantibody)、單克隆抗體、嵌合抗體、人源化和靈長類動物化抗體、CDR移植抗體、人抗體、重組產(chǎn)生的抗體、內(nèi)抗體、多特異性抗體、雙特異性抗體、單價抗體、多價抗體、抗個體基因型抗體、合成抗體(包括突變型蛋白和其變體)、免疫特異性抗體片段(例如Fd、Fab、F(ab')2、F(ab')片段)、單鏈片段(例如ScFv和ScFvFc)；和其衍生物，包括Fc融合物和其它修飾物，和任何其它免疫反應(yīng)性分子，只要它顯示與決定子的優(yōu)先締合或結(jié)合。此外，除非上下文的限制另外指示，該術(shù)語還包含所有類型的抗體(即IgA、IgD、IgE、IgG和IgM)和所有亞型(即，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)。對應(yīng)于不同類型的抗體的重鏈恒定結(jié)構(gòu)域通常分別通過相應(yīng)的小寫希臘字母α、δ、ε、γ和μ來表示。來自任何脊椎動物物種的抗體的輕鏈根據(jù)它們恒定結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列可指定為稱為kappa(κ)和lambda(λ)的兩個明顯不同類型之一?？贵w的可變結(jié)構(gòu)域顯示在抗體之間在氨基酸組成上的顯著變化，和主要負(fù)責(zé)抗原識別和結(jié)合。各輕鏈/重鏈對的可變區(qū)形成抗體結(jié)合位點，使得完整的IgG抗體具有兩個結(jié)合位點(即它是雙價的)。VH和VL結(jié)構(gòu)域包含極度可變的三個區(qū)，其稱為超變區(qū)，或更通常稱為互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)，由四個稱為框架區(qū)(FR)的較少可變的區(qū)域架構(gòu)和分開。在VH和VL區(qū)之間的非共價締合形成Fv片段(對于"可變片段")，其包含抗體的兩個抗原結(jié)合位點之一。ScFv片段(對于單鏈可變片段)，其可通過基因工程改造獲得，在單多肽鏈中締合由肽接頭分開的抗體VH和VL區(qū)。如本文所用的，指定氨基酸至各結(jié)構(gòu)域、框架區(qū)和CDR可按照Kabat等(1991)SequenceofProteinsofImmunologicalInterest(第5版)，USDept.ofHealthandHumanServices，PHS，NIH，NIHPublicationno.91-3242;Chothia等，1987，PMID:3681981;Chothia等，1989，PMID:2687698;MacCallum等,1996，PMID:8876650;或Dubel編輯(2007)HandbookofTherapeuticAntibodies，第3版.，Wily-VCHVerlagGmbHandCoorAbM(OxfordMolecular/MSIPharmacopia)中提供的編號方案之一進(jìn)行，除非另外注明。包含獲自Abysis網(wǎng)站數(shù)據(jù)庫(下文)的由Kabat、Chothia、MacCallum(亦稱為Contact)和AbM定義的CDR的氨基酸殘基在下文示出。表1KabatChothiaMacCallumAbMVHCDR131-3526-3230-3526-35VHCDR250-6552-5647-5850-58VHCDR395-10295-10293-10195-102VLCDR124-3424-3430-3624-34VLCDR250-5650-5646-5550-56VLCDR389-9789-9789-9689-97抗體序列的可變區(qū)和CDR可按照本領(lǐng)域開發(fā)的一般規(guī)則(如上所述，例如Kabat等編號系統(tǒng))或通過比對所述序列與已知可變區(qū)的數(shù)據(jù)庫來鑒定。用于鑒定這些區(qū)域的方法描述于Kontermann和Dubel編輯,AntibodyEngineering，Springer，NewYork，NY，2001和Dinarello等，CurrentProtocolsinImmunology，JohnWileyandSonsInc.，Hoboken，NJ，2000。抗體序列的示例性的數(shù)據(jù)庫描述于“Abysis"網(wǎng)站www.bioinf.org.uk/abs(由theDepartmentofBiochemistry&MolecularBiologyUniversityCollegeLondon，London，England的A.C.Martin維護(hù))和VBASE2網(wǎng)站www.vbase2.org，并可通過這些數(shù)據(jù)庫進(jìn)行評價，如Retter等，Nucl.AcidsRes.，33(數(shù)據(jù)庫發(fā)行):D671-D674(2005)所描述。優(yōu)選地，使用Abysis數(shù)據(jù)庫分析序列，其整合了來自Kabat等，IMGT的序列數(shù)據(jù)和來自PDB的具有結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)的蛋白數(shù)據(jù)庫(PDB)。參見Dr.AndrewC.R.Martin的書籍章節(jié)ProteinSequenceandStructureAnalysisofAntibodyVariableDomains.In:AntibodyEngineeringLabManual(編輯:Duebel，S.和Kontermann，R.，Springer-Verlag，Heidelberg，ISBN-13:978-3540413547，亦可獲自網(wǎng)站bioinforg.uk/abs)。Abysis數(shù)據(jù)庫網(wǎng)站還包括已開發(fā)用于鑒定CDR的一般規(guī)則，其可按照本文的教導(dǎo)使用。其中隨附的圖7E-7H表明這樣的分析在幾個示例性的抗體重鏈和輕鏈可變區(qū)的注釋中的結(jié)果。除非另外指明，否則本文所示的所有CDR根據(jù)Abysis數(shù)據(jù)庫網(wǎng)站按照Kabat等導(dǎo)出。對于本發(fā)明所述的重鏈恒定區(qū)氨基酸位置，編號按照首次描述于Edelman等，1969，Proc.Natl.Acad.Sci.USA63(1):78-85的Eu索引進(jìn)行，其描述了骨髓瘤蛋白Eu的氨基酸序列，據(jù)報道其是第一個測序的人IgG1。Edelman的EU索引也顯示在Kabat等，1991(同上)。因此，在重鏈的情況下，術(shù)語“Kabat所示的EU索引”或“Kabat的EU索引”或“EU索引”是指根據(jù)Edelman等的人IgG1Eu抗體的殘基編號系統(tǒng)，如Kabat等，1991(同上)所示。用于輕鏈恒定區(qū)氨基酸序列的編號系統(tǒng)同樣地示于Kabat等，(同上)。適合于本發(fā)明的示例性的κ輕鏈恒定區(qū)氨基酸序列如下示出：。同樣地，適合于本發(fā)明的示例性的IgG1重鏈恒定區(qū)氨基酸序列如下示出：。本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，使用標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)技術(shù)，公開的恒定區(qū)序列可與公開的重鏈和輕鏈可變區(qū)連接，以提供全長抗體，其可原樣使用，或摻入本發(fā)明的抗-RNF43ADC中。本發(fā)明的抗體或免疫球蛋白可自特異性識別任何相關(guān)決定子(即，RNF43)或與其締合的抗體產(chǎn)生。如本文所用的“決定子”或“靶標(biāo)”意指任何可檢測性狀、性質(zhì)、標(biāo)記物或因子，其可鑒定地與特定細(xì)胞、細(xì)胞群或組織相關(guān)，或特異性地存在于其中或其上。決定子或靶標(biāo)在性質(zhì)上可以是形態(tài)學(xué)的，功能的或生物化學(xué)的，和優(yōu)選地是表型的。在某些優(yōu)選的實施方案中，決定子是由特定細(xì)胞類型或由細(xì)胞在某些條件下(例如，在細(xì)胞周期的特定點期間或特定生境中的細(xì)胞)差異表達(dá)(過表達(dá)或表達(dá)不足)的蛋白。為本發(fā)明的目的，決定子優(yōu)選地在異常癌癥細(xì)胞上差異表達(dá)和可包含RNF43蛋白或任何其剪接變體、亞型或家族成員，或其特定的結(jié)構(gòu)域、區(qū)域或表位?！翱乖薄ⅰ懊庖咴詻Q定子”、“抗原決定子”或“免疫原”意指當(dāng)引入具有免疫能力的動物時可刺激免疫反應(yīng)并被自免疫反應(yīng)產(chǎn)生的抗體識別的任何蛋白或其任何片段、區(qū)域或結(jié)構(gòu)域。本文預(yù)期的決定子的存在或缺失可用于鑒定細(xì)胞、細(xì)胞亞群或組織(例如，腫瘤、致瘤細(xì)胞或CSC)。在免疫球蛋白分子中存在兩種類型的二硫橋或鍵：鏈間和鏈內(nèi)二硫鍵。如本領(lǐng)域眾所周知的，鏈間二硫鍵的位置和數(shù)量根據(jù)免疫球蛋白類型和物種而改變。盡管本發(fā)明不限于任何特定類型或亞型的抗體，但I(xiàn)gG1免疫球蛋白應(yīng)在本公開全文中用于說明性的目的。在野生型IgG1分子中，存在12個鏈內(nèi)二硫鍵(各重鏈4個和各輕鏈2個)和4個鏈間二硫鍵。鏈內(nèi)二硫鍵通常稍微受到保護(hù)和與鏈間鍵相比對還原相對不敏感。相反地，鏈間二硫鍵位于免疫球蛋白的表面，易接近溶劑和通常相對容易還原。在重鏈之間存在兩個鏈間二硫鍵，和從各重鏈至其各自的輕鏈存在一個。已經(jīng)證實，鏈間二硫鍵對于鏈締合不是必需的。IgG1鉸鏈區(qū)包含在重鏈中的形成鏈間二硫鍵的半胱氨酸，鏈間二硫鍵提供結(jié)構(gòu)支持以及利于Fab移動的柔性。重鏈/重鏈IgG1鏈間二硫鍵位于殘基C226和C229(Eu編號)，而IgG1的輕鏈和重鏈之間(重鏈/輕鏈)IgG1鏈間二硫鍵在κ或λ輕鏈的C214和重鏈的上鉸鏈區(qū)的C220之間形成。2.抗體產(chǎn)生和生產(chǎn)本發(fā)明的抗體可使用本領(lǐng)域已知的各種方法生產(chǎn)。A.在宿主動物中產(chǎn)生多克隆抗體在各種宿主動物中產(chǎn)生多克隆抗體是本領(lǐng)域眾所周知的(參見例如，Harlow和Lane(編輯)(1988)Antibodies:ALaboratoryManual，CSHPress;和Harlow等(1989)Antibodies，NY，ColdSpringHarborPress)。為了產(chǎn)生多克隆抗體，具有免疫能力的動物(例如，小鼠、大鼠、兔、山羊、非人靈長類動物等)用抗原性蛋白或包含抗原性蛋白的細(xì)胞或制備物免疫。一段時間后，包含多克隆抗體的血清通過放血或處死動物獲得。血清可以獲自動物的形式使用，或抗體可部分或完全地純化以提供免疫球蛋白部分或分離的抗體制備物。任何形式的抗原或包含抗原的細(xì)胞或制備物可用于產(chǎn)生對決定子特異性的抗體。術(shù)語“抗原”以廣泛的含義使用，和可包含選擇的靶標(biāo)的任何免疫原性片段或決定子，包括單個表位、多個表位、單個或多個結(jié)構(gòu)域或整個細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域(ECD)?？乖梢允欠蛛x的全長蛋白、細(xì)胞表面蛋白(例如，用在其表面上表達(dá)至少一部分的抗原的細(xì)胞免疫)或可溶性蛋白(例如，僅用蛋白的ECD部分免疫)?？乖稍谶z傳修飾的細(xì)胞中產(chǎn)生。任何前述抗原可單獨(dú)或與本領(lǐng)域已知的一種或多種免疫原性增強(qiáng)佐劑組合使用。編碼抗原的DNA可以是基因組的或非基因組的(例如，cDNA)，和可編碼足以引發(fā)免疫原性反應(yīng)的至少一部分的蛋白。任何載體可用于轉(zhuǎn)化抗原在其中表達(dá)的細(xì)胞，包括但不限于腺病毒載體、慢病毒載體、質(zhì)粒和非病毒載體，例如陽離子脂質(zhì)。B.單克隆抗體在選擇的實施方案中，本發(fā)明預(yù)期單克隆抗體的使用。術(shù)語"單克隆抗體"或“mAb”是指獲自一群基本上同質(zhì)的抗體的抗體，即，構(gòu)成該群的個體抗體是相同的，除了可能以較少量存在的可能的突變之外(例如，天然存在的突變)。單克隆抗體可使用各種技術(shù)制備，包括雜交瘤技術(shù)、重組技術(shù)、噬菌體展示技術(shù)、轉(zhuǎn)基因動物(例如，XenoMouse?)或其一些組合。例如，在優(yōu)選的實施方案中，單克隆抗體可使用雜交瘤和生物化學(xué)和基因工程改造技術(shù)產(chǎn)生，例如更詳細(xì)描述于An，Zhigiang(編輯)TherapeuticMonoclonalAntibodies:FromBenchtoClinic，JohnWileyandSons，第1版2009;Shire等(編輯)CurrentTrendsinMonoclonalAntibodyDevelopmentandManufacturing，SpringerScience+BusinessMediaLLC，第1版2010;Harlow等,Antibodies:ALaboratoryManual，ColdSpringHarborLaboratoryPress，第2版1988;Hammerling等，MonoclonalAntibodiesandT-CellHybridomas563-681(Elsevier，N.Y.，1981)。在產(chǎn)生特異性結(jié)合決定子的許多單克隆抗體后，特別合適的抗體可基于例如對決定子的親和力或內(nèi)化速率，通過各種篩選方法進(jìn)行選擇。在特別優(yōu)選的實施方案中，按本文所述產(chǎn)生的單克隆抗體可用作“源”抗體和進(jìn)一步修飾以例如改進(jìn)對靶標(biāo)的親和力、改進(jìn)其在細(xì)胞培養(yǎng)中的產(chǎn)量、降低體內(nèi)免疫原性、產(chǎn)生多特異性構(gòu)建體等。單克隆抗體產(chǎn)生和篩選的更詳細(xì)的描述在下文和在隨附的實施例中提供。C.人抗體抗體可包含完全人抗體。術(shù)語“人抗體”是指具有對應(yīng)于由人產(chǎn)生的抗體的氨基酸序列和/或使用下述的用于制備人抗體的任何技術(shù)制備的抗體(優(yōu)選地單克隆抗體)。在一個實施方案中，重組人抗體可通過篩選使用噬菌體展示制備的重組組合抗體庫分離。在一個實施方案中，所述庫是使用從分離自B-細(xì)胞的mRNA制備的人VL和VHcDNA產(chǎn)生的scFv噬菌體或酵母展示庫。人抗體還可通過引入人免疫球蛋白基因座至轉(zhuǎn)基因動物制備，所述動物例如其中內(nèi)源免疫球蛋白基因已被部分或完全失活和人免疫球蛋白基因已被引入的小鼠。在激發(fā)時，觀察到抗體產(chǎn)生，其在所有方面都非常類似于人中見到的情況，包括基因重排、裝配和完全人抗體庫。該方法描述于例如，U.S.P.N.5,545,807、5,545,806、5,569,825、5,625,126、5,633,425、5,661,016和關(guān)于XenoMouse?技術(shù)的U.S.P.N.6,075,181和6,150,584;和Lonberg和Huszar，1995，PMID:7494109)?；蛘?，人抗體可通過產(chǎn)生針對靶抗原的抗體的人B淋巴細(xì)胞的永生化來制備(這樣的B淋巴細(xì)胞可自患有腫瘤病癥或可能已在體外免疫的個體回收)。參見例如Cole等，MonoclonalAntibodiesandCancerTherapy，AlanR.Liss，p.77(1985);Boerner等，1991，PMID:2051030;和U.S.P.N.5,750,373。D.衍生的抗體：一旦源抗體已經(jīng)按上所述產(chǎn)生、選擇和分離，它們可進(jìn)一步改變以提供具有改進(jìn)的藥學(xué)特征的抗-RNF43抗體。優(yōu)選地，源抗體使用已知的分子改造技術(shù)被修飾或改變，以提供具有需要的治療性質(zhì)的衍生的抗體。E.嵌合和人源化抗體本發(fā)明的選擇的實施方案包含免疫特異性地結(jié)合RNF43的鼠抗體，和為本公開內(nèi)容的目的，可被認(rèn)為是“源”抗體。在選擇的實施方案中，適合于本發(fā)明的抗體可通過源抗體的恒定區(qū)和/或抗原結(jié)合氨基酸序列的任選修飾而源自這樣的“源”抗體。在某些實施方案中，如果在源抗體中選擇的氨基酸通過缺失、突變、置換、整合或組合而改變，則抗體“衍生”自源抗體。在另一個實施方案中，“衍生的”抗體是其中源抗體的片段(例如，一個或多個CDR或整個重鏈和輕鏈可變區(qū))與受體抗體序列組合或摻入受體抗體序列中以提供衍生的抗體(例如嵌合或人源化抗體)的抗體。這些“衍生的”抗體可使用下文所述的標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)技術(shù)產(chǎn)生，例如以改進(jìn)對決定子的親和力；改進(jìn)抗體穩(wěn)定性；改進(jìn)在細(xì)胞培養(yǎng)物中的產(chǎn)量和收率；降低體內(nèi)免疫原性；降低毒性；促進(jìn)活性部分的綴合；或產(chǎn)生多特異性抗體。這樣的抗體還可通過化學(xué)方式或翻譯后修飾來修飾成熟分子(例如，糖基化模式或聚乙二醇化)而源自源抗體。在一個實施方案中，本發(fā)明的嵌合抗體包含共價連接的源自至少兩個不同物種或抗體類型的蛋白區(qū)段的嵌合抗體。術(shù)語"嵌合"抗體涉及其中重鏈和/或輕鏈的一部分與來自特定物種或?qū)儆谔囟贵w類型或亞型的抗體中相應(yīng)的序列相同或同源，而所述鏈的剩余部分與來自另一物種或?qū)儆诹硪豢贵w類型或亞型的抗體中相應(yīng)的序列相同或同源的構(gòu)建體，以及這樣的抗體的片段(U.S.P.N.4,816,567;Morrison等，1984，PMID:6436822)。在一些優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的嵌合抗體可包含與人輕鏈和重鏈恒定區(qū)可操作連接的所有或大部分的選擇的鼠重鏈和輕鏈可變區(qū)。在其它特別優(yōu)選的實施方案中，抗-RNF43抗體可“衍生”自本文公開的小鼠抗體。在其它實施方案中，本發(fā)明的嵌合抗體是"CDR移植"抗體，其中CDR(如使用Kabat、Chothia、McCallum等所定義)源自特定物種或?qū)儆谔囟贵w類型或亞型，而抗體的剩余部分源自另一物種或?qū)儆诹硪豢贵w類型或亞型的抗體。對于在人中使用，一個或多個選擇的嚙齒動物CDR(例如，小鼠CDR)可移植至人受體抗體，替換一個或多個天然存在的人抗體的CDR。這些構(gòu)建體一般具有以下優(yōu)點：提供全長人抗體功能，例如補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒性(CDC)和抗體依賴性細(xì)胞-介導(dǎo)的細(xì)胞毒性(ADCC)，同時減少受試者對抗體的不需要的免疫反應(yīng)。在特別優(yōu)選的實施方案中，CDR移植抗體包含摻入人框架序列的獲自小鼠的一個或多個CDR。類似于CDR移植抗體的是“人源化”抗體。如本文所用的，“人源化”抗體是包含源自一種或多種非人抗體(供體或源抗體)的一個或多個氨基酸序列(例如CDR序列)的人抗體(受體抗體)。在某些實施方案中，“回復(fù)突變”可引入人源化抗體，其中在受體人抗體的可變區(qū)的一個或多個FR中的殘基被來自非人物種供體抗體的相應(yīng)殘基置換。這樣的回復(fù)突變可有助于維持移植CDR的合適的三維構(gòu)型和從而改進(jìn)親和力和抗體穩(wěn)定性。可使用來自各種供體物種的抗體，包括但不限于小鼠、大鼠、兔或非人靈長類動物。此外，人源化抗體可包含在受體抗體或供體抗體中不存在的新的殘基，以例如進(jìn)一步精修抗體性能。提供了適合于本發(fā)明的CDR移植抗體和人源化抗體，如下文實施例10所示。本領(lǐng)域公認(rèn)的各種技術(shù)可用于確定按照本發(fā)明用作受體抗體以提供人源化構(gòu)建體的人序列。合適的人種系序列和確定它們作為受體序列的合適性的方法的匯編公開于例如，Tomlinson，I.A.等(1992)J.Mol.Biol.227:776-798;Cook，G.P.等(1995)Immunol.Today16:237-242;Chothia，D.等(1992)J.Mol.Biol.227:799-817;和Tomlinson等(1995)EMBOJ14:4628-4638，其各自以其整體并入本文。V-BASE手冊(VBASE2–Retter等，NucleicAcidRes.33;671-674，2005)，其提供了人免疫球蛋白可變區(qū)序列的綜合性手冊(由Tomlinson，I.A.等編譯，MRCCentreforProteinEngineering，Cambridge，UK)，也可用于鑒定合適的受體序列。另外，例如U.S.P.N.6,300,064中描述的共有人框架序列也可證明是可按照本發(fā)明的教導(dǎo)使用的合適的受體序列。一般而言，人框架受體序列根據(jù)與鼠源框架序列的同源性以及分析該源抗體和受體抗體的CDR典型結(jié)構(gòu)進(jìn)行選擇。衍生抗體的經(jīng)工程改造的重鏈和輕鏈可變區(qū)序列然后可使用本領(lǐng)域公知的技術(shù)合成。例如，CDR移植抗體和人源化抗體以及相關(guān)的方法描述于U.S.P.N.6,180,370和5,693,762。對于進(jìn)一步的細(xì)節(jié)，參見例如Jones等，1986，PMID:3713831);和U.S.P.N.6,982,321和7,087,409。CDR移植抗體或人源化抗體可變區(qū)與人受體可變區(qū)的序列同一性或同源性可按本文所述確定，和當(dāng)如此測量時，優(yōu)選地共有至少60%或65%序列同一性，更優(yōu)選地至少70%、75%、80%、85%或90%序列同一性，甚至更優(yōu)選地至少93%、95%、98%或99%序列同一性。優(yōu)選地，不相同的殘基位置不同之處在于保守氨基酸置換?！氨Ｊ匕被嶂脫Q”是其中氨基酸殘基被具有類似化學(xué)性質(zhì)(例如，電荷或疏水性)的側(cè)鏈(R基團(tuán))的另一個氨基酸殘基置換的氨基酸置換。一般而言，保守氨基酸置換基本上不改變蛋白的功能性質(zhì)。在兩個或更多個氨基酸序列因保守置換而彼此不同的情況下，序列同一性或相似度百分比可調(diào)整以校正置換的保守性質(zhì)。應(yīng)當(dāng)理解，附圖中提供的帶注釋的CDR和框架序列按Kabat等使用專有的Abysis數(shù)據(jù)庫定義。然而，如本文所述的，本領(lǐng)域技術(shù)人員可按照Chothia等或MacCallum等提供的編號方案容易地鑒定CDR。F.位點特異性抗體本發(fā)明的抗體可經(jīng)工程改造以利于與細(xì)胞毒素或其它抗癌癥劑綴合(如下文更詳細(xì)論述的)。關(guān)于細(xì)胞毒素在抗體上的位置和藥物與抗體比率(DAR)，抗體藥物綴合物(ADC)制劑包含同質(zhì)群的ADC分子是有利的。根據(jù)本公開內(nèi)容，本領(lǐng)域技術(shù)人員可容易地制造本文所述的位點特異性的經(jīng)工程改造的構(gòu)建體。如本文所用的“位點特異性抗體”或“位點特異性構(gòu)建體”意指抗體或其免疫反應(yīng)性片段，其中在重鏈或輕鏈中的至少一個氨基酸被缺失、改變或置換(優(yōu)選地用另一種氨基酸)，以提供至少一個游離的半胱氨酸。同樣地，“位點特異性綴合物”應(yīng)意指包含位點特異性抗體和與未配對的半胱氨酸綴合的至少一個細(xì)胞毒素或其它化合物的ADC。在某些實施方案中，未配對的半胱氨酸殘基將包含未配對的鏈內(nèi)殘基。在其它優(yōu)選的實施方案中，游離的半胱氨酸殘基包含未配對的鏈間半胱氨酸殘基。經(jīng)工程改造抗體可具有各種同種型，例如IgG、IgE、IgA或IgD；和在這些類型中，抗體可具有各種亞型，例如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。對于IgG1構(gòu)建體，抗體的輕鏈可包含各自摻有C214的κ或λ同種型，在優(yōu)選的實施方案中，其由于缺少IgG1重鏈中的C220殘基而可以未被配對。在一個實施方案中，經(jīng)工程改造抗體包含鏈內(nèi)或鏈間半胱氨酸殘基的至少一個氨基酸缺失或置換。如本文所用的“鏈間半胱氨酸殘基”意指參與在抗體的輕鏈和重鏈之間或在抗體的兩條重鏈之間的天然二硫鍵的半胱氨酸殘基，而“鏈內(nèi)半胱氨酸殘基”是與在相同的重鏈或輕鏈中的另一半胱氨酸天然配對的半胱氨酸殘基。在一個實施方案中，缺失的或置換的鏈間半胱氨酸殘基參與在輕鏈和重鏈之間形成二硫鍵。在另一個實施方案中，缺失的或置換的半胱氨酸殘基參與在兩條重鏈之間的二硫鍵。在代表性的實施方案中，由于抗體的互補(bǔ)結(jié)構(gòu)，其中輕鏈與重鏈的VH和CH1結(jié)構(gòu)域配對和其中一條重鏈的CH2和CH3結(jié)構(gòu)域與互補(bǔ)重鏈的CH2和CH3結(jié)構(gòu)域配對，在輕鏈或重鏈中的單個半胱氨酸的突變或缺失將在經(jīng)工程改造抗體中產(chǎn)生兩個未配對的半胱氨酸殘基。在一些實施方案中，鏈間半胱氨酸殘基缺失。在其它實施方案中，鏈間半胱氨酸被置換為另一氨基酸(例如，天然存在的氨基酸)。例如，氨基酸置換可導(dǎo)致用中性(例如絲氨酸、蘇氨酸或甘氨酸)或親水性(例如甲硫氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸或異亮氨酸)殘基替換鏈間半胱氨酸。在一個特別優(yōu)選的實施方案中，鏈間半胱氨酸用絲氨酸替換。在本發(fā)明預(yù)期的一些實施方案中，缺失或置換的半胱氨酸殘基在輕鏈(κ或λ)上，從而在重鏈上留下游離的半胱氨酸。在其它實施方案中，缺失或置換的半胱氨酸殘基在重鏈上，在輕鏈恒定區(qū)上留下游離的半胱氨酸。在裝配時，應(yīng)當(dāng)理解在完整抗體的輕鏈或重鏈中的單個半胱氨酸的缺失或置換產(chǎn)生具有兩個未配對的半胱氨酸殘基的位點特異性抗體。在一個特別優(yōu)選的實施方案中，IgG輕鏈(κ或λ)的位置214的半胱氨酸(C214)被缺失或置換。在另一個優(yōu)選的實施方案中，IgG重鏈的220位的半胱氨酸(C220)被缺失或置換。在進(jìn)一步的實施方案中，重鏈的226位或229位的半胱氨酸被缺失或置換。在一個實施方案中，重鏈的C220被絲氨酸置換(C220S)，以在輕鏈中提供需要的游離半胱氨酸。在另一個實施方案中，輕鏈的C214被絲氨酸置換(C214S)，以在重鏈中提供需要的游離半胱氨酸。這樣的位點特異性構(gòu)建體提供在實施例17中。這些優(yōu)選的構(gòu)建體的概述在下文緊接的表2中顯示，其中所有編號按照如Kabat所示的EU索引進(jìn)行，和WT代表“野生型”或沒有改變的天然恒定區(qū)序列，和delta(Δ)表示氨基酸殘基的缺失(例如，C214Δ表示214位的半胱氨酸已被缺失)。表2命名抗體組分變化ss1重鏈C220S輕鏈WTss2重鏈C220Δ輕鏈WTss3重鏈WT輕鏈C214Δss4重鏈WT輕鏈C214S如本文所公開的用于產(chǎn)生具有確定位點和化學(xué)計量的藥物載荷的抗體-藥物綴合物的策略可廣泛適用于所有抗-RNF43抗體，因為其主要包括抗體的保守恒定結(jié)構(gòu)域的工程改造。因為各類型和亞類的抗體的氨基酸序列和天然二硫橋已被詳細(xì)記載，本領(lǐng)域技術(shù)人員可容易地制造各種抗體的經(jīng)工程改造構(gòu)建體，而無需過度實驗，因此這樣的構(gòu)建體明確地預(yù)期在本發(fā)明的范圍內(nèi)。G.恒定區(qū)修飾和改變的糖基化本發(fā)明的選擇的實施方案還可包含恒定區(qū)(即Fc區(qū))的置換或修飾，包括而不限于氨基酸殘基置換、突變和/或修飾，其產(chǎn)生具有優(yōu)選特征的化合物，所述特征包括但不限于：改變的藥代動力學(xué)、增加的血清半壽期、增加的結(jié)合親和力、降低的免疫原性、增加的產(chǎn)量、改變的Fc配體與Fc受體(FcR)的結(jié)合、提高或降低的ADCC或CDC、改變的糖基化和/或二硫鍵和改變的結(jié)合特異性。具有改進(jìn)的Fc效應(yīng)子功能的化合物可通過例如參與Fc結(jié)構(gòu)域和Fc受體(例如，F(xiàn)cγRI、FcγRIIA和B、FcγRIII和FcRn)之間的相互作用的氨基酸殘基的變化產(chǎn)生，其可導(dǎo)致細(xì)胞毒性增加和/或藥代動力學(xué)改變，例如血清半壽期增加(參見例如Ravetch和Kinet，Annu.Rev.Immunol9:457-92(1991);Capel等，Immunomethods4:25-34(1994);和deHaas等，J.Lab.Clin.Med.126:330-41(1995)。在選擇的實施方案中，體內(nèi)半壽期增加的抗體可通過修飾(例如置換、缺失或添加)鑒定為參與Fc結(jié)構(gòu)域和FcRn受體之間的相互作用的氨基酸殘基產(chǎn)生(參見，例如，國際公開號WO97/34631、WO04/029207、U.S.P.N.6,737,056和U.S.P.N.2003/0190311)。