專(zhuān)利名稱(chēng)：新型抗egfr人源抗體tgm10的設(shè)計(jì)及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及新型抗體及其用途。基于EGFR與功能性抗體相互作用空間結(jié)構(gòu)，利用 計(jì)算機(jī)輔助合理評(píng)價(jià)EGFR蛋白與功能性抗體作用動(dòng)態(tài)模式及功能性抗體特異性識(shí)別EGFR 胞外區(qū)功能域的表位結(jié)構(gòu)特征、理化性質(zhì)，通過(guò)虛擬篩選與輔助分子設(shè)計(jì)相結(jié)合合理設(shè)計(jì)、 獲得新型抗EGFR人源抗體TGM10。應(yīng)用分子生物學(xué)技術(shù)進(jìn)行基因全合成和蛋白表達(dá)，并通 過(guò)免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)以及細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)對(duì)新抗體的功能進(jìn)行評(píng)價(jià)。
背景技術(shù)：
表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)是細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)和細(xì)胞分化的重要分子之一 [N. Prenzel, 0. M. Fischer, S.Streit, S. Hart, A. Ullrich, The epidermalgrouth factor receptor family as a central element for cellular signaltransduction and diversification. Endocrine-related cancer 8(2001) 11—31]。EGFR 在多種類(lèi)型的 人類(lèi)實(shí)體瘤中過(guò)表達(dá)，包括肺癌、結(jié)腸癌、乳腺癌、胃癌、腦癌、膀胱癌、頭頸部腫瘤、卵巢 癌、胃癌、前列腺癌以及肝癌等[D. C.Moditahedi H, The receptor for EGF and its ligands -Expression， prognosticvalue and target for therapy in cancer.Int J Oncol (1994)277-296]。人EGFR基因位于第7號(hào)染色體pl3 q22區(qū)，全長(zhǎng)200kb，由28個(gè)外顯子組成，編 碼1186個(gè)氨基酸，形成的EGFR單鏈糖蛋白分子量約170kDa。EGFR胞外區(qū)(E⑶)N-端621 個(gè)氨基酸殘基為配體結(jié)合區(qū)，由I、II、III、IV四個(gè)亞區(qū)(或相應(yīng)稱(chēng)為L(zhǎng)i、S1/CR1、L2、S2/ CR2亞區(qū))構(gòu)成。I和III區(qū)富含亮氨酸；II和IV區(qū)富含半胱氨酸，全部50個(gè)半胱氨酸殘 基參與形成25個(gè)分子內(nèi)二硫鍵。另外胞外區(qū)存在12個(gè)潛在的N-糖苷鍵連接的糖基化位 點(diǎn)，其中I、II區(qū)各有2個(gè)，III、IV區(qū)各有4個(gè)。研究表明，EGFR的糖基化作用與其參與結(jié) 合配體及自身同型二聚化有關(guān)。EGFR跨膜(TM)區(qū)由23個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成的疏水區(qū)，為單 鏈α螺旋。EGFR胞內(nèi)區(qū)共542個(gè)氨基酸殘基，由近膜區(qū)(JM)、酪氨酸激酶(TK)區(qū)、C-末 端區(qū)三個(gè)亞區(qū)構(gòu)成。近膜區(qū)的前13個(gè)氨基酸(645 657)是介導(dǎo)胞內(nèi)二聚化作用所必需。 自身磷酸化位點(diǎn)位于C-末端，其中Tyr 1068、1148、1173為主要位點(diǎn)，Tyr992、1086為次要 位點(diǎn)，與信號(hào)傳遞密切相關(guān)。EGFR的過(guò)度表達(dá)或異常激活，常常引起細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化，從而與 腫瘤的發(fā)生、發(fā)展為惡性以及腫瘤手術(shù)預(yù)后等密切相關(guān)。目前用于EGFR靶向性治療腫瘤的藥物主要分為兩類(lèi)EGFR單克隆抗體和小分子 化合物酪氨酸激酶拮抗劑。酪氨酸激酶拮抗劑主要為小分子喹啉類(lèi)化合物，能夠競(jìng)爭(zhēng)性 抑制ATP與EGFR胞內(nèi)酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域的結(jié)合，進(jìn)而影響酪氨酸殘基磷酸化，抑制EGFR 下游的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。EGFR單克隆抗體是與內(nèi)源性配體競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合EGFR，通過(guò)抑制酪氨酸激酶 的激活、促進(jìn)EGFR內(nèi)化等作用產(chǎn)生抗腫瘤效應(yīng)，包括抗體依賴(lài)性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用 (antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity， ADCC) ·。 Tffli^S一Τ" 3 禾中
上市的抗EGFR單克隆抗體，與其他化療藥相比，這些抗體作用特異性強(qiáng)，副作用小，在臨床 上取得了較好的療效。