關(guān)于這樣的實施方案，F(xiàn)c變體可提供在哺乳動物，優(yōu)選地人中大于5天、大于10天、大于15天、優(yōu)選地大于20天、大于25天、大于30天、大于35天、大于40天、大于45天、大于2個月、大于3個月、大于4個月或大于5個月的半壽期。增加的半壽期導(dǎo)致更高的血清滴度，其因此降低抗體的給藥頻率和/或降低待給予的抗體的濃度。與人FcRn的體內(nèi)結(jié)合和人FcRn高親和力結(jié)合多肽的血清半壽期可例如在表達(dá)人FcRn的轉(zhuǎn)基因小鼠或轉(zhuǎn)染的人細(xì)胞系中或在給予具有變體Fc區(qū)的多肽的靈長類動物中測定。WO2000/42072描述了具有提高的或減少的FcRn結(jié)合的抗體變體。亦參見例如Shields等J.Biol.Chem.9(2):6591-6604(2001)。在其它實施方案中，F(xiàn)c改變可導(dǎo)致提高或降低的ADCC或CDC活性。如本領(lǐng)域已知的，CDC是指在補(bǔ)體的存在下靶細(xì)胞溶解，和ADCC是指一種細(xì)胞毒性形式，其中結(jié)合到在某些細(xì)胞毒性細(xì)胞(例如，天然殺傷細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞)上存在的FcR的分泌的Ig使這些細(xì)胞毒性效應(yīng)細(xì)胞能夠特異性結(jié)合帶抗原的靶細(xì)胞，并隨后用細(xì)胞毒素殺死所述靶細(xì)胞。在本發(fā)明的情況下，提供具有"改變的"FcR結(jié)合親和力的抗體變體，與母體或未修飾的抗體相比或與包含天然序列FcR的抗體相比，所述改變的FcR結(jié)合親和力是提高或降低的結(jié)合。與天然序列相比，顯示降低的結(jié)合的這樣的變體可具有很少或沒有可察覺的結(jié)合，例如，0-20%的FcR結(jié)合，例如通過本領(lǐng)域眾所周知的技術(shù)所測定的。在其它實施方案中，與天然免疫球蛋白Fc結(jié)構(gòu)域相比，變體將顯示提高的結(jié)合。應(yīng)理解，這些類型的Fc變體可有利地用于提高所公開的抗體的有效的抗腫瘤性質(zhì)。在又一些實施方案中，這樣的改變導(dǎo)致增加的結(jié)合親和力、降低的免疫原性、增加的產(chǎn)量、改變的糖基化和/或二硫鍵(例如對于綴合位點)、改變的結(jié)合特異性、增加的吞噬作用和/或細(xì)胞表面受體(例如B細(xì)胞受體、BCR)的減量調(diào)節(jié)等。還其它的實施方案包括一種或多種經(jīng)工程改造的糖形，例如，包含與蛋白(例如，在Fc結(jié)構(gòu)域中)共價連接的改變的糖基化模式或改變的碳水化合物組成的位點特異性抗體。參見例如Shields，R.L.等(2002)J.Biol.Chem.277:26733-26740。經(jīng)工程改造的糖形可用于各種目的，包括但不限于提高或降低效應(yīng)子功能、增加抗體對靶標(biāo)的親和力或促進(jìn)抗體的產(chǎn)生。在需要降低效應(yīng)子功能的某些實施方案中，該分子可經(jīng)工程改造以表達(dá)非糖基化形式。可導(dǎo)致消除一個或多個可變區(qū)框架糖基化位點從而消除該位點的糖基化的置換是眾所周知的(參見例如U.S.P.N.5,714,350和6,350,861)。相反地，增強(qiáng)的效應(yīng)子功能或改進(jìn)的結(jié)合可能通過在一個或多個另外的糖基化位點上工程改造而被賦予包含F(xiàn)c的分子。其它實施方案包括具有改變的糖基化組成的Fc變體，例如具有減少量的巖藻糖基殘基的低巖藻糖基化的抗體或具有增加的二等分GlcNAc結(jié)構(gòu)的抗體。已經(jīng)證實這樣的改變的糖基化模式增加抗體的ADCC能力。經(jīng)工程改造的糖形可通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何方法產(chǎn)生，例如通過使用經(jīng)工程改造或變體表達(dá)菌株，通過與一種或多種酶(例如N-乙酰葡糖氨基轉(zhuǎn)移酶III(GnTIII))共表達(dá)，通過在各種生物體或來自各種生物體的細(xì)胞系中表達(dá)包含F(xiàn)c區(qū)的分子或通過在包含F(xiàn)c區(qū)的分子已經(jīng)表達(dá)后修飾碳水化合物(參見例如WO2012/117002)。H.片段不管選擇實施本發(fā)明的抗體形式(例如嵌合、人源化等)如何，應(yīng)理解免疫反應(yīng)性片段，無論是自身還是作為所述免疫反應(yīng)性片段的抗體藥物綴合物的一部分，可按照本文的教導(dǎo)使用?！翱贵w片段"包含完整抗體的至少一部分。如本文所用的，術(shù)語抗體分子的"片段"包括抗體的抗原結(jié)合片段，和術(shù)語“抗原結(jié)合片段”是指免疫球蛋白或抗體的多肽片段免疫特異性地結(jié)合選擇的抗原或其免疫原性決定子或與其反應(yīng)，或與所述片段來自的完整抗體競爭特異性的抗原結(jié)合。示例性的位點特異性片段包括：可變輕鏈片段(VL)、可變重鏈片段(VH)、scFv、F(ab')2片段、Fab片段、Fd片段、Fv片段、單結(jié)構(gòu)域抗體片段、雙抗體、線性抗體、單鏈抗體分子和自抗體片段形成的多特異性抗體。此外，活性位點特異性片段包含抗體的一部分，其保留其與抗原/底物或受體相互作用和以類似于完整抗體的方式修飾它們(盡管可能具有稍微較低的功效)的能力。這樣的抗體片段可進(jìn)一步經(jīng)工程改造以包含一個或多個游離的半胱氨酸。在其它實施方案中，抗體片段是包含F(xiàn)c區(qū)和保留當(dāng)存在于完整抗體中時通常與Fc區(qū)有關(guān)的至少一種生物學(xué)功能(例如FcRn結(jié)合、抗體半壽期調(diào)節(jié)、ADCC功能和補(bǔ)體結(jié)合)的片段。在一個實施方案中，抗體片段是具有基本上類似于完整抗體的體內(nèi)半壽期的單價抗體。例如，這樣的抗體片段可包含與包含至少一個游離的半胱氨酸的Fc序列連接的抗原結(jié)合臂，所述游離的半胱氨酸能夠賦予該片段體內(nèi)穩(wěn)定性。如本領(lǐng)域技術(shù)人員公認(rèn)的，片段可通過分子工程改造或通過化學(xué)或酶處理(例如木瓜蛋白酶或胃蛋白酶)完整或完全的抗體或抗體鏈或通過重組方式獲得。對于抗體片段的更詳細(xì)的描述，參見例如FundamentalImmunology，W.E.Paul編輯，RavenPress，N.Y.(1999)。I.多價構(gòu)建體在其它實施方案中，本發(fā)明的抗體和綴合物可以是單價或多價的(例如，二價、三價等)。如本文所用的，術(shù)語"價"是指與抗體有關(guān)的潛在靶標(biāo)結(jié)合位點數(shù)。每個靶標(biāo)結(jié)合位點特異性結(jié)合一個靶標(biāo)分子或靶標(biāo)分子上的特定位置或部位。當(dāng)抗體是單價的時，分子的每個結(jié)合位點特異性結(jié)合單個抗原位置或表位。當(dāng)抗體包含超過一個靶標(biāo)結(jié)合位點(多價)時，每個靶標(biāo)結(jié)合位點可特異性結(jié)合相同或不同的分子(例如，可結(jié)合不同的配體或不同的抗原，或相同抗原上的不同的表位或位置)。參見例如U.S.P.N.2009/0130105。在一個實施方案中，抗體是雙特異性抗體，其中兩條鏈具有不同的特異性，如Millstein等，1983，Nature，305:537-539所述的。其它實施方案包括具有另外的特異性的抗體，例如三特異性抗體。其它更加復(fù)雜的合適的多特異性構(gòu)建體和它們的制造方法描述于U.S.P.N.2009/0155255，以及WO94/04690;Suresh等，1986，MethodsinEnzymology，121:210;和WO96/27011。多價抗體可免疫特異性結(jié)合所需靶標(biāo)分子的不同的表位，或可免疫特異性結(jié)合靶標(biāo)分子以及異源表位(例如異源多肽或固體支持材料)兩者。盡管優(yōu)選的實施方案僅結(jié)合兩個抗原(即雙特異性抗體)，但具有另外的特異性的抗體例如三特異性抗體也包括在本發(fā)明中。雙特異性抗體還包括交聯(lián)或"雜綴合物"抗體。例如，雜綴合物中的抗體之一可與抗生物素蛋白偶聯(lián)，另一個抗體與生物素偶聯(lián)。已經(jīng)提出這樣的抗體例如將免疫系統(tǒng)細(xì)胞靶向不需要的細(xì)胞(U.S.P.N.4,676,980)和用于治療HIV感染(WO91/00360、WO92/200373和EP03089)。雜綴合物抗體可使用任何常規(guī)交聯(lián)方法制備。合適的交聯(lián)劑以及許多交聯(lián)技術(shù)是本領(lǐng)域眾所周知的，和公開于U.S.P.N.4,676,980。在又一個實施方案中，使用本領(lǐng)域普通技術(shù)人員眾所周知的方法，將具有需要的結(jié)合特異性(抗體-抗原結(jié)合位點)的抗體可變結(jié)構(gòu)域與免疫球蛋白恒定結(jié)構(gòu)域序列(例如包含至少部分鉸鏈區(qū)、CH2和/或CH3區(qū)的免疫球蛋白重鏈恒定結(jié)構(gòu)域)融合。J.抗體的重組產(chǎn)生抗體和其片段可使用獲自產(chǎn)生抗體的細(xì)胞的遺傳物質(zhì)和重組技術(shù)產(chǎn)生或修飾(參見，例如，Berger和Kimmel，GuidetoMolecularCloningTechniques，MethodsinEnzymologyvol.152AcademicPress，Inc.，SanDiego，CA;Sambrook和Russell(編輯)(2000)MolecularCloning:ALaboratoryManual(第3版)，NY，ColdSpringHarborLaboratoryPress;Ausubel等(2002)ShortProtocolsinMolecularBiology:ACompendiumofMethodsfromCurrentProtocolsinMolecularBiology，Wiley，John&Sons，Inc.;和U.S.P.N.7,709,611)。本發(fā)明的另一方面涉及編碼本發(fā)明的抗體的核酸分子。核酸可以完整細(xì)胞、細(xì)胞裂解物或部分純化或基本上純的形式存在。當(dāng)通過標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)(包括堿/SDS處理、CsCl顯帶、柱色譜、瓊脂糖凝膠電泳和其它本領(lǐng)域眾所周知的技術(shù))與其它細(xì)胞組分或其它污染物(例如其它細(xì)胞核酸或蛋白)分開時，核酸是“分離的”或基本上純的。本發(fā)明的核酸可以是例如DNA(例如基因組DNA、cDNA)、RNA和其人工變體(例如肽核酸)，無論是單鏈或雙鏈或RNA，RNA可包含或可不包含內(nèi)含子。在優(yōu)選的實施方案中，核酸是cDNA分子。本發(fā)明的核酸可使用標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)技術(shù)獲得。對于雜交瘤表達(dá)的抗體(例如，按下文進(jìn)一步描述制備的雜交瘤)，編碼抗體的輕鏈和重鏈的cDNA可通過標(biāo)準(zhǔn)PCR擴(kuò)增或cDNA克隆技術(shù)獲得。對于獲自免疫球蛋白基因庫的抗體(例如，使用噬菌體展示技術(shù))，編碼抗體的核酸可自該庫回收。編碼VH和VL區(qū)段的DNA片段可通過標(biāo)準(zhǔn)重組DNA技術(shù)進(jìn)一步操作，例如以轉(zhuǎn)化可變區(qū)基因為全長抗體鏈基因、Fab片段基因或scFv基因。在這些操作中，VL-或VH-編碼DNA片段與編碼另一蛋白(例如抗體恒定區(qū)或柔性接頭)的另一DNA片段可操作連接。該情況下使用的術(shù)語“可操作連接”意指兩個DNA片段連接使得由兩個DNA片段編碼的氨基酸序列保持在框內(nèi)。編碼VH區(qū)的分離的DNA可通過可操作連接VH-編碼DNA與編碼重鏈恒定區(qū)(CH1、CH2和CH3)的另一DNA分子而轉(zhuǎn)換成全長重鏈基因。人重鏈恒定區(qū)基因的序列是本領(lǐng)域已知的(參見例如，Kabat等(1991)(同上))，包含這些區(qū)的DNA片段可通過標(biāo)準(zhǔn)PCR擴(kuò)增獲得。重鏈恒定區(qū)可以是IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgE、IgM或IgD恒定區(qū)，但最優(yōu)選地是IgG1或IgG4恒定區(qū)。示例性的IgG1恒定區(qū)顯示在SEQIDNO:2中。對于Fab片段重鏈基因，VH-編碼DNA可與僅編碼重鏈CH1恒定區(qū)的另一DNA分子可操作連接。編碼VL區(qū)的分離的DNA可通過將VL-編碼DNA與編碼輕鏈恒定區(qū)CL的另一DNA分子可操作連接，轉(zhuǎn)換為全長輕鏈基因(以及Fab輕鏈基因)。人輕鏈恒定區(qū)基因的序列是本領(lǐng)域已知的(參見例如，Kabat等(1991)(同上))，包含這些區(qū)的DNA片段可通過標(biāo)準(zhǔn)PCR擴(kuò)增獲得。輕鏈恒定區(qū)可以是κ或λ恒定區(qū)，但最優(yōu)選地是κ恒定區(qū)。在該方面，示例性的合適的κ輕鏈恒定區(qū)顯示在SEQIDNO:1中。本文預(yù)期顯示與本發(fā)明的多肽具有“序列同一性”、“序列相似性”或“序列同源性”的某些多肽(例如抗原或抗體)?！巴吹摹倍嚯目娠@示65%、70%、75%、80%、85%或90%序列同一性。在其它實施方案中，“同源的”多肽可顯示93%、95%或98%序列同一性。如本文所用的，兩個氨基酸序列之間的同源性百分比等同于兩個序列之間的同一性百分比。兩個序列之間的同一性百分比是序列共有的相同位置數(shù)的函數(shù)(即，%同源性=相同位置數(shù)/位置總數(shù)×100)，其考慮了空位數(shù)和各空位的長度，它們需要引入以最佳比對兩個序列。序列的比較和兩個序列之間同一性百分比的確定可使用數(shù)學(xué)算法實現(xiàn)，如下文的非限制性實例所描述的。兩個氨基酸序列之間的同一性百分比可使用E.Meyers和W.Miller(Comput.Appl.Biosci.,4:11-17(1988))的已經(jīng)并入ALIGN程序(版本2.0)的算法，使用PAM120加權(quán)殘基表、12的空位長度罰分和4的空位罰分確定。此外，兩個氨基酸序列之間的同一性百分比可使用已經(jīng)并入GCG軟件包(可獲自www.gcg.com)的GAP程序的Needleman和Wunsch(J.Mol.Biol.48:444-453(1970))算法，使用Blossum62矩陣或PAM250矩陣，和16、14、12、10、8、6或4的空位權(quán)重和1、2、3、4、5或6的長度權(quán)重確定。另外或備選地，本發(fā)明的蛋白序列可進(jìn)一步用作“質(zhì)詢序列”以針對公開的數(shù)據(jù)庫進(jìn)行檢索，以例如鑒定相關(guān)的序列。這樣的檢索可使用Altschul等(1990)J.Mol.Biol.215:403-10的XBLAST程序(版本2.0)進(jìn)行。BLAST蛋白檢索可用XBLAST程序、評分=50、字長=3進(jìn)行，以獲得與本發(fā)明的抗體分子同源的氨基酸序列。為了獲得帶空位的比對用于比較目的，可按Altschul等，(1997)NucleicAcidsRes.25(17):3389-3402所述使用GappedBLAST。當(dāng)使用BLAST和GappedBLAST程序時，可使用各程序(例如，XBLAST和NBLAST)的默認(rèn)參數(shù)。不相同的殘基位置可由于保守氨基酸置換或通過非保守氨基酸置換而不同?！氨Ｊ匕被嶂脫Q”是氨基酸殘基被具有類似的化學(xué)性質(zhì)(例如，電荷或疏水性)的側(cè)鏈的另一氨基酸殘基置換的置換。一般而言，保守氨基酸置換基本上不改變蛋白的功能性質(zhì)。在兩個或更多個氨基酸序列由于保守置換而彼此不同的情況下，序列同一性或相似度百分比可經(jīng)調(diào)整以校正置換的保守性質(zhì)。在存在用非保守氨基酸的置換的情況下，在優(yōu)選的實施方案中，顯示序列同一性的多肽將保留本發(fā)明的多肽(例如抗體)的需要的功能或活性。本文還預(yù)期顯示與本發(fā)明的核酸具有“序列同一性”、“序列相似性”或“序列同源性”的核酸。“同源序列”意指顯示至少約65%、70%、75%、80%、85%或90%序列同一性的核酸分子的序列。在其它實施方案中，核酸的“同源序列”可顯示與參比核酸具有93%、95%或98%序列同一性。本發(fā)明還提供包含可與啟動子可操作連接的上述核酸(參見例如WO86/05807、WO89/01036和U.S.P.N.5,122,464)和真核分泌途徑的其它轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)和加工控制元件的載體。本發(fā)明還提供包含這些載體和宿主表達(dá)系統(tǒng)的宿主細(xì)胞。如本文所用的，術(shù)語“宿主表達(dá)系統(tǒng)”包括可經(jīng)工程改造以產(chǎn)生本發(fā)明的核酸或多肽和抗體的任何類型的細(xì)胞系統(tǒng)。這樣的宿主表達(dá)系統(tǒng)系統(tǒng)包括但不限于用重組噬菌體DNA或質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的微生物(例如，大腸桿菌或枯草芽孢桿菌)；用重組酵母表達(dá)載體轉(zhuǎn)染的酵母(例如，酵母(Saccharomyces))；或含有重組表達(dá)構(gòu)建體的哺乳動物細(xì)胞(例如，COS、CHO-S、HEK293T、3T3細(xì)胞)，所述構(gòu)建體包含源自哺乳動物細(xì)胞或病毒的基因組的啟動子(例如，腺病毒晚期啟動子)。宿主細(xì)胞可用兩種表達(dá)載體共轉(zhuǎn)染，例如，編碼重鏈衍生的多肽的第一載體和編碼輕鏈衍生的多肽的第二載體。轉(zhuǎn)化哺乳動物細(xì)胞的方法是本領(lǐng)域眾所周知的。參見例如U.S.P.N.4,399,216、4,912,040、4,740,461和4,959,455。宿主細(xì)胞還可經(jīng)工程改造以允許產(chǎn)生具有各種特征(例如修飾的糖形或具有GnTIII活性的蛋白)的抗原結(jié)合分子。對于長期高收率產(chǎn)生重組蛋白，穩(wěn)定的表達(dá)是優(yōu)選的。因此，穩(wěn)定表達(dá)選擇的抗體的細(xì)胞系可使用本領(lǐng)域公認(rèn)的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)經(jīng)工程改造和形成本發(fā)明的一部分。并非使用包含病毒復(fù)制起點的表達(dá)載體，宿主細(xì)胞可用受合適的表達(dá)控制元件(例如，啟動子或增強(qiáng)子序列、轉(zhuǎn)錄終止子、多腺苷酸化位點等)控制的DNA和可選擇標(biāo)記轉(zhuǎn)化。可使用本領(lǐng)域眾所周知的任何選擇系統(tǒng)，包括谷氨酰胺合成酶基因表達(dá)系統(tǒng)(GS系統(tǒng))，其提供一種用于在某些條件下增強(qiáng)表達(dá)的有效方法。GS系統(tǒng)整體或部分地結(jié)合EP0216846、EP0256055、EP0323997和EP0338841和U.S.P.N.5,591,639和5,879,936論述。用于開發(fā)穩(wěn)定的細(xì)胞系的另一種優(yōu)選的表達(dá)系統(tǒng)是Freedom?CHO-SKit(LifeTechnologies)。一旦本發(fā)明的抗體通過重組表達(dá)或任何其它公開的技術(shù)產(chǎn)生，其可通過本領(lǐng)域已知的方法純化或分離，這意味著其自其天然環(huán)境鑒定和分離和/或回收，和自會干擾抗體的診斷或治療用途的污染物分離。分離的抗體包括重組細(xì)胞內(nèi)的原位抗體。這些分離的制備物可使用本領(lǐng)域公知的各種技術(shù)純化，例如離子交換和大小排阻色譜、透析、滲濾和親和色譜，特別是蛋白A或蛋白G親和色譜。K.生產(chǎn)后選擇無論如何獲得，產(chǎn)生抗體的細(xì)胞(例如，雜交瘤、酵母菌落等)可經(jīng)選擇、克隆和進(jìn)一步篩選需要的特征，包括例如穩(wěn)健生長、高抗體產(chǎn)量和需要的抗體特征，例如對于目的抗原的高親和力。雜交瘤可在細(xì)胞培養(yǎng)物中體外擴(kuò)增或在同基因免疫妥協(xié)動物中體內(nèi)擴(kuò)增。選擇、克隆和擴(kuò)增雜交瘤和/或菌落的方法是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員眾所周知的。一旦鑒定了需要的抗體，相關(guān)的遺傳物質(zhì)可使用常用的、本領(lǐng)域公知的分子生物學(xué)和生物化學(xué)技術(shù)分離、操作和表達(dá)。通過幼稚文庫(天然或合成的)產(chǎn)生的抗體可具有適度的親和力(約106-107M-1的Ka)。為了增強(qiáng)親和力，親和力成熟可通過構(gòu)建抗體文庫(例如，通過使用易錯聚合酶體外引入隨機(jī)突變)和自這些第二文庫(例如通過使用噬菌體或酵母展示)再選擇具有對抗原的高親和力的抗體，進(jìn)行體外模擬。WO9607754描述了用于在免疫球蛋白輕鏈的CDR中誘導(dǎo)誘變以創(chuàng)建輕鏈基因文庫的方法。各種技術(shù)可用于選擇抗體，包括但不限于噬菌體或酵母展示，其中人組合抗體或scFv片段的文庫在噬菌體或酵母上合成，所述文庫用目的抗原或其抗體結(jié)合部分篩選，和結(jié)合抗原的噬菌體或酵母被分離，從中可獲得抗體或免疫反應(yīng)性片段(Vaughan等，1996，PMID:9630891;Sheets等，1998，PMID:9600934;Boder等，1997，PMID:9181578;Pepper等，2008，PMID:18336206)。用于產(chǎn)生噬菌體或酵母展示文庫的試劑盒是市售可得的。也存在可用于產(chǎn)生和篩選抗體展示文庫的其它方法和試劑(參見U.S.P.N.5,223,409;WO92/18619、WO91/17271、WO92/20791、WO92/15679、WO93/01288、WO92/01047、WO92/09690;和Barbas等，1991，PMID:1896445)。這樣的技術(shù)有利地允許篩選大量的候選抗體和提供相對容易的序列操作(例如，通過重組改組)。IV.抗體的特征在選擇的實施方案中，產(chǎn)生抗體的細(xì)胞(例如，雜交瘤或酵母菌落)可經(jīng)選擇、克隆和進(jìn)一步篩選有利的性質(zhì)，包括例如穩(wěn)健生長、高抗體產(chǎn)量和如下文更詳細(xì)論述的需要的位點特異性抗體特征。在其它情況下，抗體的特征可通過選擇特定的抗原(例如，特定的RNF43同種型)或靶抗原的免疫反應(yīng)性片段用于接種動物來產(chǎn)生。在還其它的實施方案中，選擇的抗體可按上所述經(jīng)工程改造以增強(qiáng)或精修免疫化學(xué)特征，例如親和力或藥代動力學(xué)。1.中和抗體在選擇的實施方案中，本發(fā)明的抗體可以是“拮抗劑”或“中和”抗體，這意味著抗體可締合決定子和直接或通過阻止決定子與結(jié)合配偶體例如配體或受體(例如，RSPO)的締合來阻斷或抑制所述決定子的活性，從而干擾否則將自所述分子的相互作用產(chǎn)生的生物學(xué)反應(yīng)。當(dāng)過量的抗體減少與決定子結(jié)合的結(jié)合配偶體的量達(dá)至少約20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、85%、90%、95%、97%、99%或更多時，中和或拮抗劑抗體將顯著抑制決定子與其配體或底物的結(jié)合，例如，通過靶分子活性或在體外競爭結(jié)合測定法中測量的。將理解，改變的活性可使用本領(lǐng)域公知的技術(shù)直接測量，或可通過改變的活性在下游具有的影響(例如，腫瘤生成或細(xì)胞存活)測量。2.內(nèi)化抗體有證據(jù)表明，大部分表達(dá)的RNF43蛋白保持與致瘤細(xì)胞表面締合，從而允許所公開的抗體或ADC的定位和內(nèi)化。在優(yōu)選的實施方案中，所述抗體與在內(nèi)化時殺死細(xì)胞的一種或多種藥物締合或綴合。在特別優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的ADC包含內(nèi)化位點特異性ADC。如本文所用的，“內(nèi)化”的抗體是在結(jié)合相關(guān)的抗原或受體時被細(xì)胞攝取(與任何細(xì)胞毒素一起)的抗體。對于治療應(yīng)用，內(nèi)化優(yōu)選地在有需要的受試者的體內(nèi)發(fā)生。內(nèi)化的ADC的數(shù)量可足以殺死表達(dá)抗原的細(xì)胞，特別是表達(dá)抗原的癌癥干細(xì)胞。根據(jù)細(xì)胞毒素或ADC作為整體的效力，在一些實例中，單個抗體分子攝入細(xì)胞中足以殺死抗體所結(jié)合的靶細(xì)胞。例如，某些藥物具有高的效力，以致于少量的與抗體綴合的毒素分子的內(nèi)化足以殺死腫瘤細(xì)胞。抗體在與哺乳動物細(xì)胞結(jié)合時是否內(nèi)化可通過本領(lǐng)域公知的各種測定法確定，包括下文實施例中描述的那些方法。檢測抗體是否內(nèi)化至細(xì)胞的方法還描述于U.S.P.N.7,619,068。3.耗竭抗體(depletingantibody)在其它實施方案中，本發(fā)明的抗體是耗竭抗體。術(shù)語“耗竭”抗體是指優(yōu)選地結(jié)合在細(xì)胞表面上或附近的抗原并誘導(dǎo)、促進(jìn)或?qū)е录?xì)胞死亡的抗體(例如，通過CDC、ADCC或引入細(xì)胞毒性劑)。在優(yōu)選的實施方案中，選擇的耗竭抗體與細(xì)胞毒素綴合。優(yōu)選地，耗竭抗體能夠在確定的細(xì)胞群中殺死至少20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、85%、90%、95%、97%或99%的表達(dá)RNF43的細(xì)胞。在一些實施方案中，細(xì)胞群可包含富集的、分開的、純化的或分離的致瘤細(xì)胞，包括癌癥干細(xì)胞。在其它實施方案中，細(xì)胞群可包含整個腫瘤樣品或包含癌癥干細(xì)胞的異質(zhì)腫瘤提取物。根據(jù)本文的教導(dǎo)，標(biāo)準(zhǔn)生物化學(xué)技術(shù)可用于監(jiān)測和定量致瘤細(xì)胞的耗竭。4.結(jié)合親和力本文公開了對特定的決定子例如RNF43具有高結(jié)合親和力的抗體。術(shù)語“KD”是指特定抗體-抗原相互作用的解離常數(shù)或表觀親和力。當(dāng)解離常數(shù)KD(koff/kon)≤10-7M時，本發(fā)明的抗體可免疫特異性結(jié)合其靶抗原。當(dāng)KD≤5x10-9M時，抗體以高親和力特異性結(jié)合抗原，和當(dāng)KD≤5x10-10M時以極高親和力特異性結(jié)合抗原。在本發(fā)明的一個實施方案中，抗體具有≤10-9M的KD和約1x10-4/秒的解離速率。在本發(fā)明的一個實施方案中，解離速率<1x10-5/秒。在本發(fā)明的其它實施方案中，抗體以約10-7M和10-10M之間的KD結(jié)合決定子，和在又一個實施方案中，其以KD≤2x10-10M結(jié)合。本發(fā)明的仍其它選擇的實施方案包含具有小于10-6M、小于5x10-6M、小于10-7M、小于5x10-7M、小于10-8M、小于5x10-8M、小于10-9M、小于5x10-9M、小于10-10M、小于5x10-10M、小于10-11M、小于5x10-11M、小于10-12M、小于5x10-12M、小于10-13M、小于5x10-13M、小于10-14M、小于5x10-14M、小于10-15M或小于5x10-15M的KD(koff/kon)的抗體。在某些實施方案中，免疫特異性結(jié)合決定子例如RNF43的本發(fā)明的抗體可具有至少105M-ls-l、至少2x105M-ls-l、至少5x105M-ls-l、至少106M-ls-l、至少5x106M-ls-l、至少107M-ls-l、至少5x107M-ls-l或至少108M-ls-l的締合速率常數(shù)或kon(或ka)速率(抗體+抗原(Ag)kon←抗體-Ag)。在另一個實施方案中，免疫特異性結(jié)合決定子例如RNF43的本發(fā)明的抗體可具有小于l0-ls-l、小于5xl0-ls-l、小于l0-2s-l、小于5xl0-2s-l、小于l0-3s-l、小于5xl0-3s-l、小于l0-4s-l、小于5xl04s-l、小于l0-5s-l、小于5xl0-5s-l、小于l0-6s-l、小于5xl0-6s-l小于l0-7s-l、小于5xl0-7s-l、小于l0-8s-l、小于5xl0-8s-l、小于l0-9s-l、小于5xl0-9s-l或小于l0-10s-l的解離速率常數(shù)或koff(或kd)速率(抗體+抗原(Ag)koff←抗體-Ag)。