Cetuximab (Erbitux)是2004年2月FDA批準(zhǔn)上市的抗EGFR人/鼠嵌合單克隆 抗體。Erbitux由鼠抗EGFR抗體的Fv區(qū)與人IGgl重鏈和k輕鏈恒定區(qū)構(gòu)成，分子量約 為152kD。Erbitux與放療結(jié)合用于治療局部區(qū)域性早期頭頸部鱗狀細(xì)胞癌，與伊立替康合 用治療EGFR陽(yáng)性、伊立替康化療無(wú)效的轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌。Erbitux特異性地與腫瘤細(xì)胞膜 表面EGFR結(jié)合，競(jìng)爭(zhēng)性抑制EGF和TGF-a等配體與EGFR的結(jié)合。雖然Erbitux在體內(nèi) 抗腫瘤效應(yīng)的機(jī)制并不明確，但體外分析和動(dòng)物體內(nèi)試驗(yàn)表明，Erbitux與EGFR結(jié)合阻斷 磷酸化和與受體相關(guān)激酶的激活，從而抑制細(xì)胞生長(zhǎng)，誘導(dǎo)凋亡，減少基質(zhì)金屬蛋白酶和血 管上皮生長(zhǎng)因子的產(chǎn)生[Ciardiello F，TortoraG. A novel approach in the treatment of cancer-targeting the epidermal growthfactor receptor. Clin Cancer Res，2001; 7:2958-2970]。Erbitux還可以使細(xì)胞膜表面的EGFR內(nèi)化，表達(dá)量下調(diào)[Kim ES，Khuri FR，Herbst RS，et al. Epidermal growth factor receptor biology. Cur Op in Oncol, 2001 ；13 506-513]；增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對(duì)伊立替康等化療藥物和放療的敏感性，抗腫瘤效果比 單獨(dú)化療或放療有所±曾強(qiáng)[Baselga J,Trigo JM,Bourhis J，et al. Phase Ilmulticenter study of the antiepidermal growth factor receptor monoclonalantibody cetuximab in combination with platinum based chemotherapy inpatients with platinum refractory metastatic and/or recurrent squamous cellcarcinoma of the head and neck. J Clin Oncol, 2005 ；23 :5568_5577]。Panitumumab (VEXTIBIX)是一種由 XenoMouse 技術(shù)生產(chǎn)的完全人源 IgG2 抗 EGFR 單克隆抗體，無(wú)鼠源性[Yang XD，Jia XC,Corvalan JR, et al. Development of ABX EGF,a fully human anti EGF receptor monoclonalantibody for cancer therapy. Crit Rev Oncol Hemato 1,2001 ；38:17-23]。Panitumumab 于 2006 年 9 月被 FDA 批準(zhǔn)上市，與氟嘧 啶、奧沙利鉬和伊立替康合用或在化療后用于治療EGFR陽(yáng)性的轉(zhuǎn)移性直結(jié)腸癌。與其他抗 EGFR抗體一樣，panitumumab的作用機(jī)制也是通過(guò)阻斷EGF和TGF- a與腫瘤細(xì)胞上EGFR 的結(jié)合，誘導(dǎo)EGFR的內(nèi)化，進(jìn)而消除EGFR介導(dǎo)的細(xì)胞效應(yīng)。在動(dòng)物體內(nèi)試驗(yàn)中，與其他抗 EGFR抗體和治療方法相比，只給予panitumumab的動(dòng)物在8個(gè)月后大部分都未出現(xiàn)腫瘤復(fù) 發(fā)[Ciardiello F, Caputo R, Bianco R, et al. Antitumor effect and potentiation of cytotoxic drugsactivity in human cancer cells by ZD 1839 (Iressa), an epidermal growth factorreceptor selective tyrosine kinase inhibitor. Clin Cancer Res, 2000 ；6 =2053-2063] 0有研究表明，無(wú)論是高表達(dá)或低表達(dá)EGFR的腫瘤，panitumumab都能 夠有抑制其生長(zhǎng)。皮疹通常是臨床應(yīng)用panitumumab最常見(jiàn)的不良反應(yīng)，皮疹的發(fā)生率與 panitumumab 的劑量有關(guān)[Foon KA, Yang XD,ffeiner LM, et al. Preclinical and clinical evaluations of ABX EGF, a fullyhuman anti epidermal growth factor receptor antibody. Int J Radiat Oncol BiolPhys，2004 ;58 :984_990]?；颊咧羞€出現(xiàn)輕微的虛弱、 腹瀉、惡心等癥狀，但與劑量無(wú)關(guān)。與人鼠嵌合單抗cetuximab和其他EGFR靶向小分子藥 物不同的是，即使在高劑量2. 5mg/(kg ，完全人源的panitumumab沒(méi)有出現(xiàn)過(guò)敏性不良 反應(yīng)和人抗人抗體。Nimotuzomab (泰欣生)通用名為重組人源抗人表皮生長(zhǎng)因子受體單克隆抗體， 2006年4月獲SFDA批準(zhǔn)，是我國(guó)第一個(gè)人源單克隆抗體藥物，與放療聯(lián)合用于治療EGFR 陽(yáng)性的III/IV鼻咽癌。Nimotuzomab屬于IgGl亞型，分子量為150kD，是通過(guò)基因工程技術(shù)將鼠單克隆抗體(ioregf/rf)的互補(bǔ)決定區(qū)移植到人抗體骨架構(gòu)成的抗EGFR單克隆抗 體[Crombet T, Osorio M, Cruz T, et al. Use of the humanized antiepidermal growth factorreceptor monoclonal antibody hr3in combination with radiotherapy in thetreatment of locally advanced head and neck cancer patients. J Clin Oncol, 2004 ；22 1646-1654]。Nimotuzomab 具有與 EGFR 結(jié)合的高親和力(Kd = l(T9mol/L)，體內(nèi) 外實(shí)驗(yàn)證明nimotuzomab有抗細(xì)胞增殖和抗血管生成作用，并且能夠促進(jìn)細(xì)胞調(diào)亡，阻滯 細(xì)胞周期停留在 G1/S 期[CrombetRamos T, Rak J, Perez R, et al. Antiproliferative, antiangiogenic andproapoptotic activity of hR3 :A humanized anti EGFR antibody. Int J Cancer，2002 ; 101 :567-575]。用 99mTc 標(biāo)記研究的 nimotuzomab 其在人體內(nèi)的分 布時(shí)發(fā)現(xiàn)，nimotuzomab在肝臟、心、腎、膀胱和脾有蓄積，其中肝臟的蓄積最顯著。除腎、 膀胱和胃腸道外，各個(gè)器官對(duì)nimotuzomab的攝取量隨著時(shí)間的延長(zhǎng)而降低，這是因?yàn)?腎、膀胱和胃腸道是nimotuzomab的排泄器官。腫瘤對(duì)nimotuzomab的清除小于其他正 常組織對(duì)nimotuzomab的清除，而腫瘤對(duì)nimotuzomab的攝取量相對(duì)于其他器官較恒定 [Crombet T, TorresL, Neninger E. et al. Pharmacological evaluation of humanized anti epidermalgrowth factor receptor, monoclonal antibody hr3, in patients with advancedepithelial derived cancer. J Immunother, 2003 ;26 :139-148],這說(shuō)明 nimotuzomab對(duì)腫瘤的靶向性強(qiáng)，在腫瘤部位能達(dá)到高濃度產(chǎn)生抑制腫瘤的效應(yīng)。一項(xiàng) nimotuzomab與化療聯(lián)合應(yīng)用的I/II期臨床研究評(píng)價(jià)了 nimotuzomab的安全性和臨床療 效。24位患者16. 7%有完全反應(yīng)，20. 8%病情穩(wěn)定。所有患者的生存時(shí)間的平均值和中位 數(shù)分別為16. 76和14. 77個(gè)月。值得一提的是nimotuzomab對(duì)兒童和青少年神經(jīng)膠質(zhì)瘤 也有一定療效，而且沒(méi)有嚴(yán)重的毒副作用[Bode U，Buchen S，et al. Results ofa phase II trial ofhR3 monoclonal antibody(nimotuzumab)in the treatment of resistant orrelapsed high grade gliomas in children and adolescents. J Clin Oncol,2006 ； 24(18S) =1522]。I/II期臨床研究中nimotuzomab的一般副作用為輕中度發(fā)燒、低血壓、振 顫、肌肉酸痛和頭痛。和臨床其他抗EGFR抗體不同的是，應(yīng)用nimotuzomab很少出現(xiàn)皮疹、 皮炎等皮膚毒性。Cetuximab、panitumumab禾口 nimotuzomab這3種抗EGFR單克隆抗體具有革巴向性 強(qiáng)、毒副作用相對(duì)較小的特點(diǎn)。這些單克隆抗體與放化療結(jié)合在臨床上用于治療EGFR陽(yáng)性 腫瘤已經(jīng)取得了一定的療效，為腫瘤患者帶來(lái)了新的曙光。目前在我國(guó)抗EGFR單克隆抗體 的臨床應(yīng)用還不夠廣泛，費(fèi)用也相對(duì)較高?？笶GFR單克隆抗體未能單獨(dú)用于腫瘤的治療， 還需要與放療或化療聯(lián)合應(yīng)用；而且在臨床用于治療腫瘤的類(lèi)型也較少，這些在一定程度 上限制了抗EGFR單克隆抗體在臨床上的使用。本發(fā)明即基于上面的研究背景，利用EGFR特殊的結(jié)構(gòu)特征、EGFR胞外區(qū)與功能性 抗體Erbitux相互作用空間構(gòu)象及特定結(jié)構(gòu)域特征，通過(guò)計(jì)算機(jī)虛擬篩選及分子設(shè)計(jì)方案 設(shè)計(jì)新型抗EGFR人源抗體TGM10，并通過(guò)免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)以及細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)對(duì)其功能進(jìn)行驗(yàn) 證。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明基于計(jì)算機(jī)輔助分子設(shè)計(jì)，并通過(guò)分子生物學(xué)全合成方法獲得了一種新型抗EGFR人源抗體TGM10。本發(fā)明公開(kāi)的抗EGFR抗體TGM10是基于EGFR結(jié)構(gòu)域、EGFR與功能性抗體相互作 用空間構(gòu)象以及理化特征利用計(jì)算機(jī)輔助設(shè)計(jì)獲得的新型人源抗體。