結(jié)合親和力可使用本領(lǐng)域已知的各種技術(shù)測定，例如表面等離子體共振、生物層干涉測定、雙重極化干涉測定、靜態(tài)光散射、動態(tài)光散射、等溫滴定量熱法、ELISA、分析型超速離心和流式細(xì)胞術(shù)。5.框并(binning)和表位作圖如本文所用的，術(shù)語“框并”是指用于根據(jù)抗體的抗原結(jié)合特征和它們是否彼此競爭而將抗體分組成“箱(bin)”的方法。箱的初始確定可通過表位作圖和本文公開的其它技術(shù)進(jìn)一步精修和證實。然而，應(yīng)理解，根據(jù)經(jīng)驗將抗體指定至單個箱，提供了可指示所公開的抗體的治療潛力的信息。如圖5A所示的，公開的RNF43抗體位于標(biāo)記為A、B、C、D、E和F的至少6個箱中。更具體地，通過使用本領(lǐng)域已知和本文實施例中提供的方法，可確定選擇的參比抗體(或其片段)與第二種試驗抗體是否競爭結(jié)合(即，在相同的箱中)。在一個實施方案中，參比抗體與RNF43抗原在飽和條件下締合，然后使用標(biāo)準(zhǔn)免疫化學(xué)技術(shù)測定第二種或試驗抗體結(jié)合RNF43的能力。如果試驗抗體能夠與參比抗-RNF43抗體同時顯著結(jié)合RNF43，則所述第二種或試驗抗體結(jié)合與第一種或參比抗體不同的表位。然而，如果試驗抗體不能夠同時顯著結(jié)合RNF43，則試驗抗體結(jié)合相同的表位、重疊表位或靠近(至少在空間上)第一種抗體結(jié)合的表位的表位。即是說，試驗抗體競爭抗原結(jié)合，并在與參比抗體相同的箱中。術(shù)語“競爭”或“競爭性抗體”當(dāng)在所公開的抗體的情況下使用時意指在抗體之間的競爭，如通過其中所測試的試驗抗體或免疫學(xué)功能片段抑制參比抗體與共同抗原的特異性結(jié)合的測定法所測定的。通常，所述測定法包括使用結(jié)合至固體表面或細(xì)胞的純化抗原(例如，RNF43或其結(jié)構(gòu)域或片段)、未標(biāo)記的試驗抗體和標(biāo)記的參比抗體。競爭性抑制通過在試驗抗體的存在下測定結(jié)合至固體表面或細(xì)胞的標(biāo)記的量來測量。通常，試驗抗體過量存在，和/或允許首先結(jié)合。關(guān)于用于測定競爭結(jié)合的方法的其它細(xì)節(jié)在本文的實施例中提供。通常，當(dāng)競爭性抗體過量存在時，其將抑制參比抗體與共同抗原的特異性結(jié)合達(dá)至少30%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%或75%。在一些實例中，結(jié)合被抑制達(dá)至少80%、85%、90%、95%或97%或更多。相反地，當(dāng)參比抗體結(jié)合時，其優(yōu)選地抑制隨后加入的試驗抗體(即，抗-RNF43抗體)的結(jié)合達(dá)至少30%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%或75%。在一些實例中，試驗抗體的結(jié)合被抑制達(dá)至少80%、85%、90%、95%或97%或更多。通常，框并或競爭性結(jié)合可使用本領(lǐng)域公知的各種技術(shù)測定，例如免疫測定法，例如蛋白質(zhì)印跡、放射免疫測定法、酶聯(lián)免疫吸附測定法(ELISA)、“夾心”免疫測定法、免疫沉淀測定法、沉淀素反應(yīng)、凝膠擴(kuò)散沉淀素反應(yīng)、免疫擴(kuò)散測定法、凝集測定法、補(bǔ)體結(jié)合測定法、免疫放射測定法、熒光免疫測定法和蛋白A免疫測定法。這樣的免疫測定法是常規(guī)的和本領(lǐng)域眾所周知的(參見，Ausubel等編輯(1994)CurrentProtocolsinMolecularBiology，Vol.1，JohnWiley&Sons，Inc.，NewYork)。另外，可使用交叉封閉測定法(參見例如，WO2003/48731;和Harlow等(1988)Antibodies，ALaboratoryManual，ColdSpringHarborLaboratory，EdHarlow和DavidLane)。用于測定競爭性抑制(因此，“箱”)的其它技術(shù)包括：表面等離子體共振，使用例如BIAcore?2000系統(tǒng)(GEHealthcare)；生物層干涉測定，使用例如ForteBio?OctetRED(ForteBio)；或流式細(xì)胞術(shù)珠陣列，使用例如FACSCantoII(BDBiosciences)或多路LUMINEX?檢測測定法(Luminex)。Luminex是一種基于珠的免疫測定平臺，其能夠大規(guī)模多路抗體配對。該測定法比較抗體對與靶抗原的同時結(jié)合模式。所述對的一個抗體(捕獲mAb)與Luminex珠結(jié)合，其中各捕獲mAb與不同顏色的珠結(jié)合。另一抗體(檢測mAb)與熒光信號(例如藻紅蛋白(PE))結(jié)合。該測定法分析了抗體與抗原的同時結(jié)合(配對)，和將具有類似配對特征的抗體分組在一起。檢測mAb和捕獲mAb的類似特征表明兩種抗體結(jié)合相同或緊密相關(guān)的表位。在一個實施方案中，配對特征可使用Pearson相關(guān)系數(shù)測定，以鑒定在測試的抗體組中與任何特定抗體最緊密相關(guān)的抗體。在優(yōu)選的實施方案中，如果抗體對的Pearson相關(guān)系數(shù)是至少0.9，則測試/檢測mAb確定為處于與參比/捕獲mAb相同的箱中。在其它實施方案中，Pearson相關(guān)系數(shù)是至少0.8、0.85、0.87或0.89。在進(jìn)一步的實施方案中，Pearson相關(guān)系數(shù)是至少0.91、0.92、0.93、0.94、0.95、0.96、0.97、0.98、0.99或1。分析獲自Luminex測定法的數(shù)據(jù)的其它方法描述于U.S.P.N.8,568,992。Luminex同時分析100個不同類型的珠(或更多)的能力提供了幾乎無限的抗原和/或抗體表面，導(dǎo)致經(jīng)生物傳感器測定法的抗體表位特征分析的改進(jìn)通量和解析(Miller等，2011，PMID:21223970)?！氨砻娴入x子體共振”是指通過檢測在生物傳感器基質(zhì)內(nèi)的蛋白濃度的變化，允許分析實時特異性相互作用的光學(xué)現(xiàn)象。在其它實施方案中，可用于測定試驗抗體是否與參比抗體“競爭”結(jié)合的技術(shù)是“生物層干涉測定”，一種分析自兩個表面反射的白光的干涉模式的光學(xué)分析技術(shù)：生物傳感器觸點上的固定蛋白層和內(nèi)部參比層。與生物傳感器觸點結(jié)合的分子數(shù)量的任何變化導(dǎo)致可實時測量的干涉模式的變化。這樣的生物層干涉測定法可使用ForteBio?OctetRED機(jī)器如下進(jìn)行。參比抗體(Ab1)被捕獲到抗小鼠捕獲芯片上，然后高濃度的非結(jié)合抗體用于封閉芯片，并采集基線。單體的重組靶蛋白然后被特異性抗體(Ab1)捕獲，觸點浸入具有相同抗體(Ab1)的孔中作為對照或浸入具有不同的試驗抗體(Ab2)的孔中。如果未發(fā)生進(jìn)一步的結(jié)合，如通過比較與對照Ab1的結(jié)合水平所測定的，則確定Ab1和Ab2為“競爭性”抗體。如果觀察到與Ab2的另外的結(jié)合，則確定Ab1和Ab2不彼此競爭。該方法可擴(kuò)展以在96-孔板中使用代表獨(dú)特的箱的一整排抗體篩選大的獨(dú)特抗體文庫。在優(yōu)選的實施方案中，如果參比抗體抑制試驗抗體與共同抗原的特異性結(jié)合達(dá)至少40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%或75%，則試驗抗體與參比抗體競爭。在其它實施方案中，結(jié)合被抑制達(dá)至少80%、85%、90%、95%或97%或更多。一旦已經(jīng)確定了包含一組競爭性抗體的箱，則可進(jìn)行進(jìn)一步的表征以確定箱中的抗體結(jié)合的抗原上的特定結(jié)構(gòu)域或表位。結(jié)構(gòu)域水平的表位作圖可使用Cochran等，2004，PMID:15099763描述的方案的改良版進(jìn)行。精細(xì)表位作圖是確定抗原上構(gòu)成抗體所結(jié)合的決定子的表位的特定氨基酸的方法。術(shù)語“表位”以其常用的生物化學(xué)含義使用，是指能夠被特定抗體識別和特異性結(jié)合的靶抗原的一部分。在某些實施方案中，表位或免疫原性決定子包括分子的化學(xué)活性表面簇，例如氨基酸、糖側(cè)鏈、磷酰基或磺?；?，和在某些實施方案中，可具有特定的三維結(jié)構(gòu)特征和/或特定的電荷特征。在某些實施方案中，當(dāng)抗體優(yōu)先識別在蛋白和/或大分子的復(fù)雜混合物中的其靶抗原時，抗體被認(rèn)為特異性結(jié)合抗原。當(dāng)抗原是多肽例如RNF43時，表位可一般自通過蛋白的三維折疊緊靠的連續(xù)氨基酸和非連續(xù)氨基酸形成(“構(gòu)象表位”)。在這樣的構(gòu)象表位中，相互作用點跨越蛋白的彼此線性分開的氨基酸殘基而存在。自連續(xù)氨基酸形成的表位(有時稱為“線性”或“連續(xù)”表位)通常在蛋白變性時得到保留，而通過三維折疊形成的表位通常在蛋白變性時丟失?？贵w表位通常以獨(dú)特的立體構(gòu)象包括至少3個和更通常至少5或8-10個氨基酸。表位確定或“表位作圖”的方法是本領(lǐng)域眾所周知的，可與本公開內(nèi)容結(jié)合使用以鑒定與所公開的抗體結(jié)合的RNF43的表位。合適的表位作圖技術(shù)包括丙氨酸掃描突變體、肽印跡(Reineke(2004)MethodsMolBiol248:443-63)或肽裂解分析。此外，可使用方法例如抗原的表位切除、表位提取和化學(xué)修飾(Tomer(2000)ProteinScience9:487-496)。其它合適的方法包括酵母展示方法。在其它實施方案中，修飾-輔助概況分析(Modification-AssistedProfiling，MAP)，亦稱為基于抗原結(jié)構(gòu)的抗體概況分析(ASAP)，提供了按照各抗體與化學(xué)或酶修飾的抗原表面的結(jié)合概況的相似性將針對相同抗原的大量的單克隆抗體分類的方法(U.S.P.N.2004/0101920)。該技術(shù)允許快速過濾遺傳上相同的抗體，使得表征可集中于遺傳上不同的抗體。將理解，MAP可用于分選本發(fā)明的抗-RNF43抗體至結(jié)合不同的表位的抗體組。一旦抗原上需要的表位被確定，可產(chǎn)生抗該表位的抗體，例如，使用本發(fā)明描述的技術(shù)，通過用包含該表位的肽進(jìn)行免疫?；蛘?，在發(fā)現(xiàn)過程期間，抗體的產(chǎn)生和表征可闡明關(guān)于位于特定結(jié)構(gòu)域或基序中的需要的表位的信息。根據(jù)該信息，則有可能競爭性篩選結(jié)合相同表位的抗體。實現(xiàn)方法是進(jìn)行競爭研究以發(fā)現(xiàn)競爭結(jié)合抗原的抗體。根據(jù)其交叉競爭的用于框并抗體的高通量方法描述于WO03/48731?？虿⒒蚪Y(jié)構(gòu)域水平或表位作圖的其它方法，包括抗體競爭或在酵母上抗原片段表達(dá)，是本領(lǐng)域眾所周知的。V.抗體綴合物在某些優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的抗體可與藥學(xué)活性部分或診斷部分綴合以形成“抗體藥物綴合物”(ADC)或“抗體綴合物”。術(shù)語“綴合物”廣義使用，和意指任何藥學(xué)活性部分或診斷部分與本發(fā)明的抗體的共價或非共價締合，而不管締合方法如何。在某些實施方案中，締合通過抗體的賴氨酸或半胱氨酸殘基實現(xiàn)。在特別優(yōu)選的實施方案中，藥學(xué)活性部分或診斷部分可通過一個或多個位點特異性游離半胱氨酸與抗體綴合。所公開的ADC可用于治療和診斷目的。本發(fā)明的ADC可用于遞送細(xì)胞毒素或其它有效負(fù)荷至靶位點(例如，致瘤細(xì)胞和/或表達(dá)RNF43的細(xì)胞)。如本文所用的術(shù)語“藥物”或“彈頭”可互換使用，和意指生物學(xué)活性或可檢測分子或化合物，包括下文所述的抗癌劑。“有效負(fù)荷”可包含藥物或彈頭以及任選的接頭化合物。綴合物上的彈頭可包含肽、蛋白或體內(nèi)代謝成活性劑的前藥，聚合物、核酸分子、小分子、結(jié)合劑、模擬劑、合成藥物、無機(jī)分子、有機(jī)分子和放射性同位素。在有利的實施方案中，公開的ADC將結(jié)合的有效負(fù)荷以相對無活性、無毒的狀態(tài)定位至靶位點，然后釋放和激活有效負(fù)荷。有效負(fù)荷的這種靶向釋放優(yōu)選地通過有效負(fù)荷的穩(wěn)定綴合(例如，通過抗體上的一個或多個半胱氨酸)和ADC制備物的相對均質(zhì)的組合物進(jìn)行，這使得過度綴合的毒性物質(zhì)最小化。與經(jīng)設(shè)計一旦被遞送至腫瘤位點則大量釋放有效負(fù)荷的藥物接頭偶聯(lián)，本發(fā)明的綴合物可顯著降低不需要的非特異性毒性。這有利地提供在腫瘤位點上相對高水平的活性細(xì)胞毒素，同時使非靶向的細(xì)胞和組織的暴露最小化，從而提供提高的治療指數(shù)。將理解，盡管本發(fā)明的優(yōu)選的實施方案包含治療部分的有效負(fù)荷(例如，細(xì)胞毒素)，其它有效負(fù)荷例如診斷劑和生物相容性調(diào)節(jié)劑可自所公開的綴合物提供的靶向釋放獲益。因此，涉及示例性的治療有效負(fù)荷的任何公開內(nèi)容也適用于包含本文所論述的診斷劑或生物相容性調(diào)節(jié)劑的有效負(fù)荷，除非上下文另外指明。選擇的有效負(fù)荷可與抗體共價或非共價地連接，和顯示各種化學(xué)計量的摩爾比，至少部分地取決于用于實現(xiàn)綴合的方法。本發(fā)明的綴合物可由下式表示：Ab-[L-D]n或藥學(xué)上可接受的鹽，其中a)Ab包含抗-RNF43抗體；b)L包含任選的接頭；c)D包含藥物；和d)n是1-20的整數(shù)。本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，按照上式的綴合物可使用多種不同的接頭和藥物制造，和綴合方法根據(jù)組分的選擇而不同。因此，與所公開的抗體的反應(yīng)性殘基(例如，半胱氨酸或賴氨酸)締合的任何藥物或藥物接頭化合物適合于本文的教導(dǎo)。同樣地，允許選擇的藥物與抗體的位點特異性綴合的任何反應(yīng)條件在本發(fā)明的范圍內(nèi)。雖然前述內(nèi)容，但本發(fā)明的特別優(yōu)選的實施方案包括使用穩(wěn)定劑與本文所述的溫和還原劑組合的藥物或藥物接頭與游離半胱氨酸的選擇性綴合。這樣的反應(yīng)條件趨于提供更均質(zhì)的制備物，具有較少的非特異性綴合物和污染物，和相應(yīng)較少的毒性。適合于本文的教導(dǎo)的示例性的有效負(fù)荷在下文提供。1.治療劑本發(fā)明的抗體可與藥物活性部分綴合、連接或融合或以其它方式締合，所述藥物活性部分是治療部分或藥物，例如抗癌劑，包括但不限于細(xì)胞毒性劑、細(xì)胞生長抑制劑、抗血管生成劑、減滅劑(debulkingagent)、化學(xué)治療劑、放射治療劑、靶向抗癌劑、生物反應(yīng)調(diào)節(jié)劑、癌癥疫苗、細(xì)胞因子、激素療法、抗轉(zhuǎn)移劑和免疫治療劑。優(yōu)選的示例性的抗癌劑(包括其同系物和衍生物)包括1-去氫睪甾酮、氨茴霉素、放線菌素D、博來霉素、刺孢霉素、秋水仙堿、環(huán)磷酰胺、細(xì)胞松弛素B、更生霉素(以前稱為放線菌素)、二羥基炭疽菌素、二酮、依米丁、表柔比星、溴化乙錠、依托泊苷、糖皮質(zhì)激素、短桿菌肽D、利多卡因、美登木素例如DM-1和DM-4(Immunogen)、光輝霉素、絲裂霉素、米托蒽醌、紫杉醇、普魯卡因、普萘洛爾、嘌呤霉素、替尼泊苷、丁卡因及任何上述藥劑的藥學(xué)上可接受的鹽或溶劑合物、酸或衍生物。另外，合適的細(xì)胞毒素包括多拉司他汀和阿里他汀(auristatin)，包括單甲基阿里他汀E(MMAE)和單甲基阿里他汀F(MMAF)(SeattleGenetics)、鵝膏菌素例如α-鵝膏菌素、β-鵝膏菌素、γ-鵝膏菌素或ε-鵝膏菌素(HeidelbergPharma)、DNA小溝結(jié)合劑如多卡霉素衍生物(Syntarga)、烷化劑如修飾或二聚吡咯并苯并二氮雜?類(PBD)、氮芥，塞替派，苯丁酸氮芥，美法侖，卡莫司汀(BCNU)，洛莫司汀(CCNU)，環(huán)磷酰胺，白消安，二溴甘露醇，鏈脲霉素，絲裂霉素C和順二氯二胺鉑(II)(DDP)順鉑，剪接抑制劑例如meayamycin類似物或衍生物(例如，如U.S.P.N.7,825,267中所述的FR901464)，微管結(jié)合劑例如埃坡霉素類似物和紫杉醇和DNA損傷劑例如刺孢霉素和艾司帕霉素，抗代謝物如甲氨蝶呤，6-巰基嘌呤，6-硫鳥嘌呤，阿糖胞苷和5-氟尿嘧啶氨烯咪胺，抗有絲分裂劑如長春花堿和長春新堿和蒽環(huán)類如柔紅霉素(以前稱道諾霉素)和多柔比星及任何上述藥劑的藥學(xué)上可接受的鹽或溶劑合物、酸或衍生物。在某些選擇的實施方案中，所公開的抗體與一種或多種刺孢霉素綴合。如本文所用的術(shù)語“刺孢霉素”是指刺孢霉素γ1I、刺孢霉素β1Br、刺孢霉素γ1Br、刺孢霉素α2I、刺孢霉素α3I、刺孢霉素β1i和刺孢霉素δ1的任一種以及其n-乙?；苌锖土蚧镱愃莆铩Ｔ谀承嵤┓桨钢?，所公開的抗體藥物綴合物的刺孢霉素組分包含N-乙酰基刺孢霉素γ1I。在一個實施方案中，本發(fā)明的抗體可與抗-CD3結(jié)合分子締合，以募集細(xì)胞毒性T細(xì)胞并使它們靶向致瘤細(xì)胞(BiTEtechnology;參見例如，F(xiàn)uhrmann等(2010)AnnualMeetingofAACRAbstractNo.5625)。在進(jìn)一步的實施方案中，本發(fā)明的ADC可包含使用合適的接頭綴合的治療性放射性同位素?？蛇m合于所述實施方案的示例性的放射性同位素包括但不限于碘(131I，125I，123I，121I)、碳(14C)、銅(62Cu，64Cu，67Cu)、硫(35S)、氚(3H)、銦(115In，113In，112In，111In)、鉍(212Bi，213Bi)、锝(99Tc)、鉈(201Ti)、鎵(68Ga，67Ga)、鈀(103Pd)、鉬(99Mo)、氙(133Xe)、氟(18F)、153Sm、177Lu、159Gd、149Pm、140La、175Yb、166Ho、90Y、47Sc、186Re、188Re、142Pr、105Rh、97Ru、68Ge、57Co、65Zn、85Sr、32P、153Gd、169Yb、51Cr、54Mn、75Se、113Sn、117Sn、225Ac、76Br和211At。其它放射性核素也可用作診斷和治療劑，特別是能量范圍為60-4,000keV的那些。在某些優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明的ADC可以包含PBD和其藥學(xué)上可接受的鹽或溶劑合物、酸或衍生物作為彈頭。PBD是通過與小溝中的DNA共價結(jié)合并抑制核酸合成而發(fā)揮抗腫瘤活性的烷化劑。已經(jīng)顯示PBD具有有效的抗腫瘤性質(zhì)，同時表現(xiàn)出最小的骨髓抑制。適合于本發(fā)明的PBD可以使用幾種類型的接頭(例如，包含具有游離巰基的馬來酰亞胺部分的肽基接頭)連接到抗體，并且在某些實施方案中是二聚體形式(即PBD二聚體)?？梢耘c所公開的抗體綴合的合適的PBD(和任選的接頭)描述于例如U.S.P.N.6,362,331、7,049,311、7,189,710、7,429,658、7,407,951、7,741,319、7,557,099、8,034,808、8,163,736、2011/0256157和PCT申請WO2011/130613、WO2011/128650、WO2011/130616和WO2014/057074。本發(fā)明的抗體還可以與生物反應(yīng)修飾劑綴合。例如，在特別優(yōu)選的實施方案中，藥物部分可以是具有所需生物活性的多肽。這樣的蛋白質(zhì)可以包括例如毒素，例如相思豆毒素、蓖麻毒素A、Onconase(或另一種細(xì)胞毒性核糖核酸酶)、假單胞菌外毒素、霍亂毒素、白喉毒素；細(xì)胞凋亡劑例如腫瘤壞死因子TNF-α或TNF-β、α-干擾素、β-干擾素、神經(jīng)生長因子、血小板衍生生長因子、組織纖溶酶原激活物、AIMI(WO97/33899)、AIMII(WO97/34911)、Fas配體(Takahashi等人，1994，PMID：7826947)和VEGI(WO99/23105)、血栓形成劑、抗血管生成劑例如血管抑素或內(nèi)皮抑素；淋巴因子例如白介素-1(IL-1)、白介素-2(IL-2)、白介素-6(IL-6)、粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)和粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)，或生長因子例如生長激素(GH)。2.診斷或檢測劑在其它優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的抗體或其片段或衍生物與診斷或可檢測試劑、標(biāo)記或報告物綴合，其可以是例如生物分子(例如肽或核苷酸)、小分子、熒光團(tuán)或放射性同位素。標(biāo)記的抗體可用于監(jiān)測過度增殖性疾病的發(fā)生或進(jìn)展或作為臨床測試程序的一部分，以確定包括所公開的抗體(即，治療診斷劑)的特定治療的功效或確定未來的治療過程。此類標(biāo)記或報告物也可用于純化選擇的抗體，用于抗體分析(例如表位結(jié)合或抗體框并)，分開或分離致瘤細(xì)胞或在臨床前程序或毒理學(xué)研究中。這種診斷、分析和/或檢測可以通過將抗體偶聯(lián)到可檢測物質(zhì)來實現(xiàn)，所述可檢測物質(zhì)包括但不限于各種酶，包括例如辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或乙酰膽堿酯酶；輔基，例如但不限于鏈霉親和素生物素和抗生物素蛋白/生物素；熒光材料，例如但不限于傘形酮、熒光素、異硫氰酸熒光素、羅丹明、二氯三嗪基胺熒光素、丹磺酰氯或藻紅蛋白；發(fā)光材料，例如但不限于魯米諾；生物發(fā)光材料，例如但不限于螢光素酶、螢光素和水母發(fā)光蛋白；放射性材料，例如但不限于碘(131I，125I，123I，121I)、碳(14C)、硫(35S)、氚(3H)、銦(115In，113In，112In，111In)和锝(99Tc)、鉈(201Ti)、鎵(68Ga，67Ga)、鈀(103Pd)、鉬(99Mo)、氙(133Xe)、氟(18F)、153Sm、177Lu、159Gd、149Pm、140La、175Yb、166Ho、90Y、47Sc、186Re、188Re、142Pr、105Rh、97Ru、68Ge、57Co、65Zn、85Sr、32P、153Gd、169Yb、51Cr、54Mn、75Se、113Sn和117Tin；使用各種正電子發(fā)射斷層攝影術(shù)的正電子發(fā)射金屬，非放射性順磁金屬離子和放射性標(biāo)記或綴合至特定放射性同位素的分子。在這樣的實施方案中，適當(dāng)?shù)臋z測方法是本領(lǐng)域公知的，并且可以從許多商業(yè)來源容易地獲得。在其它實施方案中，抗體或其片段可以融合或綴合到標(biāo)記序列或化合物，例如肽或熒光團(tuán)，以促進(jìn)純化或診斷或分析程序，例如免疫組織化學(xué)，生物層干涉測量，表面等離子體共振，流式細(xì)胞術(shù)，競爭性ELISA，F(xiàn)AC等。在優(yōu)選的實施方案中，標(biāo)記包括組氨酸標(biāo)簽，例如由pQE載體(Qiagen)提供的標(biāo)簽，其中許多是可商購的。可用于純化的其他肽標(biāo)簽包括但不限于：血凝素“HA”標(biāo)簽，其對應(yīng)于源自流感血凝素蛋白的表位(Wilson等，1984，Cell37：767)；和“flag”標(biāo)簽(USPN4,703,004)。3.生物相容性調(diào)節(jié)劑在選擇的實施方案中，本發(fā)明的抗體可以與生物相容性調(diào)節(jié)劑綴合，所述調(diào)節(jié)劑可用于根據(jù)需要調(diào)整、改變、改善或調(diào)節(jié)抗體特征。例如，具有增加的體內(nèi)半壽期的抗體或融合構(gòu)建體可以通過連接相對高分子量的聚合物分子例如市售的聚乙二醇(PEG)或類似的生物相容性聚合物產(chǎn)生。本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，PEG可以以許多不同的分子量和分子構(gòu)型獲得，其可以被選擇以賦予抗體特定的性質(zhì)(例如可以定制半壽期)。PEG可以通過PEG與抗體或抗體片段的N-或C-末端綴合或通過賴氨酸殘基上存在的ε-氨基與具有或不具有多功能接頭的所述抗體或抗體片段或衍生物連接?？梢允褂脤?dǎo)致生物活性損失最小的線性或分支聚合物衍生化。可以通過SDS-PAGE和質(zhì)譜法密切監(jiān)測綴合的程度，以確保PEG分子與抗體分子的最佳綴合。未反應(yīng)的PEG可以通過例如大小排阻或離子交換色譜從抗體-PEG綴合物中分離。以類似的方式，所公開的抗體可以與白蛋白綴合，以使抗體或抗體片段在體內(nèi)更穩(wěn)定或在體內(nèi)具有更長的半壽期。這些技術(shù)是本領(lǐng)域公知的，參見例如，WO93/15199、WO93/15200和WO01/77137;和EP0413,622。其它生物相容的綴合物對普通技術(shù)人員是顯而易見的，并且可以根據(jù)本文的教導(dǎo)容易地鑒定。4.接頭化合物許多接頭化合物可用于將本發(fā)明的抗體與相關(guān)彈頭綴合。接頭僅需要與抗體上的反應(yīng)性殘基(優(yōu)選半胱氨酸或賴氨酸)和所選藥物化合物共價結(jié)合。因此，與所選抗體殘基反應(yīng)并且可用于提供本發(fā)明的相對穩(wěn)定的綴合物(位點特異性或其它)的任何接頭與本文的教導(dǎo)相容。許多相容的接頭可以有利地結(jié)合親核的還原半胱氨酸和賴氨酸。涉及還原的半胱氨酸和賴氨酸的綴合反應(yīng)包括但不限于硫醇-馬來酰亞胺、硫醇-鹵代(酰鹵)、硫醇-烯、硫醇-炔、硫醇-乙烯砜、硫醇-雙砜、硫醇-硫代磺酸酯、硫醇–吡啶基二硫化物和硫醇-對氟反應(yīng)。如本文進(jìn)一步討論的，由于其快速的反應(yīng)速率和溫和的綴合條件，硫醇-馬來酰亞胺生物綴合是最廣泛使用的方法之一。該方法的一個問題是反向邁克爾反應(yīng)以及馬來酰亞胺基連接的有效負(fù)載從抗體到血漿中的其它蛋白質(zhì)(例如人血清白蛋白)的損失或轉(zhuǎn)移的可能性。然而，在優(yōu)選實施方案中，如本文實施例13中所述的選擇性還原和位點特異性抗體的使用可用于穩(wěn)定綴合物，并減少這種不期望的轉(zhuǎn)移。硫醇-酰鹵反應(yīng)提供不能經(jīng)歷反向邁克爾反應(yīng)并因此更穩(wěn)定的生物綴合物。然而，與基于馬來酰亞胺的綴合相比，硫醇-鹵化物反應(yīng)通常具有較慢的反應(yīng)速率，因此在提供不期望的藥物與抗體比率方面不那么有效。硫醇-吡啶基二硫化物反應(yīng)是另一種常用的生物綴合途徑。吡啶基二硫化物與游離硫醇進(jìn)行快速交換，導(dǎo)致混合二硫化物和吡啶-2-硫酮的釋放?；旌系亩蚧锟梢栽谶€原性細(xì)胞環(huán)境中裂解，釋放有效負(fù)載。在生物綴合中獲得更多關(guān)注的其他方法是硫醇-乙烯砜和硫醇-雙砜反應(yīng)，其每一個與本文的教導(dǎo)相容并且明確包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。在優(yōu)選的實施方案中，相容的接頭將賦予細(xì)胞外環(huán)境中的ADC穩(wěn)定性，防止ADC分子的聚集并保持ADC在水性介質(zhì)和單體狀態(tài)下易于溶解。在運(yùn)輸或遞送到細(xì)胞中之前，ADC優(yōu)選是穩(wěn)定的并保持完整，即抗體保持與藥物部分連接。雖然接頭在靶細(xì)胞外是穩(wěn)定的，但它們被設(shè)計成在細(xì)胞內(nèi)以某一有效速率裂解或降解。因此，有效的接頭將：(i)保持抗體的特異性結(jié)合特性;(ii)允許細(xì)胞內(nèi)遞送綴合物或藥物部分;(iii)保持穩(wěn)定和完整，即不裂解或降解，直到綴合物已經(jīng)被遞送或轉(zhuǎn)運(yùn)到其靶位點;和(iv)維持藥物部分的細(xì)胞毒性、細(xì)胞殺傷效應(yīng)或細(xì)胞抑制效應(yīng)(在一些情況下包括任何旁觀者效應(yīng))?？梢酝ㄟ^標(biāo)準(zhǔn)分析技術(shù)如HPLC/UPLC、質(zhì)譜、HPLC和分離/分析技術(shù)LC/MS和LC/MS/MS測量ADC的穩(wěn)定性。如上所述，抗體和藥物部分的共價連接需要接頭具有兩個反應(yīng)性官能團(tuán)，即反應(yīng)性意義上的二價。用于連接兩個或更多個功能或生物活性部分(例如MMAE和位點特異性抗體)的二價接頭試劑是已知的，并且已經(jīng)描述了提供其所得綴合物的方法。與本發(fā)明相容的接頭可以廣泛地分類為可裂解和不可裂解接頭?？砂ㄋ岵环€(wěn)定接頭、蛋白酶可裂解接頭和二硫化物接頭的可裂解接頭優(yōu)選內(nèi)化到靶細(xì)胞中，并在細(xì)胞內(nèi)的內(nèi)體-溶酶體途徑中裂解。細(xì)胞毒素的釋放和激活依賴于促進(jìn)酸不穩(wěn)定化學(xué)鍵如腙或肟的裂解的內(nèi)體/溶酶體酸性區(qū)室。如果溶酶體特異性蛋白酶裂解位點被工程化到接頭中，則細(xì)胞毒素將在其細(xì)胞內(nèi)靶附近被釋放。或者，含有混合二硫化物的接頭提供了細(xì)胞毒性有效負(fù)荷在細(xì)胞內(nèi)釋放的一種方法，因為它們在細(xì)胞的還原環(huán)境中選擇性裂解，而不是在血流中的富氧環(huán)境中裂解。相比之下，含有酰胺連接的聚乙二醇或烷基間隔物的相容的不可裂解接頭在靶細(xì)胞內(nèi)ADC的溶酶體降解過程中釋放毒性有效負(fù)荷。在一些方面，接頭的選擇將取決于綴合物中使用的具體藥物、特定適應(yīng)癥和抗體靶標(biāo)。因此，本發(fā)明的某些實施方案包含可通過存在于細(xì)胞內(nèi)環(huán)境(例如，在溶酶體或內(nèi)體或細(xì)胞膜穴樣內(nèi)陷中)中的裂解劑裂解的接頭。接頭可以是例如被細(xì)胞內(nèi)肽酶或蛋白酶(包括但不限于溶酶體或內(nèi)體蛋白酶)裂解的肽基接頭。在一些實施方案中，肽基接頭是至少兩個氨基酸長或至少三個氨基酸長。裂解劑可以包括組織蛋白酶B和D和纖溶酶，其中已知每一種水解二肽藥物衍生物，導(dǎo)致活性藥物在靶細(xì)胞內(nèi)的釋放?？捎闪虼家蕾囆缘鞍酌附M織蛋白酶-B裂解的示例性肽基接頭是包含Phe-Leu的肽，因為已發(fā)現(xiàn)組織蛋白酶-B在癌性組織中高度表達(dá)。這種接頭的其它實例描述于例如U.S.P.N.6,214,345。在一個具體的優(yōu)選實施方案中，可通過細(xì)胞內(nèi)蛋白酶裂解的肽基接頭是Val-Cit接頭、Val-Ala接頭或Phe-Lys接頭，例如在U.S.P.N.6,214,345中所述。使用治療劑的細(xì)胞內(nèi)蛋白水解釋放的一個優(yōu)點是，所述試劑當(dāng)綴合時通常被減弱，并且綴合物的血清穩(wěn)定性通常較高。在其他實施方案中，可裂解接頭是pH敏感的。通常，pH敏感性接頭在酸性條件下是可水解的。例如，可以使用在溶酶體中可水解的酸不穩(wěn)定接頭(例如腙、肟、縮氨基脲、縮氨基硫脲、順式烏頭酰胺、原酸酯、縮醛、縮酮等)(參見例如USPN5,122,368;5,824,805;5,622,929)。此類接頭在中性pH條件下(例如在血液中的)相對穩(wěn)定，但在低于pH5.5或5.0(溶酶體的近似pH)下是不穩(wěn)定的。在其它實施方案中，接頭在還原條件下是可裂解的(例如二硫化物接頭)。各種二硫化物接頭是本領(lǐng)域已知的，包括例如可以使用SATA(N-琥珀酰亞胺基-S-乙?；虼宜狨?、SPDP(N-琥珀酰亞胺基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯)、SPDB(N-琥珀酰亞胺基-3-(2-吡啶基二硫代)丁酸酯)和SMPT(N-琥珀酰亞胺基氧羰基-α-甲基-α-(2-吡啶基二硫代)甲苯)形成的那些。在其它具體實施方案中，接頭是丙二酸酯接頭(Johnson等人，1995，AnticancerRes.15：1387-93)、馬來酰亞胺苯甲?；宇^(Lau等人，1995，Bioorg-Med-Chem.3(10):1299-1304)或3'-N-酰胺類似物(Lau等人，1995，Bioorg-Med-Chem.3(10):1305-12)。在特別優(yōu)選的實施方案中(U.S.P.N.2011/0256157中所示)，相容的肽基接頭包含：其中星形表示藥物的連接點，CBA是抗-RNF43抗體，L1是接頭，A是連接L1與抗體上的反應(yīng)性殘基的連接基團(tuán)(任選包含間隔物)，L2是共價鍵或與-OC(=O)-一起形成自斷裂接頭，L1或L2是可裂解接頭。L1優(yōu)選地是可裂解接頭，和可稱為用于激活裂解接頭的觸發(fā)劑。若存在時，L1和L2的性質(zhì)可廣泛不同。這些基團(tuán)根據(jù)它們的裂解特征進(jìn)行選擇，所述特征可由將綴合物遞送至的部位的條件指示。通過酶的作用裂解的那些接頭是優(yōu)選的，但也可使用可通過pH(例如酸或堿不穩(wěn)定的)、溫度或在照射時(例如光不穩(wěn)定的)的變化裂解的接頭。本發(fā)明也可使用在還原或氧化條件下可裂解的接頭。L1可包含連續(xù)的氨基酸序列。氨基酸序列可以是酶裂解的靶標(biāo)底物，從而允許釋放藥物。在一個實施方案中，L1可通過酶的作用裂解。在一個實施方案中，酶是酯酶或肽酶。在一個實施方案中，L1包含二肽。二肽可由-NH-X1-X2-CO-表示，其中-NH-和-CO-分別代表氨基酸基團(tuán)X1和X2的N-和C-端。二肽中的氨基酸可以是天然氨基酸的任何組合。在接頭是組織蛋白酶不穩(wěn)定的接頭時，二肽可以是組織蛋白酶-介導(dǎo)的裂解的作用位點。另外，對于具有羧基或氨基側(cè)鏈官能性的那些氨基酸基團(tuán)，例如分別為Glu和Lys，CO和NH可表示側(cè)鏈官能性。在一個實施方案中，二肽-NH-X1-X2-CO-中的基團(tuán)-X1-X2-選自：-Phe-Lys-、-Val-Ala-、-Val-Lys-、-Ala-Lys-、-Val-Cit-、-Phe-Cit-、-Leu-Cit-、-Ile-Cit-、-Phe-Arg-和-Trp-Cit-，其中Cit是瓜氨酸。優(yōu)選地，二肽-NH-X1-X2-CO-中的基團(tuán)-X1-X2-選自：-Phe-Lys-、-Val-Ala-、-Val-Lys-、-Ala-Lys-和-Val-Cit-。最優(yōu)選地，二肽-NH-X1-X2-CO-中的基團(tuán)-X1-X2-是-Phe-Lys-或-Val-Ala-。在一個實施方案中，L2存在并與-C(=O)O-一起形成自斷裂接頭。在一個實施方案中，L2是酶活性的底物，從而允許釋放藥物。在L1可通過酶的作用裂解和L2存在的一個實施方案中，酶裂解L1和L2之間的鍵。若存在時，L1和L2可通過選自以下的鍵連接：-C(=O)NH-、-C(=O)O-、-NHC(=O)-、-OC(=O)-、-OC(=O)O-、-NHC(=O)O-、-OC(=O)NH-和-NHC(=O)NH-。與L2連接的L1的氨基可以是氨基酸的N-端，或可以源自氨基酸側(cè)鏈的氨基，例如賴氨酸氨基酸側(cè)鏈。與L2連接的L1的羧基可以是氨基酸的C-端，或可以源自氨基酸側(cè)鏈的羧基，例如谷氨酸氨基酸側(cè)鏈。與L2連接的L1的羥基可源自氨基酸側(cè)鏈的羥基，例如絲氨酸氨基酸側(cè)鏈。術(shù)語“氨基酸側(cè)鏈”包括以下氨基酸中存在的那些基團(tuán)：(i)天然存在的氨基酸，例如丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、組氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、賴氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、色氨酸、酪氨酸和纈氨酸；(ii)次要氨基酸，例如鳥氨酸和瓜氨酸；(iii)非天然氨基酸、β-氨基酸、天然存在的氨基酸的合成類似物和衍生物；和(iv)所有對映異構(gòu)體、非對映異構(gòu)體、異構(gòu)體富集的、同位素標(biāo)記的(例如2H、3H、14C、15N)、受保護(hù)的形式和其外消旋混合物。在一個實施方案中，-C(=O)O-和L2一起形成基團(tuán)：其中星形表示藥物或細(xì)胞毒性劑的連接點(任選通過間隔物)位置，波浪線表示與接頭L1的連接點，Y是-N(H)-、-O-、-C(=O)N(H)-或-C(=O)O-，和n是0-3。亞苯基環(huán)被本文所述的一個、兩個或三個取代基任選取代。在一個實施方案中，Y是NH。在一個實施方案中，n是0或1。優(yōu)選地，n是0。在Y是NH和n是0時，自斷裂接頭可稱為對氨基芐基羰基接頭(PABC)。在另一個特別優(yōu)選的實施方案中，接頭可包括自斷裂接頭，并和二肽一起形成基團(tuán)-NH-Val-Ala-CO-NH-PABC-，其由下式表示：其中星形表示選擇的細(xì)胞毒性部分的連接點，和波浪線表示與可與抗體綴合的接頭的剩余部分的連接點(例如，間隔物-抗體結(jié)合區(qū)段)。在酶裂解二肽時，當(dāng)遠(yuǎn)距離位點被激活時，自斷裂接頭允許完全釋放受保護(hù)的化合物(即細(xì)胞毒素)，沿下文所示的路線進(jìn)行：其中L*是接頭的剩余部分的活化形式，包含當(dāng)前裂解的肽基單元。藥物的完全釋放確保它們保持需要的毒性。在另一個優(yōu)選的實施方案中，接頭包含-NH-Val-Cit-CO-NH-PABC-。在一個實施方案中，A是共價鍵。因此，L1和抗體直接連接。例如，在L1包含連續(xù)的氨基酸序列時，序列的N-端可與抗體殘基直接連接。在另一個實施方案中，A是間隔物基團(tuán)。因此，L1和抗體間接連接。L1和A可通過選自以下的鍵連接：-C(=O)NH-、-C(=O)O-、-NHC(=O)-、-OC(=O)-、-OC(=O)O-、-NHC(=O)O-、-OC(=O)NH-和-NHC(=O)NH-。如下文更詳細(xì)論述的，本發(fā)明的藥物接頭優(yōu)選地與半胱氨酸(包括游離的半胱氨酸)上的反應(yīng)性硫醇親核基團(tuán)連接。為此，通過用各種還原劑例如DTT或TCEP或本文所示的溫和還原劑處理，可使抗體的半胱氨酸對與接頭試劑的綴合具有反應(yīng)性。在其它實施方案中，本發(fā)明的藥物接頭優(yōu)選地與賴氨酸連接。優(yōu)選地，接頭包含與抗體上的親核官能團(tuán)反應(yīng)的親電子官能團(tuán)?？贵w上的親核基團(tuán)包括但不限于：(i)N-端胺基團(tuán)，(ii)側(cè)鏈胺基團(tuán)，例如賴氨酸，(iii)側(cè)鏈硫醇基團(tuán)，例如半胱氨酸，和(iv)在抗體被糖基化時的糖羥基或氨基。胺、硫醇和羥基是親核的，并能夠與接頭部分上的親電子基團(tuán)反應(yīng)形成共價鍵，接頭試劑包括：(i)馬來酰亞胺基團(tuán)，(ii)活化的二硫化物，(iii)活性酯例如NHS(N-羥基琥珀酰亞胺)酯、HOBt(N-羥基苯并三唑)酯、鹵代甲酸酯和酸性鹵化物，(iv)烷基和芐基鹵化物，例如鹵代乙酰胺；和(v)醛、酮、羧基，和其中的一些舉例如下：在特別優(yōu)選的實施方案中，位點特異性抗體和藥物-接頭部分之間的連接是通過位點特異性抗體的游離半胱氨酸的硫醇?xì)埢徒宇^上存在的末端馬來酰亞胺基團(tuán)進(jìn)行的。在這樣的實施方案中，抗體和藥物-接頭之間的連接是：其中星形表示與藥物-接頭的剩余部分的連接點，和波浪線表示與抗體的剩余部分的連接點。在該實施方案中，S原子優(yōu)選地源自位點特異性游離半胱氨酸。關(guān)于其它相容的接頭，結(jié)合部分包含末端碘乙酰胺，其可與活化的殘基反應(yīng)以提供需要的綴合物。在任何事件中，根據(jù)本公開內(nèi)容，本領(lǐng)域技術(shù)人員可容易地將各個所公開的藥物-接頭化合物與合適的抗-RNF43抗體(例如，位點特異性抗體)綴合。5.綴合應(yīng)當(dāng)理解，可以使用許多本領(lǐng)域公知的不同反應(yīng)來將藥物部分和/或接頭連接到所選擇的抗體上。例如，利用半胱氨酸的巰基的各種反應(yīng)可以用于綴合所需部分。特別優(yōu)選的實施方案將包括如下詳細(xì)討論的包含一個或多個游離半胱氨酸的抗體的綴合。在其它實施方案中，本發(fā)明的ADC可以通過藥物與存在于所選抗體中的賴氨酸殘基的暴露于溶劑的氨基的綴合而產(chǎn)生。還有其它實施方案包括N-末端蘇氨酸和絲氨酸殘基的活化，然后可用于將所公開的有效負(fù)荷連接到抗體。所選擇的綴合方法將優(yōu)選被定制以優(yōu)化與抗體連接的藥物的數(shù)量并提供相對高的治療指數(shù)。用于將治療化合物與半胱氨酸殘基綴合的多種方法是本領(lǐng)域已知的，并且對于本領(lǐng)域技術(shù)人員是顯而易見的。在堿性條件下，半胱氨酸殘基將被去質(zhì)子化以產(chǎn)生硫醇酯親核體，其可以與軟的親電子試劑例如馬來酰亞胺和碘乙酰胺反應(yīng)。通常用于這種綴合的試劑可以與半胱氨酸的半胱氨酸硫醇直接反應(yīng)以形成綴合的蛋白質(zhì)或與接頭-藥物反應(yīng)以形成接頭-藥物中間體。在接頭的情況下，使用有機(jī)化學(xué)反應(yīng)、條件和試劑的幾種途徑是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，包括：(1)本發(fā)明的蛋白質(zhì)的半胱氨酸基團(tuán)與接頭試劑反應(yīng)，經(jīng)由共價鍵形成蛋白質(zhì)–接頭中間體，隨后與活化的化合物反應(yīng)；和(2)化合物的親核基團(tuán)與接頭試劑反應(yīng)，經(jīng)由共價鍵形成藥物-接頭中間體，然后與本發(fā)明的蛋白質(zhì)的半胱氨酸基團(tuán)反應(yīng)。根據(jù)前述，對于本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見的是，雙官能接頭可用于本發(fā)明。例如，雙官能接頭可以包含用于與半胱氨酸殘基共價連接的硫醇修飾基團(tuán)和用于與化合物共價或非共價連接的至少一個連接部分(例如第二硫醇修飾部分)。在綴合之前，可以通過用還原劑如二硫蘇糖醇(DTT)或(三(2-羧基乙基)膦(TCEP)處理使抗體活化，用于與接頭試劑綴合。在其它實施方案中，可以通過賴氨酸與試劑(包括但不限于2-亞氨基四氫噻吩(Traut試劑)、SATA、SATP或SAT(PEG)4)反應(yīng)，將另外的親核基團(tuán)引入抗體，導(dǎo)致胺轉(zhuǎn)化為硫醇。關(guān)于這樣的綴合，半胱氨酸硫醇或賴氨酸氨基是親核的，并且能夠反應(yīng)以與接頭試劑或化合物-接頭中間體或藥物上的親電子基團(tuán)形成共價鍵，包括：(i)活性酯，例如NHS酯、HOBt酯、鹵代甲酸酯和酰鹵;(ii)烷基和芐基鹵化物，如鹵代乙酰胺;(iii)醛、酮、羧基和馬來酰亞胺基團(tuán);和(iv)二硫化物，包括吡啶基二硫化物，通過硫化物交換。化合物或接頭上的親核基團(tuán)包括但不限于能夠與接頭部分和接頭試劑上的親電子基團(tuán)反應(yīng)以形成共價鍵的胺、硫醇、羥基、酰肼、肟、肼、硫代縮氨基脲、肼羧酸鹽和芳基酰肼基團(tuán)。優(yōu)選的綴合試劑包括馬來酰亞胺、鹵代乙?；⒌庖阴０风牾啺孵?、異硫氰酸酯、磺酰氯、2,6-二氯三嗪基、五氟苯基酯和亞磷酰胺，但也可以使用其它官能團(tuán)。在某些實施方案中，方法包括例如使用馬來酰亞胺、碘乙酰亞胺或鹵代乙酰基/烷基鹵化物、氮丙啶、丙烯?；苌锱c半胱氨酸的硫醇反應(yīng)以產(chǎn)生與化合物反應(yīng)的硫醚。游離硫醇與活化的吡啶基二硫化物的二硫化物交換也可用于產(chǎn)生綴合物(例如使用5-硫代-2-硝基苯甲酸(TNB))。優(yōu)選使用馬來酰亞胺。如上所述，賴氨酸也可以用作反應(yīng)性殘基以實現(xiàn)本文所述的綴合。親核賴氨酸殘基通常通過胺反應(yīng)性琥珀酰亞胺酯靶向。為了獲得最佳數(shù)量的去質(zhì)子化賴氨酸殘基，水溶液的pH必須低于賴氨酸銨基團(tuán)的pKa，其為約10.5，因此反應(yīng)的典型pH為約8和9。用于偶聯(lián)反應(yīng)的常用試劑是NHS-酯，其通過賴氨酸?；瘷C(jī)理與親核賴氨酸反應(yīng)。經(jīng)歷類似反應(yīng)的其它相容性試劑包括異氰酸酯和異硫氰酸酯，其也可以與本文的教導(dǎo)結(jié)合使用以提供ADC。一旦賴氨酸已經(jīng)被激活，許多上述連接基團(tuán)可以用于將彈頭共價結(jié)合到抗體。用于將化合物與蘇氨酸或絲氨酸殘基(優(yōu)選N-末端殘基)綴合的方法也是本領(lǐng)域已知的。例如已經(jīng)描述了羰基前體衍生自絲氨酸或蘇氨酸的1,2-氨基醇的方法，其可以通過高碘酸鹽氧化選擇性地和快速地轉(zhuǎn)化為醛形式。醛與連接本發(fā)明的蛋白質(zhì)的化合物的半胱氨酸的1,2-氨基硫醇的反應(yīng)形成穩(wěn)定的噻唑烷產(chǎn)物。該方法對于在N端絲氨酸或蘇氨酸殘基處標(biāo)記蛋白質(zhì)特別有用。在特別優(yōu)選的實施方案中，可以通過引入一個、兩個、三個、四個或更多個游離半胱氨酸殘基將反應(yīng)性硫醇基團(tuán)引入所選擇的抗體(或其片段)(例如，制備包含一個或多個游離非天然半胱氨酸氨基酸殘基的抗體)。這種位點特異性抗體或工程改造抗體允許顯示增強(qiáng)的穩(wěn)定性和基本上同質(zhì)性的綴合物制劑，至少部分歸因于提供本文所述的工程改造的游離半胱氨酸位點和/或新的綴合方法。與完全或部分地減少鏈內(nèi)或鏈間抗體二硫鍵中的每一個以提供綴合位點(并且與本發(fā)明完全相容)的常規(guī)綴合方法不同，本發(fā)明另外提供了選擇性還原某些制備的游離半胱氨酸位點和將藥物-接頭定位至所述游離半胱氨酸位點。由工程改造位點和選擇性還原促進(jìn)的綴合特異性允許在期望位置的高百分比的位點定向綴合。顯著地，這些綴合位點中的一些，例如存在于輕鏈恒定區(qū)末端區(qū)域的那些，通常難以有效地綴合，因為它們傾向于與其它游離半胱氨酸交叉反應(yīng)。然而，通過分子工程改造和所得到的游離半胱氨酸的選擇性還原，可以獲得有效的綴合速率，其顯著減少了不希望的高DAR污染物和非特異性毒性。更一般地，工程改造構(gòu)建體和公開的包括選擇性還原的新的綴合方法提供具有改善的藥代動力學(xué)和/或藥效學(xué)和可能的改善的治療指數(shù)的ADC制劑。位點特異性構(gòu)建體存在游離半胱氨酸，其在還原時包含親核的并能夠與接頭部分上的親電子基團(tuán)(例如上文所公開的那些)反應(yīng)形成共價鍵的硫醇基團(tuán)。本發(fā)明的優(yōu)選抗體將具有可還原的非配對鏈間或鏈內(nèi)半胱氨酸，即提供此類親核基團(tuán)的半胱氨酸。因此，在某些實施方案中，還原的未配對半胱氨酸的游離巰基與所公開的藥物-接頭的末端馬來酰亞胺基或鹵代乙酰胺基團(tuán)的反應(yīng)將提供所需的綴合。在這種情況下，抗體的游離半胱氨酸可以通過用還原劑如二硫蘇糖醇(DTT)或(三(2-羧乙基)膦(TCEP)處理而活化，用于與接頭試劑綴合。各游離半胱氨酸因此理論上存在反應(yīng)性硫醇親核基團(tuán)。盡管這些試劑是相容的，但應(yīng)當(dāng)理解，可以使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的各種反應(yīng)、條件和試劑來實現(xiàn)位點特異性抗體的綴合。此外，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，工程改造抗體的游離半胱氨酸(無論是引入的還是源自天然鏈間或鏈內(nèi)二硫鍵)可以被選擇性地還原以提供增強(qiáng)的定點綴合和減少不需要的潛在毒性污染物。更具體地，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)“穩(wěn)定劑”例如精氨酸調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)中的分子內(nèi)和分子間相互作用，并且可以與所選擇的還原劑(優(yōu)選相對溫和的)一起用于選擇性地還原游離半胱氨酸和促進(jìn)本文所述的位點特異性綴合。如本文所用，術(shù)語“選擇性還原”或“選擇性地還原”可以互換使用，并且應(yīng)意指減少游離半胱氨酸而基本上不破壞工程改造抗體中存在的天然二硫鍵。在選擇的實施方案中，這可能受某些還原劑的影響。在其它優(yōu)選的實施方案中，工程改造構(gòu)建體的選擇性還原將包括使用穩(wěn)定劑與還原劑(包括溫和還原劑)的組合。應(yīng)當(dāng)理解，術(shù)語“選擇性綴合”是指已經(jīng)選擇性還原的工程改造抗體與本文所述的細(xì)胞毒素的綴合。在這方面，使用這種穩(wěn)定劑與選擇的還原劑組合可以顯著地提高位點特異性綴合的效率，如通過重鏈和輕鏈抗體鏈上的綴合程度和制劑的DAR分布所確定的。盡管不希望受任何特定理論的束縛，但是這種穩(wěn)定劑可以起作用以調(diào)節(jié)靜電微環(huán)境和/或調(diào)節(jié)所需綴合位點處的構(gòu)象變化，從而允許相對溫和的還原劑(其不實質(zhì)上減少完整的天然二硫鍵)以促進(jìn)在所需的游離半胱氨酸位點的綴合。已知這些試劑(例如，某些氨基酸)形成鹽橋(通過氫鍵和靜電相互作用)，并且可以調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用以賦予可引起有利的構(gòu)象變化的穩(wěn)定作用，和/或可減少不利的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用。此外，這樣的試劑可以在還原后起作用以抑制不期望的分子內(nèi)(和分子間)半胱氨酸-半胱氨酸鍵的形成，從而促進(jìn)期望的綴合反應(yīng)，其中工程改造的位點特異性半胱氨酸與藥物(優(yōu)選通過接頭)結(jié)合。由于選擇性還原條件不提供完整的天然二硫鍵的顯著還原，因此隨后的綴合反應(yīng)自然地被驅(qū)動至游離半胱氨酸上相對少的反應(yīng)性硫醇(例如，優(yōu)選每個抗體2個游離硫醇)。如前所述，這顯著降低了如本文所述制備的綴合物制劑中非特異性綴合和相應(yīng)雜質(zhì)的水平。在選擇的實施方案中，與本發(fā)明相容的穩(wěn)定劑通常包括具有至少一個具有堿性pKa的部分的化合物。在某些實施方案中，所述部分將包含伯胺，而在其它優(yōu)選的實施方案中，所述胺部分將包含仲胺。在其它優(yōu)選實施方案中，胺部分將包含叔胺或胍鎓基。在其它選擇的實施方案中，胺部分將包含氨基酸，而在其它相容的實施方案中，胺部分將包含氨基酸側(cè)鏈。在其它實施方案中，胺部分將包含蛋白原性氨基酸。在其它實施方案中，胺部分包含非蛋白原性氨基酸。在特別優(yōu)選的實施方案中，相容的穩(wěn)定劑可以包括精氨酸、賴氨酸、脯氨酸和半胱氨酸。此外，相容的穩(wěn)定劑可以包括具有堿性pKa的胍和含氮雜環(huán)。在某些實施方案中，相容的穩(wěn)定劑包括具有至少一個pKa大于約7.5的胺部分的化合物，在其它實施方案中，所述胺部分的pKa大于約8.0，在其它實施方案中，胺部分的pKa大于約8.5，在其它實施方案中，穩(wěn)定劑將包含pKa大于約9.0的胺部分。其它優(yōu)選的實施方案將包括穩(wěn)定劑，其中胺部分的pKa大于約9.5，而某些其它實施方案將包含顯示至少一個pKa大于約10.0的胺部分的穩(wěn)定劑。在其它優(yōu)選實施方案中，穩(wěn)定劑將包含具有pKa大于約10.5的胺部分的化合物，在其它實施方案中，穩(wěn)定劑將包含具有pKa大于約11.0的胺部分的化合物，而在在其它實施方案中，穩(wěn)定劑將包含pKa大于約11.5的胺部分。在其它實施方案中，穩(wěn)定劑將包含具有pKa大于約12.0的胺部分的化合物，而在其它實施方案中，穩(wěn)定劑將包含pKa大于約12.5的胺部分。本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，相關(guān)pKa可以容易地使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)計算或測定，并用于確定使用所選化合物作為穩(wěn)定劑的適用性。所公開的穩(wěn)定劑顯示出當(dāng)與某些還原劑組合時對靶向與游離位點特異性半胱氨酸綴合特別有效。對于本發(fā)明的目的，相容的還原劑可以包括產(chǎn)生用于綴合的還原的游離位點特異性半胱氨酸而不顯著破壞工程改造抗體天然二硫鍵的任何化合物。在通過選擇的穩(wěn)定劑和還原劑的組合提供的這種條件下，活化的藥物接頭主要限于結(jié)合所需的游離位點特異性半胱氨酸位點。特別優(yōu)選相對溫和的還原劑或在相對低濃度下使用以提供溫和條件的還原劑。如本文所用，術(shù)語“溫和還原劑”或“溫和還原條件”應(yīng)理解為由還原劑(任選在穩(wěn)定劑存在下)產(chǎn)生的任何試劑或狀態(tài)，其在游離半胱氨酸位點提供硫醇，而基本上不破壞工程改造抗體中存在的天然二硫鍵。也就是說，溫和的還原劑或條件能夠有效地還原游離半胱氨酸(提供硫醇)而不顯著破壞蛋白質(zhì)的天然二硫鍵。期望的還原條件可以通過多種基于巰基的化合物提供，其為選擇性綴合建立適當(dāng)?shù)沫h(huán)境。在優(yōu)選的實施方案中，溫和還原劑可以包括具有一個或多個游離硫醇的化合物，而在特別優(yōu)選的實施方案中，溫和還原劑將包括具有單一游離硫醇的化合物。與本發(fā)明相容的還原劑的非限制性實例包括谷胱甘肽、n-乙酰半胱氨酸、半胱氨酸、2-氨基乙烷-1-硫醇和2-羥基乙烷-1-硫醇。應(yīng)當(dāng)理解，上述選擇性還原方法在與游離半胱氨酸的靶向綴合中特別有效。在這方面，可以通過各種本領(lǐng)域接受的技術(shù)確定在位點特異性抗體中與所需靶位點綴合的程度(在此定義為“綴合效率”)。藥物與抗體的位點特異性綴合的效率可以通過評估相對于所有其它綴合的靶綴合位點(在本發(fā)明中在輕鏈的c-末端上的游離半胱氨酸)的綴合百分比來確定。在某些實施方案中，本文的方法提供有效地將藥物與包含游離半胱氨酸的抗體綴合。在一些實施方案中，綴合效率為至少5%、至少10%、至少15%、至少20%、至少25%、至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或更高，如通過相對于所有其它綴合位點的靶綴合百分比測量的。還將理解，能夠綴合的工程改造抗體可以含有包含巰基的游離半胱氨酸殘基，當(dāng)產(chǎn)生或儲存抗體時，其被封閉或加帽。這種帽包括小分子、蛋白質(zhì)、肽、離子和與巰基相互作用并防止或抑制綴合物形成的其它物質(zhì)。在一些情況下，未綴合的工程改造抗體可以包含結(jié)合在相同或不同抗體上的其他游離半胱氨酸的游離半胱氨酸。如本文所討論的，這種交叉反應(yīng)性可能在制造程序期間導(dǎo)致各種污染物。在一些實施方案中，工程改造抗體可能需要在綴合反應(yīng)之前脫帽。在具體實施方案中，本文的抗體脫帽并顯示能夠綴合的游離巰基。在具體實施方案中，本文的抗體經(jīng)受不擾亂或重排天然存在的二硫鍵的脫帽反應(yīng)。應(yīng)當(dāng)理解，在大多數(shù)情況下，脫帽反應(yīng)將在正常還原反應(yīng)(還原或選擇性還原)期間發(fā)生。6.DAR分布和純化與本發(fā)明的位點特異性抗體綴合的優(yōu)點之一是產(chǎn)生包含窄DAR分布的相對均勻的ADC制劑的能力。在這方面，就藥物和工程改造抗體之間的化學(xué)計量比而言，所公開的構(gòu)建體和/或選擇性綴合提供了樣品中ADC種類的同質(zhì)性。如上簡要討論的，術(shù)語“藥物與抗體的比率”或“DAR”是指藥物與抗體的摩爾比。在一些實施方案中，綴合物制劑在其DAR分布方面可以是基本上同質(zhì)的，這意味著具有特定DAR(例如，2或4的DAR)的位點特異性ADC的主要種類在制劑內(nèi)，其在加載位點(即，在游離半胱氨酸上)方面也是均勻的。在本發(fā)明的某些實施方案中，有可能通過使用位點特異性抗體和/或選擇性還原和綴合來實現(xiàn)期望的同質(zhì)性。在其它優(yōu)選實施方案中，可以通過使用位點特異性構(gòu)建體與選擇性還原組合來實現(xiàn)所需的同質(zhì)性。在其它特別優(yōu)選的實施方案中，可以使用分析或制備型色譜技術(shù)進(jìn)一步純化制備物。在這些實施方案的每一個中，可以使用本領(lǐng)域已知的各種技術(shù)分析ADC樣品的均質(zhì)性，包括但不限于質(zhì)譜法、HPLC(例如大小排阻HPLC、RP-HPLC、HIC-HPLC等)或毛細(xì)管電泳。關(guān)于ADC制劑的純化，應(yīng)當(dāng)理解，可以使用標(biāo)準(zhǔn)藥物制備方法以獲得所需的純度。如本文所討論的，液相色譜法例如反相(RP)和疏水相互作用色譜(HIC)可以通過藥物裝載值分離混合物中的化合物。在一些情況下，離子交換(IEC)或混合模式色譜(MMC)也可用于分離具有特定藥物負(fù)載的物質(zhì)。所公開的ADC及其制備物可以包括取決于抗體的構(gòu)型和至少部分地基于用于實現(xiàn)綴合的方法的各種化學(xué)計量摩爾比的藥物和抗體部分。在某些實施方案中，每個ADC的藥物負(fù)載可以包含1-20個彈頭(即n為1-20)。其他選擇的實施方案可以包括具有從1至15個彈頭的藥物負(fù)載的ADC。在其他實施方案中，ADC可以包括1-12個彈頭，或者更優(yōu)選地包括1-10個彈頭。在某些優(yōu)選實施方案中，ADC將包含1至8個彈頭。雖然理論藥物負(fù)載可能相對高，但是由于聚集體和其他污染物，實際限制例如游離半胱氨酸交叉反應(yīng)性和彈頭疏水性傾向于限制包含這種DAR的均勻制劑的產(chǎn)生。