本發(fā)明公開(kāi)了一種新型抗EGFR人源抗體的基因序列，其特征在于具有如序列表 所述的序列。所述EGFR人源抗體TGM10的重鏈可變區(qū)基因序列選自SEQ ID N0:1、SEQ ID N0:2和SEQ ID NO :3之一；輕鏈可變區(qū)的基因序列選自SEQ ID NO :4、SEQ ID NO :5禾口 SEQ ID NO :6 之一。本發(fā)明公開(kāi)了一種載體，包含EGFR人源抗體TGM10的重鏈可變區(qū)基因序列選自 SEQ ID N0:1、SEQ ID NO :2 和 SEQ ID NO :3 之一，輕鏈可變區(qū)的基因序列為 SEQ ID NO :4、 SEQ ID NO 5 和 SEQ ID NO 6 之一。本發(fā)明公開(kāi)的抗體TGM10的一個(gè)特征是所述抗體能特異性識(shí)別靶抗原EGFR，抗體 TGM10在免疫印跡實(shí)驗(yàn)中能夠與目的蛋白發(fā)生特異性結(jié)合，表明所述9種抗體均可以應(yīng)用 于與抗原EGFR相關(guān)的診斷試劑的生產(chǎn)過(guò)程中。本發(fā)明公開(kāi)了 EGFR人源抗體TGM10-1可以與表達(dá)靶抗原陽(yáng)性細(xì)胞表面EGFR特 異性結(jié)合；同時(shí)公開(kāi)了 TGM10-1可以應(yīng)用于不當(dāng)增殖相關(guān)疾病的藥物的生產(chǎn)，所述抗體 TGM10-1可以有效地抑制以及殺傷EGFR陽(yáng)性的腫瘤細(xì)胞。本發(fā)明公開(kāi)的抗體的一個(gè)特征是所述抗體TGM10-1的細(xì)胞生物學(xué)功能良好，且明 顯優(yōu)于對(duì)照抗體Erbitux。所述抗體TGM10-1具有明顯抑制細(xì)胞pAKT磷酸化水平的作用，TGM10-1對(duì)EGFR陽(yáng) 性的乳腺癌細(xì)胞系SK0V3、肝癌細(xì)胞系H印G2及肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549的AKT磷酸化水平有明顯 的抑制，其抑制活性高于對(duì)照抗體Erbitux。所述抗體TGM10-1可以大大降低了腫瘤細(xì)胞遷移能力。TGM10-1可以有效抑制 SKV03, HepG2以及A549等腫瘤細(xì)胞的遷移，其效果明顯優(yōu)于對(duì)照抗體Erbitux。所述抗體TGM10-1能特異性地抑制EGFR陽(yáng)性的SKV03，HepG2以及A549增殖，其 抑制能力高于對(duì)照抗體Erbitux。所述抗體TGM10-1可以特異性介導(dǎo)ADCC功能，殺傷EGFR陽(yáng)性的SKV03，HepG2以 及A549三種靶細(xì)胞，并且抗體TGM10-1的殺傷活性較對(duì)照Erbitux有顯著的提高。本發(fā)明公開(kāi)了新型抗EGFR人源抗體TGM10的制備方法。具體實(shí)施過(guò)程如下1)利用計(jì)算機(jī)輔助分子設(shè)計(jì)獲得的人源抗EGFR抗體；2)利用全合成PCR技術(shù)合成抗EGFR抗體基因；3)抗體的表達(dá)及鑒定；4)抗EGFR抗體生物學(xué)活性鑒定。下面參照上述步驟詳細(xì)描述抗EGFR人源抗體的設(shè)計(jì)及制備過(guò)程。設(shè)計(jì)及制備本 發(fā)明抗體的方法僅僅是說(shuō)明相關(guān)方法，并非是限制性的；也可以采用其他已知的方法，或者 采用修改的方法。1)利用計(jì)算機(jī)輔助分子設(shè)計(jì)獲得的人源抗EGFR抗體根據(jù)EGFR胞外區(qū)結(jié)構(gòu)域功能表位的特征，利用計(jì)算機(jī)虛擬篩選及計(jì)算機(jī)輔助分 子設(shè)計(jì)方法設(shè)計(jì)拮抗EGFR功能的短肽(長(zhǎng)度為10 15)，并將獲得的一系列功能短肽作為抗體可變區(qū)的CDR區(qū)儲(chǔ)備；借助源自TrEMBL、SwiSSPr0t、Kabat、IMGT等蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)提供 的抗體序列構(gòu)建的人源抗體序列信息數(shù)據(jù)庫(kù)；通過(guò)同源模建、力學(xué)優(yōu)化技術(shù)將人源抗體序 列信息數(shù)據(jù)庫(kù)中人源抗體可變區(qū)框架與前面儲(chǔ)備的CDR進(jìn)行合理拼接構(gòu)建合理的抗體可 變區(qū)。2)利用全合成PCR技術(shù)合成抗EGFR抗體基因；根據(jù)獲得的抗體序列，選擇在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中常用的密碼子進(jìn)行反向翻譯，獲得 相應(yīng)的抗體基因。利用基因全合成PCR技術(shù)，設(shè)計(jì)相應(yīng)的引物，通過(guò)重疊PCR的方法獲得全 長(zhǎng)基因；克隆入克隆載體，進(jìn)行序列測(cè)定。5)抗體的表達(dá)及鑒定a)抗體的表達(dá)將抗體基因構(gòu)建至真核表達(dá)載體中，通過(guò)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染、電轉(zhuǎn)等方 法瞬時(shí)轉(zhuǎn)染真核表達(dá)細(xì)胞，培養(yǎng)足夠長(zhǎng)時(shí)候后收獲上清，其中含有表達(dá)的目的抗體。b)雙夾心酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA):以合適的抗體包被后作為捕獲抗體，經(jīng)過(guò) 封閉后，加入待測(cè)樣品以及標(biāo)準(zhǔn)樣品進(jìn)行捕獲反應(yīng)；隨后利用合適的酶標(biāo)二抗進(jìn)行顯色反 應(yīng)，測(cè)定樣品中目的蛋白的含量。c)SDS-PAGE 依據(jù)目的蛋白的大小配制合適濃度的聚丙烯酰胺凝膠，根據(jù)實(shí)驗(yàn)需 要制備還原電泳樣品或非還原電泳樣品進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳，分離蛋白；經(jīng)過(guò)考馬斯 亮藍(lán)染色后，確定目的蛋白分子量。