也就是說，較高的藥物負(fù)載，例如>6，可能導(dǎo)致某些抗體-藥物偶聯(lián)物的聚集、不溶性、毒性或細(xì)胞通透性的喪失。考慮到這些問題，本發(fā)明提供的實際藥物負(fù)載優(yōu)選為每個綴合物1至8個藥物，即其中1、2、3、4、5、6、7或8個藥物共價連接至每個抗體(例如，對于IgG1，其他抗體可以具有不同的負(fù)載能力，這取決于二硫鍵的數(shù)目)。優(yōu)選地，本發(fā)明的組合物的DAR將為約2、4或6，在特別優(yōu)選的實施方案中，DAR將包含約2。盡管本發(fā)明提供了相對高水平的均質(zhì)性，但公開的組合物實際上包含具有1至8個(在IgG1的情況下)的藥物化合物范圍的綴合物的混合物。因此，所公開的ADC組合物包括綴合物的混合物，其中大多數(shù)組成抗體與一個或多個藥物部分共價連接，并且(盡管具有選擇性還原的綴合物特異性)其中藥物部分可以通過各種巰基連接到抗體。也就是說，在綴合后，本發(fā)明的ADC組合物將包含具有各種濃度的不同藥物負(fù)載(例如，每個IgG1抗體1至8個藥物)的綴合物(以及主要由游離半胱氨酸交叉反應(yīng)性引起的某些反應(yīng)污染物)的混合物。使用選擇性還原和制造后純化，可以將綴合物組合物驅(qū)動到它們主要含有相對低水平的其它ADC種類(例如，藥物裝載量為1、4、6等)的單個主要所需的ADC種類(例如，具有2的藥物負(fù)載)的點。平均DAR值表示組合物作為整體(即，所有ADC種類一起)的藥物負(fù)載的加權(quán)平均值。由于所使用的定量方法的固有不確定性和在商業(yè)環(huán)境中完全去除非優(yōu)勢ADC種類的困難，可接受的DAR值或規(guī)格通常表示為平均值、范圍或分布(即，平均DAR為2+/-0.5)。優(yōu)選包含在該范圍內(nèi)(即1.5至2.5)的測量平均DAR的組合物將用于藥用設(shè)定中。因此，在某些優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明將包括具有平均DAR為1、2、3、4、5、6、7或8的組合物，各自+/-0.5。在其它優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明將包括2、4、6或8+/-0.5的平均DAR。最后，在選擇的優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明將包括2+/-0.5的平均DAR。應(yīng)當(dāng)理解，在某些優(yōu)選實施方案中，范圍或偏差可以小于0.4。因此，在其它實施方案中，組合物將包含各自+/-0.3的1、2、3、4、5、6、7或8的平均DAR，2、4、6或8+/-0.3的平均DAR，甚至更優(yōu)選2或4+/-0.3的平均DAR或甚至2+/-0.3的平均DAR。在其它實施方案中，IgG1綴合物組合物將優(yōu)選包含平均DAR為1、2、3、4、5、6、7或8各自+/-0.4的組合物，和相對低水平(即，小于30%)的非主要ADC種類。在其它優(yōu)選實施方案中，ADC組合物將包含2、4、6或8各自+/-0.4的平均DAR，并具有相對低水平(<30%)的非主要ADC種類。在特別優(yōu)選的實施方案中，ADC組合物將包含2+/-0.4的平均DAR和相對低水平(<30%)的非主要ADC種類。在其它實施方案中，當(dāng)針對其他DAR物種測量時，主要的ADC種類(例如，2的DAR)將以大于65%的濃度、大于70%的濃度、大于75%的濃度、大于80%的濃度、大于在大于85%的濃度、在大于90%的濃度、在大于93%的濃度、在大于95%的濃度或甚至在大于97%的濃度存在。如下文實施例中詳述的，可以通過常規(guī)方法如UV-Vis分光光度法、反相HPLC、HIC、質(zhì)譜法、ELISA和電泳表征來自綴合反應(yīng)的ADC制劑中每個抗體的藥物分布。還可以確定ADC對于每個抗體的藥物的定量分布。通過ELISA，可以測定ADC的特定制劑中每個抗體的藥物的平均值。然而，通過ELISA的抗體-抗原結(jié)合和檢測限制不能辨別藥物/抗體值的分布。此外，用于檢測抗體-藥物綴合物的ELISA測定法不確定藥物部分連接于抗體的位置，例如重鏈或輕鏈片段或特定氨基酸殘基。VI.診斷和篩選1.診斷本發(fā)明提供用于檢測、診斷或監(jiān)測增殖性疾病的體外或體內(nèi)方法和從患者中篩選細(xì)胞以鑒定包括致瘤細(xì)胞(例如CSC)的腫瘤細(xì)胞的方法。這樣的方法包括鑒定具有癌癥的個體用于治療或監(jiān)測癌癥的進(jìn)展，包括使患者或從患者獲得的樣品(即在體內(nèi)或體外)與本文所述的抗體接觸，并檢測樣品中是否存在抗體結(jié)合的或游離的靶分子或其締合水平。在一些實施方案中，抗體將包含如本文所述的可檢測標(biāo)記或報告分子。在一些實施方案中，抗體與樣品中特定細(xì)胞的締合可以表示樣品表達(dá)作為本發(fā)明抗體的靶標(biāo)(例如RNF43)的蛋白質(zhì)，從而表明具有癌癥的個體可以有效地用如本文所述的抗體或抗體藥物綴合物治療?？梢允褂枚喾N測定法，例如放射免疫測定法、酶免疫測定法(例如ELISA)、競爭結(jié)合測定法、熒光免疫測定法、免疫印跡測定法、蛋白質(zhì)印跡分析和流式細(xì)胞術(shù)測定法來分析樣品。合適的體內(nèi)治療診斷或診斷測定可包括本領(lǐng)域公知的成像或監(jiān)測技術(shù)，例如磁共振成像、計算機(jī)斷層攝影(例如CAT掃描)、正電子斷層攝影(例如PET掃描)、放射照相術(shù)、超聲等，如本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。在另一個實施方案中，本發(fā)明提供了在體內(nèi)分析癌癥進(jìn)展和/或發(fā)病的方法。在另一個實施方案中，體內(nèi)癌癥進(jìn)展和/或發(fā)病的分析包括確定腫瘤進(jìn)展的程度。在另一個實施方案中，分析包括腫瘤的鑒定。在另一個實施方案中，對原發(fā)性腫瘤進(jìn)行腫瘤進(jìn)展的分析。在另一個實施方案中，根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的癌癥類型，隨時間進(jìn)行分析。在另一個實施方案中，在體內(nèi)分析源自原發(fā)腫瘤的轉(zhuǎn)移細(xì)胞的繼發(fā)性腫瘤的進(jìn)一步分析。在另一個實施方案中，分析繼發(fā)性腫瘤的大小和形狀。在一些實施方案中，進(jìn)行進(jìn)一步的離體分析。在另一個實施方案中，本發(fā)明提供了一種體內(nèi)分析癌癥進(jìn)展和/或發(fā)病的方法，包括測定細(xì)胞轉(zhuǎn)移或檢測和定量循環(huán)腫瘤細(xì)胞的水平。在另一個實施方案中，細(xì)胞轉(zhuǎn)移的分析包括測定與原發(fā)性腫瘤不連續(xù)的部位處的細(xì)胞的進(jìn)行性生長。在另一個實施方案中，細(xì)胞轉(zhuǎn)移分析位點包括腫瘤擴(kuò)散的途徑。在一些實施方案中，細(xì)胞可以通過血管系統(tǒng)、淋巴管、在體腔內(nèi)或其組合分散。在另一個實施方案中，鑒于細(xì)胞遷移、傳播、外滲、增殖或其組合進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)移分析。因此，在一個實施方案中，本發(fā)明的抗體可以用于檢測和定量患者樣品(例如血漿或血液)中的RNF43水平，其可以進(jìn)而用于檢測、診斷或監(jiān)測RNF43相關(guān)病癥，包括增殖疾病。在相關(guān)實施方案中，本發(fā)明的抗體可以用于體內(nèi)或體外檢測、監(jiān)測和/或定量循環(huán)腫瘤細(xì)胞(WO2012/0128801)。在其他實施方案中，循環(huán)腫瘤細(xì)胞可以包含致瘤細(xì)胞。在本發(fā)明的某些實施方案中，可以在治療或方案之前使用所公開的抗體來評價或表征受試者中的致瘤細(xì)胞或來自受試者的樣品以建立基線。在其他實例中，可以從衍生自被治療的受試者的樣品評估致瘤細(xì)胞。在一些實例中，在受試者開始或終止治療后至少約1、2、4、6、7、8、10、12、14、15、16、18、20、30、60、90天、6個月、9個月、12個月或>12個月，自受試者獲取樣品。在某些實例中，在一定劑量之后(例如，1、2、3、4、5、10、20、30或更多個治療劑量后)評價或表征致瘤細(xì)胞。在其他實例中，在接受一次或多次治療后1周、2周、3周、1個月、6周、2個月、1年、2年、3年、4年或更長后，表征或評估致瘤細(xì)胞。另一方面，如下文更詳細(xì)討論的，本發(fā)明提供了用于檢測、監(jiān)測或診斷過度增殖性疾病，鑒定具有這種疾病的個體以用于可能治療或監(jiān)測患者的疾病進(jìn)展(或消退)的試劑盒，其中所述試劑盒包含如本文所述的抗體和用于檢測所述抗體對樣品的影響的試劑。本發(fā)明的又一方面包括使用標(biāo)記的抗RNF43抗體用于免疫組織化學(xué)(IHC)。在這方面，IHC可以用作診斷工具以幫助診斷各種增殖性疾病，并監(jiān)測對包括抗RNF43抗體治療在內(nèi)的治療的潛在反應(yīng)。可以對已經(jīng)化學(xué)固定(包括但不限于：甲醛、戊二醛、四氧化鋨、重鉻酸鉀、乙酸、醇、鋅鹽、氯化汞、四氧化鉻和苦味酸)和包埋(包括但不限于：乙二醇甲基丙烯酸酯、石蠟和樹脂)或通過冷凍保存的組織進(jìn)行合適的診斷測定法。這樣的測定法可用于指導(dǎo)治療決定并確定給藥方案和時間。2.篩選在某些實施方案中，抗體可用于篩選樣品，以鑒定通過與決定子相互作用而改變腫瘤細(xì)胞的功能或活性的化合物或試劑(例如抗體或ADC)。在一個實施方案中，使腫瘤細(xì)胞與抗體或ADC接觸，并且抗體或ADC可用于篩選表達(dá)某種靶標(biāo)(例如RNF43)的細(xì)胞的腫瘤，以便鑒定所述細(xì)胞用于以下目的，包括但不限于：診斷目的、監(jiān)測此類細(xì)胞以確定治療功效或富集這種靶標(biāo)表達(dá)細(xì)胞的細(xì)胞群。在又一個實施方案中，方法包括直接或間接地使腫瘤細(xì)胞與測試劑或化合物接觸，并確定測試劑或化合物是否調(diào)節(jié)與決定子相關(guān)的腫瘤細(xì)胞的活性或功能，例如細(xì)胞形態(tài)或存活力的改變、標(biāo)記物的表達(dá)、分化或去分化、細(xì)胞呼吸、線粒體活性、膜完整性、成熟、增殖、存活力、細(xì)胞凋亡或細(xì)胞死亡。直接相互作用的一個實例是物理相互作用，而間接相互作用包括例如組合物對中間分子的作用，所述中間分子繼而作用于涉及的實體(例如細(xì)胞或細(xì)胞培養(yǎng)物)。篩選方法包括高通量篩選，其可以包括任選地在預(yù)定位置，例如在培養(yǎng)皿、管、燒瓶、滾瓶或板上定位或放置的細(xì)胞陣列(例如微陣列)。高通量機(jī)器人或人工處理方法可以探測化學(xué)相互作用并在短時間內(nèi)確定許多基因的表達(dá)水平。已經(jīng)開發(fā)了利用分子信號的技術(shù)，例如通過熒光團(tuán)或微陣列(Mocellin和Rossi，2007，PMID：17265713)和以非?？斓乃俾侍幚硇畔⒌淖詣踊治?參見例如Pinhasov等人，2004，PMID：15032660)?？梢院Y選的文庫包括例如小分子文庫、噬菌體展示文庫、完全人抗體酵母展示文庫(Adimab)、siRNA文庫和腺病毒轉(zhuǎn)染載體。VII.藥物制備和治療用途1.制劑和給藥途徑本發(fā)明的抗體或ADC可以使用本領(lǐng)域公知的技術(shù)以各種方式配制。在一些實施方案中，本發(fā)明的治療組合物可以單獨(dú)或以最少量的其它組分施用，而其它實施方案可以任選地配制成含有合適的藥學(xué)上可接受的載體。如本文所用，“藥學(xué)上可接受的載體”包括本領(lǐng)域熟知的且可從商業(yè)來源獲得用于藥物制備的賦形劑、溶媒、助劑和稀釋劑(參見例如Gennaro(2003)Remington：TheScienceandPracticeofPharmacywithFactsandComparisons：DrugfactsPlus，第20版，MackPublishing;Ansel等人(2004)PharmaceuticalDosageFormsandDrugDeliverySystems，第7版，LippencottWilliamsandWilkins;Kibbe等人(2000)HandbookofPharmaceuticalExcipients，第3版，PharmaceuticalPress)。合適的藥學(xué)上可接受的載體包括相對惰性的并且可以促進(jìn)抗體的施用或可以有助于將活性化合物加工成藥學(xué)優(yōu)化用于遞送至作用部位的制劑的物質(zhì)。這種藥學(xué)上可接受的載體包括可以改變制劑的形式、一致性、粘度、pH、張力、穩(wěn)定性、滲透壓、藥代動力學(xué)、蛋白質(zhì)聚集或溶解度的試劑，包括緩沖劑、潤濕劑、乳化劑、稀釋劑、包封劑和皮膚滲透促進(jìn)劑。載體的某些非限制性實例包括鹽水、緩沖鹽水、葡萄糖、精氨酸、蔗糖、水、甘油、乙醇、山梨醇、葡聚糖、羧甲基纖維素鈉及其組合。用于全身給藥的抗體可以配制用于腸內(nèi)、胃腸外或局部給藥。實際上，所有三種類型的制劑可以同時使用以實現(xiàn)活性成分的全身給藥。賦形劑以及用于胃腸外和非腸外藥物遞送的制劑在Remington：TheScienceandPracticeofPharmacy(2000)第20版，MackPublishing中提供。用于腸內(nèi)施用的合適制劑包括硬或軟明膠膠囊、丸劑、片劑(包括包衣片劑)、酏劑、混懸劑、糖漿劑或吸入劑及其控釋形式。適合于腸胃外施用(例如通過注射)的制劑包括其中活性成分溶解、懸浮或以其它方式提供(例如在脂質(zhì)體或其他微粒中)的水性或非水性、等滲、無熱原、無菌液體(例如，溶液、懸浮液)。這樣的液體可另外含有其它藥學(xué)上可接受的載體，例如抗氧化劑、緩沖劑、防腐劑、穩(wěn)定劑、抑菌劑、助懸劑、增稠劑和使制劑與預(yù)期接受者的血液(或其它相關(guān)體液)等滲的溶質(zhì)。賦形劑的實例包括例如水、醇、多元醇、甘油、植物油等。用于這種制劑的合適的等滲藥學(xué)上可接受的載體的實例包括氯化鈉注射液、林格氏溶液或乳酸林格注射液。用于胃腸外施用(例如，靜脈內(nèi)注射)的合適制劑可以包含約10μg/mL至約100mg/mL的ADC或抗體濃度。在某些選擇的實施方案中，抗體或ADC濃度將包含20μg/mL、40μg/mL、60μg/mL、80μg/mL、100μg/mL、200μg/mL、300μg/mL、400μg/mL、500μg/mL、600μg/mL、700μg/mL、800μg/mL、900μg/mL或1mg/mL。在其它優(yōu)選實施方案中，ADC濃度將包含2mg/mL、3mg/mL、4mg/mL、5mg/mL、6mg/mL、8mg/mL、10mg/mL、12mg/mL、14mg/mL、16mg/mL、18mg/mL、20mg/mL、25mg/mL、30mg/mL、35mg/mL、40mg/mL、45mg/mL、50mg/mL、60mg/mL、70mg/mL、80mg/mL、90mg/mL或100mg/mL。本發(fā)明的化合物和組合物可以通過各種途徑在體內(nèi)給予有需要的受試者，包括但不限于口服、靜脈內(nèi)、動脈內(nèi)、皮下、胃腸外、鼻內(nèi)、肌內(nèi)、心臟內(nèi)、心室內(nèi)、氣管內(nèi)、含服、直腸、腹膜內(nèi)、皮內(nèi)、局部、透皮和鞘內(nèi)，或另外通過植入或吸入。所述組合物可以配制成固體、半固體、液體或氣體形式的制劑；包括但不限于片劑、膠囊、粉劑、顆粒劑、軟膏劑、溶液劑、栓劑、灌腸劑、注射劑、吸入劑和氣溶膠。可以根據(jù)預(yù)期的應(yīng)用和治療方案來選擇合適的制劑和給藥途徑。2.劑量具體的劑量方案，即劑量、時間和重復(fù)，將取決于具體的個體，以及經(jīng)驗考慮，例如藥代動力學(xué)(例如半衰期、清除率等)。給藥頻率的確定可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員例如主治醫(yī)師，基于所治療的病癥的狀況和嚴(yán)重程度、所治療的受試者的年齡和一般健康狀況等來進(jìn)行。基于對所選組合物的功效和給藥方案的評估，可以在治療過程中調(diào)整給藥頻率。這種評估可以基于特定疾病、病癥或病況的標(biāo)記物進(jìn)行。在個體患有癌癥的實施方案中，這些包括通過觸診或目視觀察直接測量腫瘤大??；通過x射線或其他成像技術(shù)間接測量腫瘤大小；通過直接腫瘤活檢和腫瘤樣品的顯微鏡檢查評估的改善；間接腫瘤標(biāo)記物(例如，前列腺癌的PSA)或根據(jù)本文所述方法鑒定的抗原的測量；減少增殖或致瘤細(xì)胞的數(shù)量，維持這種腫瘤細(xì)胞的減少；減少腫瘤細(xì)胞的增殖；或延遲轉(zhuǎn)移的發(fā)展。本發(fā)明的RNF43抗體或ADC可以以各種范圍施用。這些包括每劑約5μg/kg體重至約100mg/kg體重；每劑約50μg/kg體重至約5mg/kg體重；每劑約100μg/kg體重至約10mg/kg體重。其它范圍包括每劑約100μg/kg體重至約20mg/kg體重和每劑約0.5mg/kg體重至約20mg/kg體重。在某些實施方案中，劑量為至少約100μg/kg體重、至少約250μg/kg體重、至少約750μg/kg體重、至少約3mg/kg體重、至少約5mg/kg體重、至少約10mg/kg體重。在選擇的實施方案中，將以每劑約10、20、30、40、50、60、70、80、90或100μg/kg體重施用(優(yōu)選靜脈內(nèi))RNF43抗體或ADC。其它實施方案可以包括以每劑約200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1100、1200、1300、1400、1500、1600、1700、1800、1900或2000μg/kg體重施用ADC。在其它優(yōu)選的實施方案中，所公開的綴合物將以2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、9或10mg/kg施用。在仍其它實施方案中，綴合物可以以每劑12、14、16、18或20mg/kg體重施用。在仍其它實施方案中，綴合物可以以每劑25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、90或100mg/kg體重施用。利用本文的教導(dǎo)，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以基于臨床前動物研究、臨床觀察和標(biāo)準(zhǔn)醫(yī)學(xué)和生物化學(xué)技術(shù)和測量，容易地確定各種RNF43抗體或ADC的合適劑量。其它給藥方案可以基于體表面積(BSA)計算來預(yù)測，如美國專利號7,744,877所公開的。眾所周知，使用患者的身高和體重來計算BSA，并且其提供由他或她的身體的表面積表示的受試者尺寸的度量。在某些實施方案中，綴合物可以以1mg/m2至800mg/m2、50mg/m2至500mg/m2的劑量、100mg/m2、150mg/m2、200mg/m2、250mg/m2、300mg/m2、350mg/m2、400mg/m2或450mg/m2的劑量施用。還應(yīng)當(dāng)理解，本領(lǐng)域公知的和經(jīng)驗技術(shù)可用于確定適當(dāng)?shù)膭┝??？筊NF43抗體或ADC可以以特定的時間表施用。通常，向受試者施用有效劑量的RNF43綴合物一次或多次。更具體地，將有效劑量的ADC每月一次、每月多于一次或每月少于一次施用給受試者。在某些實施方案中，可以多次施用有效劑量的RNF43抗體或ADC，包括至少一個月、至少六個月、至少一年、至少兩年或幾年的時期。在另外其他實施方案中，在施用所公開的抗體或ADC之間可以停藥幾天(2、3、4、5、6或7)、幾周(1、2、3、4、5、6、7或8)或幾個月(1、2、3、4、5、6、7或8)或甚至一年或幾年。在某些優(yōu)選的實施方案中，涉及綴合的抗體的治療過程將包括在數(shù)周或數(shù)月的時間內(nèi)的多個劑量的所選藥物產(chǎn)品。更具體地，本發(fā)明的抗體或ADC可以每天、每兩天、每四天、每周、每十天、每兩周、每三周、每月、每六周、每兩個月、每十周或每三個月施用一次。在這方面，應(yīng)當(dāng)理解，基于患者反應(yīng)和臨床實踐，可以改變劑量或者可以調(diào)整間隔。在已經(jīng)給予一次或多次施用的個體中，所公開的治療組合物的劑量和方案也可以憑經(jīng)驗確定。例如，個體可以給予增量劑量的如本文所述產(chǎn)生的治療組合物。在選擇的實施方案中，劑量可以分別基于經(jīng)驗確定或觀察到的副作用或毒性逐漸增加或減少或減弱。為了評估所選組合物的功效，可以如前所述跟蹤特定疾病、病癥或病況的標(biāo)記物。對于癌癥，這些包括通過觸診或視覺觀察直接測量腫瘤大小，通過x射線或其他成像技術(shù)間接測量腫瘤大??；通過直接腫瘤活檢和腫瘤樣品的顯微鏡檢查評估的改善；間接腫瘤標(biāo)記物(例如，前列腺癌的PSA)或根據(jù)本文所述方法鑒定的致瘤性抗原的測量，疼痛或麻痹的減輕；改善與腫瘤相關(guān)的言語、視力、呼吸或其他失能；增加食欲；或通過接受的測試或存活延長測量的生活質(zhì)量的提高。對本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見的是，劑量將根據(jù)個體、腫瘤病癥的類型、腫瘤病癥的階段、腫瘤病癥是否已經(jīng)開始轉(zhuǎn)移到個體中的其他位置以及過去和同時使用的治療而改變。3.組合療法組合療法可用于預(yù)防或治療癌癥和預(yù)防癌癥的轉(zhuǎn)移或復(fù)發(fā)。本文所用的“組合療法”是指施用包含至少一種抗RNF43抗體或ADC和至少一種治療部分(例如抗癌劑)的組合，其中所述組合優(yōu)選具有治療協(xié)同作用，或與以下方面相比，改善癌癥治療中的可測量的治療效果：(i)單獨(dú)使用的抗RNF43抗體或ADC，或(ii)單獨(dú)使用的治療部分，或(iii)治療部分與另一治療部分組合使用而不添加抗RNF43抗體或ADC。本文所用的術(shù)語“治療協(xié)同作用”是指抗RNF43抗體或ADC與一種或多種治療部分的組合，其具有大于抗RNF43抗體或ADC和一個或多個治療性部分的組合的加和效果的治療效果。所公開的組合的期望結(jié)果通過與對照或基線測量進(jìn)行比較來量化。如本文所使用的，諸如“改善”、“增加”或“減少”的相對術(shù)語指示相對于對照的值，所述對照例如在開始本文所述的治療之前在相同個體中的測量，或在不存在本文所述的抗RNF43抗體或ADC的情況下，但在其它治療部分(例如護(hù)理治療標(biāo)準(zhǔn))的存在下對照個體(或多個對照個體)中的測量。代表性對照個體是患有與所治療個體相同形式的癌癥的個體，其與所治療個體的年齡大致相同(以確保治療個體和對照個體中的疾病階段是可比較的。)對治療的反應(yīng)的改變或改善通常是統(tǒng)計學(xué)顯著的。如本文所使用的，術(shù)語“顯著性”或“顯著的”涉及在兩個或更多個實體之間存在非隨機(jī)關(guān)聯(lián)的概率的統(tǒng)計分析。為了確定關(guān)系是否是“顯著的”或具有“顯著性”，可以計算“p值”。低于用戶定義的截止點的p值被認(rèn)為是顯著的。小于或等于0.1、小于0.05、小于0.01、小于0.005或小于0.001的p值可以被認(rèn)為是顯著的。協(xié)同治療效果可以是比單一治療部分或抗RNF43抗體或ADC引起的治療效果，或者抗RNF43抗體或ADC或給定組合的單個治療部分引起的治療效果的總和的至少約兩倍、或至少約5倍、或至少約10倍、或至少約20倍、或至少約50倍、或至少約一百倍大的效果。當(dāng)與單一治療部分或抗RNF43抗體或ADC引起的治療效果，或者由抗-TNF43抗體或ADC或給定組合的單一治療部分引起的治療效果的總和相比，治療效果增加至少10%、或至少20%、或至少30%、或至少40%、或至少50%、或至少60%、或至少70%、或至少80%、或至少90%、或至少100%或更多時，也可以觀察到協(xié)同治療效果。協(xié)同效果還是當(dāng)組合使用時允許減少治療劑的給藥的效果。在實施組合治療中，抗RNF43抗體或ADC和治療性部分可以使用相同或不同的施用途徑同時以單一組合物或作為兩個或更多個不同組合物施用于受試者?；蛘?，用抗RNF43抗體或ADC的治療可在治療部分治療之前或之后，例如，以從數(shù)分鐘到數(shù)周的間隔。在一個實施方案中，治療部分和抗體或ADC在彼此約5分鐘至約兩周內(nèi)施用。在另外其他實施方案中，在施用抗體和治療部分之間可以停藥幾天(2、3、4、5、6或7)，幾周(1、2、3、4、5、6、7或8)或幾個月(1、2、3、4、5、6、7或8)?？梢允┯媒M合療法，直到在各種時間表上治療、緩解或治愈病癥，例如每天一次、兩次或三次、每兩天一次、每三天一次、每周一次、每兩周一次、每月一次、每兩個月一次、每三個月一次、每六個月一次，或可連續(xù)施用?？贵w和治療性部分可以間隔幾天或幾周施用；或給定抗RNF43抗體或ADC治療的順序，然后用另外的治療部分進(jìn)行一次或多次治療。在一個實施方案中，抗RNF43抗體或ADC與一個或多個治療性部分組合施用用于短治療周期。在其它實施方案中，組合治療施用用于長的治療周期。組合療法可以通過任何途徑施用。本發(fā)明還提供抗RNF43抗體或ADC與放射療法的組合。本文所用的術(shù)語“放射療法”是指在腫瘤細(xì)胞內(nèi)局部誘導(dǎo)DNA損傷的任何機(jī)制，例如γ-照射、X-射線、UV-照射、微波、電子發(fā)射等。也考慮使用放射性同位素到腫瘤細(xì)胞的定向遞送的組合療法，并且可以與本文公開的抗RNF43抗體組合使用，或作為本文公開的抗RNF43抗體的綴合物使用。通常，在約1至約2周的時間段內(nèi)以脈沖施用放射療法。任選地，放射療法可以作為單一劑量或作為多個序貫劑量施用。在其他實施方案中，抗RNF43抗體或ADC可以與一種或多種下述化療劑組合使用。4.抗癌劑本文使用的術(shù)語“抗癌劑”或“化療劑”是“治療部分”的一個子集，其又是描述為“藥物活性部分”的藥劑的子集。更具體地，“抗癌劑”是指可用于治療細(xì)胞增殖性疾病例如癌癥的任何試劑，包括但不限于細(xì)胞毒性劑、細(xì)胞生長抑制劑、抗血管生成劑、減滅劑、化療劑、放射治療和放射治療劑、靶向抗癌劑、生物反應(yīng)調(diào)節(jié)劑、治療性抗體、癌癥疫苗、細(xì)胞因子、激素療法、抗轉(zhuǎn)移劑和免疫治療劑。應(yīng)當(dāng)理解，在如上所述的選擇的實施方案中，這樣的抗癌劑可以包含綴合物，并且可以在施用前與抗體締合。在某些實施方案中，所公開的抗癌劑將與抗體連接以提供本文公開的ADC。術(shù)語“細(xì)胞毒性劑”，其也可以是抗癌劑，是指對細(xì)胞有毒性并降低或抑制細(xì)胞功能和/或引起細(xì)胞破壞的物質(zhì)。通常，物質(zhì)是來源于活生物體的天然存在的分子(或合成制備的天然產(chǎn)物)。細(xì)胞毒性劑的實例包括但不限于細(xì)菌(例如白喉毒素、假單胞菌內(nèi)毒素和外毒素、葡萄球菌腸毒素A)、真菌(例如α-帚曲霉素、局限曲菌素)、植物(例如相思豆毒素、蓖麻毒蛋白、蒴蓮根素、槲寄生毒蛋白、美洲商陸抗病毒蛋白、皂草素、白樹毒素、苦瓜毒蛋白、天花粉蛋白、大麥毒素、油桐蛋白質(zhì)、石竹素蛋白、商陸植物蛋白(PAPI、PAPII和PAP-S)、苦瓜抑制劑、麻瘋樹毒蛋白、皮質(zhì)激素、肥皂草抑制劑、mitegellin、局限曲菌素、酚霉素、新霉素和單端孢菌毒素)或動物(例如細(xì)胞毒性RNA酶、例如細(xì)胞外胰腺RNA酶；DNA酶I、包括其片段和/或變體)的小分子毒素或酶活性毒素?？拱﹦┛砂ㄒ种苹蛟O(shè)計為抑制癌細(xì)胞或可能變成癌性或產(chǎn)生致瘤性后代的細(xì)胞(例如致瘤細(xì)胞)的任何化學(xué)試劑。這種化學(xué)試劑通常針對細(xì)胞生長或分裂所必需的細(xì)胞內(nèi)過程，因此對通?？焖偕L和分裂的癌細(xì)胞特別有效。例如，長春新堿解聚微管，從而抑制細(xì)胞進(jìn)入有絲分裂。這種試劑通常聯(lián)合給藥，并且通常是最有效的，例如在制劑CHOP中。再次，在選擇的實施方案中，這樣的抗癌劑可以與所公開的抗體綴合?？梢耘c本發(fā)明的抗體組合使用(或與其綴合)的抗癌劑的實例包括但不限于烷化劑、烷基磺酸酯、阿那曲唑、鵝膏菌素、氮丙啶、乙烯亞胺和methylamelamines、多聚乙酰類、喜樹堿、BEZ-235、硼替佐米、苔蘚抑素、callystatin、CC-1065、ceritinib、crizotinib、cryptophycins、多拉司他汀、duocarmycin、eleutherobin、厄洛替尼、pancratistatin、sarcodictyin、spongistatin、氮芥、抗生素、enediynedynemicin、雙磷酸鹽、埃斯帕霉素、chromoproteinenediyneantiobioticchromophores、阿克拉霉素、放線菌素、authramycin、重氮絲氨酸、博萊霉素、放線菌素C、canfosfamide、carabicin、洋紅霉素、嗜癌霉素、chromomycinis、環(huán)磷酰胺、放線菌素D、柔紅霉素、地托比星、6-重氮-5-氧-L-正亮氨酸、多柔比星、表柔比星、依索比星、依西美坦、氟尿嘧啶、氟維司群、吉非替尼、伊達(dá)比星、拉帕替尼、來曲唑、lonafarnib、馬賽洛霉素、醋酸甲地孕酮、絲裂霉素、霉酚酸、諾加霉素、橄欖霉素、帕唑帕尼、培霉素、博替霉素、嘌呤霉素、三鐵阿霉素、雷帕霉素、羅多比星、索拉非尼、鏈黑菌素、鏈佐星、他莫昔芬、他莫昔芬檸檬酸鹽、替莫唑胺、替泊替尼、替比法尼、殺結(jié)核菌素、烏苯美司、凡德他尼、伏洛唑、XL-147、凈司他丁、佐柔比星；抗代謝物、葉酸類似物、嘌呤類似物、雄激素、抗腎上腺素、葉酸補(bǔ)充劑諸如frolinicacid、醋葡醛內(nèi)酯、醛磷酰胺糖苷、氨基乙酰丙酸、恩尿嘧啶、安吖啶、bestrabucil、比生群、依達(dá)曲沙、defofamine、秋水仙胺、地吖醌、elfornithine、依利醋銨、epothilone、依托格魯、硝酸鎵、羥基脲、香菇多糖、氯尼達(dá)明、類美登素、米托胍腙、米托蒽醌、mopidanmol、nitraerine、噴司他丁、蛋氨氮芥、吡柔比星、洛索蒽醌、鬼臼酸、2-乙基酰肼、甲基芐肼、多糖復(fù)合物、雷佐生、根霉素、SF-1126、西佐喃；鍺螺胺、細(xì)格孢氮雜酸；三亞胺醌；2,2',2''-三氯三乙胺；單端孢霉烯(T-2毒素、verracurinA、桿孢菌素A和anguidine)；尿烷；長春地辛；達(dá)卡巴嗪；甘露莫司??；二溴甘露醇；二溴衛(wèi)矛醇；哌血生；gacytosine;阿糖胞苷；環(huán)磷酰胺；塞替派；紫杉烷，chloranbucil;吉西他濱;6-硫鳥嘌呤;巰基嘌呤;甲氨蝶呤;鉑類似物，長春堿;鉑;依托泊苷;異環(huán)磷酰胺;米托蒽醌;長春新堿;長春瑞濱;諾消靈;替尼泊苷;依達(dá)曲沙;柔紅霉素;氨基蝶呤;希羅達(dá);伊班膦酸鹽;伊立替康，拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制劑RFS2000;二氟甲基鳥氨酸;類視黃醇;卡培他濱;考布他汀;甲酰四氫葉酸;奧沙利鉑;XL518，減少細(xì)胞增殖的PKC-α、Raf、H-Ras、EGFR和VEGF-A的抑制劑和任何上述藥劑的藥學(xué)上可接受的鹽或溶劑合物、酸或衍生物。在該定義中還包括用于調(diào)節(jié)或抑制激素對腫瘤的作用的抗激素劑，例如抗雌激素和選擇性雌激素受體抗體，抑制調(diào)節(jié)腎上腺中雌激素產(chǎn)生的芳香酶的芳香酶抑制劑，和抗雄激素;以及曲沙他濱(一種1,3-二氧戊環(huán)核苷胞嘧啶類似物);反義寡核苷酸，核酶例如VEGF表達(dá)抑制劑和HER2表達(dá)抑制劑;疫苗，PRILUKIN?rIL-2;LURTOTECAN?拓?fù)洚悩?gòu)酶1抑制劑;ABARELIX?rmRH;長春瑞濱和埃斯波霉素以及任何上述藥劑的藥學(xué)上可接受的鹽或溶劑合物、酸或衍生物。另外的抗癌劑包括商業(yè)上或臨床上可用的化合物，例如厄洛替尼(TARCEVA?，Genentech/OSIPharm.)，多西他賽(TAXOTERE?，Sanofi-Aventis)，5-FU(氟尿嘧啶，5-氟尿嘧啶，CASNo.51-21-8)，吉西他濱(GEMZAR?，Lilly)，PD-0325901(CAS號391210-10-9，Pfizer)，順鉑(順式二胺，二氯鉑(II)，CAS號15663-27-1)，卡鉑(CASNo.41575-94-4)，紫杉醇(TAXOL?，Bristol-MyersSquibbOncology，Princeton，N.J.)，曲妥單抗(HERCEPTIN?，Genentech)，替莫唑胺(4-甲基-5-氧代-2,3,4,6,8-五氮雜二環(huán)[4.3.0]壬-2,7,9-三烯-9-甲酰胺，CAS號85622-93-1，TEMODAR?，TEMODAL?，ScheringPlough)，他莫昔芬((Z)-2-[4-(1,2-二苯基丁-1-烯基)苯氧基]–N,N-二甲基乙胺，NOLVADEX?，ISTUBAL?，VALODEX?)和多柔比星(ADRIAMYCIN?)。其它市售或臨床可用的抗癌劑包括奧沙利鉑(ELOXATIN?，Sanofi)，硼替佐米(VELCADE?，MillenniumPharm.)，sutent(SUNITINIB?，SU11248，Pfizer)，來曲唑(FEMARA?，Novartis)，甲磺酸伊馬替尼(GLEEVEC?，Novartis)，XL-518(Mek抑制劑，Exelixis，WO2007/044515)，ARRY-886(Mek抑制劑，AZD6244，ArrayBioPharma，AstraZeneca)，SF-1126(PI3K抑制劑，SemaforePharmaceuticals)，BEZ-235(PI3K抑制劑,Novartis)，XL-147(PI3K抑制劑，Exelixis)，PTK787/ZK222584(Novartis)，氟維司群(FASLODEX?，AstraZeneca)，甲酰四氫葉酸(亞葉酸)，雷帕霉素(西羅莫司，RAPAMUNE?，Wyeth)，lapatinib(TYKERB?，GSK572016，GlaxoSmithKline)，lonafarnib(SARASAR?，SCH66336，ScheringPlough)，索拉非尼(NEXAVAR?，BAY43-9006，BayerLabs)，吉非替尼(IRESSA?，AstraZeneca)，伊立替康(CAMPTOSAR?，CPT-11，Pfizer)，tipifarnib(ZARNESTRA?，Johnson&Johnson)，ABRAXANE?(無克列莫佛)，紫杉醇的白蛋白改造的納米顆粒制劑(AmericanPharmaceuticalPartners，Schaumberg，Il)，vandetanib(rINN，ZD6474，ZACTIMA?，AstraZeneca)，chloranmbucil，AG1478，AG1571(SU5271;Sugen)，替西羅莫司(TORISEL?，Wyeth)，帕唑帕尼(GlaxoSmithKline)，canfosfamide(TELCYTA?，Telik)，塞替派和環(huán)磷酰胺(CYTOXAN?，NEOSAR?);長春瑞濱(NAVELBINE?);卡培他濱(XELODA?，Roche)，他莫昔芬(包括NOLVADEX?；檸檬酸他莫昔芬，F(xiàn)ARESTON?(托瑞米芬檸檬酸鹽)MEGASE?(乙酸甲地孕酮)，AROMASIN?(依西美坦;Pfizer)，formestanie，法倔唑，RIVISOR?(vorozole)，F(xiàn)EMARA?(來曲唑;Novartis)和ARIMIDEX?(阿那曲唑;AstraZeneca)。術(shù)語“藥學(xué)上可接受的鹽”或“鹽”是指分子或大分子的有機(jī)或無機(jī)鹽。酸加成鹽可以與氨基形成。示例性鹽包括但不限于硫酸鹽、檸檬酸鹽、乙酸鹽、草酸鹽、氯化物、溴化物、碘化物、硝酸鹽、硫酸氫鹽、磷酸鹽、酸式磷酸鹽、異煙酸鹽、乳酸鹽、水楊酸鹽、酸式檸檬酸鹽、酒石酸鹽、油酸鹽、鞣酸鹽、泛酸鹽、酒石酸氫鹽、抗壞血酸鹽、琥珀酸鹽、馬來酸鹽、龍膽酸鹽、富馬酸鹽、葡糖酸鹽、葡糖醛酸鹽、糖酸鹽、甲酸鹽、苯甲酸鹽、谷氨酸鹽、甲磺酸鹽、乙磺酸鹽、苯磺酸鹽、對甲苯磺酸鹽及雙羥萘酸鹽(即，1,1'亞甲基雙-(2-羥基3-萘酸鹽)。藥學(xué)上可接受的鹽可涉及包含另一分子，例如乙酸根離子、琥珀酸根離子或其它抗衡離子?？购怆x子可以是穩(wěn)定母體化合物上的電荷的任何有機(jī)或無機(jī)部分。此外，藥學(xué)上可接受的鹽在其結(jié)構(gòu)中可以具有多于一個帶電原子。當(dāng)多個帶電原子是藥學(xué)上可接受的鹽的一部分時，該鹽可以具有多個抗衡離子。因此，藥學(xué)上可接受的鹽可以具有一個或多個帶電原子和/或一個或多個抗衡離子?！八帉W(xué)上可接受的溶劑化物”或“溶劑化物”是指一個或多個溶劑分子與分子或大分子的締合。形成藥學(xué)上可接受的溶劑合物的溶劑的實例包括但不限于水、異丙醇、乙醇、甲醇、DMSO、乙酸乙酯、乙酸和乙醇胺。在其它實施方案中，本發(fā)明的抗體或ADC可以與目前在臨床試驗中或可商購的許多抗體(或免疫治療劑)中的任一種組合使用。所公開的抗體可與選自以下的抗體組合使用：阿巴伏單抗、阿德木單抗、afutuzumab、阿侖單抗、阿妥莫單抗、amatuximab、麻安莫單抗、阿西莫單抗、巴士昔單抗、貝妥莫單抗、貝伐單抗、比代單抗、blinatumomab、brentuximab、美坎珠單抗、卡妥索單抗、西妥昔單抗、citatuzumab、cixutumumab、clivatuzumab、conatumumab、daratumumab、drozitumab、duligotumab、dusigitumab、detumomab、dacetuzumab、dalotuzumab、ecromeximab、elotuzumab、ensituximab、ertumaxomab、etaracizumab、farletuzumab、ficlatuzumab、figitumumab、flanvotumab、futuximab、ganitumab、吉妥珠單抗、girentuximab、glembatumumab、替伊莫單抗、igovomab、imgatuzumab、indatuximab、inotuzumab、intetumumab、依匹單抗、iratumumab、labetuzumab、lambrolizumab、lexatumumab、lintuzumab、lorvotuzumab、lucatumumab、mapatumumab、馬妥珠單抗、milatuzumab、minretumomab、mitumomab、moxetumomab、narnatumab、naptumomab、necitumumab、尼妥珠單抗、nivolumab、nofetumomabn、obinutuzumab、ocaratuzumab、奧法木單抗、olaratumab、olaparib、onartuzumab、oportuzumab、oregovomab、帕尼單抗、parsatuzumab、patritumab、pemtumomab、帕妥珠單抗、pidilizumab、pintumomab、pritumumab、racotumomab、radretumab、ramucirumab、rilotumumab、利妥昔單抗、robatumumab、satumomab、selumetinib、sibrotuzumab、siltuximab、simtuzumab、solitomab、tacatuzumab、taplitumomab、tenatumomab、替妥木單抗、替加珠單抗、托西莫單抗、曲妥單抗、tucotuzumab、ublituximab、維妥珠單抗、vorsetuzumab、伏妥莫單抗、扎妥木單抗、CC49、3F8、MDX-1105和MEDI4736以及它們的組合。其它特別優(yōu)選的實施方案包括批準(zhǔn)用于癌癥治療的抗體的用途，所述抗體包括但不限于利妥昔單抗、吉妥珠單抗奧佐格霉素、阿侖單抗、替伊莫單抗、托西莫單抗、貝伐單抗、西妥昔單抗、帕利單抗、奧法木單抗、依匹單抗和brentuximabvedotin。本領(lǐng)域技術(shù)人員將能夠容易地鑒定與本文教導(dǎo)相容的另外的抗癌劑。5.放射療法本發(fā)明還提供了抗體或ADC與放射療法(即，在腫瘤細(xì)胞內(nèi)局部誘導(dǎo)DNA損傷的任何機(jī)制，例如γ-照射、X射線、UV-照射、微波、電子發(fā)射等)的組合。也考慮使用放射性同位素到腫瘤細(xì)胞的定向遞送的組合療法，并且所公開的抗體或ADC可以與靶向抗癌劑或其它靶向手段聯(lián)合使用。通常，在約1至約2周的時間段內(nèi)以脈沖施用放射療法?？梢韵蚧加蓄^頸癌的受試者施用放射療法約6至7周。任選地，放射療法可以作為單一劑量或作為多個序貫劑量施用。VIII適應(yīng)癥本發(fā)明提供了本發(fā)明的抗體和ADC用于診斷、治療診斷、治療和/或預(yù)防各種疾病，包括腫瘤性、炎性、血管生成和免疫性疾病和由病原體引起的疾病的用途。特別地，治療的關(guān)鍵目標(biāo)是包括實體瘤的腫瘤病癥，但血液惡性腫瘤在本發(fā)明的范圍內(nèi)。在某些實施方案中，本發(fā)明的抗體將用于治療表達(dá)特定決定子(例如RNF43)的腫瘤或致瘤細(xì)胞。優(yōu)選地，待治療的“受試者”或“患者”將是人，但如本文所使用的，該術(shù)語明確地包括任何哺乳動物物種。根據(jù)本發(fā)明進(jìn)行治療的腫瘤病癥可以是良性的或惡性的;實體瘤或其他血液腫瘤;并且可以選自：腎上腺腫瘤、AIDS相關(guān)癌癥、肺泡軟部肉瘤、星形細(xì)胞瘤、自主神經(jīng)節(jié)瘤、膀胱癌(鱗狀細(xì)胞癌和移行細(xì)胞癌)、囊胚性病癥、骨癌(釉質(zhì)細(xì)胞瘤、動脈瘤骨囊腫、骨軟骨瘤、骨肉瘤)、腦和脊髓癌、轉(zhuǎn)移性腦腫瘤、乳腺癌、頸動脈體腫瘤、子宮頸癌、軟骨肉瘤、脊索瘤、色細(xì)胞腎細(xì)胞癌、透明細(xì)胞癌、結(jié)腸癌、結(jié)腸直腸癌、皮膚良性纖維組織細(xì)胞瘤、促結(jié)締組織增生性小圓形細(xì)胞腫瘤、室管膜瘤、上皮病癥、尤因氏腫瘤、骨骼外骨髓樣軟骨肉瘤、纖維發(fā)生不全骨癥、骨骼的纖維性發(fā)育異常、膽囊和膽管癌、胃癌、胃腸癌、妊娠滋養(yǎng)層細(xì)胞疾病、胚細(xì)胞瘤、腺病癥、頭頸癌、下丘腦癌、腸癌、胰島細(xì)胞瘤、卡波西肉瘤、腎癌(腎母細(xì)胞瘤、乳頭狀腎細(xì)胞癌)、白血病、脂肪瘤/良性脂肪瘤、脂肉瘤/惡性脂肪瘤、肝癌(肝母細(xì)胞瘤、肝細(xì)胞癌)、淋巴瘤、肺癌(小細(xì)胞癌、腺癌、鱗狀細(xì)胞癌、大細(xì)胞癌等)、巨噬細(xì)胞疾病、成神經(jīng)管細(xì)胞瘤、黑色素瘤、腦膜瘤、多發(fā)性內(nèi)分泌瘤、多發(fā)性骨髓瘤、骨髓增生異常綜合征、神經(jīng)母細(xì)胞瘤、神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤、卵巢癌、胰腺癌、乳頭狀甲狀腺癌、甲狀旁腺腫瘤、兒科癌癥、外周神經(jīng)鞘瘤、嗜鉻細(xì)胞瘤、垂體腫瘤、前列腺癌、后色素層黑素瘤、罕見血液系統(tǒng)疾病、腎轉(zhuǎn)移癌、橫紋肌瘤、橫紋肌肉瘤、肉瘤、皮膚癌、軟組織肉瘤、鱗狀細(xì)胞癌、胃癌、間質(zhì)疾病、滑膜肉瘤、睪丸癌、胸腺癌、胸腺瘤、甲狀腺轉(zhuǎn)移癌和子宮癌(子宮頸癌、子宮內(nèi)膜癌和平滑肌瘤)。在其他優(yōu)選的實施方案中，所公開的抗體和ADC在治療肺癌方面特別有效，所述肺癌包括以下亞型：小細(xì)胞肺癌和非小細(xì)胞肺癌(例如鱗狀細(xì)胞非小細(xì)胞肺癌或鱗狀細(xì)胞小細(xì)胞肺癌)。在選擇的實施方案中，可以將抗體和ADC施用于表現(xiàn)出有限分期疾病或廣泛分期疾病的患者。在其它優(yōu)選的實施方案中，將公開的綴合抗體施用于難治性患者(即，在初始治療過程中或完成不久后疾病復(fù)發(fā)的那些患者)；敏感性患者(即在初次治療后復(fù)發(fā)超過2-3個月的患者)；或患者顯示對基于鉑的藥劑(例如卡鉑、順鉑、奧沙利鉑)和/或紫杉烷(例如多西他賽、紫杉醇、拉羅他賽或卡巴他賽)有抗性的患者。在其它特別優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的ADC可以用于治療結(jié)腸直腸癌。如本文所用，術(shù)語“結(jié)腸直腸癌”意在包括公知的醫(yī)學(xué)定義，其將結(jié)腸直腸癌定義為特征在于小腸下方腸道(即大腸(結(jié)腸)，包括盲腸、升結(jié)腸、橫結(jié)腸、降結(jié)腸、乙狀結(jié)腸和直腸)細(xì)胞的癌癥的醫(yī)學(xué)病癥。此外，如本文所使用的，術(shù)語“結(jié)腸直腸癌”意在進(jìn)一步包括以十二指腸和小腸(空腸和回腸)的細(xì)胞的癌癥為特征的醫(yī)學(xué)病癥。本文使用的結(jié)腸直腸癌的定義比常規(guī)醫(yī)學(xué)定義更廣泛，但是如此提供是由于十二指腸和小腸的細(xì)胞也可以適用于本發(fā)明的方法。此外，本發(fā)明的化合物可用于治療I期結(jié)腸直腸癌、II期結(jié)腸直腸癌、III期結(jié)腸直腸癌或IV期結(jié)腸直腸癌。本發(fā)明還提供了預(yù)防性治療患有良性或癌前期腫瘤的受試者。沒有特定類型的腫瘤或增殖性疾病被排除在使用本發(fā)明的抗體的治療之外。IX.制品本發(fā)明包括包含一個或多個容器的藥物包裝和試劑盒，其中容器可包含一個或多個劑量的本發(fā)明的抗體或ADC。在某些實施方案中，包裝或試劑盒含有單位劑量，意指預(yù)定量的包含例如本發(fā)明的抗體或ADC的組合物，其含有或不含一種或多種另外的試劑，以及任選的一種或多種抗癌劑。本發(fā)明的試劑盒通常在合適的容器中含有本發(fā)明的抗體或ADC的藥學(xué)上可接受的制劑，以及任選的在相同或不同容器中的一種或多種抗癌劑。試劑盒還可以包含用于診斷或組合療法的其它藥學(xué)上可接受的制劑或裝置。診斷裝置或儀器的實例包括可用于檢測、監(jiān)測、量化或分析與增殖性疾病相關(guān)的細(xì)胞或標(biāo)記志物的那些(關(guān)于這些標(biāo)記物的完整列表，參見上文)。在特別優(yōu)選的實施方案中，所述裝置可用于在體內(nèi)或體外檢測、監(jiān)測和/或定量循環(huán)腫瘤細(xì)胞(參見例如WO2012/0128801)。在其他優(yōu)選實施方案中，循環(huán)腫瘤細(xì)胞可以包含致瘤細(xì)胞。本發(fā)明考慮的試劑盒還可以包含合適的試劑以將本發(fā)明的抗體或ADC與抗癌劑或診斷劑組合(例如，參見美國專利7,422,739)。當(dāng)試劑盒的組分以一種或多種液體溶液提供時，液體溶液可以是非水性的，然而，優(yōu)選水溶液，特別優(yōu)選無菌水溶液。試劑盒中的制劑還可以作為干燥粉末或凍干形式提供，其可以在加入適當(dāng)?shù)囊后w后重構(gòu)。用于重構(gòu)的液體可以包含在單獨(dú)的容器中。這樣的液體可以包括無菌的、藥學(xué)上可接受的緩沖液或其它稀釋劑，例如注射用抑菌水、磷酸緩沖鹽水、林格氏溶液或葡萄糖溶液。當(dāng)試劑盒包含本發(fā)明的抗體或ADC與其它治療劑或試劑的組合時，可以以摩爾當(dāng)量組合或以超過其它組分的一種組分預(yù)混合溶液。或者，本發(fā)明的抗體或ADC和任何任選的抗癌劑或其它試劑可以在施用于患者之前分別保持在不同的容器中。試劑盒可以包括一個或多個容器和在容器中、上或與容器相關(guān)聯(lián)的標(biāo)簽或包裝說明書，指示所包裝的組合物用于診斷或治療所選擇的疾病狀況。合適的容器包括例如瓶、小瓶、注射器等。容器可以由各種材料例如玻璃或塑料形成。容器可包括無菌入口，例如，容器可以是靜脈內(nèi)溶液袋或具有可被皮下注射針刺穿的塞子的小瓶。在一些實施方案中，試劑盒可以含有向患者施用抗體和任何任選的組分的裝置，例如一個或多個針或注射器(預(yù)填充或空的)、滴眼器、移液管或其它類似裝置，從中可以將制劑注射或引入受試者或施用于身體的患病區(qū)域。本發(fā)明的試劑盒通常還將包括用于容納小瓶等的裝置和用于商業(yè)銷售的緊密限制的其它組分，例如吹塑成型的塑料容器，其中放置所需的小瓶和其它裝置并保留。X.其它方面除非本文另有定義，與本發(fā)明相關(guān)使用的科學(xué)和技術(shù)術(shù)語應(yīng)具有本領(lǐng)域普通技術(shù)人員通常理解的含義。此外，除非上下文另有要求，單數(shù)術(shù)語應(yīng)包括復(fù)數(shù)，復(fù)數(shù)術(shù)語應(yīng)包括單數(shù)。另外，說明書和所附權(quán)利要求中提供的范圍包括端點和端點之間的所有點。因此，2.0到3.0的范圍包括2.0、3.0，和在2.0和3.0之間的所有點。通常，本文所述的細(xì)胞和組織培養(yǎng)、分子生物學(xué)、免疫學(xué)、微生物學(xué)、遺傳學(xué)和化學(xué)的技術(shù)是本領(lǐng)域公知和常用的。本文中使用的與這些技術(shù)相關(guān)的命名法也是本領(lǐng)域常用的。本發(fā)明的方法和技術(shù)通常根據(jù)本領(lǐng)域公知的和如在本說明書中引用的各種參考文獻(xiàn)中描述的常規(guī)方法進(jìn)行，除非另有說明。XI.參考文獻(xiàn)本文引用的所有專利、專利申請和出版物以及電子可獲得材料(包括例如GenBank和RefSeq中的核苷酸序列提交，以及例如SwissProt、PIR、PRF和來自GenBank和RefSeq中的注釋編碼區(qū)的翻譯中的氨基酸序列提交)的完整公開內(nèi)容通過引用并入，不管短語“通過引用并入”是否與具體的參考文獻(xiàn)相關(guān)使用。前述詳細(xì)描述和以下實施例僅是為了清楚理解而給出的。從中應(yīng)理解無不必要的限制。本發(fā)明不限于所示出和描述的確切細(xì)節(jié)。對于本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見的變化包括在由權(quán)利要求限定的本發(fā)明中。本文使用的任何章節(jié)標(biāo)題僅用于組織目的，并且不應(yīng)被解釋為限制所描述的主題。XII.XV.序列表概述本申請附加的是包含許多核酸和氨基酸序列的序列表。下表3提供了所包括的序列的概述。表3SEQIDNO.描述1κ輕鏈恒定區(qū)蛋白2IgG1重鏈恒定區(qū)蛋白3RNF43的ECD的氨基酸序列4ZNRF3的ECD的氨基酸序列5全長RNF43的氨基酸序列6全長ZNRF3的氨基酸序列7-20省略21SC37.1VLDNA22SC37.1VL蛋白23SC37.1VHDNA24SC37.1VH蛋白25-252另外的鼠克隆253-270人源化克隆271-281人源化克隆的全長蛋白序列282、283、284hSC37.2CDRL1、CDRL2、CDRL3285、286、287hSC37.2CDRH1、CDRH2、CDRH3288、289、290hSC37.17CDRL1、CDRL2、CDRL3291、292、293hSC37.17CDRH1、CDRH2、CDRH3294、295、296hSC37.39CDRL1、CDRL2、CDRL3297、298、299hSC37.39CDRH1、CDRH2、CDRH3300、301、302hSC37.67CDRL1、CDRL2、CDRL3303、304、305hSC37.67CDRH1、CDRH2、CDRH3306hSC37.67v1CDRL3注意，衍生自人源化抗體hSC37.67的變體hSC37.67v1僅與hSC37.67在其輕鏈可變區(qū)的CDRL3中的單個氨基酸不同。hSC37.67和hSC37.67v1的重鏈?zhǔn)窍嗤摹Ｏ旅娴膶嵤├?0更詳細(xì)地描述了這些抗體的產(chǎn)生。XII.實施例通過參考以下實施例，將更容易地理解如上一般性所述的本發(fā)明，所述實施例通過舉例說明的方式提供并且不旨在限制本發(fā)明。這些實施例不旨在表示以下實驗是所進(jìn)行的全部或唯一的實驗。除非另有說明，份數(shù)是重量份，分子量是重均分子量，溫度是攝氏度，壓力是大氣壓或接近大氣壓。PDX腫瘤細(xì)胞類型由縮寫表示，其后是表示特定腫瘤細(xì)胞系的數(shù)字。測試樣品的傳代數(shù)由附加到樣品名稱的p0-p＃表示，其中p0表示直接從患者腫瘤獲得的未傳代樣品，p＃表示試驗前腫瘤通過小鼠已經(jīng)傳代的次數(shù)。如本文所用，腫瘤類型和亞型的縮寫如下表4所示：表4實施例1使用全轉(zhuǎn)錄組測序來鑒定RNF43表達(dá)為了表征實體腫瘤當(dāng)存在于癌癥患者中時的細(xì)胞異質(zhì)性并鑒定臨床相關(guān)的治療靶標(biāo)，使用本領(lǐng)域公知的技術(shù)開發(fā)和維持大的PDX腫瘤庫。包含大量離散的腫瘤細(xì)胞系的PDX腫瘤庫在免疫受損的小鼠中通過多次傳代最初從患有多種實體瘤惡性腫瘤的癌癥患者獲得的腫瘤細(xì)胞進(jìn)行增殖。低傳代PDX腫瘤代表了其天然環(huán)境中的腫瘤，提供了驅(qū)動腫瘤生長和對當(dāng)前療法的抗性的潛在機(jī)制的臨床相關(guān)洞察。腫瘤細(xì)胞可以廣泛分為兩種類型的細(xì)胞亞群：非致瘤細(xì)胞(NTG)和腫瘤起始細(xì)胞(TIC)。當(dāng)植入免疫受損小鼠中時，TIC具有形成腫瘤的能力。癌癥干細(xì)胞(CSC)是腫瘤起始細(xì)胞的子集，并且能夠無限地自我復(fù)制，同時保持多譜系分化的能力。腫瘤祖細(xì)胞(TProg)也是TIC的子集，并且類似于CSC，具有在原代移植物中刺激腫瘤生長的能力。然而，與CSC不同，它們不能重現(xiàn)親本腫瘤的細(xì)胞異質(zhì)性，并且在隨后的移植中重新開始腫瘤發(fā)生時效率較低，這是因為TProg通常僅能夠進(jìn)行有限次數(shù)的細(xì)胞分裂。為了進(jìn)行全轉(zhuǎn)錄組分析，來自腫瘤庫的PDX腫瘤在它們達(dá)到800-2,000mm3后從小鼠切除。使用本領(lǐng)域公知的酶消化技術(shù)將切除的PDX腫瘤解離成單細(xì)胞懸浮液(參見例如美國專利2007/0292414)。將解離的大塊腫瘤細(xì)胞與4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)一起孵育以檢測死細(xì)胞，與抗小鼠CD45和H-2Kd抗體一起孵育以鑒定小鼠細(xì)胞，和與抗人EPCAM抗體一起孵育以鑒定人類細(xì)胞。此外，將腫瘤細(xì)胞與熒光綴合的抗人CD46和/或CD324抗體孵育，并且在一些情況下與CD66c孵育，以鑒定CD46+CD324+CSC和CD46-CD324-NTG，然后使用FACSAria細(xì)胞分選儀(BDBiosciences)分選(參見USPN2013/0260385、2013/0061340和2013/0061342)。在CR4的情況下，TProg群被鑒定為CD46+/CD324+/CD66c+，而CSC群被鑒定為CD46+/CD324+/CD66c-。通過在補(bǔ)充有1%2-巰基乙醇的RLTplusRNA裂解緩沖液(Qiagen)中裂解細(xì)胞，在-80℃下冷凍裂解物，然后使用RNeasy分離試劑盒(Qiagen)解凍裂解物用于RNA提取，從腫瘤細(xì)胞或正常組織提取RNA。使用Nanodrop分光光度計(ThermoScientific)和/或Bioanalyzer2100(AgilentTechnologies)對RNA進(jìn)行定量。通過基因測序和基因表達(dá)分析評估所得的總RNA制備物。使用兩種不同的系統(tǒng)進(jìn)行高質(zhì)量RNA的全轉(zhuǎn)錄組測序。使用AppliedBiosystems(ABI)Sequencing，通過OligoLigation/Detection(SOLiD)4.5或SOLiD5500xl下一代測序系統(tǒng)(LifeTechnologies)分析一些樣品。使用IlluminaHiSeq2000或2500下一代測序系統(tǒng)(Illumina)分析其他樣品。使用來自ABI的設(shè)計用于低輸入總RNA的修飾的全轉(zhuǎn)錄組方案或OvationRNA-SeqSystemV2TM(NuGENTechnologies)，從來自大塊腫瘤樣品的1ngRNA產(chǎn)生的cDNA進(jìn)行SOLiD全轉(zhuǎn)錄組分析。將得到的cDNA文庫片段化，并加入條形碼銜接頭，以允許在測序運(yùn)行期間合并來自不同樣品的片段文庫。由SOLiD平臺產(chǎn)生的數(shù)據(jù)映射到34,609個基因，如RefSeq版本47所注釋的，使用NCBI版本hg19.2的已公布的人類基因組，并提供了大多數(shù)樣品中RNA水平的可驗證測量。來自SOLiD平臺的測序數(shù)據(jù)名義上表示為使用映射到基因的外顯子區(qū)域的度量RPM(讀數(shù)/百萬)或RPKM(讀數(shù)/千堿基/百萬)的轉(zhuǎn)錄物表達(dá)值，使得基礎(chǔ)基因表達(dá)分析被歸一化并枚舉為RPM_轉(zhuǎn)錄物或RPKM_轉(zhuǎn)錄物。與所測試的所有正常細(xì)胞的平均值相比，RNF43mRNA在以下CRPDX腫瘤細(xì)胞系中升高：CR4、CR42和CR43(圖1A)。測試的正常組織是結(jié)腸、心臟、肝臟、肺、腎、胰腺和卵巢。與相同CRPDX細(xì)胞系中的NTG細(xì)胞相比，CSC中的RNF43mRNA也有較高的表達(dá)。此外，CR4PDX系包含也表達(dá)RNF43mRNA的TProg細(xì)胞亞群(圖1A)，觀察到其在CSC和NTG細(xì)胞中觀察到的水平的中間。使用從CR和LUPDX腫瘤細(xì)胞提取的5ng總RNA產(chǎn)生的cDNA進(jìn)行Illumina全轉(zhuǎn)錄組分析。將腫瘤細(xì)胞分選用于CSC和NTG細(xì)胞群，并如針對SOLiD全轉(zhuǎn)錄組分析所述提取RNA。使用TruSeqRNA樣品制備試劑盒v2(Illumina)產(chǎn)生文庫。將所得cDNA文庫片段化并加條形碼。