6)抗EGFR抗體生物學(xué)活性鑒定a)AKT磷酸化水平測(cè)定將EGFR陽(yáng)性細(xì)胞培養(yǎng)在培養(yǎng)皿，加入不同濃度的抗體后 培養(yǎng)24小時(shí)，以人IgG作為對(duì)照。收集細(xì)胞，M2緩沖液(20mMTris、250mM NaCl、3mM EDTA、 3mM EGTA.O. 5% NP40, pH7. 6)裂解，4°C，12000rpm 離心 15min ；取裂解上清進(jìn)行 Western Blotting實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)AKT和磷酸化AKT的水平。b)流式細(xì)胞分析收集目的細(xì)胞；緩沖液(PBS+2%胎牛血清)洗滌后，加入一抗， 4。C反應(yīng)30mins ；緩沖液洗滌2次，加入相應(yīng)的二抗，4°C避光反應(yīng)30mins，緩沖液洗滌2次 后重懸在鞘液中直接進(jìn)行流式細(xì)胞分析或者以的多聚甲醛固定，4°C避光保存。c)抑制生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)以EGFR陽(yáng)性細(xì)胞作為靶細(xì)胞，加入不同濃度的抗體作用于靶細(xì) 胞，設(shè)立陰性對(duì)照、陽(yáng)性對(duì)照及實(shí)驗(yàn)組；作用24h后，以MTT法測(cè)定抗體對(duì)靶細(xì)胞生長(zhǎng)抑制活 性。d)劃痕實(shí)驗(yàn)將EGFR陽(yáng)性細(xì)胞培養(yǎng)在培養(yǎng)皿或平板上，待細(xì)胞融合后用細(xì)胞刮在 中央?yún)^(qū)域畫(huà)一條線(xiàn)，這條線(xiàn)內(nèi)的細(xì)胞被機(jī)械力去除掉了，然后將細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)，觀察細(xì)胞向 無(wú)細(xì)胞的劃痕區(qū)域遷移的情況，來(lái)判斷細(xì)胞的遷移能力。設(shè)置陰性對(duì)照、陽(yáng)性對(duì)照以及實(shí)驗(yàn) 組。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后去除上清，生理鹽水洗滌，甲醇固定30min ；流水輕輕洗滌，加入姬姆薩染液 染色30min ；倒置顯微鏡拍照。e)抗體依賴(lài)的細(xì)胞毒試驗(yàn)(ADCC)標(biāo)記EGFR陽(yáng)性細(xì)胞作為靶細(xì)胞，用淋巴細(xì)胞分 離液從外周血中分離出外周血單個(gè)核細(xì)胞作為效應(yīng)細(xì)胞；根據(jù)相應(yīng)比例混合后，加入不等 量的抗體，于圓底96孔培養(yǎng)板上進(jìn)行殺傷實(shí)驗(yàn)，設(shè)立實(shí)驗(yàn)孔、靶細(xì)胞自發(fā)釋放孔、最大釋放 孔及背景孔；37°C孵育2h。利用多功能酶標(biāo)儀進(jìn)行檢測(cè)，計(jì)算殺傷率。


圖1真核表達(dá)獲得的TGM10抗體SDS-PAGE。隨機(jī)配對(duì)組合計(jì)算機(jī)輔助設(shè)計(jì)獲得 的抗體輕重鏈可變區(qū)基因進(jìn)行真核表達(dá)，獲得的9個(gè)抗體分子量均為155KDa ；1 9表示9 個(gè)抗體，M表示分子量標(biāo)準(zhǔn)品。圖2TGM10抗體特異性被羊抗人IgG識(shí)別。隨機(jī)配對(duì)組合計(jì)算機(jī)輔助設(shè)計(jì)獲得的 抗體輕重鏈可變區(qū)基因獲得的9個(gè)抗體均可被羊抗人IgG識(shí)別；1 9表示9個(gè)抗體；IgG 表示人IgG，和Erbitux —起作為陽(yáng)性對(duì)照。圖3TGM10抗體特異性識(shí)別靶抗原。以EGFR陽(yáng)性細(xì)胞裂解液進(jìn)行WesternBlottig 檢測(cè)，隨機(jī)配對(duì)組合計(jì)算機(jī)輔助設(shè)計(jì)獲得的抗體輕重鏈可變區(qū)基因獲得的9個(gè)抗體均可識(shí) 別分子量為185KDa的靶抗原；1 9表示9個(gè)抗體，Erbitux作為陽(yáng)性對(duì)照。圖4抗體降低EGFR陽(yáng)性細(xì)胞SK0V3、H印G2及A549種AKT磷酸化水平。其中1表 示人 IgG control X^tM ；2 Erbitux 10 u g/mL ；3 Erbitux 50 u g/mL ；4 TGM10-110 u g/mL ； 5 表示 TGM10-150 u g/mL.圖5抗體抑制EGFR陽(yáng)性細(xì)胞SK0V3、HepG2及A549遷移能力。10 u g/mL的抗體 TGM10-1或Erbitux作用三種細(xì)胞后，進(jìn)行細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)。圖6抗體體外抑制EGFR陽(yáng)性細(xì)胞增殖。A 抗體抑制SK0V3細(xì)胞增殖，B ；抗體抑 制H印G2細(xì)胞增殖，C 抗體抑制A549細(xì)胞增殖。圖7抗體體外介導(dǎo)ADCC效應(yīng)殺傷EGFR陽(yáng)性細(xì)胞。A 抗體介導(dǎo)ADCC效應(yīng)殺傷 SK0V3細(xì)胞，B ；抗體介導(dǎo)ADCC效應(yīng)殺傷HepG2細(xì)胞，C 抗體介導(dǎo)ADCC效應(yīng)殺傷A549細(xì)胞。實(shí)施例一、計(jì)算機(jī)輔助分子設(shè)計(jì)獲得的人源抗EGFR抗體一、材料Insightll 2005程序包(MSI分子模擬，San Diego)，該程序包包括Homology 同源模建；Discover 力學(xué)優(yōu)化；Discover_3常溫動(dòng)力學(xué)模擬；Docking 分子對(duì)接；Delphi表觀靜電勢(shì)能分析。