來自Illumina平臺的測序數(shù)據(jù)名義上表示為片段表達(dá)值，使用映射到基因的外顯子區(qū)域的度量FPM(片段/百萬)或FPKM(片段/千堿基/百萬)，使得基礎(chǔ)基因表達(dá)分析被歸一化并枚舉為FPM_轉(zhuǎn)錄物或FPKM_轉(zhuǎn)錄物。與NTG群相比，LU-SCC(LU128)、LU-Ad(LU123)和CRPDX腫瘤細(xì)胞系(CR16、CR43、CR67、CR78)的CSC腫瘤細(xì)胞亞群中RNF43mRNA的表達(dá)升高(圖1B)。與食管、氣管、胃、脾、皮膚、胰腺、肺、肝、腎、心臟和結(jié)腸中的相關(guān)正常組織相比，CSC中的RNF43mRNA表達(dá)也更高(圖1B)。在CR、LU-Ad和LU-SCC腫瘤中升高的RNF43mRNA表達(dá)的鑒定表明RNF43值得進(jìn)一步評價作為潛在的診斷和/或免疫治療靶標(biāo)。此外，與CR、LU-Ad和LU-SCC腫瘤中的NTG相比，CSC中RNF43的表達(dá)增加表明RNF43是這些腫瘤類型中致瘤細(xì)胞的良好標(biāo)記物。實施例2使用qRT-PCR表達(dá)腫瘤中的RNF43mRNA為了證實腫瘤細(xì)胞中RNF43的mRNA表達(dá)，使用FluidigmBioMarkTMHD系統(tǒng)根據(jù)工業(yè)標(biāo)準(zhǔn)方案對多種PDX細(xì)胞系進(jìn)行qRT-PCR。如實施例1所述從大量和分選的PDX腫瘤細(xì)胞中提取RNA。使用HighCapacitycDNAArchive試劑盒(LifeTechnologies)根據(jù)制造商的說明書將1ngRNA轉(zhuǎn)化為cDNA。使用RNF43特異性Taqman測定法預(yù)擴(kuò)增的cDNA材料然后用于隨后的qRT-PCR實驗。在正常組織(脂肪、腦、黑素細(xì)胞、PBMC和分選的B、單核、NK和T細(xì)胞，正常骨髓、唾液腺、睪丸、胸腺、甲狀腺、腎上腺、動脈、靜脈、結(jié)腸、背根神經(jīng)節(jié)、食管、心臟、腎臟、肝臟、肺、胰腺、骨骼肌、皮膚、小腸、脾、胃、氣管和血管平滑肌細(xì)胞)中的RNF43的表達(dá)低于以下PDX腫瘤細(xì)胞系的亞群中的表達(dá)：BR、CR、EM、GA、LU-Ad、LU-SCC、PA和OV(圖2A)。此外，如上所述，對如實施例1中所述已經(jīng)針對CSC和NTG細(xì)胞分選的CR、GA、LU和PAPDX腫瘤細(xì)胞系進(jìn)行qRT-PCR分析。被測試的CR(CR91、CR67、CR2)、GA(GA9)、LU-SCC(LU22)和PA(PA33、PA55)PDX系與NTG相比表現(xiàn)出在CSC中增加的mRNA表達(dá)，證實了實施例1中的發(fā)現(xiàn)，即RNF43是致瘤性癌細(xì)胞的良好的生物標(biāo)記物(圖2B)?？傊?，這些數(shù)據(jù)表明，RNF43在許多腫瘤中表達(dá)，并且可能是在這些適應(yīng)癥中基于抗體的治療劑的開發(fā)的良好靶標(biāo)。實施例3使用微陣列測定腫瘤中RNF43mRNA的表達(dá)使用微陣列分析確定RNF43表達(dá)，以確認(rèn)通過qRT-PCR和全轉(zhuǎn)錄組分析獲得的結(jié)果?；旧先鐚嵤├?中所述，從包含多種癌癥類型的PDX細(xì)胞系得到1-2微克全腫瘤總RNA。使用AgilentSurePrintGEHuman8x60v2微陣列平臺分析樣品，其包含針對人類基因組中27,958個基因和7,419個lncRNA設(shè)計的50,599個生物探針。使用標(biāo)準(zhǔn)工業(yè)實踐來標(biāo)準(zhǔn)化和轉(zhuǎn)化強(qiáng)度值以量化每個樣品的基因表達(dá)。將每個樣品中RNF43表達(dá)的歸一化強(qiáng)度繪制在圖3中，并且每個腫瘤類型得到的幾何平均值由水平條指示。圖3顯示與CR中的正常組織(胃、脾、皮膚、PBMC、胰腺、卵巢、肺、肝、腎、心、結(jié)腸和乳腺)以及EM、GA、KDY、LU-Ad、LU-SCC、PA和OV的子集相比，RNF43mRNA表達(dá)升高。在各種PDX腫瘤細(xì)胞系中觀察到升高的RNF43表達(dá)證實了實施例1和2的結(jié)果。這些發(fā)現(xiàn)進(jìn)一步支持了所觀察到的RNF43表達(dá)水平與腫瘤細(xì)胞之間的關(guān)聯(lián)，特別是在CR中，以及GA、LU-Ad、LU-SCC、OV和PA腫瘤中。實施例4在使用癌癥基因組圖譜得到的腫瘤中的RNF43表達(dá)使用稱為癌癥基因組圖譜(TCGA)的原代腫瘤和正常樣品的大的可公開獲得的數(shù)據(jù)集來證實RNF43mRNA在各種腫瘤中的過表達(dá)。來自IlluminaHiSeq_RNASeqV2平臺和IlluminaHiSeq_RNASeq平臺的RNF43表達(dá)數(shù)據(jù)下載自TCGA數(shù)據(jù)門戶(https://tcga-data.nci.nih.gov/tcga/tcgaDownload.jsp)，并被解析以聚集來自各基因的個體外顯子的讀數(shù)，以產(chǎn)生每百萬映射讀數(shù)的每千堿基外顯子的單個讀數(shù)值(RPKM)。圖4顯示，相對于在TCGA數(shù)據(jù)庫中發(fā)現(xiàn)的正常組織，RNF43在原代LU-Ad、LU-SCC、CR、GA以及PR腫瘤中的表達(dá)升高。這些數(shù)據(jù)證實了實施例1-3中的結(jié)果，這意味著存在高于正常組織的良好的治療指數(shù)，因此抗RNF43抗體和ADC可以是用于治療這些腫瘤的有用的治療劑。實施例5重組RNF43蛋白的克隆和表達(dá)以及過表達(dá)細(xì)胞表面RNF43蛋白的細(xì)胞系的工程改造編碼人RNF43蛋白的DNA片段為了產(chǎn)生屬于人RNF43(hRNF43)蛋白(GenBank登錄號NP_060233)的所有細(xì)胞材料，購買了編碼全長hRNF43開放閱讀框的cDNA克隆(RC214013;Origene)。該cDNA克隆用于表達(dá)成熟hRNF43蛋白或其片段的構(gòu)建體的所有后續(xù)工程改造。為了產(chǎn)生編碼hRNF43蛋白的慢病毒載體質(zhì)粒，使用PCR從上述模板擴(kuò)增hRNF43開放閱讀框，將所得PCR產(chǎn)物亞克隆到慢病毒表達(dá)載體pCDH-EF1-MCS-T2A-GFP(SystemBiosciences)的多克隆位點(MCS)中，其已經(jīng)被預(yù)先修飾以引入編碼Igκ信號肽及隨后的MCS上游的DDDK表位標(biāo)簽的核苷酸序列。MCS下游的T2A序列促進(jìn)肽鍵縮合的核糖體跳躍，導(dǎo)致兩種獨(dú)立蛋白的表達(dá)：在T2A肽上游編碼的DDDK標(biāo)記的細(xì)胞表面蛋白的高水平表達(dá)，與在T2A肽的下游編碼的GFP標(biāo)記蛋白的共表達(dá)。該克隆步驟產(chǎn)生慢病毒載體質(zhì)粒pL120-hRNF43-NFlag。編碼大鼠和食蟹猴RNF43蛋白的DNA片段為了產(chǎn)生本發(fā)明涉及大鼠RNF43蛋白(rRNF43)所需的所有分子和細(xì)胞材料，設(shè)計了編碼與大鼠RefSeqRNF43蛋白(GenBank登錄號NP_001129393)相同的蛋白的合成cDNA克隆，并購自GeneWiz。為了產(chǎn)生本發(fā)明涉及食蟹猴(Macacafascicularis)RNF43蛋白(cRNF43)所需的所有分子和細(xì)胞材料，首先如下推斷了cRNF43開放閱讀框序列：在NCBI中對編碼hRNF43蛋白的DNA序列與食蟹猴全基因組鳥槍重疊群序列數(shù)據(jù)庫進(jìn)行BLAST分析，觀察到外顯子/內(nèi)含子邊界在人和食蟹猴基因之間是保守的，并且組裝編碼cRNF43的推定的食蟹猴開放閱讀框。結(jié)果分析表明hRNF43和cRNF43蛋白是96.2%相同的。設(shè)計了編碼該預(yù)測的cRNF43蛋白的合成DNA克隆并購自GeneWiz。大鼠和食蟹猴DNA克隆用作各種PCR反應(yīng)的模板，以產(chǎn)生rRNF43或cRNF43ECD和組氨酸標(biāo)簽或人IgG2Fc標(biāo)簽的嵌合融合基因。簡言之，通過PCR擴(kuò)增通過數(shù)據(jù)庫注釋或通過與hRNF43蛋白的序列比對推導(dǎo)的編碼rRNF43或cRNF43的預(yù)測ECD結(jié)構(gòu)域的DNA。使用標(biāo)準(zhǔn)分子技術(shù)將這些PCR產(chǎn)物亞克隆入CMV驅(qū)動的表達(dá)載體的框內(nèi)，并在Igκ信號肽序列的下游和組氨酸標(biāo)簽或人IgG2FccDNA的上游。這些CMV驅(qū)動的表達(dá)載體允許在HEK293T細(xì)胞中的高水平瞬時表達(dá)。使用聚乙烯亞胺聚合物作為轉(zhuǎn)染試劑，用這些表達(dá)構(gòu)建體轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞的懸浮或貼壁培養(yǎng)物。轉(zhuǎn)染后3至5天，使用AKTA探測器和鎳-EDTA(Qiagen)或MabSelectSuReTMProteinA(GEHealthcareLifeSciences)柱，分別從澄清的細(xì)胞上清液中純化重組His-標(biāo)記的或Fc-標(biāo)記的蛋白質(zhì)。細(xì)胞系工程改造使用如上所述的pL120-hRNF43-NFlag慢病毒載體構(gòu)建過表達(dá)hRNF43蛋白的工程改造細(xì)胞系，以使用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的標(biāo)準(zhǔn)慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)技術(shù)轉(zhuǎn)導(dǎo)HEK293T細(xì)胞系。使用高表達(dá)的HEK293T亞克隆(例如，對GFP和DDDK表位標(biāo)簽都是強(qiáng)陽性的細(xì)胞)的FACS選擇表達(dá)hRNF43的細(xì)胞。實施例6抗RNF43抗體的產(chǎn)生如下在兩種不同的免疫中產(chǎn)生抗RNF43鼠抗體。在第一種免疫中，用在TiterMax和CpG佐劑中乳化的10微克重組人RNF43-Fc蛋白(rhRNF43-Fc，R＆DSystems;＃7964-RN)，經(jīng)足墊接種一只雌性Balb/c小鼠。在初始接種后，用在明礬、PBS和CpG中乳化的5微克rhRNF43-Fc蛋白注射小鼠七次(每周兩次)。最終接種包含PBS中的5微克rhRNF43-Fc蛋白。在第二種免疫中，用10微克hRNF43-His蛋白(Sino)每周兩次免疫六只小鼠(下列品系各兩只：BALB/c、CD-1、FVB)，持續(xù)4周，接著兩周后的最后一次接種。處死小鼠，解剖引流淋巴結(jié)(腿彎部、腹股溝和髂中間)并用作抗體產(chǎn)生細(xì)胞的來源。將B細(xì)胞的單細(xì)胞懸浮液(60×106個細(xì)胞)與非分泌性P3x63Ag8.653骨髓瘤細(xì)胞(ATCC＃CRL-1580)以1：1的比例使用型號BTXHybrimmune系統(tǒng)(BTXHarvardApparatus)通過電細(xì)胞融合進(jìn)行融合。將細(xì)胞重懸浮于雜交瘤選擇培養(yǎng)基中，所述雜交瘤選擇培養(yǎng)基由補(bǔ)充有重氮絲氨酸、15%胎兒克隆I血清、10%BMcondimed、1mM非必需氨基酸、1mMHEPES、100IU青霉素-鏈霉素和50微摩爾2-巰基乙醇的DMEM培養(yǎng)基組成，并在T225燒瓶中在100mL選擇培養(yǎng)基中培養(yǎng)。將燒瓶置于含有5%CO2和95%空氣的濕潤的37℃培養(yǎng)箱中6天。在融合后第6天，從燒瓶收集雜交瘤文庫細(xì)胞，并將文庫儲存在液氮中。將冷凍的小瓶解凍到T75燒瓶中，第二天將雜交瘤細(xì)胞以在90微升補(bǔ)充的雜交瘤選擇培養(yǎng)基(如上所述)中每孔一個細(xì)胞(使用FACSAriaI細(xì)胞分選儀)鋪板到12個Falcon384孔板。將雜交瘤培養(yǎng)10天，并使用如下進(jìn)行的流式細(xì)胞術(shù)篩選上清液中hRNF43特異性的抗體。用25微升雜交瘤上清液，將每孔1×105個用hRNF43穩(wěn)定轉(zhuǎn)導(dǎo)的HEK293T細(xì)胞孵育30分鐘。用PBS/2%FCS洗滌細(xì)胞，然后用每樣品25微升的DyeLight649標(biāo)記的山羊抗小鼠IgGFc片段特異性第二抗體孵育15分鐘，該抗體在PBS/2%FCS中1:300稀釋。用PBS/2%FCS洗滌細(xì)胞兩次，并重懸浮于含有DAPI的PBS/2%FCS中，并通過流式細(xì)胞術(shù)分析超過用同種型對照抗體染色的細(xì)胞的熒光。剩余的未使用的雜交瘤文庫細(xì)胞在液氮中冷凍用于將來的文庫測試和篩選。實施例7抗RNF43抗體的特征在實施例6中產(chǎn)生的抗RNF43抗體根據(jù)(i)同種型、(ii)對RNF43的親和力和(iii)與ZNRF3的交叉反應(yīng)性進(jìn)行表征。此外，基于它們是否彼此競爭與人RNF43蛋白的結(jié)合，將抗體分組在箱中。使用Milliplex小鼠免疫球蛋白同種分型試劑盒(Millipore)根據(jù)制造商的方案確定代表性數(shù)目的抗體的同種型?；诟鶕?jù)本領(lǐng)域標(biāo)準(zhǔn)方法的序列分析，將那些沒有獲得明確信號的抗體命名為同種型。獨(dú)特的RNF43特異性抗體的同種分型分析的結(jié)果可見于圖5A。使用BIAcore2000(GEHealthcare)機(jī)器，使用表面等離子體共振確定選擇抗體對hRNF43蛋白的親和力。使用抗小鼠抗體捕獲試劑盒將小鼠抗RNF43抗體固定在CM5生物傳感器芯片上。在每個抗原注射周期之前，0.05-1微克/mL的濃度的鼠抗體捕獲在表面上，接觸時間為1分鐘，流速為5微升/min。從基線捕獲的抗體負(fù)荷為80-140個響應(yīng)單位。抗體捕獲后和1分鐘基線，在實施例5中產(chǎn)生的單體hRNF43-His抗原在10-200nM范圍內(nèi)的濃度下在表面上流動1.5分鐘的締合期，然后流速為10微升/min的5分鐘的解離期。除了使用抗人抗體捕獲試劑盒之外，使用類似的方案測量人源化抗體的結(jié)合親和力。通過從特異性抗體表面應(yīng)答減去對照非結(jié)合抗體表面應(yīng)答來處理數(shù)據(jù)，并將數(shù)據(jù)截短至締合和解離期。使用得到的應(yīng)答曲線擬合1:1Langmuir結(jié)合模型，并使用BiaEvaluation軟件3.1(GEHealthcare)使用計算的kon和koff動力學(xué)常數(shù)產(chǎn)生表觀親和力。所選擇的抗體顯示在納摩爾范圍內(nèi)的hRNF43親和力(圖5A)。使用MesoScaleDiscovery平臺進(jìn)行ELISA測定，以測試實施例6中產(chǎn)生的選擇的抗RNF43抗體結(jié)合ZNRF3(RNF43的功能同源物)的能力。盡管ZNRF3與RNF43功能上同源，但是總體上只有20%的序列同源性(圖5B)，因此不期望抗RNF43抗體與ZNRF3的交叉反應(yīng)性。用PBS中的0.5微克/mL的人ZNRF3或RNF43(兩者，R＆DSystems)包被平板，并在4℃孵育過夜。在用PBS，0.05%吐溫20(PBST)洗滌平板后，用35微升的3%(w/v)BSA的PBS溶液在室溫下封閉平板60分鐘。將板在PBST中洗滌，并將10微升的在PST，0.05%吐溫，1%BSA(w/v)(PBSTA)中稀釋的滴定的抗RNF43抗體(500ng/ml-0.032ng/ml)加入板中，并孵育60分鐘。用PBST洗滌后，在室溫下加入10微升/孔的在PBSTA中的0.5微克/ml的磺基標(biāo)簽標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG(MesoScaleDiscovery，＃R32AC-5)，持續(xù)30分鐘。MSDSULFO-TAGNHS-酯是胺反應(yīng)性的N-羥基琥珀酰亞胺酯，其在輕度堿性條件下容易與蛋白質(zhì)的伯胺基團(tuán)偶聯(lián)以形成穩(wěn)定的酰胺鍵。將板在PBST中洗滌，將具有表面活性劑的MSDRead緩沖液T在水中稀釋1倍，并向每個孔中加入35微升。板在MSDSectorImager2400上讀出。所有測試的抗體(例如SC37.2、SC37.4、SC37.8、SC37.10、SC37.17、SC37.28、SC37.39、SC37.226和SC37.236)結(jié)合RNF43，但顯示不與ZNRF3結(jié)合。此外，陰性對照、小鼠IgG1不結(jié)合任一蛋白質(zhì)。相比之下，與人FC融合或與鼠抗人FC抗體融合的RNF43或ZNRF3蛋白顯示與兩種蛋白質(zhì)的結(jié)合(陽性對照)。使用多重競爭免疫測定(Luminex)將抗體分組成箱。將濃度為10μg/mL的100μl的每種獨(dú)特的抗RNF43抗體(捕獲mAb)與已經(jīng)與抗小鼠κ抗體綴合的磁珠(Luminex)孵育1小時(Miller等，2011，PMID：21223970)。捕獲mAb/綴合的珠復(fù)合物用PBSTA緩沖液(含有0.05%Tween20的PBS中的1%BSA)洗滌，然后合并。除去殘余洗滌緩沖液后，將珠與2μg/mLhRNF43-His蛋白孵育1小時，洗滌，然后重懸于PBSTA中。將合并的珠混合物分配到96孔板中，每個孔含有獨(dú)特的抗RNF43抗體(檢測mAb)，并在振蕩下孵育1小時。洗滌步驟后，以5μg/ml的濃度向孔中加入與PE綴合的抗小鼠κ抗體(與上文所用相同)，并孵育1小時。再次洗滌珠并重懸于PBSTA中。使用LuminexMAGPIX儀器測量平均熒光強(qiáng)度(MFI)值。將抗體配對顯現(xiàn)為根據(jù)抗體對的Pearson相關(guān)系數(shù)計算的距離矩陣的樹狀圖?；跇錉顖D和抗體對的MFI值的分析確定框并。圖5A所示的結(jié)果證明了，篩選的示例性抗體可以分組成至少六個獨(dú)特的箱(A-F)，其中每個箱的成員彼此競爭與hRNF43蛋白的結(jié)合。實施例8抗RNF43抗體對WNT信號傳導(dǎo)的影響WNT途徑是調(diào)節(jié)細(xì)胞生長和分化的關(guān)鍵的發(fā)育和干細(xì)胞相關(guān)的信號途徑。在典型的WNT/β-連環(huán)蛋白信號傳導(dǎo)途徑(圖6A)中，WNT配體結(jié)合Frizzled(FZD)受體和LRP5/6共受體的復(fù)合物，引發(fā)信號傳導(dǎo)級聯(lián)，導(dǎo)致蛋白GSK3的抑制，其一個結(jié)果是在細(xì)胞質(zhì)中發(fā)現(xiàn)的通常不穩(wěn)定的β-連環(huán)蛋白的穩(wěn)定化。穩(wěn)定的β-連環(huán)蛋白然后能夠積累，進(jìn)入細(xì)胞核，并與TCF/LEF轉(zhuǎn)錄因子形成復(fù)合物，以激活含有這些轉(zhuǎn)錄激活物的結(jié)合位點的基因。典型的WNT途徑在受體-配體水平上廣泛調(diào)節(jié)，具有包含各種可溶性誘餌受體(例如，SFRP和FRZB)、結(jié)合WNT本身或調(diào)節(jié)其生物活性的因子(例如，WIF和NOTUM)或調(diào)節(jié)FZD受體周轉(zhuǎn)的因子(例如，RNF43，ZNRF3)的多個激活和抑制性反饋環(huán)，以及包含調(diào)節(jié)這些調(diào)節(jié)劑的蛋白質(zhì)(例如LGR和RSPO)的更精細(xì)的環(huán)。這些激動劑、拮抗劑和抗拮抗劑網(wǎng)絡(luò)一起能夠精確控制強(qiáng)力和多效信號傳導(dǎo)途徑的強(qiáng)度和持續(xù)時間。與本發(fā)明特別相關(guān)的是兩種拮抗劑和抗拮抗劑相互作用：第一，拮抗相互作用，其中RNF43通過其促進(jìn)FZD受體的內(nèi)吞作用的能力下調(diào)WNT介導(dǎo)的含有TCF/LEF結(jié)合位點的基因的激活，即減少WNT信號傳導(dǎo);第二，抗拮抗相互作用，其中R-spondin與RNF43的相互作用導(dǎo)致RNF43的膜清除，其促進(jìn)增加的FZD在細(xì)胞表面的駐留，從而上調(diào)或增加WNT信號傳導(dǎo)。使用ELISA測定來測試實施例6中產(chǎn)生的抗RNF43抗體阻斷RNF43與人R-spondin(RSPO)結(jié)合的能力。功能性阻斷R-spondin與RNF43相互作用的抗體在圖6A中表示為組II。用PBS中的0.25微克/mL的人RSPO3(R＆DSystems，＃3500RS/CF)(其是RSPO蛋白家族的代表性成員)包被平板，并在4℃孵育過夜。在用PBS，0.05%吐溫20(PBST)洗滌板之后，將它們用在PBS中的3%(w/v)BSA在37℃封閉90分鐘。在封閉過程中，將5ng/mlrhRNF43Fc(R＆DSystems;＃7964-RN)與或不與10微克/mL抗RNF43抗體在PBS中的1%(w/v)BSA+0.05%吐溫20(PBSA)中孵育60分鐘。將板在PBST中洗滌，將100微升抗體/蛋白質(zhì)混合物加入板中并孵育90分鐘。用PBST洗滌后，在室溫下加入50微升/孔在PBSA中1:2000稀釋的HRP標(biāo)記的山羊抗人IgG，持續(xù)1小時。洗滌平板，并通過加入100微升/孔的TMB底物溶液(ThermoScientific)在室溫下顯色5分鐘。加入等體積的1MH2SO4以停止底物顯色。然后通過分光光度計在OD450下分析樣品。示例性RNF43特異性抗體的結(jié)果可以以圖5A中的表格形式看到?？梢钥闯?，在該測定中，抗體可以觀察到大范圍的阻斷活性。為了確定本發(fā)明的抗RNF43抗體是否調(diào)節(jié)典型的WNT信號傳導(dǎo)途徑，在抗體功能的各種研究中使用含有用于激活典型WNT信號傳導(dǎo)途徑的報告基因的穩(wěn)定細(xì)胞群。通過用慢病毒載體pGreenFire1-TCF(SystemBiosciences)轉(zhuǎn)導(dǎo)HEK293T細(xì)胞產(chǎn)生這些稱為293.TCF細(xì)胞的細(xì)胞，所述載體在連接到四個串聯(lián)重復(fù)的TCF家族的轉(zhuǎn)錄因子的轉(zhuǎn)錄應(yīng)答元件(例如，WRE)的最小CMV報告基因的控制下編碼雙功能GFP和螢光素酶報告盒。因此，這些細(xì)胞中經(jīng)典WNT信號傳導(dǎo)途徑的激活將導(dǎo)致β-連環(huán)蛋白在與TCF/LEF轉(zhuǎn)錄因子的復(fù)合物中的穩(wěn)定化，導(dǎo)致螢光素酶報告基因的激活，隨后在加入合適的螢光素酶底物和輔因子后產(chǎn)生發(fā)光。將293.TCF細(xì)胞如下用于WNT3A典型信號傳導(dǎo)測定：將2.5×104個293.TCF細(xì)胞接種在96孔組織培養(yǎng)板的每個孔中的50μL無血清DMEM培養(yǎng)基中。24小時血清饑餓后，將25μL來自L/WNT3A細(xì)胞(ATCCCRL-2647;Willert，2003)的各種稀釋度的條件培養(yǎng)基(CM)或來自親本L細(xì)胞(ATCCCRL-2648)的未稀釋CM以及25μLDMEM+0.2%FBS加入到每個孔中。加入CM后18小時，向每個孔中加入100μLOne-Glo溶液(ProMegaCorp)。然后將每個孔的內(nèi)容物充分混合以裂解細(xì)胞，將100μL裂解物轉(zhuǎn)移到黑色96孔板中，并在5分鐘后使用WallacVictor3Multilabel計數(shù)器(Perkin-ElmerCorp)讀取每個孔中的發(fā)光。暴露于不同濃度的含有WNT3A的CM的細(xì)胞通常顯示相對于暴露于L-細(xì)胞對照CM的細(xì)胞的2至6倍的螢光素酶信號誘導(dǎo)(圖6B中所示的代表性數(shù)據(jù))。此外，293.TCF細(xì)胞在下述處理之后如預(yù)期的那樣反應(yīng)：(1)將WNT3A+CM培養(yǎng)基從25%稀釋至3%，這導(dǎo)致WNT報告基因激活的減少和發(fā)光的減少，或(2)用20mmLiCl(已知非常有效地抑制GSK3并因此激活典型的WNT信號傳導(dǎo)應(yīng)答基因的化學(xué)物質(zhì))處理，其表明相對于用L細(xì)胞對照CM處理，發(fā)光增加12倍(數(shù)據(jù)未顯示)。通過使用上文實施例5中所述的pL120-hRNF43-NFlag慢病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)293.TCF細(xì)胞，進(jìn)一步修飾293.TCF細(xì)胞以產(chǎn)生293.TCF.37細(xì)胞系。293.TCF.37細(xì)胞系過表達(dá)RNF43。然后用WNT3A+CM或?qū)φ誄M處理大量的293.TCF.37細(xì)胞群。如對于RNF43的生物學(xué)功能所預(yù)期的，相對于親本293.TCF細(xì)胞，阻斷了WNT3A活化的螢光素酶報告基因表達(dá)(圖6B)。用20mMLiCl處理293.TCF.37細(xì)胞能夠刺激螢光素酶報告基因表達(dá)高于對照CM所觀察到的(數(shù)據(jù)未顯示)。如下測定各種抗RNF43抗體調(diào)節(jié)WNT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)活性的能力。將在50μL無血清DMEM培養(yǎng)基中的2.5×104個293.TCF.37細(xì)胞鋪板在96孔組織培養(yǎng)板的每個孔中。24小時血清饑餓后，向細(xì)胞中加入5μg/ml的抗RNF43抗體(在WNT3A+CM中)。圖5A以表格形式顯示抗體處理后相對于單獨(dú)的WNT3A+CM的螢光素酶報告基因活性的倍數(shù)增加。本發(fā)明的一些抗體導(dǎo)致WNT3A介導(dǎo)的螢光素酶信號的升高(例如SC37.231，其導(dǎo)致螢光素酶信號的3倍增加)，而其它抗體減少WNT3A介導(dǎo)的螢光素酶信號(例如SC37.77，其導(dǎo)致螢光素酶信號的約2倍的減少)，而還有其它抗體不改變WNT3A介導(dǎo)的螢光素酶信號(例如SC37.170)?？傊?，這些數(shù)據(jù)表明獲得了具有不同功能效應(yīng)的多種抗RNF43抗體。實施例9抗RNF43抗體的測序如上所述產(chǎn)生抗RNF43抗體，然后測序。使用RNeasyMiniprep試劑盒(Qiagen)根據(jù)制造商的說明書從選擇的雜交瘤細(xì)胞純化總RNA。每個樣品使用104至105個細(xì)胞。通過在1%瓊脂糖凝膠中分離3微升來確定RNA制備物的質(zhì)量，然后在-80℃下儲存?zhèn)溆?。使用包含設(shè)計為靶向完整小鼠VH譜的三十二個小鼠特異性前導(dǎo)序列引物的5'引物混合物，與對所有小鼠Ig同種型特異的3'小鼠Cγ引物組合，擴(kuò)增每個雜交瘤的Ig重鏈的可變區(qū)。類似地，包含設(shè)計用于擴(kuò)增每個Vκ小鼠家族的32個5'Vκ前導(dǎo)序列的引物混合物與對小鼠κ恒定區(qū)特異的單個反向引物組合使用，以擴(kuò)增和測序κ輕鏈。使用QiagenOneStepRT-PCR試劑盒如下從100ng總RNA擴(kuò)增VH和VL轉(zhuǎn)錄物。對于每個雜交瘤，總共進(jìn)行8個RT-PCR反應(yīng)，4個用于Vκ輕鏈，4個用于Vγ重鏈。對于含有λ輕鏈的抗體，使用設(shè)計為在Vλ前導(dǎo)序列上引發(fā)的三個5'引物與對小鼠λ恒定區(qū)特異性的一個反向引物組合進(jìn)行擴(kuò)增。PCR反應(yīng)混合物包括3微升RNA、0.5微升100微摩爾重鏈或輕鏈引物(由IDT定制合成)、5微升5×RT-PCR緩沖液、1微升dNTP、1微升含有逆轉(zhuǎn)錄酶和DNA聚合酶的酶混合物和0.4微升核糖核酸酶抑制劑RNasin(1單位)。熱循環(huán)儀程序為：RT步驟50℃30分鐘，95℃15分鐘，隨后是30個循環(huán)(95℃30秒、48℃30秒、72℃1分鐘)。然后在72℃下最終孵育10分鐘。使用與上述用于擴(kuò)增可變區(qū)的相同的特異性可變區(qū)引物對提取的PCR產(chǎn)物進(jìn)行測序。為了制備用于直接DNA測序的PCR產(chǎn)物，使用QIAquickTMPCR純化試劑盒(Qiagen)根據(jù)制造商的方案純化它們。使用50微升無菌水從離心柱洗脫DNA，然后直接從兩條鏈測序。使用IMGT序列分析工具(http://www.imgt.org/IMGTmedical/sequence_analysis.html)分析核苷酸序列，以鑒定具有最高序列同源性的種系V、D和J基因成員。通過使用專有抗體序列數(shù)據(jù)庫將VH和VL基因與小鼠種系數(shù)據(jù)庫比對，將衍生的序列與IgV-區(qū)和J-區(qū)的已知種系DNA序列進(jìn)行比較。圖7A描述了來自抗RNF43抗體的許多新的鼠輕鏈可變區(qū)和衍生自代表性鼠抗RNF43抗體的可變輕鏈的示例性人源化輕鏈可變區(qū)的連續(xù)氨基酸序列。圖7B描述了來自相同抗RNF43抗體的新的鼠重鏈可變區(qū)和衍生自提供人源化輕鏈的相同鼠抗體的人源化重鏈可變區(qū)的連續(xù)氨基酸序列。