Ludi分子設(shè)計(jì)程序(1995)；IBM圖形工作站；PDB 2008 數(shù)據(jù)庫(kù)(網(wǎng)絡(luò) www. rcsb. org 下載)；SwissProt 數(shù)據(jù)庫(kù)(2008，網(wǎng)絡(luò)下載)；Kabat數(shù)據(jù)庫(kù)(2001，網(wǎng)絡(luò)下載)；IMGT數(shù)據(jù)庫(kù)(2008，網(wǎng)絡(luò)下載)。二、方法結(jié)果利用確定的EGFR胞外區(qū)功能表位的結(jié)構(gòu)特征，通過(guò)Ludi程序經(jīng)片段生長(zhǎng)方法設(shè) 計(jì)能夠識(shí)別該特征表位的短肽序列；利用從頭搭建與二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)連用模擬拮抗短肽的空 間構(gòu)象。借助源自網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫(kù)PDB、SwissProt、TrEMBL、Kabat、IMGT獲得的抗體序列信息 構(gòu)成的人源抗體可變區(qū)框架結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫(kù)，與上述拮抗短肽合理組合拼接構(gòu)成新型人源抗體可變區(qū)。利用設(shè)計(jì)的抗體可變區(qū)序列經(jīng)同源模建技術(shù)搭建其空間構(gòu)象。利用分子對(duì)接方法構(gòu)建抗體可變區(qū)與抗原EGFR相互作用的復(fù)合物結(jié)構(gòu)。在考慮 溶劑效應(yīng)的前提下，通過(guò)常溫動(dòng)力學(xué)模擬獲得抗體與抗原相互作用的復(fù)合物模型，通過(guò)相 互作用能確定能夠作用于抗原EGFR的抗體可變區(qū)結(jié)構(gòu)。進(jìn)一步優(yōu)化獲得的新型人源抗體 可變區(qū)氨基酸序列，最終獲得3條靶向EGFR的重鏈氨基酸序列(SEQ_ID NO :1、SEQ_ID NO :2、 SEQ_ID NO 3)以及 3 條輕鏈可變區(qū)氨基酸序列(SEQ_ID NO :4、SEQ_ID NO 5 和 SEQ_ID NO 6)。實(shí)施例二、抗EGFR人源抗體TGM10的表達(dá)和鑒定一、材料引物設(shè)計(jì)軟件為biosim軟件，引物由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成；Pyrobest DNA polymerase 為 TAKARA 公司產(chǎn)品；dNTP 為 TAKARA 公司產(chǎn)品；pGEM-T Easy vector system為Invitrogen公司產(chǎn)品；T4DNA連接酶為NEB公司產(chǎn)品；基因測(cè)序由北京諾賽基因 組研究中心有限公司完成；抗體真核表達(dá)載體PTGS-FRT-DHFR由本公司構(gòu)建并申請(qǐng)國(guó)家專(zhuān) 利(專(zhuān)利授權(quán)號(hào)ZL200510064335. 0)；脂質(zhì)體、MTT為Invitrogen公司產(chǎn)品，羊抗人IgG、 及辣根酶標(biāo)記的羊抗人IgG及人IgG為本公司制備；內(nèi)切酶為NEB公司產(chǎn)品；其他試劑為市 購(gòu)產(chǎn)品。二、方法結(jié)果1. EGFR抗體基因的合成根據(jù)計(jì)算機(jī)模擬獲得的抗體基因序列，包括重鏈可變區(qū)的基因序列SEQ ID NO :1、 SEQ ID NO :2 禾口 SEQ ID NO :3，輕鏈可變區(qū)的基因序列 SEQID NO :4、SEQ ID NO 5 禾口 SEQ ID NO :6。選擇在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中使用頻率較高的密碼子，將計(jì)算機(jī)設(shè)計(jì)篩選獲得的抗體輕 重鏈可變區(qū)氨基酸序列反向翻譯，獲得抗體的可變區(qū)核苷酸序列；根據(jù)基因全合成的原理， 利用計(jì)算機(jī)輔助設(shè)計(jì)軟件，設(shè)計(jì)引物，考慮引物的二級(jí)結(jié)構(gòu)、GC含量等相關(guān)參數(shù)；采用重疊 PCR技術(shù)全合成抗體輕重可變區(qū)基因。2.抗體的表達(dá)2. 1抗體真核表達(dá)載體的構(gòu)建選擇本公司獲得的含有人IgGl抗體恒定區(qū)基因的表達(dá)載體pTGS-FRT-DHFR(專(zhuān)利 授權(quán)號(hào)ZL200510064335. 0)作為本發(fā)明抗體的表達(dá)載體。將本實(shí)施例步驟1所述獲得的3 個(gè)抗體輕鏈可變區(qū)基因、3個(gè)重鏈可變區(qū)基因進(jìn)行隨機(jī)配對(duì)組合，克隆入pTGS-FRT-DHFR載 體中。經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)化等分子生物學(xué)常用技術(shù)，共獲得9個(gè)抗體的真核表達(dá)載體。2. 2抗體表達(dá)將獲得的真核表達(dá)載體，通過(guò)脂質(zhì)體介導(dǎo)的方法瞬時(shí)轉(zhuǎn)染至CH0細(xì)胞，48h后收獲 上清，通過(guò)雙夾心ELISA法以及SDS-PAGE等實(shí)驗(yàn)分析目的抗體的表達(dá)情況。利用羊抗人IgG以及辣根酶標(biāo)記的羊抗人IgG進(jìn)行雙夾心ELISA法檢測(cè)上清中抗 體的含量，以未轉(zhuǎn)染上清作為陰性對(duì)照，人IgG純品作為標(biāo)準(zhǔn)品。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，將計(jì)算機(jī) 輔助設(shè)計(jì)獲得的抗體輕重鏈可變區(qū)基因隨機(jī)配對(duì)組合表達(dá)，收獲的上清中具有目的蛋白表 達(dá)。以非還原的形式進(jìn)行SDS-PAGE實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示表達(dá)的目的蛋白約為155KDa，符合抗體 的分子量(圖1)；以辣根酶標(biāo)記的羊抗人IgG進(jìn)行Western Blotting檢測(cè)，表達(dá)獲得的目 的蛋白可以被羊抗人IgG特異性識(shí)別，具有人IgG抗體特征(圖2)；提示獲得的抗體序列 經(jīng)過(guò)反向翻譯得到的基因在真核細(xì)胞中可成功表達(dá)，表達(dá)獲得的蛋白為抗體分子，具有典型的IgG抗體特征。2. 3抗體鑒定收集EGFR陽(yáng)性的細(xì)胞SK0V3，M2緩沖液裂解細(xì)胞后取裂解液進(jìn)行Western Blotting實(shí)驗(yàn)，將計(jì)算機(jī)輔助設(shè)計(jì)獲得的抗體輕重鏈可變區(qū)基因隨機(jī)配對(duì)組合表達(dá)獲得的 9個(gè)抗體作為檢測(cè)抗體，以辣根酶標(biāo)記的羊抗人IgG進(jìn)行檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，各抗體均可 特異性識(shí)別靶蛋白，其分子量約為185KDa(圖3)，提示，獲得的抗體TGM10可以特異性識(shí)別 靶抗原EGFR。實(shí)施例三、抗EGFR抗體TGM10-1的功能性試驗(yàn)以重鏈可變區(qū)基因?yàn)镾EQ ID NO 2,輕鏈可變區(qū)基因?yàn)镾EQ ID NO 6的EGFR人源 抗體TGM10-1為例，進(jìn)一步驗(yàn)證抗體的生物學(xué)功能。一、材料乳腺癌細(xì)胞系SKV03，肝癌細(xì)胞系H印G2以及肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549購(gòu)自ATCC ；DELFIA EuTDA細(xì)胞毒作用試劑盒為PE公司產(chǎn)品；其他相關(guān)試劑參看實(shí)施例二。二、方法結(jié)果1)流式細(xì)胞分析TGM10-1與細(xì)胞表面EGFR的結(jié)合以EGFR陽(yáng)性乳腺癌細(xì)胞系SKV03，肝癌細(xì)胞系H印G2以及肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549三種細(xì) 胞作為靶細(xì)胞，檢測(cè)不同濃度的TGM10-1抗體結(jié)合細(xì)胞表面EGFR抗原的能力；以Erbitux 抗體作為陽(yáng)性對(duì)照。結(jié)果顯示TGM10-1能特異性識(shí)別靶細(xì)胞，并且其結(jié)合陽(yáng)性率與對(duì)照抗 體Erbitux相似(表1)，提示抗體TGM10-1的識(shí)別活性與對(duì)照抗體Erbitux —致。表1FACS檢測(cè)TGM10-1與細(xì)胞表面EGFR的結(jié)合活性 2) TGM10-1抑制AKT磷酸化水平將EGFR陽(yáng)性乳腺癌細(xì)胞系SKV03，肝癌細(xì)胞系H印G2以及肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549三種細(xì) 胞接種6孔板，加入梯度稀釋(10ug/ml、50ug/ml)的Erbitux或TGM10-1作用24h后收集 細(xì)胞，以M2緩沖液裂解，取上清進(jìn)行WesternBlotting實(shí)驗(yàn)。檢測(cè)AKT、pAKT、GAPDH表達(dá)水 平。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，GAPDH含量一致時(shí)，不同抗體作用后細(xì)胞內(nèi)AKT表達(dá)水平相近，而pAKT 表達(dá)水平呈明顯變化；不同濃度的Erbitux或TGM10-1均能有效降低細(xì)胞內(nèi)AKT的磷酸化 水平；并且TGM10-1對(duì)SK0V3、H印G2及A549三種細(xì)胞系pAKT磷酸化水平的抑制作用均優(yōu) 于對(duì)照抗體Erbitux，其中在50 u g/ml的條件下尤為明顯(圖4)。3)細(xì)胞劃痕定性實(shí)驗(yàn)檢測(cè)TGM10-1的功能以EGFR陽(yáng)性乳腺癌細(xì)胞系SKV03，肝癌細(xì)胞系H印G2以及肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549進(jìn)行 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)，設(shè)置TGM10-1實(shí)驗(yàn)組、Erbitux對(duì)照組以及人IgG對(duì)照組，濃度為10 u g/mL。結(jié)果表明，抗體TGMlO-I可明顯降低了三種腫瘤細(xì)胞遷移能力，并且TGMlO-I作用三種細(xì)胞 系后形成的劃痕面積顯著大于Erbitux作用后形成的劃痕面積；提示TGM10-1的抑制效果 明顯優(yōu)于Erbitux (圖5)。4)抑制生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)以EGFR陽(yáng)性乳腺癌細(xì)胞系SKV03，肝癌細(xì)胞系H印G2以及肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549三種細(xì) 胞作為靶細(xì)胞，加入不同濃度的抗體作用于靶細(xì)胞，設(shè)立陰性對(duì)照、陽(yáng)性對(duì)照及實(shí)驗(yàn)組；以 MTT法測(cè)定抗體對(duì)靶細(xì)胞生長(zhǎng)抑制活性。