獨(dú)特的鼠輕鏈和重鏈可變區(qū)氨基酸序列提供于SEQIDNO：22-252，偶數(shù)，而人源化輕鏈和重鏈可變區(qū)氨基酸序列提供于SEQIDNO：254-270，偶數(shù)?？傊?，圖7A和7B提供了許多獨(dú)特的鼠抗-RNF43抗體的帶注釋的序列。然而，產(chǎn)生了許多重復(fù)抗體，具有與圖7A和7B所列的獨(dú)特抗體相同的可變區(qū)輕鏈和可變區(qū)重鏈，并列在相關(guān)獨(dú)特抗體后的括號中。所述抗體稱為：SC37.1、SC37.2、SC37.3、SC37.4、SC37.6、SC37.7、SC37.8、SC37.9(與SC37.59和SC37.69相同)、SC37.10、SC37.11、SC37.12、SC37.13、SC37.15、SC37.16、SC37.17、SC37.19(與SC37.33、SC37.35、SC37.52、SC37.55、SC37.58和SC37.71相同)、SC37.20(與SC37.30、SC37.34、SC37.36、SC37.38、SC37.50、SC37.60和SC37.66相同)、SC37.21(與SC37.53、SC37.54和SC37.68相同)、SC37.22、SC37.23、SC37.28(與SC37.32相同)、SC37.29、SC37.37(與SC37.78相同)、SC37.39、SC37.40、SC37.41、SC37.44(與SC37.46相同)、SC37.45(與SC37.67相同)、SC37.47(與SC37.57相同)、SC37.48、SC37.51、SC37.72、SC37.75、SC37.77、SC37.108、SC37.122、SC37.127、SC37.136(與SC37.208相同)、SC37.141、SC37.150、SC37.160、SC37.163、SC37.169、SC37.170、SC37.177、SC37.185、SC37.191、SC37.193、SC37.196、SC37.202、SC37.212、SC37.223、SC37.226、SC37.231、SC37.233、SC37.236、SC37.239、SC37.243和SC37.244；和人源化抗體，稱為hSC37.2、hSC37.17、hSC37.39、hSC37.67和hSC37.67v1。除了前面段落中相關(guān)抗體后的括號中所示的具有相同的輕鏈和重鏈可變區(qū)的抗體之外，還有許多共享相同的輕鏈可變區(qū)的抗體，如下：SC37.17(與SC37.21、SC37.53、SC37.54、SC37.68相同的輕鏈)、SC37.23(與SC37.28和SC37.32相同的輕鏈)、SC37.208(與SC37.217、SC37.232、SC37.136和SC37.172相同的輕鏈)、SC37.122(與SC37.198相同的輕鏈)。此外，一些抗體共享相同重鏈可變區(qū)，如下：SC37.20(與SC37.30、SC37.34、SC37.36、SC37.38、SC37.50、SC37.60、SC37.66和SC37.74相同的重鏈)、SC37.23(與SC37.36相同的重鏈)、SC37.47(與SC37.57和SC37.75相同的重鏈)、SC37.122(與SC37.127相同的重鏈)、SC37.160(與SC37.198相同的重鏈)。值得注意的是，許多上述獨(dú)特的鼠抗體包含λ輕鏈。在圖7A和7B中僅給出了獨(dú)特的序列，即7A和7B不包含重復(fù)的序列。注釋氨基酸序列以鑒定根據(jù)Kabat定義的框架區(qū)(即FR1-FR4_)和互補(bǔ)決定區(qū)(即圖7A中的CDRL1-CDRL3或圖7B中的CDRH1-CDRH3)。使用專有版本的Abysis數(shù)據(jù)庫分析可變區(qū)序列，以提供CDR和FR指定。盡管CDR是根據(jù)Kabat定義的，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，相同的數(shù)據(jù)庫可以用于提供如Chothia或McCallum的CDR和FR指定。圖7C是顯示編碼圖7A和7B所示的重鏈和輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列的核酸序列的表。實施例10嵌合和人源化抗RNF43抗體的產(chǎn)生使用本領(lǐng)域公知的技術(shù)如下產(chǎn)生嵌合抗RNF43抗體。如實施例1所述從雜交瘤中提取總RNA，并進(jìn)行PCR擴(kuò)增。關(guān)于以下鼠抗體的VH和VL鏈的V、D和J基因區(qū)段的數(shù)據(jù)：SC37.2、SC37.17、SC37.39和SC37.67，獲自所述核酸序列的分析(對于核酸序列，參見圖7C)。使用以下限制性位點，設(shè)計抗體的VH和VL鏈的框架序列特異性引物組：VH片段的AgeI和XhoI，VL片段的XmaI和DraIII。PCR產(chǎn)物用QiaquickPCR純化試劑盒(Qiagen)純化，隨后用限制性酶AgeI和XhoI(對于VH片段)和XmaI和DraIII(對于VL片段)消化。純化VH和VL消化的PCR產(chǎn)物，并分別連接到IgH或Igκ表達(dá)載體中。用200UT4-DNA連接酶(NewEnglandBiolabs)、7.5微升消化和純化的基因特異性PCR產(chǎn)物和25ng線性化載體DNA在總體積為10微升中進(jìn)行連接反應(yīng)。在42℃下用3微升連接產(chǎn)物通過熱休克轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH10B細(xì)菌(LifeTechnologies)，并以100微克/mL的濃度鋪板在氨芐青霉素平板上。在純化和消化擴(kuò)增的連接產(chǎn)物后，將VH片段克隆到包含HuIgG1的pEE6.4表達(dá)載體(Lonza)的AgeI-XhoI限制性位點中，并將VL片段克隆到包含Hu-Kappa輕鏈恒定區(qū)的pEE12.4表達(dá)載體(Lonza)的XmaI-DraIII限制性位點。通過HEK293T細(xì)胞與pEE6.4HuIgG1和pEE12.4Hu-Kappa表達(dá)載體的共轉(zhuǎn)染來表達(dá)包含完整鼠重鏈和輕鏈可變區(qū)和人恒定區(qū)的嵌合抗體。在轉(zhuǎn)染前，將HEK293T細(xì)胞在標(biāo)準(zhǔn)條件下在補(bǔ)充有10%熱滅活的FCS、100微克/mL鏈霉素和100U/mL青霉素G的Dulbecco改良Eagle培養(yǎng)基(DMEM)中在150mm板中培養(yǎng)。為了瞬時轉(zhuǎn)染，將細(xì)胞生長至80%匯合。將12.5微克每種pEE6.4HuIgG1和pEE12.4Hu-Kappa載體DNA加入到在1.5mLOpti-MEM中的50微升HEK293T轉(zhuǎn)染試劑中。將混合物在室溫下孵育30分鐘并鋪板。轉(zhuǎn)染后3至6天收獲上清液。通過在800×g離心10分鐘從細(xì)胞碎片中澄清含有重組嵌合抗體的培養(yǎng)物上清液，并在4℃下儲存。用蛋白A珠純化重組嵌合抗體。使用專有的計算機(jī)輔助的CDR-移植方法(AbysisDatabase，UCLBusiness)和如下的標(biāo)準(zhǔn)分子工程技術(shù)，將鼠抗RNF43抗體進(jìn)行CDR移植或人源化。基于人種系抗體序列的框架序列和CDR典型結(jié)構(gòu)與相關(guān)小鼠抗體的框架序列和CDR之間的最高同源性，設(shè)計可變區(qū)的人框架區(qū)。為了分析的目的，將氨基酸指定到每個CDR結(jié)構(gòu)域根據(jù)Kabat等人編號進(jìn)行。在這方面，圖7E至7H顯示使用鼠抗體SC37.2、SC37.17、SC17.39和SC37.67的各種分析方案得到的重和輕CDR。一旦設(shè)計了包含鼠KabatCDR和選定的人框架的可變區(qū)，就從合成基因區(qū)段(IntegratedDNATechnologies)產(chǎn)生它們。然后使用上述用于嵌合抗體的分子方法克隆和表達(dá)人源化抗體。人源化抗體hSC37.2、hSC37.17、hSC17.39、hSC37.67和hSC37.67v1(圖7A和7B;SEQIDNO：254-270，偶數(shù))的VL和VH氨基酸序列衍生自相應(yīng)鼠抗體的VL和VH序列(例如hSC37.2源自SC37.2)。VL和VH的相應(yīng)核酸序列示于圖7C中(SEQIDNO：253-271，奇數(shù))。表5顯示需要非常少的框架改變以維持所選抗體的有利性質(zhì)。對于一個人源化克隆，將保守突變引入CDR中以解決穩(wěn)定性問題。在這點上，hSC37.67的輕鏈的CDRL3(N91Q)中的單個氨基酸改變導(dǎo)致hSC37.67變體1(hSC37.67v1)。對于每個人源化構(gòu)建體，檢查抗體的結(jié)合親和力以確保它們等同于相應(yīng)的嵌合抗體或鼠抗體。在上述選擇的抗體人源化后，分析所得的VH和VL鏈氨基酸序列，以確定它們與鼠供體和人受體輕鏈和重鏈可變區(qū)的同源性。如下表6所示的結(jié)果表明，人源化構(gòu)建體相對于人受體序列一致地顯示比鼠供體序列更高的同源性。與人源化抗體和供體雜交瘤蛋白序列的同源性77%-88%相比，鼠重鏈和輕鏈可變區(qū)顯示與最接近匹配的人種系基因的相似的總體百分比同源性82%-91%。表6mAb與人(CDR受體)的同源性與鼠親本(CDR供體)的同源性hSC37.2HC91%85%hSC37.2LC86%82%hSC37.17HC83%82%hSC37.17LC82%85%hSC37.39HC90%81%hSC37.39LC85%77%hSC37.67HC85%80%hSC37.67LC84%88%實施例11位點特異性抗RNP43抗體的產(chǎn)生構(gòu)建包含天然輕鏈(LC)恒定區(qū)和重鏈(HC)恒定區(qū)的工程改造人IgG1/κ抗RNF43位點特異性抗體，其中與LC中的半胱氨酸214(C214)形成鏈間二硫鍵的HC的上鉸鏈區(qū)中的半胱氨酸220(C220)被絲氨酸取代(C220S)。當(dāng)組裝時，HC和LC形成包含兩個游離半胱氨酸(在輕鏈上的位置214)的抗體，所述半胱氨酸適合與治療劑綴合。除非另有說明，所有恒定區(qū)殘基的編號均符合Kabat等人所述的編號方案。如下產(chǎn)生工程改造抗體。編碼人源化抗RNF43抗體hSC37.17HC(SEQIDNO：274)或hSC37.39HC(SEQIDNO：277)的表達(dá)載體用作PCR擴(kuò)增和定點誘變的模板。使用Quick-change?系統(tǒng)(AgilentTechnologies)根據(jù)制造商的說明書進(jìn)行定點誘變。將編碼hSC37.17(SEQIDNO：275)或hSC37.39(SEQIDNO：278)的突變體C220SHC的載體分別與hSC37.17的天然IgG1κLC(SEQIDNO：273)或hSC37.39的κLC(SEQIDNO：276)共轉(zhuǎn)染CHO-S細(xì)胞，并使用哺乳動物瞬時表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)。含有C220S突變體的工程改造抗RNF43位點特異性抗體稱為hSC37.17ss1和hSC37.39ss1。hSC37.17ss1(SEQIDNO：273和275)和hSC37.39ss1(SEQIDNO：276和278)位點特異性抗體的全長LC和HC的氨基酸序列顯示在圖7D中。通過SDS-PAGE表征工程改造的抗RNF43抗體，以確認(rèn)已產(chǎn)生正確的突變體。在存在和不存在還原劑例如DTT(二硫蘇糖醇)的情況下，在來自lifetechnologies的預(yù)制的10%Tris-甘氨酸微凝膠上進(jìn)行SDS-PAGE。電泳后，將凝膠用膠體考馬斯溶液染色。在還原條件下，觀察到對應(yīng)于游離LC和游離HC的兩條帶。這種模式是IgG分子在還原條件下典型的。在非還原條件下，條帶模式不同于天然IgG分子，表明在HC和LC之間不存在二硫鍵。觀察到對應(yīng)于HC-HC二聚體的約98kD的條帶。另外，觀察到對應(yīng)于游離LC的弱帶，和對應(yīng)于LC-LC二聚體的約48kD的主帶。由于每個LC的C末端上的游離半胱氨酸，預(yù)期形成一定量的LC-LC物質(zhì)。實施例12抗RNF43抗體-藥物綴合物的制備制備具有Ab-[L-D]結(jié)構(gòu)的抗RNF43抗體藥物綴合物(ADC)，其中Ab指抗RNF43抗體，L指接頭(例如具有游離巰基的末端馬來酰亞胺部分)，D指藥物或細(xì)胞毒素(例如阿里他汀、刺孢霉素等)。每個ADC包含與接頭-藥物共價連接的抗RNF43抗體。ADC使用本領(lǐng)域已知的技術(shù)合成和純化，例如基本上如下?？筊NF43抗體的半胱氨酸鍵通過加入在20℃下在具有5mMEDTA的磷酸緩沖鹽水(PBS)中的預(yù)定摩爾的三(2-羧乙基)膦(TCEP)/mol抗體90分鐘而部分還原。以3mol/mol抗RNF43抗體的比例加入溶解在二甲基乙酰胺(DMA)中的接頭-藥物。使反應(yīng)進(jìn)行30分鐘。使用在水中制備的10mMN-乙酰半胱氨酸儲備溶液(NAC)，通過向接頭-藥物中加入過量的NAC猝滅反應(yīng)。在20分鐘的最小猝滅時間后，通過加入0.5M乙酸將pH調(diào)節(jié)至6.0，并使用30kDa膜通過滲濾將緩沖液交換成滲濾緩沖液。然后將經(jīng)滲濾的抗RNF43ADC與蔗糖和聚山梨酯-20配制成目標(biāo)最終濃度。通過反相HPLC(RP-HPLC)和體外細(xì)胞毒性分析所得抗RNF43ADC的蛋白質(zhì)濃度(通過測量UV)、聚集(SEC)、藥物與抗體的比率(DAR)。實施例13使用選擇性還原過程進(jìn)行的位點特異性抗RNF43抗體的綴合制備具有如上文實施例12中所述的Ab-[L-D]結(jié)構(gòu)的抗RNF43抗體藥物綴合物(ADC)，其中Ab部分是位點特異性抗體，例如hSC37.17ss1或hSC37.39ss1，如按實施例11所述產(chǎn)生。期望的產(chǎn)物是這樣的ADC，在每個LC恒定區(qū)上在未配對的半胱氨酸(在IgG1位點特異性抗體的情況下為C214，或IgG4位點特異性抗體上為C127)最大限度綴合并且使具有大于2(DAR>2)或小于2(DAR<2)的藥物與抗體比率(DAR)的ADC最小化，同時使DAR為2(DAR=2)的ADC最大化。為了進(jìn)一步改善最終位點特異性ADC的綴合的特異性和同質(zhì)性，使用例如包括穩(wěn)定劑(例如L-精氨酸)和溫和還原劑(例如谷胱甘肽)的方法選擇性還原位點特異性抗體(例如“hSC37.17ss1”或“hSC37.39ss1”)，然后與接頭-藥物綴合，然后是用于分離不同DAR物質(zhì)的制備型疏水相互作用色譜(HIC)。上述方法例如基本上如下所述進(jìn)行。在含有1ML-精氨酸/5mM谷胱甘肽、還原型(GSH)/5mMEDTA，pH8.0的緩沖液中，在室溫下將位點特異性抗體的制劑部分還原至少1小時。然后使用30kDa膜(MilliporeAmiconUltra)將所有制劑緩沖液交換成20mMTris/3.2mMEDTA，pH8.2緩沖液，以除去還原緩沖液。然后將所得到的部分還原的制劑通過接頭(例如馬來酰亞胺接頭)與細(xì)胞毒素(例如阿里他汀、刺孢霉素等)在室溫下綴合至少30分鐘。然后使用在水中制備的10mMNAC儲備溶液，通過加入過量的NAC至接頭-藥物來猝滅反應(yīng)。在20分鐘的最小猝滅時間后，通過加入0.5M乙酸將pH調(diào)節(jié)至6.0。使用30kDa膜將位點特異性ADC緩沖液交換成滲濾緩沖液。然后用高鹽緩沖液稀釋位點特異性ADC制劑，以提高電導(dǎo)率，促進(jìn)與樹脂的結(jié)合，然后裝載在丁基HP樹脂色譜柱(GELifeSciences)上。然后使用降低的鹽梯度以基于疏水性分離不同的DAR物質(zhì)，其中首先洗脫DAR=0物質(zhì)，然后是DAR=1、DAR=2，然后是更高的DAR物質(zhì)。使用RP-HPLC分析最終的ADC“HIC純化的DAR=2”制劑，以確定HC和LC上的綴合百分比和DAR分布。還使用分析型HIC來分析樣品，以確定相對于不需要的DAR>2和DAR<2物質(zhì)的DAR=2物質(zhì)的量。實施例14在腫瘤中的RNF43蛋白表達(dá)鑒于與實施例1-3中描述的各種腫瘤相關(guān)的升高的RNF43mRNA轉(zhuǎn)錄物水平，進(jìn)行工作以測試在PDX腫瘤中的RNF43蛋白表達(dá)是否也升高。為了檢測和定量RNF43蛋白表達(dá)，使用MSD發(fā)現(xiàn)平臺(MesoScaleDiscovery)開發(fā)電化學(xué)發(fā)光RNF43夾心ELISA測定。從小鼠切下PDX腫瘤，并在干冰/乙醇中快速冷凍。將蛋白質(zhì)提取緩沖液(BiochainInstitute)加入到解凍的腫瘤塊中，使用TissueLyser系統(tǒng)(Qiagen)將腫瘤粉碎。通過離心(20,000g，20分鐘，4℃)澄清裂解物，并使用二辛可寧酸定量每種裂解物中的總蛋白濃度。將蛋白裂解物標(biāo)準(zhǔn)化至5mg/mL，并儲存在-80℃直至測定。正常組織購自商業(yè)來源并如上所述進(jìn)行處理。通過內(nèi)插來自使用具有組氨酸標(biāo)簽的純化的重組RNF43蛋白(SinoBiologicalcat＃16108-H08H)產(chǎn)生的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)濃度曲線的值來確定來自裂解物樣品的RNF43蛋白質(zhì)濃度。RNF43蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線和蛋白質(zhì)定量測定如下進(jìn)行：MSD384孔標(biāo)準(zhǔn)板在4℃下用15微升在PBS中的2微克/mL的抗RNF43捕獲抗體包被過夜。將板在PBST中洗滌并在35微升MSD3%BlockerA溶液中封閉1小時，同時振蕩。將板再次在PBST中洗滌。將10微升在含有10%蛋白質(zhì)提取緩沖液的MSD1%BlockerA中的5x稀釋的裂解物或連續(xù)稀釋的重組RNF43標(biāo)準(zhǔn)物加入到孔中，并在振蕩下孵育2小時。將板再次在PBST中洗滌。然后根據(jù)制造商的方案使用MSD?SULF0-TAGNHSEster對抗RNF43檢測抗體進(jìn)行磺基標(biāo)記。將10微升在MSD1%封閉劑A中的0.5微克/mL帶標(biāo)簽的抗RNF43檢測抗體在室溫下在振蕩下加入到洗滌過的平板中1小時。將板在PBST中洗滌。將具有表面活性劑的MSD讀出緩沖液T在水中稀釋1倍，并向每個孔中加入35微升。在MSDSectorImager2400上使用集成軟件分析程序讀取板，以通過從標(biāo)準(zhǔn)曲線內(nèi)插獲得裂解物樣品中的RNF43濃度。然后將值除以總蛋白濃度，得到每毫克總裂解物蛋白質(zhì)的納克RNF43。結(jié)果示于圖8，其中每個斑點代表源自單個PDX腫瘤系的RNF43蛋白濃度。雖然每個斑點衍生自單個PDX系，但在大多數(shù)情況下，從相同的PDX系測試多個生物樣品，并且將值平均以提供數(shù)據(jù)點。圖8顯示與正常組織相比，代表性GA和CRPDX腫瘤細(xì)胞系顯示出高RNF43蛋白表達(dá)。測試的正常組織包括腎上腺、動脈、結(jié)腸、食道、膽囊、心臟、腎臟、肝臟、肺、外周和坐骨神經(jīng)、胰腺、骨骼肌、皮膚、小腸、脾、胃、氣管、紅細(xì)胞和白細(xì)胞和血小板、膀胱、腦、乳腺、眼、淋巴結(jié)、卵巢、腦垂體、前列腺和脊髓。在以下PDX系中，RNF43蛋白表達(dá)和mRNA表達(dá)(通過微陣列或qPCR確定)之間存在良好的相關(guān)性：CR88、CR64、CR104、CR76和CR99。這些數(shù)據(jù)與上文所述的RNF43表達(dá)的mRNA轉(zhuǎn)錄數(shù)據(jù)組合，強(qiáng)烈地加強(qiáng)了RNF43決定子為治療性干預(yù)提供有吸引力的靶標(biāo)的見解。實施例15使用原位雜交在腫瘤表面上檢測RNF43使用RNAscope?2.0Reagent試劑盒(AdvancedCellDiagnostics;Wang等，2012，PMID：22166544)進(jìn)行RNF43mRNA的RNA原位雜交。用于RNF43的RNAscope探針設(shè)計在核苷酸3451-4489之間。使用對于肽基脯氨酰異構(gòu)酶B(PPIB)(位于所有細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)的環(huán)孢菌素結(jié)合蛋白質(zhì))特異性的RNAscope探針，對每個樣品進(jìn)行RNA完整性的質(zhì)量控制(數(shù)據(jù)未顯示)。使用對DiAminoPimelate(dapB)RNA特異的探針測定背景染色(數(shù)據(jù)未顯示)。簡言之，在與RNF43寡核苷酸探針雜交之前，用熱和蛋白酶預(yù)處理21個原發(fā)性患者結(jié)腸直腸腫瘤樣品的5微米甲醛固定、石蠟包埋(FFPE)組織切片。然后將前置放大器、放大器和HRP標(biāo)記的寡核苷酸依次雜交，隨后用3,3'-二氨基聯(lián)苯胺顯色產(chǎn)色沉淀。特異性RNA染色信號被鑒定為棕色、點狀點。將FFPE載玻片用Gill's蘇木精復(fù)染色并在光學(xué)顯微鏡下分析。以0至4的等級手動評分染色，其中0=無染色或每10個細(xì)胞小于1個點;1=每個細(xì)胞1-3個點;2=每個細(xì)胞4-10個點;3=每個細(xì)胞多于10個點，并且小于10%的陽性細(xì)胞具有在簇中發(fā)現(xiàn)的點;4=每個細(xì)胞多于10個點，并且超過10%的陽性細(xì)胞在簇中具有點。圖9顯示測試的所有21個PDX細(xì)胞系在一定程度上表達(dá)RNF43，其中52.3%的腫瘤表現(xiàn)4分。實施例16使用流式細(xì)胞術(shù)，抗RNF43抗體檢測腫瘤上的RNF43蛋白表達(dá)流式細(xì)胞術(shù)用于評估本發(fā)明的抗RNF43抗體特異性檢測CRPDX腫瘤細(xì)胞系表面上抗RNF43蛋白的存在的能力。收獲CRPDX腫瘤細(xì)胞，并使用本領(lǐng)域公知的酶組織消化技術(shù)解離以獲得單細(xì)胞懸浮液(參見例如美國專利2007/0292414)。將腫瘤細(xì)胞與小鼠全I(xiàn)gG(在2%FCS/PBS中10微克/ml)孵育10分鐘，以阻斷非特異性抗體結(jié)合，然后用熒光綴合的市售抗小鼠CD45和H-2Kd抗體、抗人EpCAM和抗人CD46和/或CD324共染色以鑒定NTG(CD46-細(xì)胞)和CSC/TIC(CD46hi/CD324+細(xì)胞)群(參見USPN2013/0260385、2013/0061340和2013/0061342)。然后將腫瘤細(xì)胞與生物素化的抗RNF43抗體(生物素-SC37.67,10微克/ml，在2%FCS/PBS中)或與IgG同種型匹配的對照抗體孵育30分鐘，并在PBS/2%FCS中洗滌兩次。將細(xì)胞與APC標(biāo)記的鏈霉親和素(1微克/ml，在2%FCS/PBS中)孵育15分鐘，用1mLPBS/2%FCS洗滌兩次，并重懸浮于含有DAPI的PBS/2%FCS中(以檢測死細(xì)胞)。結(jié)合活的人細(xì)胞的抗體被解釋為APC信號在mCD45-H2kd-EpCAM+DAPI-事件上保留，如在BDFACSCantoII流式細(xì)胞儀上分析的。圖10顯示本發(fā)明的抗RNF43抗體(黑線)能夠以比IgG同種型對照抗體(灰色填充直方圖)明顯更高的強(qiáng)度特異性結(jié)合活人CRCREX腫瘤細(xì)胞(CR14、CR81、CR91、CR99、CR104、CR115)。此外，在測試的大多數(shù)PDX系中，與NTG(黑色虛線)相比，CSC(實線黑線)中的RNF43表達(dá)較高，表明RNF43表達(dá)與致瘤群相關(guān)。圖10包括比較抗RNF43抗體的染色強(qiáng)度與對照抗體的染色強(qiáng)度的表，其中表達(dá)被計數(shù)為幾何平均熒光強(qiáng)度減去用同種型對照抗體觀察到的強(qiáng)度(ΔMFI)。實施例17抗RNF43抗體促進(jìn)細(xì)胞毒性劑的遞送為了確定本發(fā)明的抗RNF43抗體是否能夠內(nèi)化以介導(dǎo)細(xì)胞毒性劑遞送至細(xì)胞，使用選擇的抗RNF43抗體和與第二抗小鼠抗體FAB片段連接的皂草素進(jìn)行體外細(xì)胞殺傷測定。皂草素是使核糖體失活的植物毒素，從而抑制蛋白質(zhì)合成并導(dǎo)致細(xì)胞死亡。皂草素僅在細(xì)胞內(nèi)具有細(xì)胞毒性，其中它接近核糖體，但是不能自己內(nèi)化。因此，這些測定中的皂草素介導(dǎo)的細(xì)胞毒性指示抗小鼠FAB-Saporin構(gòu)建體在結(jié)合和內(nèi)化相關(guān)鼠或人源化抗RNF43抗體至靶細(xì)胞中時內(nèi)化的能力。將過表達(dá)hRNF43的HEK293T細(xì)胞的單細(xì)胞懸浮液以每孔500個細(xì)胞鋪板到BD組織培養(yǎng)板(BDBiosciences)中。一天后，將各種濃度的純化的抗RNF43抗體(鼠或人源化的)與固定濃度的2nM抗小鼠IgGFAB-皂草素綴合物(AdvancedTargetingSystems)(用于測試小鼠抗體)或2nM抗人IgGFAB-皂草素綴合物(用于測試人源化抗體)一起加入到培養(yǎng)物中。孵育96小時后，使用CellTiter-Glo?(Promega)根據(jù)制造商的說明書計數(shù)活細(xì)胞。使用含有僅用第二FAB-皂草素綴合物孵育的細(xì)胞的培養(yǎng)物的原始發(fā)光計數(shù)設(shè)定為100%參考值，所有其它計數(shù)計算為參考值的百分比。濃度為250pM的抗RNF43鼠抗體的大子集有效地以不同的功效殺死了過表達(dá)hRNF43的HEK293T細(xì)胞(圖5A)，而相同濃度的小鼠IgG2b同種型對照抗體(mIgG2b)沒有(數(shù)據(jù)未顯示)。此外，抗RNF43人源化抗體(hSC37.2、hSC37.17、hSC37.39和hSC37.67v1)有效殺死了過表達(dá)RNF43的HEK293T細(xì)胞。人源化抗體顯示與它們衍生自的嵌合抗體(在hSC37.2、hSC37.17和hSC37.39的情況下)或鼠抗體(在hSC37.67v1的情況下)相當(dāng)?shù)墓π?圖11)。上述結(jié)果證明抗RNF43抗體介導(dǎo)內(nèi)化的能力及其遞送細(xì)胞毒性有效負(fù)荷的能力，支持了抗RNF43抗體可具有作為ADC的靶向部分的治療效用的假設(shè)。實施例18通過抗RNF43抗體-藥物綴合物減少腫瘤引發(fā)細(xì)胞頻率如上文實施例1所示，RNF43表達(dá)與癌癥干細(xì)胞相關(guān)。因此，為了證明用抗RNF43ADC進(jìn)行的治療降低了已知是耐藥的并刺激腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的腫瘤引發(fā)細(xì)胞(TIC)的頻率，進(jìn)行體內(nèi)有限稀釋測定(LDA)，例如，基本上如下所述。在免疫缺陷小鼠中皮下生長PDX腫瘤(例如結(jié)腸直腸)。當(dāng)腫瘤體積平均為150mm3-250mm3時，將小鼠隨機(jī)分成兩組。一組用與藥物綴合的人IgG1作為陰性對照腹膜內(nèi)注射;而另一組用抗RNF43ADC(例如，如實施例16和18中制備的)腹膜內(nèi)注射。給藥后一周，將來自每組的兩個代表性小鼠安樂死，并收獲它們的腫瘤并分散到單細(xì)胞懸浮液中。然后如前面實施例1所述收獲、合并和解聚來自每個治療組的腫瘤細(xì)胞。用FITC綴合的抗小鼠H2kD和抗小鼠CD45抗體標(biāo)記細(xì)胞以檢測小鼠細(xì)胞；EpCAM以檢測人類細(xì)胞；和DAPI以檢測死細(xì)胞。然后通過FACS使用BDFACSCantoII流式細(xì)胞儀分選所得懸浮液，分離并收集活的人腫瘤細(xì)胞。用來自用抗RNF43ADC處理的腫瘤的1250、375、115或35個分選的活的人類細(xì)胞注射四組小鼠。作為陰性對照，用來自用對照IgG1ADC處理的腫瘤的1000、300、100或30個分選的活的人類細(xì)胞移植四組小鼠。每周測量受體小鼠的腫瘤，并且在腫瘤達(dá)到1500mm3之前對個體小鼠實施安樂死。受體小鼠評分為具有陽性或陰性腫瘤生長。陽性腫瘤生長定義為超過100mm3的腫瘤生長。泊松分布統(tǒng)計(L-Calc軟件，StemcellTechnologies)用于計算每個群體中TIC的頻率。本領(lǐng)域技術(shù)人員將進(jìn)一步理解，在不脫離本發(fā)明的精神或中心屬性的情況下，本發(fā)明可以以其他具體形式實施。由于本發(fā)明的前述描述僅公開了其示例性實施方案，應(yīng)當(dāng)理解，其他變化被認(rèn)為在本發(fā)明的范圍內(nèi)。因此，本發(fā)明不限于本文已經(jīng)詳細(xì)描述的特定實施方案。更確切地，應(yīng)當(dāng)參考所附權(quán)利要求來指示本發(fā)明的范圍和內(nèi)容。當(dāng)前第1頁1 2 3