結(jié)果表明，抗體TGM10-1明顯抑制三種細(xì)胞的增 殖，其抑制活性呈抗體濃度依賴(lài)；并且在各濃度下，TGM10-1對(duì)三種細(xì)胞的抑制活性均優(yōu)于 Erbitux ；提示相同濃度下，TGM10-1對(duì)EGFR陽(yáng)性細(xì)胞的抑制增殖活性較Erbitux顯著提高 (圖6，A 抗體抑制SK0V3細(xì)胞增殖，B ；抗體抑制H印G2細(xì)胞增殖，C 抗體抑制A549細(xì)胞增 殖)。6)抗體依賴(lài)的細(xì)胞毒試驗(yàn)(ADCC) 以PE公司的DELFIA EuTDA細(xì)胞毒作用試劑盒進(jìn)行ADCC實(shí)驗(yàn)，標(biāo)記EGFR陽(yáng)性乳腺 癌細(xì)胞系SKV03，肝癌細(xì)胞系HepG2以及肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549作為靶細(xì)胞，用淋巴細(xì)胞分離液從 外周血中分離出外周血單個(gè)核細(xì)胞作為效應(yīng)細(xì)胞；根據(jù)相應(yīng)比例混合后，加入不等量的抗 體，于圓底96孔培養(yǎng)板上進(jìn)行殺傷實(shí)驗(yàn)，設(shè)立實(shí)驗(yàn)孔、靶細(xì)胞自發(fā)釋放孔、最大釋放孔及背 景孔；37°C孵育2h。利用多功能酶標(biāo)儀進(jìn)行檢測(cè)，計(jì)算殺傷率。結(jié)果表明，抗體TGM10-1可 以有效介導(dǎo)ADCC活性殺傷三種細(xì)胞，其活性呈抗體濃度依賴(lài)；并且相同濃度下，TGM10-1對(duì) 三種細(xì)胞的殺傷率均高于Erbitux，提示TGM10-1介導(dǎo)ADCC功能殺傷把細(xì)胞的活性顯著高 于Erbitux (圖7，A 抗體介導(dǎo)ADCC效應(yīng)殺傷SK0V3細(xì)胞，B ；抗體介導(dǎo)ADCC效應(yīng)殺傷H印G2 細(xì)胞，C 抗體介導(dǎo)ADCC效應(yīng)殺傷A549細(xì)胞)。
權(quán)利要求
一種計(jì)算機(jī)輔助分子設(shè)計(jì)獲得的新型抗EGFR人源抗體TGM10，包括人源化的重鏈可變區(qū)、輕鏈可變區(qū)以及其他區(qū)域，所述EGFR人源化抗體TGM10的重鏈可變區(qū)的基因序列選自SEQ ID NO1、SEQ ID NO2和SEQ ID NO3之一；輕鏈可變區(qū)的基因序列選自SEQ ID NO4、SEQ ID NO5和SEQ ID NO6之一。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的計(jì)算機(jī)輔助分子設(shè)計(jì)抗EGFR人源抗體TGM10的方法，其特征 在于，所述的計(jì)算機(jī)輔助設(shè)計(jì)是基于EGFR胞外區(qū)結(jié)構(gòu)域、EGFR與功能性抗體相互作用空間 構(gòu)象以及理化特征而進(jìn)行的。
3.一種載體，包含EGFR人源抗體TGM10的重鏈可變區(qū)的基因序列為SEQ IDN0 :1、SEQ ID NO 2和SEQID NO 3之一，或輕鏈可變區(qū)的基因序列選自SEQ IDNO :4、SEQ ID NO 5和 SEQ ID NO 6 之一。
4.一種宿主細(xì)胞，包含權(quán)利要求3所述的載體。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述抗體，其特征在于，可以應(yīng)用于與抗原EGFR相關(guān)的診斷試劑的 生產(chǎn)過(guò)程中。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述EGFR人源抗體，其特征在于，其重鏈可變區(qū)基因?yàn)镾EQIDNO 2，輕鏈可變區(qū)基因?yàn)镾EQ ID NO :6。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述EGFR人源抗體，其特征在于，可以應(yīng)用于不當(dāng)增殖疾病的相關(guān) 藥物生產(chǎn)過(guò)程。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述EGFR人源抗體應(yīng)用為不當(dāng)增殖疾病的相關(guān)藥物，其特征在于， 所述抗體可以有效地抑制及殺傷EGFR陽(yáng)性的腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)，包括乳腺癌細(xì)胞系SKV03，肝 癌細(xì)胞系HepG2以及肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了基于計(jì)算機(jī)輔助設(shè)計(jì)新型抗EGFR人源抗體TGM10及其應(yīng)用，該抗體可用于抑制表達(dá)EGFR的人腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)。本發(fā)明基于EGFR蛋白胞外區(qū)與功能性抗體相互作用結(jié)構(gòu)特征，通過(guò)計(jì)算機(jī)虛擬篩選、設(shè)計(jì)獲得新型抗EGFR功能性人源抗體TGM10，應(yīng)用PCR方法進(jìn)行抗體基因全合成，將其構(gòu)建至真核表達(dá)載體，并表達(dá)出能夠特異性識(shí)別EGFR的9種TGM10抗體?？贵wTGM10-1可以有效地殺傷EGFR陽(yáng)性的腫瘤細(xì)胞，包括乳腺癌細(xì)胞系SKOV3、肝癌細(xì)胞系HepG2及肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549。
文檔編號(hào)A61P35/00GK101875697SQ20101014683
公開(kāi)日2010年11月3日 申請(qǐng)日期2010年4月15日 優(yōu)先權(quán)日2010年4月15日
發(fā)明者馮健男, 劉旭, 葉偉亮, 呂明, 朱康勤, 沈倍奮, 黎燕 申請(qǐng)人:北京天廣實(shí)生物技術(shù)股份有限公司;中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所